CN103333907A - 一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列。本发明还公开了一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶，用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌，所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽水溶性海藻糖酶中的应用及绿盲蝽水溶性海藻糖酶的制备方法。本发明制得的酶蛋白分子量为71KD，最佳pH值为7.0，最佳温度为55℃，可降解海藻糖成为葡萄糖。纯化出的海藻糖酶可以用于工业及其它一些领域海藻糖含量的定性及定量工作，同时可为昆虫海藻糖酶抑制剂的研发提供基础。

Description

一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用。 

背景技术

水溶性海藻糖酶(soluble trehalase，Tre-1)是昆虫体内重要酶系，水解昆虫细胞中的海藻糖成为葡萄糖，在昆虫的表皮几丁质合成、飞行、抗寒性等多种生理活动中发挥着重要作用。绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转Bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强。目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。运用昆虫海藻糖酶抑制剂防治昆虫是一种害虫防控新兴方法，然而目前从体外获得的重组海藻糖酶十分缺乏，同时针对绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）的研究，国内外尚未见相关报道。因此分离纯化绿盲蝽水溶性海藻糖酶，研究其生化特征，这对于进一步开发其抑制剂有着重要的理论意义和指导作用。 

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列。 

本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

本发明的又一个目的是提供用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。 

本发明的又一个目的是提供所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽水溶性海藻糖酶中的应用。 

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶的制备方法。 

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 

一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

含有所述的用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。 

所述的重组表达载体，将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽水溶性海藻糖酶的重组表达载体。 

所述的重组表达载体，所述大肠杆菌表达载体为PET28a。 

所述的转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。 

所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。 

所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽水溶性海藻糖酶中的应用。 

一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶的制备方法，是培养所述的转基因重组菌得到的绿盲蝽水溶性海藻糖酶。 

一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）的制备方法，包括以下步骤： 

1、绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因的扩增； 

2、绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因原核表达载体构建； 

3、绿盲蝽水溶性海藻糖酶蛋白的变性和复性； 

4、绿盲蝽水溶性海藻糖酶蛋白的纯化即得到绿盲蝽水溶性海藻糖酶。 

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点： 

1．本发明的绿盲蝽水溶性海藻糖酶由643个氨基酸组成，是目前报道分子量较小的海藻糖分解酶，小分子的酶蛋白可具有更高的比活，比大分子量的酶更加容易实现工程菌的高效表达，容易降低酶的生产成本。本发明制得的酶蛋白分子量为71KD，最佳pH值为7.0，最佳温度为55℃，可降解海藻糖成为葡萄糖。纯化出的海藻糖酶可以用于工业及其它一些领域海藻糖含量的定性及定量工作，同时可为昆虫海藻糖酶抑制剂的研发提供基础。 

2．本发明的水溶性海藻糖酶的适合反应温度范围广，在25～60℃都能保持较高的酶活力，在工艺中可以通过降低反应温度来提高海藻糖的分解率，也可以通过提高反应温度来加快反应速度。 

附图说明

图1绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因全长序列的PCR扩增电泳图。泳道1：为2000bp的DNA maker，泳道2：绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因。 

图2NdeI和NotI双酶切载体的电泳图。泳道1：该绿盲蝽水溶性海藻糖酶的基因片段，泳道2：为10000bp的DNA maker。 

图3pET28a-ALTre-1诱导表达的SDS-PAGE分析电泳图。 

图4不同咪唑浓度梯度下pET28a-ALTre-1重组表达产物纯化分析电泳图。 

图5pH对ALTre-1酶活的影响曲线图。 

图6温度对ALTre-1酶活的影响曲线图。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。 

实施例1：ALTre-1基因的获得 

采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8～2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：0.5μg总RNA，0.5μl Oligo-dT18，2μl5×反应缓冲液，2μl10mM dNTP，40U RNasin，200U SuperscriptⅡ，加ddH₂O至10μl；PCR反应参数为：42℃30min，75℃30min，4℃5min。根据已知昆虫水溶性型海藻糖酶基因的保守序列设计适用于PCR扩增引物ALTre-1-F(5′-TACTACTGGGACTCTTATTGG-3′)及ALTre-1-R(5′-CCAGGCGTTAGGGAAGTCCC-3′)，获得ALTre-1基因保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID NO：3，PCR反应体系为：2.5μl10×反应缓冲液，2μl25mM Mg²⁺，2μl10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶，1μl10μM上游引物ALTre-1-F，1μl10μM下游引物ALTre-1-R，cDNA模板1μl，加ddH2O至25μl；PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃90s，35个循环；72℃继续延伸10min；在根据获得的ALTre-1基因的保守序列设计适用于RACE方法的扩增引物ALTre-1-5′-R1(5′-CAAGCGACCACCGTTTGGAATAAATC-3′)和ALTre-1-5′-R2(5′-GATCGTTGTATCTTGCCAGAGTGTATG-3′)，ALTre-1-3′-F1(5′-GAAGTGTTGTGGCATGAAGAAGTCG-3′)，ALTre-1-3′-F2(5′-GGAGACCTGGAAAGGCTCTGAAGTAC-3′)，扩增方法具体参见宝生物大连有限公司的cDNA末端的快速扩增(RACE)试剂盒的方法进行扩增，PCR反应参数为：94℃30s，70℃180s，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃180s，5个循环；94℃30s，68℃30s,72℃ 180s，72℃继续延伸5min。电泳结果显示PCR扩增分别得到与预期大小1932bp相符的条带（图1）。将PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步载体构建。 

结论：ALTre-1基因ORF框包含1932个碱基，编码643个氨基酸。 

实施例2：ALTre-1基因原核表达载体的构建 

含有ALTre-1基因T载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序正确连入pGEM-TEasy的载体及pET28a均用限制性内切酶NdeI和NotI双酶切，进行大片段连接（图2）。酶切体系为：2种限制性内切酶各1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，带有合适酶切位点的基因片段10.0μl，用ddH₂O补足至20μl，37℃水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载体5.0μl，基因片段10.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，用ddH₂O补足至20μl，16℃反应12～16h。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pET28a-ALTre-1转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后涂布到含卡那霉素（50μg/mL）的平板上，37℃，230r/min培养过夜；从转化后培养过夜的平板上挑单克隆到10ml含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按1%的比例接种到LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃摇床中培养2-3h，在菌液的OD₆₀₀达到0.6-0.8之间时，降低培养温度到25℃，继续培养15分钟后，取0.5mL菌液做诱导前对照样品，其余培养液中加入终浓度为0.6mM的IPTG进行诱导培养12h。离心少量菌体，加适量TE溶液（pH8.0），震荡悬浮后加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃5min，SDS-PAGE电泳检测（图3）。 

结论：经37℃，0.6mM IPTG诱导12h后ALTre-1基因可在pET28a载体中进行高效表达，主要以包涵体形式存在。 

实施例3：ALTre-1融合蛋白变性和复性及蛋白的纯化 

目的融合蛋白的提取及纯化：大量培养经SDS-PAGE电泳检测后含有表达载体的BL21(DE3)菌体。4℃，8000rpm/min离心收集足量的菌体。超声破碎重悬菌体99次（功率200W，超声3S，暂停5S为一次，始终保持离心管置于冰上），4℃，8000rpm/min离心15min，收集上清和沉淀。将离心后的沉淀置于溶解液（1×PBS，8M尿素）中悬 浮，室温孵育3h，4℃，6000rpm/min离心15min后取上清。将上清置于用Binding buffer（1×PBS，含8M尿素，15mM咪唑，300mM NaCl，0.5%Triton X-100，pH8.0）平衡好的Ni-NTA柱上（流速为45mL/h），收集穿透液。用Eulte Buffer（1×PBS，含8M尿素，500mM咪唑，pH8.0）洗脱穿透液（流速为45mL/h），收集洗脱液。蛋白复性采用透析法：将纯化后的蛋白置于透析袋中，在PBS缓冲液（pH8.0）中缓慢透析3次，每次2h，收集透析后的样品进行SDS-PAGE分析（图4）。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（微板法）测定靶蛋白浓度。 

结论:先用8M尿素的溶解液溶解包涵体，再用含8M尿素、15mM咪唑的洗脱液洗脱包涵体，可获得大小约为71KD ALTre-1蛋白，蛋白浓度为0.3mg/ml。 

实施例4：ALTre-1活性检测及最佳pH和温度的测定 

ALTre-1活性检测：以海藻糖为底物测定靶蛋白的酶活性。反应混合物总体积为2mL，包含0.4ml0.3mg/mL溶解在PBS中的所述纯化蛋白溶液，0.5ml40mmol/L海藻糖和0.3mL PBS(pH8.0)。混合溶液在37℃孵育60min，沸水浴5min以终止反应，4℃，12000rpm/min离心10min，冰敷10min后待测。使用已糖激酶法测定待测溶液的葡萄糖生成量。靶蛋白酶活性以nmol(葡萄糖)·μg^-1(蛋白)·min^-1表示。 

结论：ALTre-1具海藻糖酶活性，酶活性为184.83±13.39nmol·μg^-1·min^-1。 

ALTre-1反应的最佳pH和温度测定：从pH3.0～9.0每隔1.0个pH设置一个梯度，分别测定pH对ALTre-1酶活的影响（表1，图5）；从5.0～95.0℃每隔10℃设置一个温度梯度，分别测定温度对ALTre-1酶活的影响（表2，图6），测定方法如上述ALTre-1活性检测方法。 

结论：ALTre-1最佳pH为7.0，最佳温度为55℃。 

表1： 

表2： 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述的用于编码绿盲蝽水溶性海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽水溶性海藻糖酶的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为PET28a。

6.根据权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。

8.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽水溶性海藻糖酶中的应用。

9.一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶的制备方法，是培养权利要求3或6所述的转基因重组菌得到的绿盲蝽水溶性海藻糖酶。

10.一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因的扩增；

2）、绿盲蝽水溶性海藻糖酶基因原核表达载体构建；

3）、绿盲蝽水溶性海藻糖酶蛋白的变性和复性；

4）、绿盲蝽水溶性海藻糖酶蛋白的纯化即得到绿盲蝽水溶性海藻糖酶。

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