KR101241540B1 - 신균주 테트라셀미스 하제니 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신균주 테트라셀미스 하제니 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류(일명, 'KMMCC-62'라고 함), 상기 미세조류 및 이의 배양액을 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물 및 상기 본 발명의 신규한 미세조류를 이용한 포복성 해양무척추동물 유생의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 테트라셀미스 하제니 (Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 포복성 해양무척추동물 유생이 용이하게 섭취할 수 있는 크기를 가지고 있을 뿐만 아니라, 성장률 및 부착률이 우수하여 포복성 해양무척추동물 유생의 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 신균주는 포복성 해양무척추동물 유생의 배양에 적합한 미세조류로서, 전복을 포함한 해양생물들에 대한 양식 산업에 사료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신균주 테트라셀미스 하제니 및 이의 용도{Novel Tetraselmis hazeni and Use Thereof}
본 발명은 신균주 테트라셀미스 하제니 및 이의 용도에 관한 것으로서, 참전복과 같은 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 사용할 수 있는 신균주인 Tetraselmis hazeni KCTC 11962BP 미세조류(일명, 'KMMCC-62'라고 함), 이를 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물 및 이를 이용하여 포복성 해양무척추동물 유생을 배양하는 방법에 관한 것이다.
전복이나 해삼과 같이 우수한 영양성분을 함유한 해양생물들에 대한 수요가 증가함에 따라 이들을 대량으로 생산할 수 있는 양식 기술들도 점차 발전하고 있다. 특히 전복은 고부가가치 어종으로 각광받고 있으며, 인공 종묘생산이 실시된 이후 해마다 양식면적이 늘어나고 있다. 종래 전복이나 해삼을 양식하는 방법은 어린 전복이나 해삼 유생을 육상 수조에서 일정 크기 이상 성장시킨 후 바다에 설치되어 있는 가두리 양식장으로 옮겨서 양식하는 방법이 주된 것이었다. 또한 전복은 자연 상태에서 암벽이나 암초가 있는 곳에서 주로 서식하는 부착성 어종이므로, 양식을 할 때에도 이러한 습성을 충족시키기 위하여 전복이 붙어서 생활할 수 있는 다양한 형태의 쉘터가 개발되고 있는 실정이다.
그러나 아직 전복을 포함한 해양생물들에 대한 양식 기술은 초기단계라 할 수 있으며, 특히 초기 배양에 사용될 사료의 개발은 크게 실용화되어 있지 않다. 예를 들어, 전복의 경우 종래에는 양식 사료로서 미역, 다시마, 파래 등의 가공되지 않은 사료를 주로 사용하여 왔는데, 이러한 사료들은 장기간 저장 시 부패, 악취, 유해미생물 등이 발생하며 저장비용도 높은 편이어서 안정적 공급이 어렵고 양식원가를 상승시켜 수익성이 떨어지는 문제가 있다.
이러한 문제점들을 해결하기 위해 배합사료를 개발하려는 시도들이 국내외적으로 이루어지고 있다. 가령 대한민국 특허출원 제2009-0068453호("전복 초기 미립자 사료", 2009.07.27.출원)는 부착규조류의 분말과 미네랄 등을 혼합한 미립자 사료의 제조방법을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원 제2003-0085219호("락토바실러스 플란타룸을 유효성분으로 함유하는 어류양식용 사료 첨가제", 2003.11.27.출원)는 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸을, 대한민국 특허출원 제2000-0047066호("양식어류의 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법", 2000.08.14.출원)는 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움 등을 각각 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료첨가제에 관해 개시하고 있다. 그러나, 이러한 배합 또는 미생물 사료들에 대해 아직 양식 현장에서 이렇다 할 평가를 받고 있지는 못하는 실정이다.
한편, 미세조류의 생물학적인 막은 점액물질로 구성되어 있어 참전복(Haliotis discus hannai)과 같은 부착성 해양무척추동물 유생의 부착 기질로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 실제로 해양 미세조류는 양식 생물의 인공종묘생산을 위한 필수적인 먹이생물이다. 그러나 미세조류는 경제적, 기술적으로 대량배양이 어려우며, 먹이효율을 파악하기 어려운 문제점이 있다.
특히 포복성 해양무척추동물의 유생 사육을 위한 부착성 미세조류의 먹이효율에 대해서는 부유성 미세조류에 비해 상대적으로 충분한 연구가 되어 있지 않으며, 최근 대량 양식 기술이 개발된 전복의 경우에도 유생 시기에 적합한 부착성 미세조류의 선별과 대량 배양은 여전히 어려운 문제로 남아 있다. 그 이유는 부착하는 미세조류는 종에 따라 성장 특성이 다르고, 과다하게 부착할 경우 자체 무게를 견디지 못하고 탈락하므로 먹이부족 현상을 나타낼 수도 있기 때문이다. 부착 미세조류가 형성하는 막이 평면일 경우에는 참전복 유생의 높은 부착률을 유도하나 3차원적인 형상을 나타내는 종에서는 낮은 부착률을 보인다(Kawamura T and Kikuchi H. 1992. Effects of benthic diatoms on settlement and metamorphosis of abalone larvae. Suisanzoshoku 40, 403-409; Searcy-Bernal R. 1996. Boundary layers and abalone post-larval culture: preliminary studies. Aquaculture 140, 129-137; Roberts RD, Kawamura T and Handley CM. 2007a. Factors affecting settlement of abalone (Haliotis) larvae on benthic diatom films. J Shellfish Res 26, 323-334.). 또한, 일부 부착 규조류는 단단한 규각을 가지고 있어 유생의 낮은 소화율의 원인이 되기도 한다. 이와 같이 미세조류는 종에 따라 성장, 부착 및 영양 특성이 다르므로 파판에 부착된 양질의 미세조류 확보 여부는 참전복 종묘생산의 관건이라 볼 수 있다.
참전복의 경우 후기 유생의 사육에 관해서는 비교적 많은 보고가 있었으나, 부착 직후 초기 유생의 사육 등에 관한 보고는 충분하지 않은 실정이다. 또한 참전복 유생의 먹이효율에 대한 연구도 규조류에 주로 국한되어 있다.
따라서 참전복과 같은 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 적합한 신규한 미세조류의 개발 및 이들을 이용한 포복성 해양무척추동물 유생의 효율적인 배양에 관한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 참전복의 초기 유생을 실험 생물로 선정하고, 그 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있는 규조류를 포함한 담녹조류 및 남조류 등의 다양한 미세조류를 대상으로 성장률과 부착률을 연구 조사하던 중, 성장률과 부착률이 우수하여 대량배양이 용이하고 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 적합한 신규한 미세조류인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni)를 처음으로 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 대량배양이 용이하고 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 적합한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) 미세조류를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세조류를 이용한 포복성 해양무척추동물 유생의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 20~28℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 미세조류인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP의 대량배양 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포복성 해양무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼, 성게 및 군소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포복성 해양무척추동물은 참전복(Haliotis discus hannai)일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류를 배양하는 단계; 상기 배양이 이루어진 배양기에서 배양액만을 제거하고 여과해수를 채우는 단계; 및 상기 여과해수를 채운 배양기에 포복성 해양무척추동물 유생을 접종하는 단계를 포함하는, 포복성 해양무척추동물 유생의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 20~28℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 미세조류인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP의 대량배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 포복성 해양무척추동물 유생이 용이하게 섭취할 수 있는 크기를 가지고 있을 뿐만 아니라, 성장률 및 부착률이 우수하여 포복성 해양무척추동물 유생의 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 신균주는 포복성 해양무척추동물 유생의 배양에 적합한 미세조류로서, 전복을 포함한 해양생물들에 대한 양식 산업에 사료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 계통발생분석에 따른 본 발명의 신균주의 18S rRNA 아미노산 서열의 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 와 다른 미세조류들을 먹이로 사용한 참전복 유생의 변태율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 와 다른 미세조류들을 먹이로 사용한 참전복 유생의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 성장률 및 부착률이 우수하여 대량배양이 용이하고 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 적합한 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) 미세조류를 제공한다는 데 그 특징이 있다.
본 발명에서 “포복성 해양무척추동물”이라 함은 해양에 서식하는 동물로서 다른 물질의 표면에 포복하는 특성을 가진 무척추동물을 의미한다.
해양무척추동물의 예로는 굴, 담치류, 진주조개, 우렁쉥이와 같은 부착성 동물; 가리비류, 고막류, 키조개와 같은 일시부착성 동물; 대합류, 바지락류, 우럭류와 같은 비부착성 동물; 해삼, 성게류, 전복류, 소라와 같은 포복성 동물; 보리새우류, 꽃게, 닭새우와 같은 유영성 저서동물로 나뉠 수 있다.
본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) 미세조류는 표면에 부착하는 성질이 우수하여 해양무척추동물 중에서도 특히 포복성 해양무척추동물에 적합하다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 상기 포복성 해양무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼, 성게 및 군소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으며, 바람직하게는 전복류일 수 있다.
전복(Haliotis discus)은 옛날부터 고가의 기호식품으로서 산업적으로 전망이 밝은 고부가가치 양식품종이다. 세계적으로 전복류는 100여종이 있으며, 우리나라에서는 한류계인 참전복과 난류계인 말전복, 까막전복, 시볼트 전복 등이 서식하고 있다.
특히 참전복(Haliotis discus hannai)은 전복의 두 아종 중 북방형으로 수온이 낮은 북부 연안에 분포하며, 전복류 중에서는 가장 얕은 곳에 살며 수심 약 15m 이내이고 바닷물이 깨끗해 해조류가 많이 번식하는 곳에 서식한다. 또한 미역, 다시마, 감태, 대황, 파래 등 해초류가 주식이며 한국과 일본에 분포한다. 수명은 12년 정도이고 자웅이체로 체외수정을 하며 산란기는 9~11월경이나 수온 차이에 따라 지역마다 다르며, 산란기간 동안 무리를 짓는 습성이 있다. 크기가 10cm 정도의 성체가 보통 20~30만개의 알을 낳는 것으로 알려져 있다.
이러한 참전복은 수분함량이 많고 단백질, 지방의 함량은 적은 편으로 영양이 체내에서 잘 흡수되어 회복기의 환자나 노약자를 위한 건강식으로 많이 쓰인다. 예로부터 궁중요리에서 많이 사용되었으며, 특유의 오돌오돌하게 씹히는 촉감이 좋아 회로 즐기고, 익혀 먹으면 감칠맛을 느낄 수 있다. 내장은 게웃이라 하여 젓갈을 담가 먹기도 한다. 다만 산란기에는 내장에 독성이 있으므로 생식은 피하고 살짝 익혀서 먹는 것이 좋다. 또한 진주광택이 나는 껍질은 자개, 나전, 세공, 단추 등 공예품의 원료로 쓰이고 있다.
한편, 전복양식은 부착기 유생을 파판에 채묘한 후, 미세조류를 먹이로 하여 7 ~ 8mm까지 성장시킨 후 박리하여 상품크기로 육성시켜 수확하는 방식으로 이루어지고 있다. 일반적으로 전복 유생은 부화 후 약 96시간 이내에 기질에 부착하고 변태를 진행하며, 변태가 이루어진 개체는 바로 부착 미세조류를 먹이로 섭취하는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명에서는 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있는 미세조류를 발굴하기 위해, 인천광역시 연안에서 식물플랑크톤네트(20μm)를 이용하여 채취한 후 신규한 미세조류를 분리 및 동정하였고, 18S rRNA의 염기서열을 분석하여 계통학적 분류를 조사한 결과, 계통학적으로 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni)에 속하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한 상기 동정한 본 발명의 신균주의 전체 염기서열을 분석하였고, 그 염기서열을 서열번호 1에 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인할 수 있었다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 미세조류를 2011.06.14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11962BP를 부여받았고 이를 “테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류”로 명명하였다.
본 발명에서 분리 및 동정한 상기 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 20℃~28℃의 온도조건 및 25psu~35psu의 염도조건 하에서 생장 또는 성장이 활발한 특징이 있다.
상기에서 염도 단위로 사용한 "psu"는 실용 염분 단위인 practical salinity unit를 의미하는 것으로서, 해수 1kg에 녹아 있는 용존 물질의 g 질량의 비(psu)로 염분을 나타낸 것이다. 일반적으로 해수의 평균 염도는 35psu의 염분을 나타낸다고 알려져 있다.
본 발명자들은 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류가 실제로 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 유용한지 확인하기 위해, 먼저 본 발명의 신균주가 전복 유생이 섭취하기 용이한 크기인지를 분석한 후, 이들의 생장률 및 부착률을 분석하였다.
본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면, 본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 약 15μm 정도의 크기를 가진 것으로 측정되어, 크기가 상대적으로 큰 다른 미세조류에 비해 전복 유생이 섭취하기 비교적 용이한 것으로 판단되었다(표 3 참조).
또한, 생장률 및 부착률 분석 결과, 본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 다른 미세조류와 비교하여 성장률 및 부착률이 유의적으로 높은 것으로 나타났다(표 4 참조).
또한, 본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류를 먹이로 섭취한 참전복 유생의 부착률, 변태율 및 생존율 측정한 결과, 본 발명의 신균주를 먹이로 이용한 참전복 유생의 경우, 접종 후 96시간까지의 부착률이 타 미세조류에 비하여 가장 높았으며(표 5 참조), 접종 4일 후의 변태율은 규조류인 Rhaphoneis sp.를 제외한 타 미세조류 중에서도 유의적으로 높게 나타났으며(도 2 참조), 15일간의 사육 후 유생 생존율도 Rhaphoneis sp. 다음으로 가장 높은 것으로 나타났다(도 3 참조).
이러한 점에 비추어 볼 때, 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는 전복 유생이 섭취할 수 있을 정도의 작은 크기를 가질 뿐만 아니라, 부착기질에서의 부착률 및 생장률이 우수하여 전복과 같은 포복성 해양무척추동물의 양식에 사료로서 유용하게 이용될 수 있다.
특히 미세조류 가운데 성장과 영양이 높은 규조류만을 먹이로 사용하는 경우 양식생물의 영양 균형이 문제될 수 있어, 포복성 해양무척추동물의 양식을 위해서는 규조류 이외에 다른 미세조류를 혼합공급이 필요하다. 따라서 규조류를 제외한 부착성 미세조류 가운데 성장과 영양이 높은 본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류는, 파판 등의 부착기질을 이용하여 규조류 이외의 타 미세조류를 대량 배양하여 산업적으로 활용하고자 할 때 가치가 더욱 클 것으로 판단된다.
그러므로 본 발명은 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공할 수 있다.
상기 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물은 유효성분으로서 본 발명은 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류 또는 상기 미세조류의 배양액을 포함할 수 있는데, 상기 미세조류의 배양액은 미세조류를 포함한 배양액일 수 있고, 또는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수득한 농축 균체을 포함할 수 있으며 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 바람직하게 상기 미세조류 및 상기 미세조류의 배양액은 살아있는 미세조류를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에는 상기 미세조류 이외에도 종래 포복성 해양무척추동물의 먹이로 알려져 있는 생물, 영양분 또는 그것을 재료로 한 사료 첨가물을 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 전복 유생 배양용 사료 조성물에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 파래류 분말, 북양백색어분, 대두박, 콘글루텐밀, 소맥분, 감자전분 및 선인장 줄기 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 북양백색어분(魚粉)은 고가의 카제인을 대체할 수 있는 경제적인 동물성 단백질원으로 제공될 수 있으며, 이를 보충하기 위하여 대두박과 콘글루텐밀 등을 사용할 수 있다. 상기 소맥분과 감자전분은 탄수화물원으로 사용될 수 있으며, 선인장 줄기는 식이섬유질이 풍부한 점착제로서 값비싼 알긴산 나트륨을 대체하여 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 사료 조성물에는 비타민, 미네랄, 라이신 등이 포함될 수 있다. 상기 비타민은 아스코르브산, α-토코페릴 아세테이트, 티아민 , 피리독신, 니아신, Ca-D-pantothenate, myo-이노시톨, D-비오틴, 폴산(folic acid), 파라-아미노벤조산, 비타민 K3, 비타민 A, 비타민 D3, 염화콜린, 시아노코발라민 등이 포함된 혼합물을 셀룰로오스에 희석시켜 사용될 수 있으며, 상기 미네랄은 NaCl, MgSO47H2O, NaH2PO42H2O, KH2PO4, CaH4(PO4)2H2O, Ferric citrate, ZnSO47H2O, Calactate, CuCl, AlCl36H2O, KIO3, Na2Se2O3, MnSO4H2O, CoCl26H2O 등이 포함된 혼합물의 형태로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 배양용 사료 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 배양용 사료에 있어 미세조류 또는 사료 첨가물의 조성은 각각의 생물종에 특이적으로 성장률, 생존율 및 부착률 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 특히 전복은 사료를 치설을 통하여 갉아먹기 때문에 사료의 수중 보존시간도 고려할 필요가 있다. 한편, 본 발명에 따른 배양용 사료 조성물은 포복성 해양무척추동물 유생 양식의 주 사료로 제공되는 것으로서, 그 사용 함량은 수온 및 대상 유생의 밀도에 따라 달라질 수 있다.
나아가 본 발명은 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류를 배양하는 단계; 상기 배양이 이루어진 배양기에서 배양액만을 제거하고 여과해수를 채우는 단계; 및 상기 여과해수를 채운 배양기에 포복성 해양무척추동물 유생을 접종하는 단계를 포함하는, 포복성 해양무척추동물 유생의 배양방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 20~28℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 신규한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류의 대량배양 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
통계분석
모든 실험 결과는 One-way ANOVA test를 실시하였으며, 평균간의 유의성(P<0.05)은 Duncan's multiple range test로 하였다. 모든 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., 2008; Ver. 17) program을 사용하였다.
< 실시예 1>
신균주인 테트라셀미스 하제니 ( Tetraselmis hazeni ) KCTC 11962 BP 의 분리
<1-1> 균주의 분리
본 발명자들은 생육 발달이 활발하고 부착률이 우수하여 참전복과 같은 포복성 해양무척추동물 유생 배양에 사용할 수 있는 새로운 미세조류를 발굴하기 위해 남해안에서 식물플랑크톤네트(20μm)를 이용하여 채취하여, 한천 고체 배지(LDM 배지, 표1 참조)에 도말하여 배양한 후 분리하였다. 이후, 성장률과 부착률이 우수한 균주를 분리하기 위해, 상기 분리된 각 균주들을 대상으로 23℃의 온도가 유지되는 조건하에서 해수용 배양액으로 알려진 f/2배지(표 2 참조)를 이용하여 균주를 배양시켰고, 배양 후, 높은 성장률 및 부착률을 보이는 균주를 선택하여 형태학적 분석 및 균학적 특성을 분석하였다.
LDM 배지 조성표 (Starr, 1978)
Bristol solution 100 mL
Biotin 0.25 ㎍
Vitamin B12 0.15 ㎍
PIV metal solution 6 mL
Tryptone 1 g
Agar 12 g
Filtered Sea water 900 mL
Bristol solution stock
NaNO3 10.0 g/400 mL dH2O
CaCl2 1.0 g/400 mL dH2O
MgSO47H2O 3.0 g/400 mL dH2O
K2HPO4 3.0 g/400 mL dH2O
KH2PO4 7.0 g/400 mL dH2O
NaCl2 1.0 g/400 mL dH2O
10 mL of each stock solution is added to 940 mL of distilled water. To this add a drop 1.0% FeCl3 solution.
PIV metal solution
Na2 - EDTA 750 ㎎
FeCl26H2O 97 ㎎
MnCl24H2O 41 ㎎
ZnCl2 5 ㎎
CoCl26H2O 2 ㎎
Na2MoO4 4 ㎎
Distilled water 1,000 mL
Figure 112011086628152-pat00001
<1-2> 선별된 균주의 동정
a. 형태학적 동정
상기 실시예 <1-1>에서 선별된 균주를 대상으로 현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다.
관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 소형 담녹조류로 타원형이며, 단경은 6.0~9.4μm (평균 7.1±1.7μm), 장경은 11.2~18.8μm (평균 15±3.8μm)이었으며, 유주세포는 편모를 가지고 있어 운동성을 가지는 것으로 나타났다. 또한 조도가 낮아지면, 배양용기 벽면에 부착하여 편모가 탈락하여 부동세포가 되어 분열하는 것을 관찰할 수 있었다(결과 미도시).
b. 분자생물학적 동정
상기 실시예 <1-1>에서 선별된 균주의 분자생물학적 동정을 위해 당업계에서 사용되고 있는 18S rRNA의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 테트라셀미스 속에 속하는 균주인 것으로 나타났고, 분류상 위치는 Prasinophyceae - Chlorodenrales - Chlorodendraceae - Tetraselmis에 속하는 것으로 조사되었으며, 특히 Tetraselmis hazeni 에 속하는 것으로 분석되었다(도 1 참고). 이에 본 발명자들은 상기 동정한 균주의 염기서열을 분석하였고, 그 염기서열을 서열번호 1에 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2011년 06월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11962BP를 부여받았다. 이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP”로 명명하였다.
c. 균학적 동정
상기 동정한 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 균주의 균학적 특징을 조사하였는데, 조사 결과, 광합성에 의한 광독립 영양생육을 할 수 있는 것으로 나타났고, 생육 온도는 20~28℃의 온도에서 잘 성장하는 특징이 있는 것으로 나타났으며, 특히 생육 최적 온도는 25℃인 것으로 나타났다.
또한 25psu 내지 35psu에서 생육 가능한 것으로 조사되었으며, 생육 조도는 3,000~5,000lux의 범위인 것으로 조사되었다.
참고로 상기 "psu"는 실용 염분 단위인 practical salinity unit를 의미하는 것으로서, 해수 1kg에 녹아 있는 용존 물질의 g 질량의 비(psu)로 염분을 나타낸 것이다. 일반적으로 해수의 평균 염도는 35psu의 염분을 나타낸다고 알려져 있다.
< 실시예 2>
본 발명에 따른 신균주의 성장률 및 부착률 측정
본 발명에 따른 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP가 참전복 유생 배양에 적합한지 알아보기 위하여, 먼저 미세조류의 크기를 측정한 후 성장률 및 부착률을 측정하였다. 이때 대조군으로는 부경대학교 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture center, KMMCC)에서 보유하고 있는 미세조류 종 중에서 참전복의 먹이생물로 이용 가능할 것으로 판단되는 30종의 미세조류(규조류 24종, 담녹조류 2종, 남조류 4종)를 분양받아 미세조류의 성장률과 부착률을 조사하였다(표 4 참조).
<2-1> 본 발명에 따른 신균주의 크기 측정
전복 유생은 변태 후, 적어도 2일 안에 입이 열리고 먹이를 섭취하기 시작하는데, 참전복 초기 유생의 입이 열렸을 때의 구경은 불과 10μm이므로 미세조류의 크기는 먹이 조건으로 중요하다. 따라서 본 실험에서는 본 발명의 신균주가 전복 유생이 섭취하기 용이한 크기인지 확인하기 위해 미세조류의 크기를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1에서 나타내었다.
미세조류의 크기
미세조류 종류 종(Species) 길이(Length) (㎛)
KMMCC 493 Achnanthes sp. 27±3.9
KMMCC 931 Amphiprora gigantea var. sulcata 42±6.7
KMMCC 714 Amphora delicatissima 18±2.3
KMMCC 935 Amphora delicatissima 25±2.7
KMMCC 716 Amphora lineata 22±1.5
KMMCC 773 Amphora sp. 23±3.3
KMMCC 823 Amphora sp. 12±1.0
KMMCC 939 Amphora veneta var . coffeaeformis 19±3.0
KMMCC 941 Navicula annexa 21±1.8
KMMCC 905 Navicula cancellata 23±2.2
KMMCC 893 Navicula elegans 14±1.2
KMMCC 17 Navicula incerta 39±1.7
KMMCC 919 Navicula viridis 19±1.9
KMMCC 957 Navicula sp. 11±1.2
KMMCC 841 Navicula sp. 16±4.2
KMMCC 900 Caloneis schroder 21±2.5
KMMCC 833 Cocconeis californica 24±9.1
KMMCC 267 Cylindrotheca closterium 34±3.9
KMMCC 26 Nitzschia dissipata 26±1.0
KMMCC 962 Nitzschia sp. 24±1.0
KMMCC 77 Phaeodactylum tricornutum 17±1.8
KMMCC 847 Pleurosigma angulatum 56±8.6
KMMCC 628 Rhaphoneis sp. 9±1.7
KMMCC 268 Trachyneis aspera 26±3.3
본발명의 신균주 Tetraselmis hazeni 15±3.8
KMMCC 109 Tetraselmis sp. 13±2.6
KMMCC 40 Tetraselmis sp. 13±2.4
KMMCC 30 Lyngbya taylorii 4±0.6*
KMMCC 98 Oscillatoria splendida 2±0.3*
KMMCC 34 Phormidium luridum 2±0.2*
KMMCC 180 Trichodesmium erythraeum 5±0.2*
KMMCC : Korea Marine Microalgae Culture Center. * : width(μm)
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 동정한 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP는 장경 약 15μm, 단경 약 7μm 정도의 크기를 가진 것으로 측정되어, 크기가 상대적으로 큰 다른 미세조류에 비해 전복 유생이 섭취하기 용이한 것으로 판단되었다.
<2-2> 본 발명에 따른 신균주의 성장률 및 부착률 측정
참전복과 같은 포복성 해양무척추동물 유생의 먹이 및 부착기질을 형성하는 미세조류로 적합하기 위해서는 미세조류 자체의 성장률이 높아야 하며, 또한 부착률이 우수하여야 한다. 따라서 본 실험에서는 본 발명에 따른 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP가 참전복 유생 배양에 적합한지 알아보기 위하여 성장률 및 부착률을 측정하였다.
미세조류의 성장률과 부착률을 측정하기 위하여 14 L 원형 아크릴 수조에 부착기질로서 19× 16× 0.1 ㎝의 아크릴 파판 5장을 넣고 10 L의 f/2 배지를 채운 후, 충분히 배양된 대수 성장기의 미세조류를 10% 되게 접종하였다. 수조내의 부착기질의 면적은 수조벽면(1,583 ㎠)과 바닥(451 ㎠) 그리고 파판(3,075 ㎠)으로 총 부착면적은 5,109 ㎠였다. 미세조류는 23℃, 40 μmol m-2s-1, 연속조명의 조건에서 2주간 통기 배양으로 실험하였다.
2주간 배양된 미세조류의 성장률과 부착률을 측정하기 위해 먼저 부착되지 않은 세포를 GF/C 필터로 수거하고, 수조의 바닥, 벽면 및 파판에 부착되어 있는 세포를 부드러운 붓을 이용해 탈락시켜서, 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 각각 GF/C 필터로 여과하여 수확하였다. 수확한 미세조류는 60℃ 건조기에서 2시간 각각 건조시킨 후, mg 단위로 건조중량을 측정하였다. 미세조류의 부착률과 성장률은 다음 공식으로 계산하였다.
부착률(%) = 부착된 미세조류 중량/총 미세조류 중량×100
성장률(%) = (n1-n0)/n0×100 (n1: 최종 수확량(㎎), n0: 최초 접종량(㎎))
그 결과 하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 동정한 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP가 다른 미세조류와 비교하여 성장률 및 부착률이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
미세조류의 최종 총 생체량(mg), 성장률 및 부착률(%)
미세조류 종류 최종 총 생체량 성장률 부착률
KMMCC 493 12.8±5.4ab 150±106.9e 14±1.9e
KMMCC 931 18.1±1.4a 363±36.2cd 44±3.5c
KMMCC 714 17.0±2.2ab 254±45.8de 66±6.1b
KMMCC 935 16.8±0.4ab 240±7.2de 39±11.1cd
KMMCC 716 16.8±0.4ab 430±11.2c 31±5.3cd
KMMCC 773 17.3±0.1ab 498±2.4bc 97±1.6a
KMMCC 823 12.1±1.6b 642±100.1a 24±10.9de
KMMCC 939 15.9±0.4ab 593±15.5ab 42±5.4c
KMMCC 941 22.9±1.9a 487±49.1c 64±7.5ab
KMMCC 905 25.3±4.4a 359±79.6c 43±2.6c
KMMCC 893 25.5±6.0a 843±222.7b 57±4.9b
KMMCC 17 26.1±4.5a 592±112.1bc 71±8.6a
KMMCC 919 23.2±1.1a 606±32.4bc 71±5.1a
KMMCC 957 21.3±0.1a 1,826±6.4a 69±5.1ab
KMMCC 841 23.2±1.1a 838±45.7b 72±0.2a
KMMCC 900 15.1±0.4a 262±30.1def 72±4.8bc
KMMCC 833 8.0±0.0c 217±25.4ef 69±1.8bc
KMMCC 267 13.7±0.7b 2,302±128.5a 24±3.6e
KMMCC 26 8.4±0.5c 161±3.6f 67±2.8c
KMMCC 962 16.1±0.5a 1,057±2.0b 30±1.3de
KMMCC 77 6.7±0.0d 901±53.9c 37±5.3d
KMMCC 847 6.2±0.3d 257±43.0def 77±3.9ab
KMMCC 628 8.4±0.1c 389±67.0d 80±2.4a
KMMCC 268 7.2±1.0cd 360±76.7de 36±0.9d
본발명의 신균주 13.6±1.8a 275±42.5b 69±12.1a
KMMCC 109 12.5±1.3a 432±44.6ab 17±1.0b
KMMCC 40 15.2±3.7a 593±149.0a 87±0.1a
KMMCC 30 10.1±0.7bc 676±52.6a 83±3.7a
KMMCC 34 7.7±2.8c 1,378±539.4a 11±4.8b
KMMCC 180 12.3±0.4ab 996±31.6a 6± 1.0b
<2-3> 본 발명에 따른 신균주를 먹이로 섭취한 참전복 유생의 부착률, 변태 율 및 생존율 측정
본 실험에서는 본 발명에 따른 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP의 참전복 유생에 대한 먹이효율을 알아보기 위하여, 본 발명에 따른 신균주를 먹이로 하여 배양된 참전복 유생의 부착률, 변태율 및 생존율을 측정하였다.
먼저 수온 21℃에서 난과 정자를 수정시킨 후 56시간이 지난 참전복 veliger 유생을 실험에 사용하였다. 본 발명의 신규주와 더불어 상기 실시예 <2-2>에서 부착률과 성장률이 높았던 8종 미세조류를 대상으로 조사하였다. f/2 배지 10 mL를 6-well tissue culture chamber에 넣고, 각 종의 미세조류를 약 10% 접종량 수준으로 접종한 후, 20℃, 40 μmol m-2s-1 연속조명하에서 10일간 정치배양하였다.
참전복 유생 실험은 각 미세조류가 배양, 부착된 챔버(chamber)를 유생 사육조로 사용하였다. 챔버(chamber)에 유생을 넣기 전, 배양액을 제거하고 남아 있는 배지의 성분을 없애기 위해서 부착된 미세조류가 탈락되지 않도록 여과해수로 충분히 행군 후, 10 mL의 여과해수를 채우고 유생을 30개체씩 접종하였다. 참전복 유생의 실험을 시작할 때 챔버(chamber)에 부착한 각 미세조류의 밀도는 약 5~10×104 cells/mL 되게 유지하였다. 유생은 20℃, 40 μmol m-2s-1, 광주기는 8(L):16(D) 조건에서 15일간 사육하였고 유생의 부착이 완료된 시점부터는 매일 5 mL 씩 여과해수로 교환해 주었다. 대조구로는 미세조류가 없이 여과해수만 채웠고 모든 실험구는 6반복으로 하였다.
참전복 유생의 부착 및 변태는 해부현미경으로 확인하였다. 면반으로 부착기질에 부착한 유생을 부착 개체로, 부착후 유각이 없어지고 주구각이 생긴 유생을 변태한 개체로 간주하였다. 유생의 변태가 진행되기에 충분한 시간이 흐른 후에도 변태가 되지 않은 유생은 모두 제거하였다. 유생의 부착률은 7반복, 변태율과 변태후 성존율은 2반복으로 조사하였다. 유생의 생존은 해부현미경으로 매일 체크하여 죽은 개체는 즉시 제거하였다. 10초 동안 어떤 움직임도 없어 고정되어있거나, 심장의 뜀을 관찰할 수 없는 개체는 죽은 개체로 간주하여 변태후 생존율을 측정하였다.
부착률(%) = (부착 직후 개체수 / 초기 접종 개체수) × 100
변태율(%) = (변태 직후 개체수 / 부착 직후 개체수) × 100
생존율 (%) = (생존 개체수 / 변태 직후 개체수) × 100
Figure 112011086628152-pat00002
그 결과 참전복 유생은 실험 시작 1 시간 후부터 부착기질에 대한 반응을 보이며 부착활동을 시작하였으며, 부착률은 전반적으로 12시간이 지났을 때 전 실험구에서 높게 나타나기 시작하여 24시간 때에는 기장 높았으며 그 이후에는 부착 유생의 사망으로 지속적으로 감소하는 경향을 보였다.
특히 본 발명의 신균주인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP를 먹이로 이용한 참전복 유생의 경우, 접종 후 96시간까지의 부착률이 타 미세조류에 비하여 가장 높았으며(표 5 참조), 접종 4일후의 변태율은 규조류인 Rhaphoneis sp.를 제외한 타 미세조류 중에서도 유의적으로 높게 나타났으며(도 2 참조), 15일간의 사육 후 유생 생존율도 Rhaphoneis sp. 다음으로 가장 높은 것으로 나타났다(도 3 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11962BP 20110614
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Pukyong National University <120> Novel Tetraselmis hazeni and Use Thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetraselmis hazeni KCTC 11962BP_gene sequence <400> 1 ggctcattaa atcagttata gtttatttga tggtacctac tactcggata accgtagtaa 60 ttctagagct aatacgtgcg taaatcccga cttctggaag ggacgtattt attagattta 120 aggccgaccg agctttgctc gtcttgcggt gaatcatgat aacttcacga atcgcatggc 180 ctccgcgccg gcgatgtttc attcaaattt ctgccctatc aatttgcgat ggtaggatag 240 aggcctacca tggtggtaac gggtgacgga gaattagggt tcgattccgg agagggagcc 300 tgagaaacgg ctaccacatc caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca 360 cagggaggta gtgacaataa ataacaatac cgggcttttc aagtctggta attggaatga 420 gtacaatcta aacaacctta acgaggatcc attggagggc aagtctggtg ccagcagccg 480 cggtaattcc agctccaata gcgtatattt aagttgctgc agttaaaaag ctcgtagttg 540 gatttcggat gggatttgcc ggtccgccgt ttcggtgtgc actggccagt cccatcttgt 600 tgtcggggac tagctcctgg gcttcactgt ccgggactag gagctgacga ggttactttg 660 agtaaattag agtgttcaaa gcaagcctac gctctgaata cattagcatg gaataacatg 720 ataggactct ggcttatctt gttggtctgt gagaccagag taatgattaa gagggacagt 780 cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa agacgaactt 840 ctgcgaaagc atttgtcaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg ggggctcgaa 900 gacgattaga tactgtccta gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga ttggcagacg 960 tttttttgac gactctgcca gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga 1020 gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc 1080 ctgcggctta atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata gtgaggattg 1140 acagattgag agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt 1200 gggttgcctt gtcaggttga ttccggtaac gaacgagacc tcagcctgct aaatagttac 1260 tcctactttg gtaggaggtg aacttcttag agggactatt ggcgtttagc caatggaagt 1320 gtgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact 1380 gatgcattca acgagcctag ccttgaccga gaggtccggg taatctttga aactgcatcg 1440 tgatggggct agattattgc aattattaat cttcaacgag gaatgcctag taagcgtgat 1500 tcatcagatc gcgttgatta cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gctcctaccg 1560 attgaatgtg ttggtgagga gttcggattg gcagtttgtg gtggttcgcc actgcttaca 1620 gctgagaagt tctccaaacc gccccattta gaggaaggag aagcgtaaca agg 1673

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포복성 해양무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼, 성게 및 군소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포복성 해양무척추동물은 참전복(Haliotis discus hannai)인 것을 특징으로 하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류.
  4. 제1항의 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 포복성 해양무척추동물 유생 배양용 사료 조성물.
  5. 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP 미세조류를 배양하는 단계;
    상기 배양이 이루어진 배양기에서 배양액만을 제거하고 여과해수를 채우는 단계; 및
    상기 여과해수를 채운 배양기에 포복성 해양무척추동물 유생을 접종하는 단계를 포함하는, 포복성 해양무척추동물 유생의 배양방법.
  6. 20~28℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 미세조류인 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni) KCTC 11962BP의 대량배양 방법.
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