CN112458060B - 1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用 - Google Patents

1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2020108，分类命名Mus musculus F4‑4。该杂交瘤细胞株分泌得到的抗1型猪星状病毒的单克隆抗体，是首次得到的对1型猪星状病毒有竞争效果的单克隆抗体，该单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。同时，发明人还建立了相应杂交瘤细胞株的制备方法。据此，还可以建立和制备1型猪星状病毒竞争ELISA检测方法及其试剂盒。研究表明，应用本发明的ELISA检测方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，可用于1型猪星状病毒血清抗体的检测，这为猪星状病毒免疫抗体水平的检测及流行病学调查提供了技术平台。

Description

1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用
技术领域
本发明属于星状病毒技术领域，尤其涉及一种1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用。
背景技术
猪星状病毒(Porcine Astrovirus，PAstV)在猪群中感染率较高，常与其他肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，在世界各地均有分布，给养猪业造成不小的经济损失。目前，国内外研究中仍没有针对猪星状病毒单克隆抗体制备以及检测方法的相关报道。因此，有必要建立一种便捷、特异的检测方法对该病的诊断、监测和有效控制提供技术手段。
星状病毒(Astrovirus，AstV)是单股正链RNA病毒，无囊膜，主要感染哺乳类和禽类动物，因其基因序列变异度高且具有遗传性，使该病毒成为一种潜在的人畜共患病病毒。星状病毒的基因组大小约6.2-7.7kb，包含3个开放性阅读框(open reading frames,ORFs)，其中位于基因组5′端的ORF1a和ORF1b负责编码病毒转录和复制相关的非结构蛋白(non-structure protein，nsp)；而位于基因组3′端的ORF2通过转录形成亚基因组RNA而编码病毒唯一的结构蛋白，即衣壳蛋白(capsid protein，capsid)。cap蛋白大小约为80-90kDa，由病毒基因组ORF2编码。cap蛋白是PAstV唯一的结构蛋白，决定病毒毒力、细胞嗜性和致病性的主要因素；作为星状病毒唯一结构蛋白，cap蛋白免疫原性较好，且N端保守性较高，可作为血清学检测的靶区域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用，其ELISA检测方法具有高特异性、高灵敏度、高准确度和操作简单等特点，可实现对1型猪星状病毒的快速血清学检测。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2020108，分类命名Mus musculus F4-4。
上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体F4-4。
所述单克隆抗体F4-4在ELISA中的应用。
ELISA针对1型猪星状病毒。
猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包含上述的单克隆抗体F4-4。
上述杂交瘤细胞株的制备方法，用pGEX-4t-1-cap-1作为抗原免疫小鼠；收集免疫后的小鼠的脾细胞，并将所述脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合得到融合细胞；采用HAT、HT缺陷型培养基对所述融合细胞进行选择培养；以及用pGEX-4t-1-cap-1蛋白抗原检测所述融合细胞的培养上清中的抗体，筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体F4-4的杂交瘤细胞F4-4。
发明人针对1型猪星状病毒检测存在的问题，运用杂交瘤技术获得了一株杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2020108，分类命名Mus musculus F4-4。该杂交瘤细胞株分泌得到的抗1型猪星状病毒的单克隆抗体，是首次得到的对1型猪星状病毒有竞争效果的单克隆抗体，重复性试验显示不同批次的变异系数均小于10％，特异性试验表明除PAstV-1阳性血清外其余血清均无法阻断与抗原的反应，因而该单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。同时，发明人还建立了相应杂交瘤细胞株的制备方法。据此，还可以建立和制备1型猪星状病毒竞争ELISA检测方法及其试剂盒。研究表明，应用本发明的ELISA检测方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，可用于1型猪星状病毒血清抗体的检测，这为猪星状病毒免疫抗体水平的检测及流行病学调查提供了技术平台。
具体实施方式
研究设计原理
利用纯化的融合蛋白pGEX-4t-1-cap-1(cap蛋白N端保守区域)作为抗原免疫BALB/c小鼠，按常规免疫程序免疫4次后取小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，经筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得杂交瘤细胞系F4-4，通过杂交瘤技术建立抗1型猪星状病毒的单克隆抗体细胞株，并利用获得的单克隆抗体建立了1型猪星状病毒竞争ELISA抗体检测方法。
具体研究试验如下：
实施例1杂交瘤细胞株F4-4单克隆抗体的制备
1.1动物免疫
第一次免疫将切胶纯化的pGEX-4t-1-cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，按照100μg/只腹腔注射6周龄BALA/c雌性小鼠。
第二次免疫：间隔14天，将乳化剂换成弗氏不完全佐剂，依照第一次免疫相同操作，100μg/只腹腔注射小鼠。
第三次免疫：间隔14天，具体免疫操作同第二次免疫。
加强免疫：间隔7天，100μg/只腹腔注射纯化的蛋白。3天后准备细胞融合。
其中，pGEX-4T-1-cap-1的构建及鉴定如下：
根据已知的保守区序列，结合表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，运用Vazyme公司开发的CE Design V1.04引物设计软件，设计扩增保守区片段的特异性引物，引物序列如表1。
表1引物序列
Figure GDA0002898025290000031
上、下游各引入BamHI酶切位点，引物由华大基因公司合成。
以本实验室前期构建的猪星状病毒全长质粒为模板扩增衣壳蛋白保守区基因(SEQ.ID.No.1)。反应程序：98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸45s；共35个循环。扩增后取PCR产物5μl于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，PCR产物大小与目的条带大小一致。PCR产物用小量胶回收试剂盒回收纯化。
将PCR回收产物与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。挑取阳性克隆，用带氨苄青霉素抗性的LB培养基扩增培养。按质粒提取试剂盒(plasmid MiniprepKit)说明书提取质粒，对重组质粒进行PCR及双酶切鉴定，阳性质粒命名为pGEX-4T-1-cap-1，送华大基因生物工程公司测序，测序结果用DNAstar软件进行比对，测序结果显示无突变。之后进行酶切鉴定，实验结果表明目的片段(SEQ.ID.No.4)已插入到质粒中且酶切位点无突变产生，提取的质粒为阳性质粒，可进一步用于重组蛋白的表达。
将重组质粒pGEX-4T-1-cap-1转化大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆菌，接种于LB培养基。于37℃摇床200r/min振荡培养过夜，按1:100的比例接种至5ml LB培养基中。培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达6h后收菌。将1.5ml菌液离心，取沉淀，加入40μl 1％SDS和10μl蛋白上样缓冲液，振荡混匀后，沸水煮5min，稍离心，取上清10μl进行10％SDS-PAGE分析。按照GST蛋白纯化试剂盒操作说明提纯蛋白。使用电转印仪将SDS胶面蛋白转移至PVDF硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉PBST封闭液37℃封闭3h，然后将膜装入内有GST标签一抗(1：5000稀释)的无菌小塑料袋中，孵育结合1h，用TBST室温摇床上脱色，洗3次，每次5min。再加入二抗(1：50000稀释，羊抗鼠IgG-HRP购自Proteintech公司)，室温孵育结合50min，然后用TBST在摇床上洗3次，每次5min。ECL显色。
实验结果表明，含有阳性重组载体的大肠杆菌在IPTG诱导下表达，不同诱导时间的产物经SDS-PAGE检测，在大约43KD处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致，而空载体菌诱导后，没有出现此蛋白条带纯化的蛋白为所要表达的目的蛋白。
1.2细胞融合
1.2.1融合前一天，取一只正常鼠取其腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，具体方法如下；
细胞融合前一天，取一只阴性BALA/C小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阴性对照血，处死后将其浸泡在75％酒精中，紫外照射等待15min。
预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10μL枪头固定好小鼠四肢。
用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开一个小口(不可剪破腹膜)。用镊子剥开腹部皮肤，使皮肤与腹膜分离，暴露腹膜，用酒精棉球消毒腹膜表面。
在平皿中倒入30mL HAT培养基，取2mL注射器针头与10mL注射器针管，安装好后吸取HAT培养基。
用镊子轻轻提起腹膜，注射器将培养基缓慢推进腹腔，再吸出腹腔中液体。不可吸到腹腔中器官粘膜及脂肪组织。冲洗小鼠腹腔3-5次。冲洗过程中可用酒精棉球不断轻轻按压腹腔，便于收集腹腔液体。尽可能充分收集腹腔液体后，800rpm离心10min.
弃上清，用HAT培养基重悬细胞，将细胞铺于96孔板中培养，100μL/孔。放入培养箱(37℃、5％CO2)中过夜培养。
1.2.2免疫鼠脾细胞的制备，具体如下：
加强免疫3天后，取实验小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阳性血，处死后将其浸泡在75％酒精中，紫外照射等待15min。
预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10μL枪头固定好小鼠四肢。用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开皮肤及腹膜。小鼠脾脏的位置大致在小鼠左上侧靠近背部，找到脾脏并钝性分离。
将脾脏表面的组织清理干净，放入干净平皿中，并倒入30mL RPMI-1640培养基(不含血清)。
轻轻用镊子固定好脾脏，用5mL注射器吸取培养基从脾脏一端扎入并冲洗，反复多次冲洗至脾脏颜色又深红色变为白色、体积由大变小为止。将冲洗下来的脾细胞用铜网过滤。将过滤后的脾细胞液转至50mL离心管中800rpm离心10min。
弃上清，用清理液清洗细胞2次，弃上清，用清理液重悬细胞。
1.2.3细胞融合按照细胞融合试剂盒(购自上海杰美基因)说明进行，具体方法如下：
将准备好的骨髓瘤细胞悬液与脾细胞悬液混合，800rpm离心10min，弃上清，用5-10mL清理液清洗细胞，800rpm离心10min。
弃上清，轻弹管底使细胞松散，边转动离心管边缓慢加入1500μL融合剂(融合剂实验开始前需放入37℃培养箱中预热)。将离心管放入37℃培养箱中融合2min。
取出离心管，缓慢加入10mL清理液终止融合反应。800rpm离心10min，弃上清，加入40mL配制好的HAT培养基，100μL/孔加入预先铺好饲养层细胞的96孔板中。放入37℃，5％CO2培养箱培养。
融合3天后，观察细胞生长状态，用HAT培养基半换液。即每孔吸出100μL旧培养基，加入新培养基。注意操作要缓慢，防止吹散细胞，造成细胞死亡。融合1周后，用HAT培养基全换液。换液3-5天后，吸取上清用间接ELISA及IFA检测。
1.3阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆
将pGEX-4t-1-cap-1蛋白和pGEX-4t-1空载体诱导产物分别包被酶标板，4℃包被过夜，用PBST清洗后加入5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭3h，PBST清洗后备用。将培养1周后的融合板换液，3-4天后可观察孔中杂交瘤细胞的形成，取上清液加入到包被的酶标板中进行ELISA试验，筛选阳性杂交瘤细胞株。
对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，以有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆3次，每次亚克隆后都利用ELISA实验对单克隆孔进行检测，筛选稳定分泌的单克隆扩大培养，最终获得一株稳定分泌的单克隆抗体细胞株，命名为F4-4。
为了鉴定杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性，将细胞冻存后复苏并进行传代，ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。
该杂交瘤已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：
杂交瘤细胞株F4-4(Mus musculus F4-4)，保藏编号为CCTCC NO:C2020108，保藏日期：2020年7月13日，保藏地址为：武汉·武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
杂交瘤细胞F4-4在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在含有5％CO2，37℃条件下培养，细胞生长状态良好，抗体分泌稳定。
实施例2腹水的制备及效价测定
2.1腹水的制备
选取大龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注射液体石蜡，200μL/只。提前复苏培养阳性杂交瘤细胞，注射液体石蜡一周后，将一个T75瓶细胞用1640培养基(不含血清)吹落，800rpm离心5min，再取200μL相同培养基重悬细胞。将200μL细胞重悬液腹腔注射小鼠。用同样方法取SP2/0细胞重悬液200μL腹腔注射小鼠作为阴性对照。5天后观察小鼠腹腔胀大情况，及时进行腹水采集。采集的腹水3500rpm离心15min，弃去最上面脂肪层及最下面组织层，吸取中间淡黄色透明液体，-80℃冻存。
2.2腹水纯化
使用Protein L Resin纯化腹水。具体操作如下：
将腹水从-80℃中取出放在冰上融化，用0.45μm滤器过滤腹水。过滤后用结合液1：1稀释腹水，取1mL纯化介质装柱，水平静置。待介质沉降完全后，将缓冲液排出。加入5mL结合缓冲液，使介质达到平衡，流动排出缓冲液，控制流速约为1mL/min。加入稀释好的腹水，控制流速约为1mL/min。收集流穿液。将流穿液反复收集后再上样，重复3-5次。用30mL洗涤缓冲液清洗介质，控制流速约为2mL/min排出缓冲液。用10-15mL洗脱缓冲液洗脱免疫球蛋白，控制流速约为1mL/min排出洗脱液。收集洗脱液并立即用中和缓冲液(总洗脱液的1/10体积)中和至pH7.4。收集最洗脱液进行SDS-PAGE检测抗体纯化效率。
2.3腹水效价测定及亚型鉴定
采用间接ELISA检测方法，将腹水作为一抗，按照1：1000、1：5000、1：10000、1：50000、1：100000进行稀释，腹水效价可达105。
根据Roche公司提供的抗体亚型鉴定试剂盒(购自Roche 11493027001MouseMonoclonal Antibody Isotyping Kit)鉴定单克隆抗体F4-4亚型，结果显示该单抗属于IgG2b亚类。
实施例3 1型猪星状病毒竞争ELISA检测方法的建立
3.1酶标板的制备
通过方阵法确定最适包被浓度，将采用GST柱纯化的pGEX-4t-1-cap-1蛋白不同浓度稀释，抗原包被最适量为200ng/孔，在37℃包被1h；
3.2洗涤
配制洗涤液，向PBS中加入0.05％的tween-20，配制的PBST作为本方法的洗涤液。将3.1中包被的酶标板按照200μl/孔加入PBST洗涤液，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干弃去包被液，加入5％BSA作为封闭液，37℃封闭2h；弃去封闭液后得到包被抗原的酶标板。
3.3一抗最适稀释度及待检血清最适稀释度的选择
将未知血清样品与PH＝9.6的磷酸盐缓冲液1：1稀释，得到待检血清样品，加入到3.1中得到的酶标板中，37℃孵育40min，使血清抗体与包被的抗原结合，再加入稀释度为1：10000的纯化的腹水F4-4，37℃孵育40min，使1型猪星状病毒单克隆抗体结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到竞争反应后的酶标板。
3.4重复3.2的步骤。
3.5酶标记抗体的稀释与反应向
3.4中得到的竞争反应后的酶标板中加入酶标记抗体，酶标记抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP，酶标记抗体的稀释度为1：5000，37℃反应60min。
3.6重复3.2的步骤。
3.7显色与终止
向3.6中得到的酶标板中加入TMB显色液，避光孵育15min后，加入终止液，混匀孵育5min终止反应，混匀后测定OD450nm值。
3.8结果判定
确定阴阳临界值为当检测样品PI≥X+3SD＝0.570判定样品为阳性，当检测样品PI≤X+2SD＝0.439判定样品为阴性，中间值为可疑样品。根据3.3中测定的吸光值计算待测样品的抑制率。抑制率(PI)＝(阴性对照OD450值-待测样品OD450值)/阴性对照OD450值×100％。
3.9符合率确定
用实验室前期建立的间接ELISA方法，对实验室保存的40份已知为PAstV阴性血清进行检测，其中20份阴性，20份阳性。经测定OD450值发现，20份阴性样品中19份显示阴性，1份为可疑样品。20份阳性样品全部为阳性，计算符合率为95％。
序列表
<110> 广西大学
<120> 1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctagca agtctggcaa agatgtcact gtcaaggtcg aaaataacac cggccgtggc 60
aggagcagat cccgctctag atctcggtct agagccagga acaaaaatgt taaaattacc 120
atcaactcta aaccaggagc gaacggagga cagcgcagac ggggtaaacc tcagtctgat 180
aagcgtgtcc gtaatattgt caaacaacag cttgacaaat caggtgtcac aggtccaaaa 240
ccagcaatcc gtcaacgggc aacagcaacc cttggaacca ttggaagcaa ctccagtggg 300
aagacggagc tcgaggcatg cattctcacg aatcccgttc ttgtcaagga taacacgggg 360
aataacacgt ttggtccgat cgttgcttta ggagcgcagt attcgctatg gcgcatacgc 420
tacctacgcc tcaaatttac accaatggta tag 453
<210> 4
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Ser Lys Ser Gly Lys Asp Val Thr Val Lys Val Glu Asn Asn
1 5 10 15
Thr Gly Arg Gly Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ala
20 25 30
Arg Asn Lys Asn Val Lys Ile Thr Ile Asn Ser Lys Pro Gly Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Gln Arg Arg Arg Gly Lys Pro Gln Ser Asp Lys Arg Val Arg
50 55 60
Asn Ile Val Lys Gln Gln Leu Asp Lys Ser Gly Val Thr Gly Pro Lys
65 70 75 80
Pro Ala Ile Arg Gln Arg Ala Thr Ala Thr Leu Gly Thr Ile Gly Ser
85 90 95
Asn Ser Ser Gly Lys Thr Glu Leu Glu Ala Cys Ile Leu Thr Asn Pro
100 105 110
Val Leu Val Lys Asp Asn Thr Gly Asn Asn Thr Phe Gly Pro Ile Val
115 120 125
Ala Leu Gly Ala Gln Tyr Ser Leu Trp Arg Ile Arg Tyr Leu Arg Leu
130 135 140
Lys Phe Thr Pro Met Val
145 150
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatctggttc cgcgtggatc catggctagc aagtctggca aa 42
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccgggaat tccggggatc cctataccat tggtgtaaat ttgaggc 47

Claims (5)

1.一株杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2020108，分类命名Mus musculus F4-4。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体F4-4。
3.权利要求2所述单克隆抗体F4-4在ELISA试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ELISA针对1型猪星状病毒。
5.一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于包含权利要求2所述的单克隆抗体F4-4。
CN202010873888.5A 2020-08-26 2020-08-26 1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用 Active CN112458060B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2014153168A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Porcine astrovirus sequences and uses thereof
CN111551750A (zh) * 2020-06-17 2020-08-18 广西大学 猪星状病毒间接elisa检测试剂盒

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