KR101768577B1

KR101768577B1 - 로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법

Info

Publication number: KR101768577B1
Application number: KR1020150037361A
Authority: KR
Inventors: 박흠기; 박기영; 권오남; 박진철
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2017-08-17
Also published as: KR20160112168A

Abstract

본 발명은 로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법에 대한 것으로, 대게를 포함한 한해성 양식품종의 초기 유생사육에 적합한 로티퍼의 적정 조건을 통해 사육 초기의 생존율의 확보와 향상을 달성할 수 있는 양식방법에 관한 것이다. 이를 위한 본 발명은, 울진 스트레인의 브라키오누스 플리카틸러스(Brachionus plicatilis) 로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 상기 방법에 있어서, 상기 울진 스트레인의 브라키오누스 플리카틸러스(Brachionus plicatilis) 로티퍼를 배양하여 먹이생물로 공급할 수 있다. 상기 로티퍼의 경우, 고밀도로 배양이 용이하므로, 대량공급이 가능하다.

Description

로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법{Method of culturing of cold water species using rotifer as live food}

본 발명은 로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법에 대한 것으로, 대게를 포함한 한해성 양식품종의 초기 유생사육에 적합한 로티퍼의 적정 조건을 통해 사육 초기의 생존율의 확보와 향상을 달성할 수 있는 양식방법에 관한 것이다.

로티퍼는 대부분 댐, 저수지 등 유속이 완만한 담수역에서 주로 발견되는 윤형동물문(Rotifera)의 동물플랑크톤으로, 지금까지 알려진 바로는 전세계적으로 2500 여종이 분포하고 있다. 그 중에서 순수 해수역에 서식하는 로티퍼는 10 여종에 불과하며, 담수 유래종 중 극히 일부만이 담수와 해수의 중간정도 수준의 염도를 나타내는 영역, 즉 자연 수역의 기수(汽水, brackish water) 영역에 적응하여 서식하는 것으로 알려져 있다.

로티퍼 중에서 특히 브라키오누스 속( Brachionus ) 로티퍼는 해산어의 종묘생산 과정에서 초기 자어(子魚, fry)에게 가장 먼저 급이되는 '먹이생물'로서 유용하게 사용되고 있다(Fulk and Main, 1991; Furusawa, 1989; Hirayama, 1985; Jung and Rho, 1999).

먹이생물이란 수서생물(aquatic creature)이 어린 시기에 먹게 되는 식물, 동물플랑크톤을 의미한다. 수서생물의 자어는 입크기가 매우 작기 때문에, 이들 자어에 대한 먹이생물은 그 크기가 매우 작아야 한다. 또한 먹이생물은 자어의 생장이 원만하게 이루어질 수 있도록 영양분을 골고루 함유해야 한다. 기존에 먹이생물로 사용되어 온 인공 배합사료의 평균 크기는 100㎛ 수준이므로 이론적으로는 먹이생물로서 적당한 크기인 것처럼 보이나, 실제로는 제조과정상 그 크기의 편차가 매우 커질 수밖에 없으므로 모든 자어에게 적절한 먹이생물이 될 수는 없다. 또한 인공적으로 제조되었으므로 영양적인 문제도 배제하기 어렵다. 또한 일반적인 배합사료를 공급하여 자어를 생산할 경우 시간이 흐르면서 사료가 부패되어 수질을 악화시키므로 자어의 폐사를 유발하는 경우가 종종 있다.

반면 로티퍼는 크기의 편차가 비교적 작으며 살아있는 생물체라는 특성상 자어에 필요한 영양분을 고루 갖추고 있다. 배합사료보다 우수한 먹이원이 될 수 있다. 먹이생물학적 측면에 있어서, 로티퍼는 부유성을 지니고 그 크기가 160∼320㎛로 매우 작으며 느린 유영력을 지니고 있으므로 양식용으로 사육 중인 어린 자어가 포식하기에 용이하다. 또한 로티퍼는 배양환경이 매우 광범위하며 번식력이 대단히 높아 고밀도 배양이 가능하므로 안정적이고 계획적인 대량 배양이 가능하다(Hino, 1990; Jung and Rho, 1998; Jung et al., 1997; Jung et al., 1998a; Jung et al., 1998b; Park et al., 2001). 실제로 수산 분야에서 증식, 양식 대상 생물이 되는 어류의 자어를 비롯하여, 갑각류 중 일부는 수정난에서 부화된 후 먹이로서 로티퍼를 섭취해야만 생존할 수 있다. 이처럼 로티퍼가 없이는 수산 증양식 분야의 생물들을 사육하는 것 자체가 불가능하므로, 로티퍼는 이들 수서생물 종묘의 대량 생산시 유용한 먹이생물로서 그 산업적 가치를 인정받고 있다.

기수 또는 해수역, 즉 염분 환경에 적응되어 있는 브라키오누스 속 로티퍼는 매우 국지적으로 서식, 분포하는 것으로 알려져 있다. 브라키오누스 속 로티퍼는 채집된 생물학적 생식 격리 현상과 그 조건, 예를 들면 외부 형태, 생식 패턴 및 유전적 형질에 따라 고유한 특성을 지니고 있으며, 이러한 특성이 스트레인 구분의 기준이 된다. 해산어의 종묘 생산 시설에서 초기 자어의 동물먹이생물로 이용되는 로티퍼는 브라키오누스 로툰디포미스( Brachionus rotundiformis )와 브라키오누스 플리카틸리스( Brachionus plicatilis )의 2 종이 알려져 있다. 담수어의 종묘 생산 시설에서 초기 먹이생물로 이용되는 로티퍼는 순수 담수산 로티퍼 브라키오누스 칼리시플로루스( Brachionus calyciflorus )와 브라키오누스 루벤스( Brachionus rubens )의 2종이 알려져 있다. 또한, 해산어의 종묘 생산 과정에서 먹이생물로 이용 가능한 로티퍼는 보통 기수역에서 채집되는 것으로 보고되고 있다. 따라서 해산어의 종묘 생산 과정에서 동물먹이생물로서 이용하기 위해서는 일반 해수에서 배양할 수 있어야 한다.

한편, 일반적으로 대게는 절지동물 갑각강 십각목 물맞이게과에 속하는 종류로서 전세계 북방 냉수대 대게속 5종 중우리나라 동해에는 영덕대게(Chionoecetes opilio)와 붉은대게(Chionoecetes japonicus) 2종류가 있으며, 대게는 우리나라 경북 이북의 동해안에 서식하며 특히 함경북도 연안의 냉수역 지대에 많고, 일본 서남해역, 오호츠크해, 캄챠카, 베링해 등 수심 100 ∼ 400m 해역에 주로 서식하며, 특히 대게는 전국 생산량의 90%를 차지하는 경상북도 동해안 지역의 특산물이고 수산업의 핵심자원이며 경제적 파급효과가 높은 어종이지만 최근 과다한 어획으로 자원이 감소 추세에 있고, 또한 어업간의 분쟁도 빈발하게 일어나고 있는 실정이다. 대게의 포란기간은 첫 산란의 게들은 12 ∼ 18개월이며 2번째 산란한 게들의 경우 포란 기간은 약 12개월이며, 그리고 산란은 2월경에 일어나며, 2번째 이후의 산란개체의 산란은 5월경까지 일어나며, 대게의 탈피는 5월∼10월에 이루어지며 탈피를 통해서 단계적으로 성장하게 되며, 크기는 수컷이 갑폭 187mm, 암컷이 113mm에 달하며, 수명은 암컷이 부화 후 6 ∼ 8년에 성체에 달하여 이후 탈피하지 않고 3 ∼ 4년 생존하며, 수컷은 13년 정도 산다.

그러나, 게류의 양식은 상업 사이즈로 성장할 때까지의 10년 정도의 오랜 시간이 걸리고, 더욱이 암게에서 부화후 유생에서 치게단계를 거치면서 유생끼리 서로 잡아먹는 공식현상으로 대량 폐사가 일어나므로, 유생에서 치게 단계까지 성장시키기에도 매우 어려운 실정이며, 또한 완전한 대게로 성장시키기 위해 6년 ∼ 8년을 사육함에 있어 소요시간이 길어 사육에 상당한 어려움이 있는 것이다. 그리고, 대게를 양식하기 위해서는 자연에서의 부화(부출)가 주로 1월 ∼ 4월이지만 최성기는 2월에서 3월이며, 이 시기는 자연 표층 수온이 저수온에서 서서히 상승하는 시기로 4월 이후는 성장 적수온은 비교적 낮은 온도를 유지해야 하는 어려움이 있다. 따라서 대게를 포함한 한해성 품종의 종묘생산을 위해서는 낮은 온도에서도 활성이 있는 먹이생물의 공급이 필요하다. 한해성 품종으로는 대게뿐만 아니라 털게, 어류로는 명태, 대구, 꼼치 등의 대표적 수산물이 포함되고 있다.

대게 시장의 지속적인 유지와 가격안정을 위해서는 초기 생존율 확보가 매우 중요하다. 인공 종묘생산을 통한 방류사업은 지역 산업의 지속적 확보를 위한 가장 적극적인 방법으로 생각된다. 따라서 대게 종묘생산에 적합한 먹이생물의 개발은 매우 중요하며, 특히 초기 생존율 확보를 위한 먹이생물의 개발이 중요하다.

대한민국 공개특허 10-2010-0013035

한해성 품종 종묘생산을 위한 로티퍼의 적정 영양강화 수온 및 미세조류 선택(Kor J fish aquat sci 43(6), 654-658)

본 발명은 대게를 포함한 한해성 양식품종의 초기 유생사육에 적합한 로티퍼의 선택과 적정 조건을 통해 사육 초기의 생존율의 확보와 향상을 달성할 수 있는 양식방법을 제공하고자 하는 것이다.

이를 위한 본 발명은, 울진 스트레인의 브라키오누스 플리카틸러스(Brachionus plicatilis) 로티퍼를 먹이생물로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 상기 방법에 있어서, 상기 울진 스트레인의 브라키오누스 플리카틸러스(Brachionus plicatilis) 로티퍼를 배양하여 먹이생물로 공급할 수 있다. 상기 로티퍼의 경우, 고밀도로 배양이 용이하므로, 대량공급이 가능하다. 상기 로티퍼는 갑장의 길이는 220 내지 260 ㎛정도 범위이다.

그리고, 상기 배양은 배양온도 20 내지 30 ℃에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 특히 24℃가 적절하다.

그리고, 상기 배양은 배양염분 10 내지 25 ‰에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 특히 15 ‰ 이 적절하다.

그리고, 상기 배양은 클로렐라를 로티퍼의 먹이로 하되, 일당, 2 내지 8 mg/2000 rotifer의 양으로 공급되는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 다만 먹이를 공급할 때, 수질악화가 발생하지 않도록 클로렐라가 한꺼번에 공급되지 않고 지속적으로 공급되도록 장치가 구비되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 4 mg/2000 rotifer의 양으로 공급되는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 배양은 산소를 공급하여 통기하는 방법을 채택하는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다.

그리고, 상기 배양은 당의 공급을 통하여 영양강화와 소화효소 활성화를 돕는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법이다. 바람직하게는 스타치(starch)의 공급이 좋다.

한편, 상기 양식방법은 대게의 양식에 있어서 매우 유용한데, 이는 충분한 고밀도로 대량 배양이 가능하며, 이를 먹이생물로 공급할 때, 저온에서도 활성이 충분히 있기 때문에 더욱 적절하다. 물론 다른 한해성 양식품종에도 적용가능할 것으로 생각된다.

본 발명에서의 울진 스트레인의 저온성 로티퍼(L-타입, Brachionus plicatilis)가 대게의 초기 생육에 바람직한 먹이생물로 사용될 수 있다는 것과 먹이 생물의 대량배양과 이후 이를 대게의 생육조건에서도 먹이 생물로 공급할 때, 충분히 가능한 활성을 지니고 있다는 부분이 핵심적인 것이다. 그러나, 대게 이외에도 한해성 품종에도 충분히 적용될 수 있을 것으로 생각한다.

한편, 대게의 경우, 종래, 부적절한 초기 먹이의 선택 혹은 사육환경의 원인으로 조에아에서 메갈로파로 변태하는 과정에서 유생의 생존율이 극히 낮은 문제가 있다. 따라서, 초기 먹이로 적합한 저온성 로티퍼의 개발이 중요현안이다. 2006년 일본 후쿠이현에서 보고된 자료에 의하면, 조에아 1기에서 2기로의 이행과정과 조에아 2기에서 메갈로파로의 변태과정에서 상당한 폐사가 되는 것으로 보고되고 있는데, 이를 통해 볼 때, 변태전 영양적 보충이 충분히 이루어져야 폐사를 막을 수 있다. 특히 조에아 2기에서 메갈로파로 이행되는 과정에서의 문제점 해결에 대한 자료는 없는 것으로 보인다. 본 발명에서는 저온에서 활력이 좋은 유생의 부유성을 잘 고려할 수 있는 L-타입의 로티퍼를 적용하였고, 특히 울진 스트레인의 저온성 로티퍼를 적용하였다. L-타입의 로티퍼는 S-타입에 비하여 크기는 20% 정도 크지만, 중량이 4배 정도로 무겁기 때문에 S-타입 4 마리를 섭취하는 것과 같은 효과를 볼 수 있다.

본 발명에서는 로티퍼의 특성에 따른 분류와 선택, 여러 가지 조건에서의 배양환경을 개선하여, 고밀도의 대량 배양이 가능한 환경들을 조절함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 대게를 포함한 한해성 양식품종의 초기 유생사육에 적합한 로티퍼의 적정 조건을 통해 사육 초기의 생존율의 확보와 향상을 달성할 수 있는 양식방법을 제공한다.

도 1은 S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 형태비교를 하였다. 좌측이 S-타입이며, 우측이 L-타입이다.
도 2는 양 타입의 크기를 비교한 그래프이다.
도 3은 양 타입의 중량을 비교한 그래프이다.
도 4는 S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 클로렐라 섭취량 비교한 것으로, 막대 안의 숫자는 28℃ S-타입 로티퍼를 기준으로 클로렐라 섭취량을 배수로 표기하였다.
도 5는 S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 소화효소(amylase, total alkaline protease- TAP and lipase) 개체별 활성을 비교하였고, 도 6은 단백질 비활성을 나타내었다.
도 7은 S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 배양온도별 핵산비 비교하였다.
도 8은 S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 배양온도별 성장률(Specific growth rate, SGR) 비교하였다.
도 9는 대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양수온별 최고밀도(ind./ml)를 나타내었다.
도 10은 대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양수온별 포란율(%)을 나타내었다.
도 11은 대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양염분별 최고밀도(ind./ml)를 나타내었다.
도 12는 대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양염분별 포란율(%)을 나타내었다.
도 13에 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 무성생식 클론의 소규모 배양사례를 나타내었다.
도 14는 클로렐라 양을 변화시킨 경우의 개체 밀도 변화를 나타내었다.
도 15는 클로렐라 양을 변화시킨 경우의 포란율 변화를 나타내었다.
도 16은 공기와 산소를 이용한 통기방법에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 개체밀도(ind./ml) 변화를 나타내었다.
도 17은 공기와 산소를 이용한 통기방법에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 포란율(%) 변화를 나타내었다.
도 18은 Starch 공급에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 배양과정에서의 amylase, total alkaline protease (TAP) 및 TG-lipase (TGL) 활성 변화를 나타내었다.
도 19는 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 starch 공급여부에 배양 후 영양강화 시켰을 경우의 지질 영양강화 효과를 나타내었다.
도 20은 저온성 로티퍼 Brachionus plicatilis의 50 L에서의 배양 예의 결과이다.
도 21은 저온성 로티퍼 Brachionus plicatilis의 500 L에서의 배양 예의 결과이다.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 통하여 설명한다.

<로티퍼의 확보>

다양한 지역(strain)의 저온성 로티퍼(Brachionus plicatilis, Lorica length 약 220 ∼ 260㎛)를 확보하였다. 저온성 로티퍼(L-타입, Brachionus plicatilis)는 국내에서 울진에 위치한 배양장과 대산과 부안의 염전지역에서 채집하여 강릉원주대학교 해양자원육성학과에서 보관해 오던 스트레인을 사용하였다. 그리고 일본 스트레인은 1996년 미에현 양식연구소에서 확보한 스트레인이었다. 또한 중국 천진은 2011년 천진의 로티퍼 공급업체가 활용하고 있는 로티퍼 배양 연못에서 분리한 로티퍼 중 대형개체를 분리 배양하여 천진스트레인으로 하였다.

<S-타입 로티퍼와 L-타입 로티퍼의 선정>

S-타입의 로티퍼는 고온성 로티퍼로서, 브라키오누스 로툰디로프미스(Brachionus rotundiformis) 이고 L-타입 로티퍼는 브라키오누스 플리카틸리스(Brachionus plicatilis)이다. 우선 울진 스트레인에서 분리배양한 소형종과 저온성 대형종을 사용하였는데, 소형종은 S-타입이며 고온성이며, 대형종은 L-타입으로 대형종이다. 형태를 대비하기 위해 도 1에 이를 나타내었다. 좌측이 S-타입이며, 우측이 L-타입이다.

1) 크기와 중량 비교

Lorica length와 lorica width를 광학현미경(Olympus CH40) 하에서 micrometer를 이용하여 10마리 이상의 개체를 측정하였으며, neonate와 adult를 별도로 구분하여 100,000 마리 가량을 수집하여 건조 후 건조중량을 0.02 mg 단위까지 측정하여 확인하였다(Mettler, U.S.A.)

Lorica length는 S-타입이 163±11.9 μm였지만, 본 발명에서의 L-타입의 울진 스트레인은 247±27.8 μm였다. Lorica width도 L-타입의 울진 스트레인이 178±1.5 μm로 소형종의 123±19.8 μm보다 큰 것을 알 수 있다. 알의 크기도 length와 width에서 소형이 85±4.1 μm와 64±5.4 μm였지만, 저온성 울진 스트레인 로티퍼는 122±8.3 μ와 96±3.2 μm로 소형종과 구분되는 크기로 확인되었다. S-타입은 복주머니와 같은 형태이고 L-타입은 항아리 모양이다. 도 2에 크기를 대비하였다.

한편, 현재 통영 아쿠아넷에서 고밀도 배양하여 전국으로 유통시키고 있는 스트레인(1999년 이래로 강릉원주대 동실험실에서 아쿠아넷에 지속적으로 제공하여 생산되고 있는 로티퍼로서, 소형임)은 고온성-S-타입 Brachionus rotundiformis이었다. 1996년 일본 나가사키에서 개최되었던 로티퍼심포지움에서 서로 다른 종으로 구분되어 결국 저온성 대형 로티퍼가 Brachionus plicatilis라는 기존의 이름을 갖고 소형종이면서 고온에서 증식을 잘하는 종이 Brachionus rotundiformis로 명명되어 사용되기 시작하였다.

소형 로티퍼(고온성, S-타입)와 대형 로티퍼(저온성, L-타입)의 중량 비교는 도 3에 나타내었다. 소형 로티퍼는 갓부화한 neonate가 0.32±0.091 μg/neonate rotifer로 나타났고 adult의 경우 0.44±0.058 μg/adult rotifer으로 조사되었다. 하지만, 대형(저온성) 로티퍼의 경우 neonate가 0.33±0.060 μg/neonate rotifer으로 소형개체와 비슷한 중량을 보였지만, adult의 중량에 있어서는 1.96±0.072 μg/adult rotifer로 소형 로티퍼와 큰 차이를 보이는 것으로 조사되었다.

2) 클로렐라 섭취량 비교

S-타입은 adult를 이용하였고 저온성 로티퍼는 neonate, grower 및 adult로 구분하여 클로렐라 섭취량 실험을 하였다. 농축 클로렐라를 희석하여 슬라이드 글라스 위에 올려두고 그 안에 정량의 로티퍼를 넣어서 4-6시간 동안의 클로렐라 감소량으로 각각의 클로렐라 섭취량으로 계산하였다. 모든 섭취량은 24시간으로 환산하여 표시하였다.

S-타입 로티퍼와 L-타입 (대형, 저온성) 로티퍼의 갓 부화한 개체(neonate), 알을 달지 않았던 로티퍼(grower) 및 알을 달고 있는 adult로 구분하여 클로렐라 섭취량을 도 4에 나타내었다. 28℃에서 배양된 S-타입 로티퍼 성체는 일일 27만개의 클로렐라를 섭취한다(해양수산부 1999). 저온성 로티퍼의 갓 부화한 개체는 29.7±3.15 10⁴ cells/rotifer를 섭취하였으며, grower는 44.7±10.66 10⁴ cells/rotifer의 클로렐라를 섭취하였다. 그리고 알을 달고 다니는 저온성 로티퍼의 성체(adult)는 53.2±3.36 10⁴ cells/rotifer의 로티퍼를 섭취하는 것으로 조사되었다. 결국 갓부화한 저온성 로티퍼는 S-타입 로티퍼 성체에 비해 1.1배, grower는 1.6배 및 성체는 1.9배의 섭취량을 보였다.

3) 영양강화 전 소화효소활성과 영양강화 후의 지방산 비교

가) 영양강화 전 소화효소 활성 비교

영양강화 전 S-타입과 저온성 로티퍼 성체를 정량 수확하여 증류수로 세척 후 냉동 보관하였다. 냉동 보관 후 1,800 rpm에서 1분간 균질화 하여 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 조효소액으로 사용하였다. 이 조효소액은 단백질과 소화효소로 구분하여 사용하였으며, 그리고 α-amylase 활성 측정은 pH 7.0 phosphate-NaOH buffer 내에 3.5% soluble starch를 기질로 하는 Somogyi-Nelson (Somogyi, 1952)의 방법을 따랐다. 30℃에서 30분간 조효소액과 기질을 혼합한 혼합액을 반응시킨 후 3, 5-Dinitro salicylic acid를 포함하는 color reagent를 넣고 100℃에서 가열 반응시킨 후 OD540을 측정하였다. 1 unit은 1분간 starch로부터 maltose의 nmol 수를 유리시키는 양으로 정의하였다.

Total alkaline protease 활성 측정은 pH 8.0 phosphate-NaOH 내에서 3% Azo-casein을 기질로 하여 Garcia-Carreno and Haard (1993).의 방법에 따랐다. 50℃에서 1시간 동안 조효소액과 기질을 혼합한 혼합액을 반응시킨 후 20% trichloric acid (TCA)로 반응을 정지시킨 후 유리되어 나온 아미노산을 tyrosine으로 대표해서 OD280으로 측정하였다. 1 unit은 1분간 azo-caseindm로부터 유리되어 나온 tyrosine의 nmol 수를 유리시키는 양으로 정의하였다. 그리고 TG-lipase는 pH 8.0 phosphate-NaOH 내에 81.2 mM p-nitrophenylpalmitate (pNPP)를 기질로 하는 Hung et al. (2003)의 방법을 따랐다. 25℃에서 30분간 조효소액과 기질을 혼합한 혼합액을 반응시킨 후 즉시 OD405를 측정하였다. 1 unit은 1분간 pNPP로부터 유리되어 나온 p-nitrophenol의 nmol 수를 유리시키는 양으로 정의하였다. 또한 soluble protein 함량은 Bradford (1976)의 방법에 따라 정량하여 단백질비활성으로 나타내었다.

S-타입 로티퍼와 저온성 로티퍼(L-타입)의 개체당 소화효소 중 amylase, total alkaline protease 및 lipase 활성은 도 5에 나타내었으며, 단백질 비활성은 도 6에 나타내었다. 개체별 활성은 S-타입에 비해 모두 높은 활성을 보여 저온성 로티퍼에서 7.2±1.72 U/rotifer의 amylase 활성을 보였으며, total alkaline protease는 2.5±0.34 U/rotifer 그리고 lipase 활성은 0.3±0.05 U/rotifer의 활성을 보였다. 그러나 단백질 비 활성에 있어서는 두가지 로티퍼 종류에서 모두 amylase 활성이 10.9-11.3 U/mg protein, total alkaline protease 활성은 3.1-3.7 U/mg protein 그리고 lipase 활성은 0.3-0.4 U/mg protein의 활성을 보였다.

나) 영양강화 후 지방산 조성(% of ug /mg total fatty acids)

Aquarich를 이용한 6시간 동안 영양강화 후 S-타입과 저온성 로티퍼를 수확하여 냉동 보관하였다. 냉동 보관된 두 로티퍼는 정량 시료채취하여 Chloroform과 methanol 2:1의 비율로 된 혼합액으로 지질을 추출 하고, 추출된 지질에 BF₃MeOH과 hexane을 처리하여 85℃에서 30분 이상 처리하여 methylation 시킨 후 GC (HPLC 6890)으로 측정하였다. 분리된 피크들은 Supleco FAME 37 (Supleco, U.S.A.)를 이용하여 동정하고, 표준물질에 함유된 정량과 대비하여 정량분석하였다.

S-타입 (Brachionus rotundiformis)와 L-타입 (B. plicatilis) (저온성 로티퍼)의 Aqua rich로 영양강화 시킨 후의 지방산 조성은 다음과 같다. 포화지방산의 총계는 S-타입 로티퍼에서 29.1±2.41% of total fatty acid (ug/mg)로 저온성 로티퍼의 19.8±2.95% of total fatty acid (ug/mg)보다 높게 나왔다. mono-unsaturated fatty acid (MFA)는 3.4-4.6% of total fatty acid (ug/mg)로 로티퍼 종류별로 비슷한 함량을 보였다. EPA (C20:5n3, eicosapentaenoic acid)는 두 로티퍼 종류 모두 0.8-1.1% of total fatty acid (ug/mg)로 조사되었지만, DHA (C22:3n6, Docosahexaenoic acid)는 저온성 로티퍼에서 16.4±1.09% of total fatty acid (ug/mg)로 13.1±0.79% of total fatty acid (ug/mg)의 S-타입 로티퍼보다 높은 함량을 보였다. 그리고 unsaturated fatty acid index (UI, 지방산불포화도)도 또한 저온성 로티퍼에서 235.5±3.89로 S-타입 로티퍼의 205.1±9.77보다 높은 비율을 보여 지방산의 이용율에서 보다 높음을 확인하였다. 그리고 n3/n6 fattya acid 비율은 두 종류 모두 0.4로 동일하게 나타났다.

4) 저온 내성

저온 내성 테스트를 위하여 S-타입 로티퍼와 L-타입 로티퍼(본 저온성 로티퍼)를 16, 20, 24, 28, 30℃에서 24시간 이상 방치하여 적응시켰다. 그 후 일정량 수확하여 RNA와 DNA를 포함하는 RNA/DNA ratio를 측정하였다. 또한 수확 전 (접종 24시간 후)의 개체증식을 확인하여 specific growth rate (SGR)으로 나타내었다.

S-타입 로티퍼와 저온성 로티퍼의 저온 내성은 각 온도에서의 핵산비율(RNA/DNA ratio)는 도 7에 나타내었으며, 순간성장율(SGR, specific growth rate, r)은 도 8에 나타내었다. S-타입 로티퍼의 핵산비율은 28℃ 이상에서 2.5-2.65로 증가하지 않았지만, 24℃부터 감소하여 16℃에서는 핵산비율이 0.05±0.03의 비율로 RNA 합성이 거의 없는 것으로 조사되었다. 저온성 로티퍼에서는 28℃에서 1.9±0.24로 가장 높게 나타났지만, 높은 온도와 낮은 온도에서 각각 낮아지는 경향을 보였다. 특히 20℃에서는 0.89±0.18의 비율을 보여 S-타입 로티퍼 보다 훨씬 높은 경향을 보였다. 그리고 16℃에서는 0.4±0.21의 핵산비로 RNA 합성이 다소 되는 것을 확인하였다.

그리고 이들 두 종의 각 온도에서의 성장률은 S-타입 로티퍼는 28℃ 이상에서 증가하여 36℃에서 3.05±0.12의 성장률을 보였고, 16℃에서는 0.7±0.05로 개체수가 낮아지는 것을 보였다. 하지만 저온성 로티퍼는 28℃에서 2.0±0.34의 비율로 가장 높았으며, 수온 상승에 따라 감소하여 36℃에서는 1.05±0.15까지 감소하였지만, 16℃에서도 1.1±0.09의 성장률을 보여 활력이 유지되어 있는 것으로 조사되었다.

5) 소결

결국 종래의 S-타입의 먹이생물이 아니라, L-타입의 먹이생물을 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다. 다시 말해, 한해성 품종에 적합한 먹이생물은 L-타입 로티퍼이어야 한다는 것이다. 특히 대게의 경우에는 L-타입의 로티퍼의 공급은 조에기에서 메갈로파로의 변태과정에서의 폐사율을 획기적으로 낮추는 효과가 있었다. 털게에도 적용가능할 것으로 보이며, 다른 한해성 품종에서도 적용가능할 것이다. 이러한 특성은 5개 스트레인 중에서 울진스트레인의 L-타입 로티퍼가 가장 뛰어났다.

<고밀도배양에 적합한 strain의 선발>

개체별 특성도 중요한 부분이 있으며, 대량 배양하여 공급하여야 하므로, 고밀도 배양에 적합한 스트레인의 선별이 필요하다. 이를 위해, 5개의 스트레인의 저온성 로티퍼를 대상으로 실험을 하였다.

1) 수온별

확보된 5개 스트레인의 저온성 로티퍼는 16, 20, 24, 28 및 32℃에서 배양하였다. 250 mL 삼각플라스크(배양수 200 mL)에서 배양하였으며, 1일 2 mg/2000 rotifer의 담수 농축 클로렐라를 공급하였다.

대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양수온별 최고밀도(ind./ml)와 초고 포란율은 도 9, 10에 나타내었다. 대산 스트레인은 28℃에서 355.2±62.45 rotifer/mL의 최고밀도를 보였지만 32℃와 유의적인 차이는 없었다. 부안 스트레인은 32℃에서 80.0±5.00 rotifer/mL의 최고밀도를 보였으며, 일본과 중국 천진 스트레인은 142.2±65.72 rotifer/mL와 393.3+32.27 rotifer/mL로 32℃와 28℃에서 최고밀도를 보였지만 두 온도간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그리고 울진 스트레인은 24℃에서 1436.6±92.92 rotifer/mL로 가장 높은 최고밀도를 보였다. 포란율은 대산, 부안, 일본 및 중국 천진 스트레인에서는 20℃에서 각각 40.8±5.98%, 44.1±2.58%, 34.8±2.92% 및 29.5±3.12%로 가장 높은 포란율을 보였다. 하지만 울진 스트레인은 24℃에서 40.4±0.48%로 가장 높은 포란율을 보였지만, 28, 32℃와의 차이를 보이지 않았다.

2) 염분별

확보된 5개 스트레인의 저온성 로티퍼는 10, 15, 20, 25 및 30 psu (‰)에서 배양하였다. 배양은 수온별 배양과 같은 방법으로 하였으며, 배양온도는 28℃로 고정하였다. 대산, 부안, 중국 천진, 일본 미에 및 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 배양염분별 최고밀도(ind./ml)와 초고 포란율은 도 11, 12에 나타내었다. 부안 스트레인은 10‰에서 452.3±59.00 rotifer/mL의 최고밀도를 보였다. 대산, 일본, 중국 천진 및 울진 스트레인에서는 15‰에서 각각 391.7+14.43 rotifer/mL, 417.5±29.72 rotifer/mL, 533.3±46.64 rotifer/mL 및 1306.7±137.69 rotifer/mL로 최고밀도를 보였으며, 이중 울진 스트레인에서 가장 높은 최고밀도를 보였다. 포란율에 있어서는 대산과 울진에서는 모든 염분구에서 각각 32-39%와 35.1-39.9%의 포란율을 보였다. 하지만 부안, 일본 및 중국 천진 스트레인은 25‰ 실험구에서 각각 43.9±0.85%, 31.7±8.77% 및 31.7±13.6%로 가장 높았지만, 10‰까지 낮아지는 염분과와의 유의적인 차이는 없었다.

<울진 L-타입 로티퍼의 배양>

1) 무성생식 클론의 소규모 배양사례

도 13에 울진 스트레인 Brachionus plicatilis의 무성생식 클론의 소규모 배양사례를 나타내었다. 접종 후 4일까지는 크게 증가하지 못했다. 접종 밀도가 50 rotifer/ml이었지만, 포란율이 높을 때는 증식율이 2 이상 유지되었지만, 2, 3, 4일째에는 증식율이 포란율과 함께 떨어지는 경향을 보였다. 그렇지만 포란율을 높게 유지 시켰던 4일째 이후 급격하게 증가하여 성장률이 3 이상을 보였지만, 이후 포란율의 유지가 힘들고, 배양수 관리상의 문제로 증가폭은 높지 않았다. 그리고 최고밀도 3000 rotifer/ml의 밀도를 넘지 못하는 상태에서 배양이 붕괴되었다.

2) 클로렐라 공급량에 따른 배양

200 mL 플라스크에서 먹이공급량별 저온성 로티퍼 Brachionus plicatilis 의 개체밀도 변화는 도 14에 나타내었다. 4 mg/2000 rotifer의 먹이를 공급하였을 때 72시간에 1765±210 rotifer/mL로 가장 높은 밀도를 보였다. 2 mg/2000 rotifer 실험구는 96시간째 1420 rotifer/mL의 밀도를 보였다. 8 mg/2000 rotifer 실험구는 72시간 째까지 증가하였지만, 이후 개체수의 증가는 보이지 않았다. 200 mL에서 먹이공급량별 저온성 로티퍼의 최고밀도에 있어서는 1 mg/2000 rotifer 실험구는 850±170 rotifer/mL로 가장 낮은 최고밀도를 보였지만, 4 mg/2000 rotifer는 가장 높은 1765±210 rotifer/mL의 최고밀도를 보였다.

200 mL에서 먹이공급량을 달리한 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 포란율(%) 변화는 도 15에 나타내었다. 4 및 8 mg/2000 rotifer 실험구에서는 포란율이 35% 이상을 꾸준히 유지하였다. 하지만 2 mg 이하의 공급량에서는 포란율이 15-35%로 낮게 유지되어 개체 증식을 고려한다면 높은 포란율이 익일 혹은 다음 계수 시에 개체수의 증가가 뚜렷하기 때문에 2 mg/2000 rotifer 를 초과하는 먹이의 공급이 반드시 필요할 것으로 판단된다. 8 mg/2000 rotifer 실험구에서 56±8%의 최고 포란율을 보였지만 4 mg/2000 rotifer의 실험구의 55±15%의 최고포란율과 차이를 보이지 않았다. 그리고 먹이공급량이 적어질수록 최고포란율은 낮아져서 1 mg/2000 rotifer 실험구에서는 25±12%가 가장 높은 포란율이었다.

3) 공기와 산소를 이용한 통기 방법에 따른 배양

5 리터 배양기에서 공기와 산소를 이용한 통기방법에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 개체밀도(ind./ml) 변화는 도 16에 나타내었다. 최고 밀도는 산소를 공급한 96시간에 1950±270 rotifer/mL로 조사되었다. 하지만 72시간 이후 증가폭은 줄어들어 72시간 대비 96시간에는 5.7%의 개체수의 증가만 있었다. 그리고 공기를 사용하였을 경우에는 72시간 1690±230 rotifer/mL까지 증가하였지만 익일 배양이 붕괴되었다. 산소를 사용하는 것이 개체수 증가에는 큰 영향을 주지 못했지만, 배양수의 수질 악화로 인한 배양의 붕괴를 막아 줄 수 있었던 것으로 판단된다.

공기와 산소를 이용한 통기방법에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 최고밀도는 산소를 이용한 경우 1965 rotifer/mL의 밀도를 보였지만 1690±310 rotifer/mL 의 최고밀도를 보인 공기를 이용한 배양과 비슷한 경과를 보였다. 그리고 이들의 포란율의 변화는 도 17에 나타내었다. 두 통기 방법 모두 접종 시 25%였던 포란율이 4 mg/2000 rotifer의 먹이공급량으로 실험 했기 때문에 익일 높아지는 포란율을 보였으며, 35%이상의 포란율이 유지되었다.

4) 영양강화와 소화효소 활성 향상방법

가) 배양과정에서 소화효소 활성 향상

Starch 공급에 따른 Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 배양과정에서의 amylase, total alkaline protease (TAP) 및 TG-lipase (TGL) 활성 변화는 도 18에 나타내었다. Starch 공급 후 경과 시간에 따라 탄수화물분해효소인 amylase는 24시간 경과 후 141%로 증가하였고, 48시간 경과 후에는 473%로 증가하였다(A). 단백질분해효소 활성은 24시간째에는 82%로 감소하였지만 48시간째는 158%로 증가하였으며, 지질분해효소인 TGL 활성은 48시간째까지 280%로 꾸준히 증가하였다(B).

나) 소화효소 활성 향상된 로티퍼의 지방산 영양강화 효과

Brachionus plicatilis 울진 스트레인의 starch 공급여부에 배양 후 영양강화 시켰을 경우의 지질 영양강화 효과는 도 19에 나타내었다. 영양강화하지 않은 로티퍼(Non), 일반적인 영양강화(Nor-Enrich)와 starch 첨가로 배양한 후 영양강화한 토리퍼(Star-enrich)는 C18;3n3이 1.4-3.5%로 종류별 차이를 보이지 않았다. EPA (C20:5n3)의 경우 Non 로티퍼에서는 전혀 검출되지 않았지만, Nor-Enrich와 Star-enrich에서 각각 1.1±0.16%와 2.2±0.18%로 증가하는 경향을 보였다. DHA (C22:6n3)도 영양강화하였을 때만 검출되었으며 starch의 첨가와 함께 배양된 로티퍼를 영양강화하였을 때 15.3±1.03%로 가장 높은 비율을 보였다(A). 그리고 수산생물의 초기 생활사에서 성장과 생존에 많은 영향을 주는 것으로 알려져 있는 n3 HUFA 함량이 Non 로티퍼에서 2.6±0.39%에 그쳤지만, 영양강화하였을 때는 13.1% 이상의 비율을 보였고, 특히 star-enrich 로티퍼에서는 18.9±0.98%까지 높아 진 것을 확인하였다. 하지만 DHA/EPA ratio는 일반적인 방법으로 배양하여 영양강화한 로티퍼에서 12.5±1.75의 비율로 가장 높았다. 하지만 지방산의 불포화도(index of unsaturated fatty acid)는 star-enrich 로티퍼에서 227.6±8.98로 가장 높은 비율을 보였다(B).

5) 50 L와 500 L 배양기 적용

저온성 로티퍼 Brachionus plicatilis의 50 L에서의 배양 예는 배양결과를 도 20에 나타내었으며, 500 리터는 도 21에 나타내었다. 50 L 배양에서 2번 사례는 초기 접종밀도가 30개체/mL 였기 때문에 배양이 안정되기까지 5일이 걸렸으며, 이후 4일동안 최고 밀도인 1855 rotifer/mL까지 개체증식을 하였다. 하지만, 접종밀도가 120, 180 rotifer/mL이었던 사례 1과 3에서는 사례 2의 6일차 이후의 경향과 같이 성장률 “2” 이상의 성장을 보여, 각각 최고 밀도 2180 rotifer/mL과 1920 rotifer/mL를 보였다. 하지만 500 L 배양에서는 초기 접종밀도는 140과 155 rotifer/mL로 하였지만 사례 1에서는 배양이 안정되어 증가할 때까지 7일의 시간이 소요되었다. 이후 사례 2와 같이 꾸준히 증가하는 경향을 보였지만, 개체 밀도는 두 사례 모두 1370과 1345 rotifer/mL로 소규모 배양에서 보다 낮은 개체밀도를 보였다.

Claims

울진 스트레인의 브라키오누스 플리카틸러스(Brachionus plicatilis) 로티퍼를 고밀도로 배양하여 한해성 양식품종의 먹이생물로 공급하되,
상기 브라키오누스 플리카틸러스 로티퍼의 배양을 위해 로티퍼의 먹이로 공급하는 클로렐라는 배양시부터 72 시간까지는 4 내지 8 mg/2000 rotifer의 양으로 공급하고, 배양시간은 5 내지 9일 동안 배양하며,
상기 배양은 당의 공급을 통하여 영양강화와 소화효소 활성화를 돕는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 배양은 배양온도 20 내지 28 ℃에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법.
제 1항에 있어서, 상기 배양은 배양염분 10 내지 25 ‰ 에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 배양은 산소를 공급하여 통기하는 방법을 채택하는 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법.
삭제
제 1항, 3항, 4항 및 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한해성 양식품종은 대게인 것을 특징으로 하는 한해성 양식품종의 양식방법.