CN103789319B - 一种绿盲蝽超气门蛋白、其编码序列、载体和菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列。本发明还公开一种绿盲蝽超气门蛋白，用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌，所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽超气门蛋白中的应用及绿盲蝽超气门蛋白的制备方法。本发明利用绿盲蝽超气门蛋白基因，构建其pEGX-6P-1原核表达载体，并在大肠杆菌Rosetta？gami？B中经IPTG诱导后能产生所述蛋白的包涵体，再经变性、复性可形成所述的蛋白，并加以纯化制得。制得的蛋白分子量约为65KD，蛋白浓度为1.67mg/ml。纯化的超气门蛋白可为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期的理论基础。

Description

一种绿盲蝽超气门蛋白、其编码序列、载体和菌株

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽超气门蛋白、其编码序列、载体、菌株。

背景技术

绿盲蝽Apolyguslucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转Bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。

类固醇激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)是昆虫蜕皮激素的主要活性形式，在昆虫的变态发育过程中起着重要的调控作用。蜕皮激素受体(ecdysonereceptors，EcR)是蜕皮激素的作用靶标，是昆虫体内重要的调控蛋白，目前已成为新型杀虫剂的重要靶标。它必须首先与超气门蛋白(ultraspiracleprotein，USP)形成异源二聚体，再激活或抑制下游相关基因的表达。USP隶属于昆虫核受体，一般含有4个模块结构域：A/B域、C域、D域和E域。其中C域及D域相对保守，C域含有2个锌脂结构，E域存在一个配体结合袋，是与EcR形成异源二聚体的结合域。研究绿盲蝽ALUSP基因结构及获得其重组蛋白，可望为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期的理论基础。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列，如SEQIDNO：1所示。

本发明的另一个目的在于提供一种用于编码绿盲蝽超气门蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明的又一个目的是提供用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽超气门蛋白的制备方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

一种绿盲蝽膜超气门蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

其中，含有上述的用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

其中，上述的重组表达载体，是将上述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽超气门蛋白的重组表达载体。

其中，上述大肠杆菌表达载体为pEGX-6P-1。

其中，上述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

其中，上述的大肠杆菌为RosettagamiB。

一种绿盲蝽超气门蛋白的制备方法，是培养上述的转基因重组菌得到的绿盲蝽超气门蛋白。

一种绿盲蝽超气门蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）、绿盲蝽超气门蛋白基因的扩增；

2）、绿盲蝽超气门蛋白基因原核表达载体构建；

3）、绿盲蝽超气门蛋白的变性和复性；

4）、绿盲蝽超气门蛋白的纯化。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

本发明的利用绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP），构建其pEGX-6P-1原核表达载体，并在大肠杆菌RosettagamiB中经IPTG诱导后能产生所述蛋白的包涵体，再经变性、复性可形成所述的蛋白，并加以纯化制得。制得的蛋白分子量约为65KD，蛋白浓度为1.67mg/ml。纯化出的超气门蛋白可为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期的研究基础。

附图说明

图1绿盲蝽超气门蛋白基因5'和3'端PCR扩增电泳图。泳道1：10000bp的DNAmaker，泳道2：绿盲蝽超气门蛋白基因5'(A)和3'端(B)PCR片段

图2绿盲蝽超气门蛋白基因全长序列的PCR扩增电泳图。泳道1：2000bp的DNAmaker，泳道2：绿盲蝽超气门蛋白基因全长；

图3EcoRI和XhoI双酶切T载体电泳图；

图4pEGX6P1-ALUSP诱导表达的SDS-PAGE分析电泳图；

图5pEGX6P1-ALUSP蛋白的GST琼脂糖亲和层析图；

图6pEGX6P1-ALUSP蛋白的分子筛纯化电泳图；

图7纯化的pEGX6P1-ALUSP蛋白SDS-PAGE检测电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：ALUSP基因的获得

采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8～2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：10μl总RNA，4.0μl5X反应缓冲液，2μl10mmoldNTP，1μl核糖核苷酸抑制剂，2μl反转录酶，加ddH₂O至反应体积为20μl。PCR反应参数为：42℃温浴60min，72℃温浴10min。根据已知昆虫超气门蛋白的保守序列设计适用于PCR扩增引物ALUSP-F(5’-CATTATGGWGTYTAYAGYTGTG-3’)及ALUSP-R(5’-AGHAGTTCATTCCAVCCTGCTC-3’)，获得绿盲蝽超气门蛋白保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQID：3，PCR反应体系为：12.5μl2×GCBufferI，0.5μlALUSP-F，0.5μlALUSP-R，4μldNTP，6.3μlddH2O，1μlcDNA，0.5μlTaq酶；PCR反应参数为：95℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃修复延伸7min，总循环33次；根据上述获得的保守序列设计特异性引物，利用巢式PCR进行绿盲蝽超气门蛋白5′和3′端序列的克隆。第一轮3’-RACE反应体系：12.5μl2×GCBufferI，0.5μlALUSP-F1(5’-AGTTACTCTTCTGAAAGCAGGTTGG-3’)，0.5μl3′outer引物(5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3’)，4μldNTP，6.3μlddH2O，1μlcDNA，0.2μlTaq酶；第一轮3′-RACE反应条件：95℃预变性，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃修复延伸7min，总循环数33次。第二轮3′-RACE反应体系：25μl2×GCBufferI，1μlALUSP-F2(5’-ATACCGTTCCGTGGGAGTCAG-3’)，0.5μl3′inner引物(5’-GCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’)，8μldNTP，12.5μlddH2O，1μlcDNA，0.5μlTaq酶，第二轮3′-RACE反应条件：95℃预变性，94℃变性30s，58℃退火58s，72℃延伸60s，72℃修复延伸7min，总循环数33次。第一轮5′-RACE反应体系：12.5μl2×GCBufferI，1μl锚定引物(5’-GCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’)，0.5μl3′ALUSP-R1(5’-AAGCATTTGCCTGTCTATTGTCTGTCCA-3’)，4μldNTP，6.3μlddH2O，1μlcDNA，0.2μlTaq酶，第一轮5′-RACE反应条件为：95℃预变性，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s，72℃修复延伸7min，总循环数33次，第二轮5′-RACE反应体系：25μl2×GCBufferI，1μl通用扩增引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)，0.5μl3′ALUSP-R2(5’-TGTCTGTGTGGAAACTGCTGGTGCTCTC-3’)，8μldNTP，12.5μlddH2O，1μlcDNA，0.5μlTaq酶，反应条件同上。将PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pMD18-T载体进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步载体构建。

结论：绿盲蝽超气门蛋白5'和3'端分别得到约700bp（图1A）和420bp（图1B）大小的片段。经回收、测序和拼接，获得绿盲蝽绿盲蝽超气门蛋白的全长序列（图2）。该基因ORF框包含1005bp的核苷酸，编码334个氨基酸。

实施例2ALUSP基因原核表达载体的构建

含有ALUSP基因T载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序连入pMD18-T载体的目的基因及pEGX-6P-1载体均用限制性内切酶EcoRI及XhoI双酶切，进行大片段连接（图3）。酶切体系为：2种限制性内切酶各1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，带有合适酶切位点的基因片段10.0μl，用ddH₂O补足至20μl，37℃水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载体5.0μl，基因片段10.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，用ddH₂O补足至20μl，16℃反应12～16h。连接产物转化大肠杆菌TOP10后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pEGX61-ALUSP转化到大肠杆菌RosettagamiB感受态细胞后涂布到含卡那霉素（50μg/mL）的平板上，37℃，250r/min培养过夜；次日在转化后的平板上挑选单克隆到LB培养基（含50ug/ml卡那霉素、10mL）中，37℃，250r/min培养过夜；次日将菌液按1%的比例接种到LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃摇床中培养2～3h，在菌液的OD600达到0.6～0.8之间时，降低培养温度至25℃，继续培养15分钟后，取0.5mL菌液做诱导前对照样品，其余培养液中在不同温度条件下进行目的蛋白的表达（15℃，1mmol·L-1IPTG，过夜培养；25℃，1mmol·L-1IPTG，过夜培养；30℃，1mmol·L-1IPTG，过夜培养；37℃，mmol·L-1IPTG，培养5h）。离心少量菌体，分别取上清和沉淀，加适量TE溶液（pH8.0），震荡悬浮后加入等体积的2×SDS缓冲液，100℃5min，12%SDS-PAGE电泳检测重组ALUSP蛋白的表达情况（图4）。

结论：经37℃，1mMIPTG诱导5h后ALUSP基因在pEGX-6P-1载体中可高效表达，主要以包涵体形式存在。

实施例3：ALUSP融合蛋白变性和复性及蛋白的纯化

按下述步骤进行包涵体蛋白的变性：4000g、4℃离心15min弃上清液，PBS洗涤菌体2次后，PBS重悬，高压破细胞，12000g、4℃离心30min，保留沉淀包涵体，加入60ml结合缓冲液（7mol·L^-1盐酸胍、50mmol·L-1Tris、2MmDTT、0.1%Triton-100，pH8.0），重悬包涵体，搅拌溶解，16000g、4℃离心30min，保留上清液；然后用10倍于柱床体积的Bindingbuffer清洗平衡柱子，流速为60ml·h^-1；再将样品（溶解液上清液）上柱，流速为45ml·h-1，收集穿透液，用10倍于柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速为60ml·h^-1；最后用EulteBuffer（7mol·L^-1盐酸胍、50mmol·L^-1Tris、2mmol·L^-1DTT、0.1%Triton-100，20mmol·L^-1GSH，pH8.0）洗脱，流速为45ml·h-1，收集洗脱液(图5)。

选用下述复性液进行包涵体蛋白的复性：在收集的含有目的蛋白的洗脱液中加入bindingbuffer（7mol·L^-1盐酸胍、50mmol·L^-1Tris、2MmDTT、0.1%Triton-100，pH8.0）后进行亲和层析，12%SDS-PAGE电泳检测收集的蛋白（图6）。最终样品加入0.1%SKL透析复性缓冲液，4℃过夜，逐步去除变性剂，最终透析于PBS(pH7.4)，离心，取上清液检测（图7）。将复性得到的蛋白经超滤浓缩后，溶解于PBS缓冲液（pH7.4）中，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度（图6）。

结论：经过蛋白变性和复性后，可成功获得ALUSP蛋白，大小约为65KD，该蛋白浓度为1.67mg/mL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种绿盲蝽膜超气门蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3.含有权利要求1所述的用于编码绿盲蝽超气门蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽超气门蛋白的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pEGX-6P-1。

6.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为RosettagamiB。

8.一种绿盲蝽超气门蛋白的制备方法，是培养权利要求3或6所述的转基因重组菌得到绿盲蝽超气门蛋白。

9.一种绿盲蝽超气门蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、绿盲蝽超气门蛋白基因的扩增；所述绿盲蝽超气门蛋白基因的碱基序列如SEQIDNO：1所示；

2）、绿盲蝽超气门蛋白基因原核表达载体的构建；

3）、绿盲蝽超气门蛋白的变性和复性；

4）、绿盲蝽超气门蛋白的纯化。