CN110408624A - 一种菲律宾蛤仔c型凝集素蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白及其制备方法及应用，属于分子生物学技术领域。本发明所述菲律宾蛤仔C型凝集素的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO.2所示，制备菲律宾蛤仔C型凝集素的方法主要包括：(1)重组表达质粒的制备；(2)菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白的表达以及纯化；(3)凝集素蛋白的复性。所述菲律宾蛤仔C型凝集素具有对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌高效的抑菌性能，尤其针对大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌性能。

Description

一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白及其制备方法与应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
到目前为止，越来越多的C型凝集素被学者发现，以及它们在功能方面的研究也积累的比较丰富[1]。如，(1)识别微生物。C型凝集素作为PPR家族的重要的识别分子，它能通过识别病原微生物细胞表面上的多种PAMPs，进而识别微生物并与之结合，Collectin亚家族的MBL能识别肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)[2,3]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[4]、HIV病毒[5]等。而具有更广泛识别能力的TypeHreceptors家族的DC-SIGN，它能识别寄生虫[6]、细菌[7]、病毒[8]和真菌[9]。(2)促进吞噬作用。如，同样在菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)中发现MCL-4凝集素能够提高血细胞的吞噬率[10],小龙虾(Pacifastacus leniusculus)的C型凝集素能对琼脂糖凝胶颗粒的包囊化起促进作用[11]。(3)凝集作用。凡纳滨对虾的C型凝集素能对多种动物的血红细胞起到凝集的作用，如大鼠血红细胞、兔血红细胞等[12]。同样海参(Holothuria grisea)的C型凝集素也具有凝集作用，它能够凝集兔的血红细胞[13]。(4)抑菌活性。相关研究表明，一些无脊椎动物的C型凝集素具有杀菌作用，能抑制微生物的生长，甚至有的C型凝集素能够直接杀死微生物。如文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中发现的C型凝集素AmphiCTL1具有杀菌的作用，它能直接杀死酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)和金黄葡萄球菌[14]。
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发明内容
因此，本发明利用原核重组表达和亲和层析的方法纯化出菲律宾蛤仔C型凝集素RpCTL，进而检测其抑菌和杀菌活性。
本发明提供了一种菲律宾蛤仔C型凝集素基因，所述C型凝集素的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白，所述C型凝集素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种的菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)以菲律宾蛤仔cDNA为模板，用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pEASY-T1构建成复合物pEASY-T1-RpCTL，转化到大肠杆菌TANS5α中扩增，将pEASY-T1-RpCTL和载体PET-30a分别用限制性内切酶SallⅠ和Not I进行酶切，分别回收500bp和100bp的片段，纯化后将这两个片段通过T4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET-30a-RpCTL；
(2)将步骤(1)得到的重组表达载体pET-30a-RpCTL转化到Tansetta(DE3)，于37℃在营养琼脂固体培养基上培养12h，选择阳性转化子作为模板进行PCR扩增，经测序确保插入后，阳性转化子在含卡那霉素的LB培养基中震荡培养，当菌液OD 600达到0.4-0.6时，将IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)加入培养基中，继续培养4小时后离心收集菌体，加入PBS将沉淀悬浮后，将菌液置于冰上超声破碎至澄清，离心，沉淀物即为纯化后的RpCTL；
(3)将步骤(2)纯化后的RpCTL采用透析技术通过逐渐降低蛋白溶液中的尿素浓度进行蛋白复性，即得到序列表中SEQ ID NO.2所述的菲律宾蛤仔C型凝集素。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中采用T4 DNA连接酶的连接温度为36-38℃，时间为4-5h。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中卡那霉素的浓度为500mg/ml。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中IPTG的浓度为1mmg/ml。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中两次离心的条件均为4℃，12000rpm、15min。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中透析技术的透析液体系为：50mM的Tris-HCL；质量体积比为1％的Glycin(甘氨酸)；1mM的EDTA(乙二胺四乙酸)；体积比为10％的Glycerin(甘油)；50mM的NaCl；2mM的Reduced Glutathione(还原型谷胱甘肽)；0.02mM的Oxidized Glutathione(氧化型谷胱甘肽)；所述尿素浓度依次为6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中透析技术的透析条件为4℃，pH＝8.0，12h。
本发明还提供了一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白在制备抑菌剂中的应用。
进一步地，上述技术方案中，所述抑菌剂为革兰氏阳性菌抑菌剂和革兰氏阴性菌抑菌剂。
进一步地，上述技术方案中，所述革兰氏阳性菌抑菌剂包括金黄色葡萄球菌抑菌剂、枯草芽孢杆菌抑菌剂。
进一步地，上述技术方案中，所述革兰氏阴性菌抑菌剂包括鳗弧菌抑菌剂、大肠杆菌抑菌剂。
发明有益效果
本专利为提取出的RpCTL为首次通过原核表达方法获得菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白，本发明的有益效果是：具有一定的抑菌的效果，对革兰氏阴性菌(鳗弧菌和大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)均具有一定的抑菌作用。本发明对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长具有一定的抑制作用。
附图说明
图1为菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白SDS-PAGE电泳图；(A)M：蛋白分子Marker，泳道1:未经IPTG诱导的PET30a裂解的蛋白电泳；泳道2：IPTG诱导37℃PET30a转化大肠杆菌裂解物；(B)泳道M：蛋白质MarKer，泳道1-3：分别含有80mM、100mM和150mM咪唑的洗脱液纯化的蛋白质。
图2为菲律宾蛤仔C型凝集素的抑菌活性测试(A)：大肠杆菌；(B)：鳗弧菌；(C)：金黄色葡萄球菌；和(D)：枯草芽孢杆菌。
图3为菲律宾蛤仔C型凝集素对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制活性：(A)枯草芽孢杆菌、(B)大肠杆菌。
图4为注射菲律宾蛤仔C型凝集素对鳗弧菌感染后菲律宾蛤仔存活率的测定。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1 pET-30a(+)重组载体的构建
本发明采用的原核重组表达载体为pET-30a(+)和pEASY-T1(TransGen CT101-01)载体。本发明构建的pET-30a(+)重组表达载体表达的产物带有由6个His组成的标签，便于纯化。
1.在目的基因(RpCTL基因)特异的正向引物SEQ ID NO.3：RpCTL-F：ACGCGTCGACTCTACAAGAAATGTTCGAAAT和反向引物SEQ ID NO.4：RpCTL-R：ATAAGAATGCGGCCGCAAGCAGTTTCACTATTTC的5’端分别加上特定的内切酶位点(Sal I和Not I)根据具体基因序列选定合适的内切酶位点，用于扩增目的基因的片段(目的基因的分子量为490bp)；
2.将PCR扩增的目的片段通过胶回收试剂盒(Sangon)纯化回收，然后连接pEASY-T1载体，转化E.coli 5α感受态细胞，PCR反应筛选阳性克隆，利用质粒抽提试剂盒(Sangon)提取质粒；所述PCR反应的总反应体系为26μl，其中ExTaq：0.25μl、、SEQ ID NO.3：RpCTL-F：1.5μl(浓度为10μg/ml)、SEQ ID NO.4：RpCTL-R：1.5μl(浓度为10μg/ml)、10×Buffer：2.5μl、dNTP：2μl、Mg2+：1.5μl、H2O：15.75μl、cDNA：1μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min循环30次；72℃延伸10min。
3.选取特异的限制性内切酶Sal I和Not I双酶切质粒，体系参考内切酶说明书(宝生物1080s)，酶切后进行琼脂糖电泳，切胶并回收470+bp的目的片段；
4.利用T4DNA连接酶(TransGen)将回收的目的片段与相同双酶切后的pET-30a(+)载体连接，连接体系参考T4DNA连接酶说明书，然后转化Escherichia coli Trans5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序确定构建的表达载体上编码序列的正确性(与原序列对比)确定插入片段的准确性。
实施例2蛋白原核重组表达及纯化
基于特异性引物SEQ ID NO.3：RpCTL-F：ACGCGTCGACTCTACAAGAAATGTTCGAAAT和SEQ ID NO.4：RpCTL-R：ATAAGAATGCGGCCGCAAGCAGTTTCACTATTTC用于扩增编码菲律宾蛤仔RpCTL重组蛋白的完整ORF DNA片段(序列见SEQ ID NO.5)，通过PCR将产物经胶回收和纯化试剂盒PCRClean Up Kit(Sangon)纯化后测序后，将测序正确的RpCTL片段与pEASY-T1载体(TransGene)连接形成pEASY-T1-RpCTL复合物，转化到大肠杆菌TANS5α(TransGene)中扩增。将pEASY-T1-RpCTL和PET-30a(Novagen)用限制性内切酶SallⅠ和Not I(TaKaRa)进行酶切，用凝胶和纯化试剂盒PCRClean Up Kit(Sangon)纯化目的片段(500bp和100bp)，并在37℃条件下，通过T4 DNA连接酶(TrimGEN)连接4小时，构建重组表达载体pET-30a-RpCTL。
将重组表达质粒pET30-RpCTL转化到Tansetta(DE3)(TransGen)，于37℃在固体培养基上过夜培养。选择阳性转化子作为模板进行PCR反应，所述PCR反应的总反应体系为20μl，其中r-Taq Mix：5μl、SEQ ID NO.3：RpCTL-F：0.4μl(浓度为10μg/ml)、SEQ ID NO.4：RpCTL-R：0.4μl(浓度为10μg/ml)、H2O：3.2μl、cDNA：1μl、Total：10。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min循环30次；72℃延伸10min。
经测序确保插入后，阳性转化子在终浓度为500mg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养，当菌液OD 600达到0.4-0.6时(约2小时)，将终浓度为1mmol/l的IPTG加入培养基中，并在相同条件下继续培养4小时后离心(4℃，12000rpm，15min)收集菌体，加入50ml PBS轻轻将沉淀悬浮后，将菌液置于冰上用超声破碎，直到样品最大程度地澄清，破碎后将样品离心(4℃，12000rpm，15min)，将收集的沉淀物和上清液分别混合到5×LoadingBuffer蛋白缓冲液中，在12％凝胶上进行SDS-PAGE电泳，进而推导出RpCTL的表达位置。
重组蛋白RpCTL在PET-30a表达系统中成功表达。预测RpCTL的分子量约为22.36kD，PI预测为5.19，在原核表达系统中，RpCTL以N末端的His标签作为融合蛋白表达，表观分子量约为23kDa。通过12％SDS-PAGE分析IPTG诱导后的PET30a-RpCTL的Transetta表达感受态细胞裂解产物(图1A，泳道2)与未诱导的(图1A，泳道1)相比，分子量为23kDa的带较厚(图1，泳道2)与RpCTL的预测分子量一致，因此，RpCTL成功表达。利用含有不同浓度的咪唑(20mM、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、300mM)洗脱液，在Ni-NTA亲和层析纯化柱上纯化重组RpCTL蛋白。SDS-PAGE结果表明，在80、100和150mM咪唑浓度下能纯化出较高浓度的RpCTL(图1B，泳道1-3)，并且通过100mM咪唑浓度在Ni-NTA柱亲和层析获的RpCTL浓度最高(图1B，泳道2)。
实施例3重组蛋白的复性与浓度测定
由于本发明RpCTL是在变性状态下进行进行纯化，所以在完成纯化后还需要进行蛋白质复性。在本发明中，采用透析技术通过逐渐降低蛋白溶液中的尿素浓度，从而达到对重组蛋白复性的目的。对于不同尿素浓度的透析液的体系如下：
在透析过程中，在4℃下，透析液的pH＝8.0，依次降低透析液的尿素浓度，并且每个尿素浓度透析12h。最后将重组蛋白透析到PBS缓冲液中。重组蛋白的浓度通过BCA蛋白测定试剂盒(碧云天)进行测定。
实施例4重组蛋白的对不同微生物的抑菌活性测试
测定RpCTL对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(鳗弧菌和大肠杆菌)的抑菌活性。在琼脂培养皿上用涂布器将培养好的菌液均匀涂在培养皿上后，用钻头钻出直径为8mm的四个孔。然后将纯化的RpCTL蛋白(0.6μg/μl，60μl)和氨苄青霉素(0.5μg/μl，60μl)加入孔中，以TBS和rTrX各60μl作为为阴性对照。在37℃下培养14小时，孔周围的透明环表示具有抗菌活性。
革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的在RpCTL下培养的生长曲线构建方法如下：选择枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的单个菌落转移到5ml LB培养基中，加入最终浓度为0,20,60和180μg/ml的RpCTL蛋白。等量PBS作为阴性对照。在37℃，200rpm下培养，然后每2h测定OD 600，分3个样品进行分析独立实验。
结果如图2所示，在抑菌圈试验中，将RpCTL与阴性对照(PBS和RTRX)进行比较发现，在相应的氨苄青霉素阳性对照孔周围观察到较大的区域，这些区域是抑菌圈，阴性对照中并无此区域，且在大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌培养基中均可观察到RpCTL孔周围有透明的圆形区域(图2)。这些结果证实了RpCTL对鳗弧菌和大肠杆菌的抑制作用，而且大肠杆菌平板上RpCTL孔抑菌圈大于枯草芽孢杆菌平板上抑菌圈，表明RpCTL对大肠杆菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长曲线如图3所示。当RpCTL的最终浓度为180μg/ml时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的OD600值均降低。一般来说，在这个浓度下微生物的生长受到抑制，而20μg/ml的RpCTL的作用很弱(图3A和3B)。利用终浓度为20、60和180μg/ml RpCTL孵育12h后，大肠杆菌OD600分别增长到1.36、0.65或0.13(图3A)，枯草芽孢杆菌OD600分别增长到1.86、1.32或0.30(图3B)。因此，RpCTL对大肠杆菌的抑制作用明显大于对枯草芽孢杆菌，这与抑菌圈试验的结果一致(图2A和2D)。另外，20和60μg/ml浓度的RpCTL对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生长的抑制作用弱于180μg/ml的RpCTL(图3A和3B)。
实施例5鳗弧菌侵染后注射重组RpCTL的存活率测试
1、从大连金石滩采集野生菲律宾蛤仔，随机分为4组，每组50只蛤仔，在18摄氏度海水中暂养1周，每天定时投饵2次。
2、第1和第2组注射0.9μg/μl RpCTL蛋白(50μl),第3和第4组同样体积的PBS对为照组。
3、注射1h后,50μl的鳗弧菌(OD600＝0.1)注入第1和第3组。第2组和第4组注射与对照组等体积的PBS。
4、感染后每12h统计每组蛤仔存活数用于计算存活率，存活率＝(存活的蛤仔数/50)×100％,得到存活率后绘制存活率曲线。
健康的菲律宾蛤仔注射RpCTL后，分别注射鳗弧菌，观察其生存率。注射后12h后，各组蛤蜊成活率均发生了下降的趋势，其中注射PBS+鳗弧菌组的蛤仔存活率最高，为86.8％，在注射了PBS+PBS组的蛤仔中，存活率降低幅度最小，其次是注射了RpCTL+PBS的蛤仔，RpCTL+鳗弧菌组的存活率下降幅度较大(图4)。但在注射72h后各组存活率趋于稳定，感染72-96h后各组存活率均大于50％，但注射PBS+鳗弧菌组处理的蛤仔存活率仍继续下降，在鳗弧菌感染96h时达到20.4％(图4)。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连海洋大学
<120> 一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白及其制备方法与应用
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gcattacctc acttcatttt ctctaattat gggtatcgtt ggtgctttga tagtaaggag 120
tgattgccaa tgtagctgca ctgatataga agttattaaa catcttctac aagaaatgtt 180
cgaaataaaa caagaagtat acaaactacg ttcagaaaca gactcaatca aagtttcatg 240
cccggacgtc aaatggaaac aatatggaaa caagtgttat cgatttatca aagatcctaa 300
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aagcaaagaa gagaatgatt ttatagtggc taatatcaag ggaagtacat ctggtttttg 420
gattggactg gatgacacgc agaaggaaaa taactggcaa tggagttcat cagaaggaac 480
acaaagtctt ggaaattttt taaattgggc acctggcgag cctaacaatg acagagggga 540
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<210> 2
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His Tyr Leu Thr Ser Phe Ser Leu Ile Met Gly Ile Val Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ile Val Arg Ser Asp Cys Gln Cys Ser Cys Thr Asp Ile Glu Val
20 25 30
Ile Lys His Leu Leu Gln Glu Met Phe Glu Ile Lys Gln Glu Val Tyr
35 40 45
Lys Leu Arg Ser Glu Thr Asp Ser Ile Lys Val Ser Cys Pro Asp Val
50 55 60
Lys Trp Lys Gln Tyr Gly Asn Lys Cys Tyr Arg Phe Ile Lys Asp Pro
65 70 75 80
Asn Thr Trp Ser Asp Ala Lys Glu Lys Cys Arg Leu Ile Ser Gly Asp
85 90 95
Leu Val Arg Ile Glu Ser Lys Glu Glu Asn Asp Phe Ile Val Ala Asn
100 105 110
Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Phe Trp Ile Gly Leu Asp Asp Thr Gln
115 120 125
Lys Glu Asn Asn Trp Gln Trp Ser Ser Ser Glu Gly Thr Gln Ser Leu
130 135 140
Gly Asn Phe Leu Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Asp Arg Gly
145 150 155 160
Asp Glu Asp Cys Gly Glu Ile Phe Ala Lys Met Ser Lys Ile Gly Lys
165 170 175
Trp Asn Asp Ala Pro Cys Ser Thr Lys Leu Pro Tyr Ile Cys Glu Ile
180 185 190
Val Lys Leu Leu
195
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcgtcgac tctacaagaa atgttcgaaa t 31
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ataagaatgc ggccgcaagc agtttcacta tttc 34
<210> 5
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcattacc tcacttcatt ttctctaatt atgggtatcg ttggtgcttt gatagtaagg 60
agtgattgcc aatgtagctg cactgatata gaagttatta aacatcttct acaagaaatg 120
ttcgaaataa aacaagaagt atacaaacta cgttcagaaa cagactcaat caaagtttca 180
tgcccggacg tcaaatggaa acaatatgga aacaagtgtt atcgatttat caaagatcct 240
aacacatggt ctgacgccaa agagaaatgc agattgatca gcggcgacct tgttagaata 300
gaaagcaaag aagagaatga ttttatagtg gctaatatca agggaagtac atctggtttt 360
tggattggac tggatgacac gcagaaggaa aataactggc aatggagttc atcagaagga 420
acacaaagtc ttggaaattt tttaaattgg gcacctggcg agcctaacaa tgacagaggg 480
gatgaggatt gtggcgagat atttgcaaaa atgtctaaaa taggaaaatg gaatgatgcg 540
ccatgttcga caaagcttcc atatatttgt gaaatagtga aactgctttg a 591

Claims (10)

1.一种菲律宾蛤仔C型凝集素基因，其特征在于，所述C型凝集素的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白，其特征在于，所述C型凝集素的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以菲律宾蛤仔cDNA为模板，用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pEASY-T1构建成复合物pEASY-T1-RpCTL，转化到大肠杆菌TANS5α中扩增，将pEASY-T1-RpCTL和载体PET-30a分别用限制性内切酶SallⅠ和Not I进行酶切，分别回收500bp和100bp的片段，纯化后将这两个片段通过T4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET-30a-RpCTL；
(2)将步骤(1)得到的重组表达载体pET-30a-RpCTL转化到Tansetta(DE3)，于37℃在营养琼脂固体培养基上培养12h，选择阳性转化子作为模板进行PCR扩增，经测序确保插入后，阳性转化子在含卡那霉素的LB培养基中震荡培养，当菌液OD 600达到0.4-0.6时，将IPTG加入培养基中，继续培养4小时后离心收集菌体，加入PBS将沉淀悬浮后，将菌液置于冰上超声破碎至澄清，离心，沉淀物即为纯化后的RpCTL；
(3)将步骤(2)纯化后的RpCTL采用透析技术通过逐渐降低蛋白溶液中的尿素浓度进行蛋白复性，即得到序列表中SEQ ID NO.2所述的菲律宾蛤仔C型凝集素。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用T4 DNA连接酶的连接温度为36-38℃，时间为4-5h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中卡那霉素的浓度为500mg/ml，所述步骤(2)中IPTG的浓度为1mmg/ml，所述步骤(2)中两次离心的条件均为4℃，12000rpm、15min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中透析技术的透析液体系为：50mM的Tris-HCL；质量体积比为1％的Glycin；1mM的EDTA；体积比为10％的Glycerin；50mM的NaCl；2mM的Reduced Glutathione；0.02mM的Oxidized Glutathione；所述尿素浓度依次为6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M；所述步骤(3)中透析技术的透析条件为4℃，pH＝8.0，12h。
7.根据权利要求2所述的菲律宾蛤仔C型凝集素蛋白在制备抑菌剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂为革兰氏阳性菌抑菌剂和革兰氏阴性菌抑菌剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌抑菌剂包括金黄色葡萄球菌抑菌剂、枯草芽孢杆菌抑菌剂。
10.根据权利要去8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌抑菌剂包括鳗弧菌抑菌剂、大肠杆菌抑菌剂。
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