CN101955526A - 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 - Google Patents
大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101955526A CN101955526A CN2010102913410A CN201010291341A CN101955526A CN 101955526 A CN101955526 A CN 101955526A CN 2010102913410 A CN2010102913410 A CN 2010102913410A CN 201010291341 A CN201010291341 A CN 201010291341A CN 101955526 A CN101955526 A CN 101955526A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mstn
- propetide
- solution
- yellow croaker
- large yellow
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体及制备方法，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示，该前肽可以结合大黄鱼肌肉生长抑制素的功能区域，抑制肌肉生长抑制素的活性，促进大黄鱼的肌肉生长；大黄鱼MSTN-1前肽抗体可与该前肽结合，阻断该前肽与大黄鱼MSTN-1成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌肉的生长；大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体的制备通过RNA提取、cDNA合成、目的片段制备、目的片段纯化、目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽基因制备、pET-28a质粒的抽提和酶切、前肽基因-pET-28a-BL21载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽制备及该前肽的免疫应答反应，可以得到大量的大黄鱼MSTN-1前肽和纯度较高的前肽抗体。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类肌肉生长抑制素，具体涉及体外表达的大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体及制备方法。
背景技术
肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）属转化生长因子-β(Transfoming growth factor-β，TGF-β)超家族，是一个重要的肌细胞生长调控因子，主要功能是负调控肌细胞的生长和分化。美国学者McPherron等在1997年首次克隆到该基因，并证实MSTN基因敲除的小鼠，其骨骼肌重量明显增加，是正常野生型小鼠的2-3倍左右。MSTN 基因编码序列的自然突变造成了比利时兰牛(Belgian blue) 和皮尔蒙特牛( Piedmontese ) 的双肌臀现象，进一步证明MSTN基因的功能。MSTN包含N端的前肽和C端的成熟肽，在动物体内前肽可与成熟肽二聚体结合，从而抑制MSTN的功能，促进动物的生长。目前对鱼类MSTN 基因有研究报道，如授权公告号为CN100347298的发明专利公开了花鲈的MSTN基因（4873bp）克隆及载体构建，通过设计引物，扩增该基因的一个3.2KB长片段和一个1.5KB短片段，依次连接pBS+KS载体上，再在长片段与短片段之间连接正标记基因，在长片段侧翼连接负标记基因。但对鱼类MSTN基因体外表达研究很少，尤其是大黄鱼存在两种类型的肌肉生长抑制素，即大黄鱼Ⅰ型肌肉生长抑制素（大黄鱼MSTN-1）和大黄鱼Ⅱ型肌肉生长抑制素（大黄鱼MSTN-2），大黄鱼MSTN-1主要在肌肉组织中表达，而大黄鱼MSTN-2主要在脑组织中表达；我们克隆的大黄鱼MSTN-1基因序列的登录号为AY842933，该基因包括三个外显子，从109 bp -1239 bp（含有一个终止子）编码具有376个氨基酸的大黄鱼MSTN-1，它包括一个信号肽序列（1-22氨基酸残基），一个TGF-β前肽结构域（41-256氨基酸残基），一个RXXR蛋白酶水解位点（264-267氨基酸残基）和一个TGF-β成熟肽结构域（282-376氨基酸残基），其中最保守的区域为TGF-β成熟肽结构域，含有9个保守的半胱氨酸位点；对大黄鱼MSTN-1前肽的体外表达从未有研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供大黄鱼MSTN-1前肽，该前肽可以与大黄鱼MSTN-1的成熟肽结合，抑制肌肉生长抑制素的活性，从而促进大黄鱼肌肉的生长。
本发明还提供了前肽抗体，该前肽抗体可与上述前肽结合，阻断上述前肽与大黄鱼MSTN-1成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌肉的生长。
本发明又提供了上述前肽和前肽抗体的制备方法，该制备方法可以得到纯度较高的大黄鱼MSTN-1前肽，通过免疫学方法，可获得大黄鱼MSTN-1前肽抗体。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：大黄鱼MSTN-1前肽，其特征在于该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
大黄鱼MSTN-1前肽抗体，其特征在于该前肽抗体为上述大黄鱼MSTN-1前肽免疫应答反应的血液中分离得到的血清。
大黄鱼MSTN-1前肽的制备方法，包括下述步骤：
1）引物设计：依据登录号为AY842933的大黄鱼肌肉生长抑制素基因序列，大小为1906bp，根椐编码大黄鱼MSTN-1前肽的核苷酸序列设计引物，正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其中正向引物含BamH I酶切位点，反向引物含Hind Ⅲ酶切位点；正反向引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
2）RNA提取：取100mg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol溶液研磨成匀浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0.2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0.5ml异丙醇，冰上置10min，12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混匀后7500rpm离心5min，弃上清液，室温下干燥5-10min，加入30μl水溶解，得到RNA溶液，-70℃保存；
3）cDNA合成：上述RNA溶液用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒逆转录得到cDNA溶液，逆转录反应条件：42℃，60 min；70℃，15 min，cDNA溶液在-20℃保存备用；具体逆转录方法按该逆转录试剂盒的操作说明进行；
4）目的片段制备：对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为：浓度为2.5mmol/L的10×Buffer溶液2.5μl，浓度为2.5mmol/L的dNTP溶液2.0μl，浓度为25mmol/L的 MgCl2溶液1.5μl，上述cDNA溶液1μl，上述正向引物和反向引物各0.5μl，Taq酶0.2μl，用PCR水补足至25μl，扩增反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，循环30次，72 ℃延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；该目的片段为MSTN-1基因序列中193 bp前连接26bp正向引物，859 bp后连接25 bp反向引物的重组序列；
5）目的片段纯化：上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的纯化液；具体纯化操作步骤按该纯化试剂盒的操作说明进行；
6）目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建：取上述含目的片段的纯化液2.25μl置于PCR管中，加入pMD18-T质粒0.25μl和solutionⅠ溶液2.5μl，组成连接反应液，16℃连接3小时，构建得到含目的片段-pMD18-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到50μl感受态细胞DH5α中，冰上放置30min，然后42℃水浴90s，立刻放冰上4min，然后加入300μl LB液体培养基，在摇床中37℃震荡培养1h得到培养液，摇床转速为150rpm，取120μl培养液涂于含氨苄的平板中，37℃培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含氨苄的LB液体培养基中过夜扩大培养，该含氨苄的LB液体培养基中氨苄的终浓度为100μg/ml，得到含目的片段-pMD18-T-DH5α的培养物，并测序验证；
7）大黄鱼MSTN-1前肽基因制备：将上述培养物用质粒提取试剂盒抽提，得到含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液，抽提方法依质粒提取试剂盒的操作说明进行，取含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液32μl置于PCR管中，加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer溶液 4μl，37℃酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的酶切液，该酶切液先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-1前肽基因的琼脂条，放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-1的前肽基因纯化液，该大黄鱼MSTN-1前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
8）pET-28a表达质粒的抽提和酶切：将过夜培养的pET-28a-DH5α表达质粒菌液用质粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET-28a表达质粒的抽提液32μl, BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer 溶液4μl，37℃酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET-28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切下目的条带，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切之后的pET-28a表达质粒纯化液；
9）前肽基因-pET-28a- BL21载体构建：取上述大黄鱼MSTN-1前肽基因纯化液7μl，上述pET-28a表达质粒纯化液1μl，T4 DNA ligase溶液1μl，10×T4 DNA ligase buffer溶液 1μl，16℃连接过夜，然后转化到感受态DH5α中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养的菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1：50的比例进行扩大培养，37℃振摇培养3 h～4 h，得到含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液，上述含卡那霉素的LB液体培养基的卡那霉素终浓度为30μg/ml；
10）大黄鱼MSTN-1前肽制备：在含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液加入浓度为1mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液，使其终浓度为0.5mmol/L，诱导表达培养3 h收集菌液，4℃ 10000rpm离心5 min，收集菌体，将菌体先用浓度0.01mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后5000rpm离心10 min，洗涤离心重复3次，得到去杂菌体，用His.Bind Purification Kit纯化试剂盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到大黄鱼MSTN-1前肽溶液，末端测序验证，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，-20℃冰箱保存备用。
大黄鱼MSTN-1前肽抗体制备：用等体积的弗氏佐剂将上述大黄鱼MSTN-1前肽溶液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四次注射免疫反应，各次注射的间隔时间为一周，首次注射量为100-200μg/只，第二、三四次注射量都为20-40μg/只，第四次注射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37℃放置20min，然后置于4℃冰箱过夜，将过夜的血液用4000rpm离心10min，取上清即为前肽抗体血清。
上述Trizol溶液、IPTG溶液、PBS缓冲液、LB液体培养基、含氨苄的平板、弗氏佐剂、EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购于上海生工生物工程技术服务有限公司；其中LB液体培养基组成成份：Tryptone 1g，Yeast Extract 0.5 g，NaCl 1g，ddH2O至100 ml， pH为7.0；含氨苄的平板的组成为Tryptone 1g，Yeast Extract 0.5 g，NaCl 1g，琼脂粉A 1.5 g，ddH2O至100 ml，调pH至7.0，加氨苄使其终浓度为100μg/mll。
上述PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、10×Buffer溶液、Taq酶、dNTP溶液、pMD18-T质粒、solutionⅠ溶液、BamH Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶、10×K buffer溶液、T4 DNA ligase溶液、10×T4 DNA ligase buffer溶液均购于大连宝生物工程有限公司。
感受态DH5α、pET-28a-DH5α表达质粒菌液和感受态BL21均购于北京天恩泽基因科技有限公司。
His.Bind Purification Kit纯化试剂盒购于Novagen公司。
与现有技术相比，本发明的优点大黄鱼MSTN-1前肽，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，该前肽可以结合大黄鱼肌肉生长抑制素的功能区域，抑制肌肉生长抑制素的活性，促进大黄鱼的肌肉生长。大黄鱼MSTN-1前肽抗体可与该前肽结合，阻断该前肽与大黄鱼MSTN-1成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌肉的生长。大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体的制备通过RNA提取、cDNA合成、目的片段制备、目的片段纯化、目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽基因制备、pET-28a质粒的抽提和酶切、前肽基因-pET-28a- BL21载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽制备及该前肽的免疫应答反应，可以得到大量的大黄鱼MSTN-1前肽和纯度较高的前肽抗体，本发明的大黄鱼MSTN-1前肽可以增加大黄鱼的肌肉量，本发明的前肽抗体可以抑制前肽的作用，因而前肽和前肽抗体具有互相调节大黄鱼肌肉发育和生长的功能，如用本发明的前肽抗体注射大黄鱼幼鱼，一月后的称量，注射前肽抗体的大黄鱼比未注射的大黄鱼体重轻8.4%左右。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例
大黄鱼Ⅰ型肌肉生长抑制素前肽和前肽抗体的制备方法：
1）引物设计：依据登录号为AY842933的大黄鱼Ⅰ型肌肉生长抑制素基因序列，大小为1906bp，根椐发明要求设计扩增MSTN-1前肽基因的引物，正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其中正向引物含BamH I酶切位点，反向引物含Hind Ⅲ酶切位点；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
2）RNA提取：取100mg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol溶液研磨成匀浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0.2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0.5ml异丙醇，冰上置10min，12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混匀后7500rpm离心5min，弃上清液，室温下干燥5-10min，加入30μl水溶解，得到RNA溶液，-70℃保存；
3）cDNA合成：上述RNA溶液用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒逆转录得到逆转录cDNA溶液，具体逆转录方法按该逆转录试剂盒的操作说明进行：在Microtube管中，加Oligo dT Primer（50μM）lμl，dNTP Mixture（10mM each）1μl，Total RNA 2μl，最后加RNase free dH2O至10μl，配制成混合液；在PCR仪上65℃变性处理5min，然后冰上急冷退火；再在上述Microtube管中加入5×PrimeScriptTM Buffer 4μl，RNase Inhibitor（40 U/μl）0.5μl ，PrimeScriptTM RTase（200 U/μl）1μl，RNase Free dH2O 4.5μl，总体积为 20μl；在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃，60 min；70℃，15 min，最后-20℃保存；
4）目的片段制备：对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为：浓度为2.5mmol/L的10×Buffer溶液2.5μl，浓度为2.5mmol/L的dNTP溶液2.0μl，浓度为25mmol/L的 MgCl2溶液1.5μl，上述cDNA溶液1μl，上述正向引物和反向引物各0.5μl，Taq酶0.2μl，用PCR水补足至25μl，扩增反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，循环30次，72 ℃延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；
5）目的片段纯化：上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的纯化液，纯化的目的片段溶于30μl的Elution buffer，保存于-20 ℃备用；具体纯化操作步骤按该纯化试剂盒的操作说明进行；
6）目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建：取上述含目的片段的纯化溶液2.25μl置于PCR管中，加入pMD18-T质粒0.25μl和solutionⅠ溶液2.5μl，组成连接反应液，16℃连接3小时，构建得到含目的片段-pMD18-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到50μl感受态细胞DH5α中，冰上放置30min，然后42℃水浴90s，立刻放冰上4min，然后加入300μl LB液体培养基，在摇床中37℃震荡培养1h得到培养液，摇床转速为150rpm，取120μl培养液涂于含氨苄的平板中，37℃培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含氨苄的LB液体培养基中过夜扩大培养，培养基中氨苄终浓度为100μg/ml，得到含目的片段-pMD18-T-DH5α的培养物，并测序验证，经比对没有基因突变、缺失和增补等异常情况存在，可以进行下一步实验；
7）大黄鱼MSTN-1前肽基因制备：经测序验证后的培养物用质粒提取试剂盒抽提，得到含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液，抽提方法依质粒提取试剂盒说明书进行，取含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液32μl置于PCR管中，加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer溶液 4μl，37℃酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的酶切液，该酶切液先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-1前肽基因的琼脂条，放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-1的前肽基因纯化液，测序，该大黄鱼MSTN-1前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
8）pET-28a表达质粒的抽提和酶切：将过夜培养的pET-28a-DH5α表达质粒菌液用质粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET-28a表达质粒的抽提液32μl, BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer 溶液4μl，37℃酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET-28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切下目的条带，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切之后的pET-28a表达质粒纯化液，抽提和纯化方法依说明书进行；
9）前肽基因-pET-28a- BL21载体构建：取上述大黄鱼MSTN-1前肽基因纯化液7μl，上述pET-28a表达质粒纯化液1μl，T4 DNA ligase溶液1μl，10×T4 DNA ligase buffer溶液 1μl，16℃连接过夜，然后转化到感受态DH5α中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，培养基的卡那霉素终浓度为30μg/ml，过夜培养的菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1：50的比例进行扩大培养，37℃振摇培养3 h～4 h，得到大量的含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液；
10）大黄鱼MSTN-1前肽制备：在含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液加入浓度为1mol/L的IPTG溶液，使其终浓度为0.5mmol/L，诱导表达培养3 h收集菌液，4℃ 10000rpm离心5 min，收集菌体，将菌体先用浓度0.01mol/L、PH7.4的PBS缓冲液洗涤，然后5000rpm离心10 min，洗涤离心重复3次，得到去杂菌体，用His.Bind Purification Kit纯化试剂盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到大黄鱼MSTN-1前肽溶液，末端测序验证，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，-20℃冰箱保存备用；
11）大黄鱼MSTN-1前肽抗体制备：用等体积的弗氏佐剂将上述大黄鱼MSTN-1前肽溶液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四次注射免疫反应，各次注射的间隔时间为一周，首次注射量为100-200μg/只，第二、三四次注射量都为20-40μg/只，第四次注射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37℃放置20min，然后置于4℃冰箱过夜，将过夜的血液用4000rpm离心10min，取上清即为前肽抗体血清；
12）前肽抗体的West blotting鉴定：按照Western blot试剂盒进行免疫印迹实验，检测该抗体，100V转膜2h，一抗与封闭液的比例1:1000，二抗与封闭液的比例为1:10000，显色后在31KDa处出现棕色条带，说明抗体制备成功。
试验例
用体重为10.5±2.4克的养殖大黄鱼20尾，随机分成实验组10尾和对照组10尾，实验组腹腔注射本发明的大黄鱼Ⅰ型肌肉生长抑制素前肽抗体，注射量每尾100μl 抗体溶液（含20 μl抗体），对照组注射等量的生理盐水，同样条件下养殖1月，称重，实验组的体重为14.1±3.6克，对照组的体重为15.4±3.9克，实验组比对照组轻8.4%。
<110>宁波大学
<120>大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体及制备方法
<160>4
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>702
<212>cDNA
<213>大黄鱼肌肉
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(702)
<223>大黄鱼MSTN-1前肽基因
<400>1
Gaccaagagacgcaccagcaaccctccgccaccagcccagaagacacggaccagtgcgct 60
AspGlnGluThrHis GlnGlnProSerAla ThrSerProGluAsp ThrAspGlnCysAla
1 5 10 15 20
acctgcgaggttcggcagcaaattaaaaccatgcgattaaacgccataaaatcccagatt 120
ThrCysGluValArg GlnGlnIleLysThrMetArgLeuAsnAla IleLysSerGlnIle
25 30 35 40
ttgagcaagctgcgaatgaaagaagctcctaatatcagccgagacatagtgaagcagctc 180
LeuSerLysLeuArgMetLysGluAlaProAsnIleSerArgAsp IleValLysGlnLeu
45 50 55 60
ctgcccaaagcgccaccgctgcagcagcttctcgaccagtacgacgtgctgggagatgac 240
LeuProLysAlaPro ProLeuGlnGlnLeuLeuAspGlnTyrAspValLeuGlyAspAsp
65 70 75 80
aacagggatgtggttatggaggaggacgatgagcatgccatcacggagacaataatgatg 300
AsnArgAspValValMetGluGluAspAsp GluHisAlaIleThr GluThrIleMetMet
85 90 95 100
atggctactgaacccgagtccgtcgtccaagtggatgaggaaccaaagtgctgctttttc 360
MetAlaThrGluProGluSerValValGln ValAspGluGluPro LysCysCysPhePhe
105 110 115 120
tcttttactcaaaag tttcaagccaatcgaatagtccgggcgcagctctgggtgtatctg 420
SerPheThrGlnLysPheGlnAlaAsnArgIleValArgAlaGln LeuTrpValTyrLeu
125 130 135 140
cgctcgtcgaacgaagcgaccactgtgttcctgcaaatctcccgcctgatgccggtcaca 480
ArgSerSerAsnGlu AlaThrThrValPheLeuGlnIleSerArgLeuMetProValThr
145 150 155 160
gacgggagcaggcacatacgcatccgctccctgaagatcgacgtgaatgccggggtcagc 540
AspGlySerArg HisIleArg IleArgSer LeuLysIleAspVal AsnAlaGlyValSer
165 170 175 180
tcttggcaaagtatagacgtcaaacaagtgttgagtgtgtggctgcggcagccggagacc 600
SerTrpGlnSerIle AspValLysGlnValLeuSerValTrpLeu ArgGlnProGluThr
185 190 195 200
aactggggcatcgagattaacgccttcgattcgaggggaaatgacttggccgtgacctct 660
AsnTrpGlyIleGlu IleAsnAlaPheAspSerArgGlyAsnAsp LeuAlaValThrSer
205 210 215 220
gcggagcctggagaggaaggactgcaaccgttcatggaggtg 702
AlaGluProGly GluGluGlyLeuGlnPro PheMetGluVal
225 230 234
<210>2
<211>234
<212>蛋白质
<220>
<223>大黄鱼MSTN-1前肽
<400>2
AspGlnGluThrHisGlnGlnProSerAlaThrSerProGluAspThrAspGlnCysAla
1 5 10 15 20
ThrCysGluValArgGlnGlnIleLysThrMetArgLeuAsnAlaIleLysSerGlnIle
25 30 35 40
LeuSerLysLeuArgMetLysGluAlaProAsnIleSerArgAspIleValLysGlnLeu
45 50 55 60
LeuProLysAlaProProLeuGlnGlnLeuLeuAspGlnTyrAspValLeuGlyAspAsp
65 70 75 80
AsnArgAspValValMetGluGluAspAspGluHisAlaIleThrGluThrIleMetMet
85 90 95 100
MetAlaThrGluProGluSerValValGlnValAspGluGluProLysCysCysPhePhe
105 110 115 120
SerPheThrGlnLysPheGlnAlaAsnArgIleValArgAlaGlnLeuTrpValTyrLeu
125 130 135 140
ArgSerSerAsnGluAlaThrThrValPheLeuGlnIleSerArgLeuMetProValThr
145 150 155 160
AspGlySerArgHisIleArgIleArgSer LeuLysIleAspVal AsnAlaGlyValSer
165 170 175 180
SerTrpGlnSerIleAspValLysGlnValLeuSerValTrpLeuArgGlnProGluThr
185 190 195 200
AlaGluProGlyGluGluGlyLeuGlnProPheMetGluVal
225 230 234
<210>3
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据编码大黄鱼MSTN-1前肽的核苷酸序列设计的正向引物
<400>3
5’-CGGGATCCGA CCAAGAGACG CACCAG-3’ 26
<210>4
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据编码大黄鱼MSTN-1前肽的核苷酸序列设计的反向引物
<400>4
5’-CCAAGCTTCA CCTCCTAGAA CGGTT-3’ 25
Claims (4)
1.大黄鱼MSTN-1前肽，其特征在于该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.利用权利要求1所述的大黄鱼MSTN-1前肽制备得到的大黄鱼MSTN-1前肽抗体，其特征在于该前肽抗体为所述大黄鱼MSTN-1前肽免疫应答反应的血液中分离得到的血清。
3.权利要求1所述的大黄鱼MSTN-1前肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1）引物设计：依据登录号为AY842933的大黄鱼肌肉生长抑制素基因序列，大小为1906bp，根椐编码大黄鱼MSTN-1前肽的核苷酸序列设计引物，正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其中正向引物含BamH I酶切位点，反向引物含Hind Ⅲ酶切位点；
2）RNA提取：取100mg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol溶液研磨成匀浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0.2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0.5ml异丙醇，冰上置10min，12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混匀后7500rpm离心5min，弃上清液，室温下干燥5-10min，加入30μl水溶解，得到RNA溶液，-70℃保存；
3）cDNA合成：上述RNA溶液用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒逆转录得到cDNA溶液，逆转录反应条件：42℃，60 min；70℃，15 min，cDNA溶液在-20℃保存备用；
4）目的片段制备：对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为：浓度为2.5mmol/L的10×Buffer溶液2.5μl，浓度为2.5mmol/L的dNTP溶液2.0μl，浓度为25mmol/L的 MgCl2溶液1.5μl，上述cDNA溶液1μl，上述正向引物和反向引物各0.5μl，Taq酶0.2μl，用PCR水补足至25μl，扩增反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，循环30次，72 ℃延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；
5）目的片段纯化：上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的纯化液；
6）目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建：取上述含目的片段的纯化液2.25μl置于PCR管中，加入pMD18-T质粒0.25μl和solutionⅠ溶液2.5μl，组成连接反应液，16℃连接3小时，构建得到含目的片段-pMD18-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到50μl感受态细胞DH5α中，冰上放置30min，然后42℃水浴90s，立刻放冰上4min，然后加入300μl LB液体培养基，在摇床中37℃震荡培养1h得到培养液，摇床转速为150rpm，取120μl培养液涂于含氨苄的平板中，37℃培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含氨苄的LB液体培养基中过夜扩大培养，该含氨苄的LB液体培养基中氨苄的终浓度为100μg/ml，得到含目的片段-pMD18-T-DH5α的培养物，并测序验证；
7）大黄鱼MSTN-1前肽基因制备：将上述含目的片段-pMD18-T-DH5α的培养物用质粒提取试剂盒抽提，得到含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液，取含目的片段-pMD18-T质粒的抽提液32μl置于PCR管中，加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer溶液 4μl，37℃酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的酶切液，该酶切液先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-1前肽基因的琼脂条，放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的纯化液，该大黄鱼MSTN-1前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
8）pET-28a表达质粒的抽提和酶切：将过夜培养的pET-28a-DH5α表达质粒菌液用质粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET-28a表达质粒的抽提液32μl, BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶各2μl，10×K buffer 溶液4μl，37℃酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET-28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切下目的条带，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切之后的pET-28a表达质粒纯化液；
9）前肽基因-pET-28a- BL21载体构建：取上述大黄鱼MSTN-1前肽基因纯化液7μl，上述pET-28a表达质粒纯化液1μl，T4 DNA ligase溶液1μl，10×T4 DNA ligase buffer溶液 1μl，16℃连接过夜，然后转化到感受态DH5α中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养的菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1：50的比例进行扩大培养，37℃振摇培养3 h～4 h，得到含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液，上述含卡那霉素的LB液体培养基的卡那霉素终浓度为30μg/ml；
10）大黄鱼MSTN-1前肽制备：在含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液加入浓度为1mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液，使其终浓度为0.5mmol/L，诱导表达培养3 h收集菌液，4℃ 10000rpm离心5 min，收集菌体，将菌体先用浓度0.01mol/L、PH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，然后5000rpm离心10 min，洗涤离心重复3次，得到去杂菌体，用His.Bind Purification Kit纯化试剂盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到大黄鱼MSTN-1前肽溶液，末端测序验证，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，-20℃冰箱保存备用。
4.权利要求2所述的大黄鱼MSTN-1前肽抗体制备方法，其特征在于用等体积的弗氏佐剂将所述的大黄鱼MSTN-1前肽的溶液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四次注射免疫反应，各次注射的间隔时间为一周，首次注射量为100-200μg/只，第二、三四次注射量都为20-40μg/只，第四次注射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37℃放置20min，然后置于4℃冰箱过夜，将过夜的血液用4000rpm离心10min，取上清即为前肽抗体血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102913410A CN101955526A (zh) | 2010-09-26 | 2010-09-26 | 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102913410A CN101955526A (zh) | 2010-09-26 | 2010-09-26 | 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101955526A true CN101955526A (zh) | 2011-01-26 |
Family
ID=43483141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102913410A Pending CN101955526A (zh) | 2010-09-26 | 2010-09-26 | 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101955526A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103160497A (zh) * | 2013-04-07 | 2013-06-19 | 北京市水产科学研究所 | 一种快速提取鱼类总rna的方法 |
| CN105341531A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 绍兴文理学院 | 一种促进河虾生长的生物制剂及其应用方法 |
| CN107827968A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 山东省海洋生物研究院 | 一种从六线鱼中分离的多肽 |
| CN113679827A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-11-23 | 华南农业大学 | 一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144092A (zh) * | 2006-09-14 | 2008-03-19 | 天津市畜牧兽医研究所 | 应用基因工程技术培育“双肌”肉羊的方法 |
-
2010
- 2010-09-26 CN CN2010102913410A patent/CN101955526A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144092A (zh) * | 2006-09-14 | 2008-03-19 | 天津市畜牧兽医研究所 | 应用基因工程技术培育“双肌”肉羊的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《Mol Biol Rep》 20061231 Liangyi Xue, et al. Molecular cloning and characterization of the myostatin gene in croceine croaker, Pseudosciaena crocea. 129-136 第33卷, * |
| 《水产科学》 20081031 薛良义，等 大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I遗传多态性分析 503-506 第27卷, 第10期 * |
| LIANGYI XUE, ET AL.: "Molecular cloning and characterization of the myostatin gene in croceine croaker, Pseudosciaena crocea.", 《MOL BIOL REP》 * |
| 赵同峰，等: "人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体的构建", 《重庆医学》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103160497A (zh) * | 2013-04-07 | 2013-06-19 | 北京市水产科学研究所 | 一种快速提取鱼类总rna的方法 |
| CN105341531A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 绍兴文理学院 | 一种促进河虾生长的生物制剂及其应用方法 |
| CN105341531B (zh) * | 2015-11-30 | 2019-03-05 | 绍兴文理学院 | 一种促进河虾生长的生物制剂及其应用方法 |
| CN107827968A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 山东省海洋生物研究院 | 一种从六线鱼中分离的多肽 |
| CN107827968B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-11-03 | 山东省海洋生物研究院 | 一种从六线鱼中分离的多肽 |
| CN113679827A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-11-23 | 华南农业大学 | 一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101492661B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备 | |
| CN103614386B (zh) | 盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 | |
| CN101955526A (zh) | 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 | |
| CN102181453A (zh) | 一种与欧美杨花药发育相关MYB基因PeMYB103及其RNAi载体 | |
| CN110408624A (zh) | 一种菲律宾蛤仔c型凝集素蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN107937408B (zh) | 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用 | |
| CN111763253B (zh) | 染色质重塑因子iswi、编码基因和在烟粉虱med隐种温度耐受性中的作用 | |
| WO2014089950A1 (zh) | 一种从水稻种子生产重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法 | |
| CN108588089A (zh) | 嘉宝果myb转录因子McMYB与李bHLH转录因子PsbHLH及其应用 | |
| CN100489098C (zh) | 鹅B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用 | |
| CN104212779A (zh) | 一种新型核糖核酸酶a及其纯化生产工艺 | |
| CN101824435A (zh) | 一种罗非鱼神经肽y重组蛋白的表达系统 | |
| CN107602686B (zh) | 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽 | |
| CN100404680C (zh) | 鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用 | |
| CN102533683B (zh) | 毛竹紫黄质脱环氧化酶PeVDE蛋白，编码该蛋白的基因和应用 | |
| CN101538318A (zh) | 一种信号肽及其编码基因与应用 | |
| CN100529059C (zh) | 一种促进动物生长的口服重组dna疫苗及应用 | |
| CN103045623A (zh) | 一种罗非鱼激活素受体ⅱb重组蛋白的制备方法及其应用 | |
| CN104561040B (zh) | 植物抗热基因htt3及其应用 | |
| CN102993309A (zh) | 一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用 | |
| CN102121010B (zh) | 暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用 | |
| CN104928307A (zh) | 一种茎瘤芥硫苷酶基因myr1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法 | |
| CN102021188A (zh) | 白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途 | |
| CN101693739A (zh) | 绿原酸合成相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101475644A (zh) | 具有抗炎作用的新型靶向融合蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110126 |