CN109517061B - 一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用。该单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示；所述的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示。本发明的鼠源性单克隆抗体能够特异的与高致病型蓝耳病毒结合而不与传统型蓝耳病毒结合，进而能有效的诊断出该猪是否感染高致病型蓝耳病毒，从而对感染不同蓝耳病毒的猪进行区别治疗；还可以将其用于开发区分高致病性蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒抗体诊断试剂盒、试纸条以及用于制备诊断蓝耳病毒的药物。

Description

一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
蓝耳病毒是危害养猪业发展的重要的单链RNA病毒，它的RNA长约15KB，包含10个开放阅读框，分别是ORF1a，ORF1b，ORF2a，ORF2b，ORF3，ORF4，ORF5，ORF5a，ORF6，ORF7；其中ORF1编码2个大的多聚体蛋白，这两个蛋白可以裂解为14个非结构蛋白。而ORF2a，ORF2b，ORF3-7and ORF5a则编码7个结构蛋白分别为糖蛋白GP2，包膜蛋白E蛋白，GP3，GP4，GP5，M，N和ORF5a蛋白。其中GP5和M蛋白可以形成二聚体，而GP2，GP3，GP4可以形成三聚体并协助病毒进入宿主细胞。根据核苷酸序列分析可把蓝耳病毒分为两种基因型，欧洲型和北美型，他们的基因相似性只有63％。此外即使是同一基因型的病毒，他们的基因依然存在一定的差异，所以存在众多抗原性不同的蓝耳病毒。
蓝耳病毒可使猪患上猪繁殖与呼吸综合征，让妊娠母猪出现出流产、早产、死胎，幼龄仔猪出现咳嗽、呼吸困难等症状。所以猪繁殖与呼吸综合征使世界养猪业蒙受巨大的损失。因此，建立一种稳定性好的，准确性高的检测蓝耳病毒的方法是十分有必要的。目前比较普遍的检测方法主要是分子生物学检测和血清学检测，由于分子生物学检测需要仪器和相关技术人员，不能做到现场大规模检测。而血清水平上有多种检测方法例如ELISA，胶体金试纸条等，这些方法简单快捷，不需要相关技术人员，并且可以现场大规模检测。
2006年高致病性蓝耳病毒首次在中国被发现，并很快传播到其他欧洲国家，引起了巨大的经济损失。与传统的蓝耳病毒想比较，高致病性蓝耳病毒具有更强的复制能力和致病能力。高致病性蓝耳病毒威胁着中国养猪业，因此，建立一种快速、方便、灵敏、具体的诊断方法，对C-PRRSV和HP-PRRSV进行区分，对中国的PRRSV的诊断和控制非常有意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供所述蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体，所述的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示；
所述的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示。
编码所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；编码所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～9所示。
所述的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
所述的单克隆抗体的重链可变区由357个碱基组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区；CDR1编码8个氨基酸(SEQ ID NO.4)，CDR2编码8个氨基酸(SEQID NO.5)，CDR3编码13个氨基酸(SEQ ID NO.6)；可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达95.6％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。具体如下：
重链可变区(4D5H链)的基因序列(横线为CDR区，依次为CDR1，CDR2，CDR3)：
Figure BDA0001875624950000021
Figure BDA0001875624950000031
重链可变区(4D5H链)的氨基酸序列(横线为CDR区，依次为CDR1，CDR2，CDR3)：
Figure BDA0001875624950000032
所述的单克隆抗体的轻链可变区由327个碱基组成，编码109个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区；CDR1编码10个氨基酸(SEQ ID NO.10)，CDR2编码3个氨基酸(SEQID NO.11)，CDR3编码17个氨基酸(SEQ ID NO.12)；可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为98.7％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。具体如下：
轻链可变区(4D5L链)的基因序列(横线为CDR区，依次为CDR1，CDR2，CDR3)：
Figure BDA0001875624950000033
轻链可变区(4D5L链)的氨基酸序列(横线为CDR区，依次为CDR1，CDR2，CDR3)：
Figure BDA0001875624950000034
所述的蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体，是通过以高致病性蓝耳病毒为抗原对小鼠进免疫获得；其制备方法包括如下步骤：
(1)动物免疫：
①初次免疫：将灭活的高致病性蓝耳病毒株和弗氏完全佐剂混匀后选择小鼠皮下多点进行注射；
②二次免疫：2周后，将灭活的高致病性蓝耳病毒株和弗氏不完全佐剂混匀后选择小鼠皮下多点进行注射；
③三、四次免疫：重复步骤②2次；
④加强免疫：2周后，以灭活的高致病性蓝耳病毒株为抗原选择小鼠皮下多点进行注射；
⑤3天后取出小鼠的脾脏，碾磨，制备单个脾细胞悬液；
(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞SP2/0与步骤⑤中得到的脾细胞进行细胞融合，待细胞融合后放入培养箱中培养；
(3)融合细胞的筛选与克隆化：细胞融合后第六天取细胞培养上清，用包被有孔蓝耳病毒的ELISA板进行间接ELISA检测，并筛选获得的阳性孔杂交瘤细胞进行有限稀释法克隆化，得到稳定的杂交瘤细胞；
(4)单克隆抗体的制备：小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂1周后，接种步骤(3)中得到的杂交瘤细胞，7～10天收集腹水，离心，得到蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体。
步骤(1)①、②和④中所述的灭活的高致病性蓝耳病毒株的用量为300μg/只。
步骤(1)①中所述的高致病性蓝耳病毒株为高致病性蓝耳病毒TP株(HP-PRRSV TPstrain)。
步骤(1)①中所述的灭活的高致病性蓝耳病毒株和弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
步骤(1)②中所述的灭活的高致病性蓝耳病毒株和弗氏不完全佐剂的体积比为1:1。
步骤(1)中和(3)中所述的小鼠为10周龄雌性Balb/c小鼠。
步骤(2)中所述的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞的细胞个数比为1：10。
步骤(4)中所述的接种的杂交瘤细胞的个数为4*105个。
步骤(4)中所述的离心的条件为：3000rpm离心10min。
所述的蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒中的应用，该抗体能特异性与高致病型蓝耳病毒结合而不与传统型蓝耳病毒结合。
所述的高致病型蓝耳病毒包括高致病性蓝耳病毒TP株、蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株和蓝耳病毒TY株等。
所述的传统型蓝耳病毒包括蓝耳病毒CH-1A株等。
所述的蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在制备可区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒的试剂盒或试纸条中的应用。
一种用于区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒的试剂盒，包括上述蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体。
所述的蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在制备用于诊断蓝耳病毒的药物中的应用。
所述的蓝耳病毒为高致病型蓝耳病毒；包括高致病性蓝耳病毒TP株、蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株和蓝耳病毒TY株等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明获得的抗高致病型蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体蛋白的功能由抗体轻、重链可变区抗原互补决定簇(complementarity determing regions CDRs)CDR1、CDR2、CDR3(是本发明的功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性靶向高致病型蓝耳病毒结合位点的区域。
2、本发明的鼠源性单克隆抗体能够特异的与高致病型蓝耳病毒结合而不与传统型蓝耳病毒结合，进而能有效的诊断出该猪是否感染高致病型蓝耳病毒，从而对感染不同蓝耳病毒的猪进行区别治疗。
3、本发明的单克隆抗体可以区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒，可在临床上用于区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒,也可用于开发区分高致病性蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒抗体诊断试剂盒和试纸条，或可用于制备诊断蓝耳病毒的药物。
附图说明
图1为抗体重链可变区的3个CDR(互补决定簇)区的序列分析图。
图2为抗体轻链可变区的3个CDR(互补决定簇)区的序列分析图。
图3为鼠源性单克隆抗体4D5腹水的效价检测ELISA结果图。
图4为鼠源性单克隆抗体4D5与高致病型蓝耳病毒，传统型蓝耳病毒，Marc145细胞反应的western blot图。
图5为鼠源性单克隆抗体4D5与高致病型蓝耳病毒，Marc145细胞免疫荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。
实施例1抗原制备
灭活的高致病性蓝耳病毒TP株(即HP-PRRSV TP strain，参考文献获得：Yang,H.,et al.,CD163 knockout pigs are fully resistant to highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus.Antiviral Res,2018.151:p.63-70.)。
实施例2单克隆抗体的制备
1、蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体的制备方法如下：
动物免疫：选择10周龄雌性Balb/c小鼠(购于广东省南方医科大学动物中心)。
(1)初次免疫：300μg抗原(实施例1制备)和弗氏完全佐剂按体积比1:1比例乳化后皮下多点注射；
(2)二次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加弗氏不完全佐剂按体积比1:1比例乳化后皮下多点注射；
(3)三次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加弗氏不完全佐剂皮下多点注射(10天后采血测其效价)；
(4)四次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加弗氏不完全佐剂皮下多点注射；10天后采血测其效价，结果如图3所示。证明TP株免疫的老鼠效价高。
(4)加强免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量不加佐剂腹腔注射；
(5)3天后取脾脏融合。
2、细胞融合
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0(购于广州速研生物科技有限公司)，用RPMI1640基础培养基(RPMI Medium 1640basic，gibco购买，货号8114056，使用前加入青霉素与链霉素，每100mL培养基加入1mL含100U青霉素与链霉素双抗)洗涤，吹悬后计数；
(2)取小鼠脾脏，用RPMI 1640基础培养基洗涤、碾磨，制备单个脾细胞悬液，计数；
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按个数比1：10的比例混合在一起，1000rpm离心7min；
(4)弃上清，用滴管吸尽残余液体，在37℃水浴条件下1min内加入1mL的分子量为2000的聚乙二醇(PEG-2000)，静置90秒，2～4min内加入15mLRPMI 1640基础培养基终止反应；
(5)1000rpm离心7min，弃上清，用100mL 10％(v/v)胎牛血清HAT-RPMI1640轻轻混悬；滴加于预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔；37℃，5％(v/v)CO2培养箱内培养。
3、融合细胞的筛选与克隆化
(1)于细胞融合后第六天取细胞培养上清，用包被有300ng/孔灭活的高致病性蓝耳病毒TP株的ELISA板进行间接ELISA检测，阳性孔经过荧光法跳出阳性细胞团；
(2)将筛选到的阳性孔杂交瘤细胞进行有限稀释法克隆化，经过三次亚克隆筛选得到稳定的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞4D5)。
4、单克隆抗体的大量制备
(1)取10周龄雌性Balb/c小鼠(购于广东省南方医科大学动物中心)腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；
(2)1周后于小鼠腹腔接种4*105个杂交瘤细胞，细胞接种7～10天后可诱生腹水；
(3)待腹水尽可能多时抽取腹水；
(4)间隔1～2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm离心10min，取上清冻存于-20℃。
5、测序
经测序，所得抗体(鼠源性单克隆抗体4D5)的可变区基因包括重链可变区基因和轻链可变区基因；其中：
重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述重链可变区由357个组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区；CDR1编码8个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码13个氨基酸(如附图1所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达95.6％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异；
轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述轻链可变区由327个碱基组成，编码109个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码3个氨基酸，CDR3编码17个氨基酸(如附图2所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为98.7％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。
实施例3本发明单克隆抗体区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒
1、ELISA实验验证单克隆抗体区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒
(1)包被：用碳酸盐包被缓冲液分别稀释PRRSV TP株(实施例1中灭活的高致病性蓝耳病毒TP株，简称蓝耳病毒TP株)，PRRSV CH-1a株(购于山东绿都生物科技有限公司，简称蓝耳病毒CH-1A株，蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株，蓝耳病毒TY株(病毒株均购于山东绿都生物科技有限公司)，MARC-145(Marc145细胞，购于广州亚历山生物科技有限公司)。分别在不同的聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml含PRRSV TP株的包被液和含PRRSVCH-1a株的包被液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。
(2)封闭：每孔加入5％(w/v)脱脂奶粉，置37℃孵育1小时，然后洗涤。
(3)加4D5培养上清：于各反应孔中，滴加杂交瘤细胞4D5培养上清。37℃孵育1小时，洗涤。
(4)加二抗：于各反应孔中，滴加稀释4000倍的羊抗鼠IGg抗体0.1ml。37℃孵育40min，洗涤(二抗购于艾斯金生物技术有限公司)。
(5)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(TMB显色液)底物溶液0.1ml，37℃10分钟。
(6)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(7)结果：鼠源性单克隆抗体4D5与高致病型蓝耳病毒，传统型蓝耳病毒，Marc145细胞反应Elisa图如图4所示。酶标仪测吸光值，结果如表1所示，结果显示包被PRRSV TP株的孔的OD450值明显高于包被PRRSV CH-1a株的OD450值。
表1鼠源性单克隆抗体4D5与高致病型蓝耳病毒、传统型蓝耳病毒反应WB
Figure BDA0001875624950000091
表中：“OVRFLW”表示超过检测范围。
2、免疫荧光实验验证单克隆抗体区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒
(1)待Marc145细胞(购于广州亚历山生物科技有限公司)长满80％以上，吸走板中液体；
(2)以无血清的DMEM培养基稀释PRRSV TP株病毒(实施例1中灭活的高致病性蓝耳病毒TP株)，感作1.5h后，将细胞液轻轻吸去。
(3)更换为含10％(v/v)的FBS的DMEM培养基，CO2培养箱(37℃，5％(v/v)CO2)培养48h；
(4)先用37℃预温的1×PBS缓冲液(0.05M，pH7.4)漂洗细胞3遍(每次浸泡2min)；
(5)经过上面清洗后向96孔中中缓慢加入100μL预冷的2％(w/v)多聚甲醛，放入4℃冰箱中放置20～30min。固定结束后预冷的1×PBS缓冲液(0.05M，pH7.4)漂洗3遍(每次浸泡2min)，然后进行穿透；
(6)经上面步骤清洗过后，每孔加入100μL 0.3％(v/v)的Triton X-100常温放置10min，然后用1×PBS漂洗缓冲液1次(每次浸泡5min)；
(7)封闭：用1％(w/v)的脱脂奶粉(96孔板中进行，用1×PBS缓冲液(pH7.4)来配制1％(w/v)的脱脂奶粉)把96孔全部浸泡即可(一般加入100μL)，4℃封闭2h；然后把封闭液丢弃，加入一抗处理；
(8)一抗处理：(先用1×PBS缓冲液来配制1％(w/v)的脱脂奶粉，再用1％(w/v)的脱脂奶粉稀释一抗)；
在免疫荧光皿中滴加适量稀释4000倍的4D5抗体(实施例2制备的蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体)，4℃冰箱过夜，然后吸去一抗，用1×PBS缓冲液漂洗3次(每次浸泡5min)；
(9)DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)处理：一抗处理完之后，每孔加入DAPI 50μL/孔，室温10min。然后用1×PBS缓冲液漂洗3次(每次浸泡5min)。
(10)照相：将96孔板避光包裹，待照相。
(11)结果：鼠源性单克隆抗体4D5与高致病型蓝耳病毒，Marc145细胞免疫荧光图如图5所示。结果可以看出4D5只与感染了PRRSV TP株的Marc145细胞反应，证明了4D5产生的抗体是针对PRRSV的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 1
tctggataca cattcattga ctat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 2
gagatttatc ctggaagtgg tcgt 24
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区CDR3
<400> 3
gcaaaccact acggtagtgg ccactggact atggactac 39
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区 CDR1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Val
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区 CDR2
<400> 5
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区 CDR3
<400> 6
Ala Asn His Tyr Gly Ser Gly His Trp Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR1
<400> 7
aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30
<210> 8
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR2
<400> 8
cttgtatcc 9
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR3
<400> 9
cagcacatta gggagcttac acgttcggag gggggaccaa gctggaaaaa a 51
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR1
<400> 10
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR2
<400> 11
Leu Val Ser
1
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区 CDR3
<400> 12
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 13
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Met Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Val
20 25 30
Ile Ser Trp Val Lys Gln Lys Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe Thr
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Ile Thr Ser Asn Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Asn His Tyr Gly Ser Gly His Trp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Lys
100 105
<210> 15
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 15
gtcaagctgc aggagtcagg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gatgatgtcc 60
tgcaaggctt ctggatacac attcattgac tatgtgataa gttgggtgaa gcagaaaact 120
ggacagggcc ttgagcggat tggagagatt tatcctggaa gtggtcgtac tttctataat 180
gagaagttca cgggcaaggc cacactgact acagacataa cctccaacac agcctacatg 240
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaaa ccactacggt 300
agtggccact ggactatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 16
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 16
gacattgtga tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaaaaa 327

Claims (6)

1.一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在非疾病诊断目的的区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒中的应用，其特征在于：所述的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示；
所述的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示；
所述的高致病型蓝耳病毒为高致病性蓝耳病毒TP株、蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株或蓝耳病毒TY株；
所述的传统型蓝耳病毒为蓝耳病毒CH-1A株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；编码所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～9所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在制备可区分高致病型蓝耳病毒和传统型蓝耳病毒的试剂盒或试纸条中的应用，其特征在于：所述的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示；
所述的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示；
所述的高致病型蓝耳病毒为高致病性蓝耳病毒TP株、蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株或蓝耳病毒TY株；
所述的传统型蓝耳病毒为蓝耳病毒CH-1A株。
6.一种蓝耳病毒鼠源性单克隆抗体在制备用于诊断蓝耳病毒的试剂中的应用，其特征在于：所述的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示；
所述的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示；
所述的蓝耳病毒为高致病型蓝耳病毒；
所述的高致病型蓝耳病毒为高致病性蓝耳病毒TP株、蓝耳病毒JN株，蓝耳病毒QT株，蓝耳病毒LQ株或蓝耳病毒TY株。
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