CN104829722A - 绿盲蝽水溶性海藻糖酶单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明将经原核表达纯化的AlTre-1重组蛋白首先应用于免疫小鼠后制备了抗血清，间接ELISA方法确定效价；制备骨髓瘤细胞及脾细胞后进行细胞融合，ELISA法筛选阳性孔细胞后进行亚克隆，挑出阳性单克隆孔扩大培养定株，最终获得AlTre-1单克隆抗体。此外，发明人采用Western blot法确定该单克隆抗体能特异性识别AlTre-1重组蛋白，并可产生特异性免疫反应。应用本发明，可为水溶性海藻糖酶在绿盲蝽体内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

Description

绿盲蝽水溶性海藻糖酶单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体工程农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转Bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。迄今，多种新型昆虫生长调节剂已应用到防治绿盲蝽的危害中，如氟铃脲等第三代杀虫剂，显示出较好的杀虫效果。但是，由于这些农药的特异性靶标表达量的差异，可显著影响其药效。水溶性海藻糖酶(soluble trehalase，Tre-1)是多种昆虫生长调节剂的靶标基因，也是绿盲蝽体内一种重要的水解酶。绿盲蝽水溶性海藻糖酶(AlTre-1)基因在不同龄期、不同组织中的蛋白表达量均不相同，导致昆虫生长调节剂施用后，对靶标基因水溶性海藻糖酶的抑制效果出现较大差异，从而可引起农药的使用效果下降。因此要求有灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析绿盲蝽体内水溶性海藻糖酶的表达量，指导这些昆虫生长调节剂的使用时间。目前，应用在昆虫蛋白检测的方法主要有ELLSA和Western blot。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的ELLSA检测方法。

本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的Western blot检测方法。

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的抗体特异性检测方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体，将重组AlTre-1蛋白抗原免疫小鼠后制得。

一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

a、抗原处理：取纯化后的重组AlTre-1蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐剂和重组AlTre-1蛋白抗原等体积混合得到第二、三和四次免疫抗原；

b、动物免疫：采用皮下多点注射法免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠；首次免疫采用首次免疫抗原；间隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原；间隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价，选取效价大于1:10000的2只小鼠进行细胞融合过程中脾细胞的制备；

c、骨髓瘤细胞的制备：于细胞融合前一周，用含10％FBS DMEM的培养基扩大培养SP2/0细胞。在融合当天收集SP2/0细胞，1000rpm，5min离心后弃上清，然后加入20mlDMEM培养基，吹散细胞后计数；

d、脾细胞的制备：将上述b过程中选取的小鼠在融合前3天终免，于腹腔注射抗原100μg，融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠，75％酒精浸泡5min后无菌取脾脏，把脾脏放入内有10ml DMEM培养基的培养皿中，取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏，加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中，将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000rpm离心5min后收集脾细胞计数；

e、细胞融合：混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1︰20，用DMEM基础培养基稀释混合细胞，1000rpm离心5min后弃上清，将细胞均匀后加入0.8ml50％PEG，反应90秒，再加入25ml DMEM培养基后37℃水浴锅中反应10min，1000rpm离心5min后弃上清，加入HAT DMEM培养基，然后将融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl，然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养，融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率达到50％以上，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测；

f、融合筛选：于检测的前一天，用PBS包被5μg/ml抗原于ELISA板后过夜。次日吸取细胞上清100μl/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果，判断阳性孔，以样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1时，则判定为阳性孔，用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔，确定后的阳性孔细胞进行亚克隆；

g、亚克隆：吹打阳性孔中细胞后计数，加入N/4ml DMEM培养基(N为细胞数)，取100μl阳性孔细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml后吹匀，留100μl在管底，加入DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的A、B、C三行，每孔一滴，管底留1.8～2.0ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5～1.8ml左右，补加DMEM至3ml，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7～10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，挑取阳性单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，从而获得单克隆抗体。

其中，上述步骤b中的首次、第二、三或四次免疫抗原剂量均为100μg/只。

本发明中采用的重组AlTre-1蛋白的专利号为ZL201310227473.0，发明名称为“一种绿盲蝽水溶性海藻糖酶、其编码序列、载体和菌株及应用”中的制备方法制备得到的。

一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的ELISA检测方法，包括以下步骤：用碳酸盐包被重组AlTre-1蛋白抗原，包被浓度为5μg/ml，4℃孵育过夜，取出抗原后用PBST洗涤液洗涤三次，然后加入封闭液，取出再用PBST洗涤液洗涤三次，将小鼠血清(一抗)首先按照1:500稀释，然后3倍稀释，37℃孵育1小时；取出用PBST洗涤液洗涤三次，加入辣根酶标记兔抗小鼠-HRP(二抗)，1:5000稀释，37℃孵育60min；取出用PBST洗涤液洗涤四次，3分钟/次，最后加入TMB显色液100μl/孔，反应15min，加入100μl 1mol/L盐酸终止反应，在450nm波长下测定OD值，评价效价。

一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的Western blot检测方法，包括以下步骤：取AlTre-1重组蛋白按梯度上样，上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先75V跑完积层胶，再将电压升至115V直到电泳结束，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟，然后置于37℃，5％脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时，洗膜4次，每次5分钟，用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1小时，洗膜ECL显影。

一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的抗体特异性检测方法，包括以下步骤：取绿盲蝽若虫提取总蛋白，通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，取下膜后先用PBS缓冲液洗涤，然后将膜置于封闭液中封闭，然后用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释二抗，膜在二抗中反应，洗膜ECL显影。

本发明采用的封闭剂为脱脂奶粉。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：将原核表达纯化的AlTre-1单重组蛋白应用于免疫小鼠后制备了单克隆抗体，在通过利用ELISA法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人采用Western blot法发现该单克隆抗体能特异性识别原核表达的AlTre-1重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的Western blot方法，可特异性地从绿盲蝽虫体内检测出水溶性海藻糖酶。应用本发明，可为水溶性海藻糖酶在绿盲蝽体内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

附图说明

图1Western blot检测AlTre-1单克隆抗体与AlTre-1重组蛋白结合及特异性结果图；泳道1-4分别为：1-4:5μg、1μg、0.2μg和0.04μg AlTre-1重组蛋白。

图2Western blot检测AlTre-1单克隆抗体特异性结果图；泳道1-5分别为：1-3:80μg、40μg和20μg绿盲蝽总蛋白(加1抗和2抗)，4为水(加1抗和2抗)；5为80μg绿盲蝽总蛋白(不加1抗和2抗)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1 绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的获得

首先进行抗原处理：取纯化后的重组AlTre-1蛋白总量约2mg，初免、二免、三免及四免剂量均为100μg/只；初免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化；二免、三免、四免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。然后进行动物免疫：采用皮下多点注射法免疫健康的6-8周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫4次；首次免疫抗原为弗氏完全佐剂和蛋白抗原；间隔21天后第二次免疫。间隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价，选取效价大于1:10000的2只小鼠进行细胞融合过程中脾细胞的制备(表1)。

表1:4免后血清ELISA检测OD值结果

处理	稀释倍数	1#鼠	2#鼠	3#鼠	4#鼠	5#鼠
							1	500	3.198	3.198	3.187	3.003	3.189
2	1,500	3.080	3.090	3.056	2.899	2.852
							3	4,500	2.897	3.015	2.913	2.746	2.108
4	13,500	2.302	2.811	2.678	2.405	1.984
							5	40,500	1.548	2.365	1.935	2.107	1.297
6	121,500	1.167	2.179	1.774	1.711	0.607

7

空白对照

0.072

于细胞融合前一周，用含10％FBS DMEM的培养基扩大培养骨髓瘤细胞(SP2/0)。在融合当天收集SP2/0细胞，1000rpm离心5min后弃上清，然后加入20ml DMEM培养基，吹散细胞后计数。将上述抗原处理过程中选取的小鼠在融合前3天终免，于腹腔注射抗原100μg。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。75％酒精浸泡5min后无菌取脾脏，把脾脏放入内有10ml DMEM培养基的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000rpm离心5min后收集脾细胞计数。混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1︰20。用DMEM基础培养基稀释混合细胞，1000rpm离心5min后弃上清。将细胞均匀后加入0.8ml 50％PEG，反应90秒，再加入25ml DMEM培养基后37℃水浴锅中反应10min。1000rpm离心5min后弃上清，加入HAT DMEM培养基。然后将融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率达到50％以上，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测，用PBS包被5μg/ml抗原于ELISA板后过夜。次日吸取细胞上清100μl/孔进行ELISA检测(表2)，根据ELISA结果，判断阳性孔，以样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1时，则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。然后吹打阳性孔中细胞后计数，加入N/4ml DMEM培养基(N为细胞数)，取100μl细胞到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml后吹匀，留100μl在管底，加入DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的A、B、C三行，每孔一滴，管底留1.8～2.0ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5～1.8ml左右，补加DMEM至3ml，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7～10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，挑取阳性单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，ELISA检测效价后从而获得单克隆抗体(表3)。

结论：AlTre-1单克隆抗体效价均大于1:210000。

表2 融合后细胞上清ELISA检测OD值

备注：根据阳性细胞株效价孔值的高低以及细胞生长状态综合来选取阳性融合细胞株进行亚克隆，选取上述表中灰色标注的进行亚克隆。

表3 定株后细胞上清ELISA检测OD值

样品编号	OD值
		2A1	3.223
2B10	3.255
		2C4	3.165
7A6	3.052
		7E3	3.011
7E8	3.031
		7F8	2.973
7G11	2.991
		7C2	3.146
7G10	3.074

备注：上述样品编号定义为上述选定的阳性孔进行亚克隆后获得的细胞株的效价。

实施例2：绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的Western blot检测

取AlTre-1重组蛋白按梯度上样。上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先75V跑完积层胶，再将电压升至110V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于37℃，5％脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。洗膜4次，每次5分钟，用含5％牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时。洗膜ECL显影(图1)。

结论：AlTre-1单克隆抗体细胞株可较好的与AlTre-1重组蛋白结合。

实施例2：Western blot检测AlTre-1抗体特异性

取绿盲蝽3龄若虫20头，提取总蛋白。组织样品通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样。上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先75V跑完积层胶，再将电压升至110V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时(稀释倍数1:1000)。洗膜4次，每次5分钟；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(稀释倍数1:5000)。膜在二抗中37℃反应1小时。洗膜ECL显影(图2)。

结论：AlTre-1单克隆抗体细胞株能特异性的结合绿盲蝽虫体内的水溶性海藻糖酶蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体，其特征在于，将重组AlTre-1蛋白抗原免疫小鼠后制得。

2.权利要求1所述的一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、抗原处理：取纯化后的重组AlTre-1蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐剂和重组AlTre-1蛋白等体积混合得到第二、三和四次免疫抗原；

b、动物免疫：采用皮下多点注射法免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠；首次免疫采用首次免疫抗原；间隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原；间隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价，选取效价大于1:10000的2只小鼠进行细胞融合过程中脾细胞的制备；

c、骨髓瘤细胞的制备：于细胞融合前一周，用含10% FBS DMEM的培养基扩大培养SP2/0细胞；在融合当天收集SP2/0细胞，1000rpm，5min离心后弃上清，然后加入20 ml DMEM培养基，吹散细胞后计数；

d、脾细胞的制备：将上述b过程中选取的小鼠在融合前3天终免，于腹腔注射抗原100 μg，融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠，75%酒精浸泡5min后无菌取脾脏，把脾脏放入内有10 ml DMEM培养基的培养皿中，取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏，加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中，将细胞移至10 ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次， 1000 rpm离心5min后收集脾细胞计数；

e、细胞融合：混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1︰20，用DMEM基础培养基稀释混合细胞，1000 rpm离心5min后弃上清，将细胞均匀后加入0.8 ml 50% PEG，反应90秒，再加入25 ml DMEM培养基后37 ℃水浴锅中反应10 min，1000 rpm 离心5min后弃上清，加入HAT DMEM培养基，然后将融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl，然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养；融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率达到50%以上，细胞生长状态良好，融合10天后开始进行筛选检测；

f、融合筛选：于检测的前一天，用PBS缓冲液包被5 μg/ml抗原于ELISA板后过夜，次日吸取细胞上清100 μl/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果，判断阳性孔，以样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1时，则判定为阳性孔，用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔，确定后的阳性孔细胞进行亚克隆；

g、亚克隆：吹打阳性孔中细胞后计数，加入N/4 ml DMEM培养基，N为细胞数，取100 μl阳性孔细胞悬液到离心管中，吹匀后留1 ml，补加DMEM到4 ml后吹匀，留100 μl在管底，加入DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的A、B、C三行，每孔一滴，管底留1.8～2.0 ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5～1.8 ml左右，补加DMEM至3ml，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7～10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，挑取阳性单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，从而获得单克隆抗体。

3.权利要求1所述的一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其中，上述步骤b中的首次、第二、三或四次免疫抗原剂量均为100 μg/只。

4.一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体细胞株的ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：用碳酸盐包被重组AlTre-1蛋白抗原，包被浓度为 5μg/ml，4℃孵育过夜，取出抗原后用PBST洗涤液洗涤三次，然后加入封闭液，取出再用PBST洗涤液洗涤三次，将一抗小鼠血清首先按照1:500稀释，然后3倍稀释，37℃ 孵育1小时；取出用PBST洗涤液洗涤三次，加入二抗辣根酶标记兔抗小鼠-HRP，1:5000稀释，37℃孵育60min；取出用PBST洗涤液洗涤四次，3分钟/次，最后加入TMB显色液100 μl/孔，反应15min，加入100μl 1 mol/L盐酸终止反应，在450nm波长下测定OD值，评价效价。

5.一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的Western blot检测方法，其特征在于，包括以下步骤：取AlTre-1重组蛋白按梯度上样，上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先75V跑完积层胶，再将电压升至115V直到电泳结束，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1.5小时，电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟，然后置于37℃，5%脱脂奶粉封闭液中封闭1小时，用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时，洗膜4次，每次5 分钟，用含5%牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1小时，洗膜ECL显影。

6.一种绿盲蝽AlTre-1单克隆抗体的抗体特异性检测方法，包括以下步骤：取绿盲蝽若虫提取总蛋白，通过 RIPA 裂解获得上清，按梯度上样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，取下膜后先用 PBS 缓冲液洗涤，然后将膜置于封闭液中封闭，然后用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释二抗，膜在二抗中反应，洗膜ECL 显影。