CN116621976B - 抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用方法。该单克隆抗体包含抗体重链的Ig结构域VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及抗体轻链的Ig结构域VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，前三者的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示，后三者的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:5所示。该单克隆抗体为IgG1亚型，抗体的亲和力高，免疫能力强，具有稳定性好，活性高、亲和力强、灵敏度高、特异性强等优点；与PEDV和TGEV等其他猪肠道病毒无交叉反应，可用于PDCoV诊断试剂盒开发，能够有效进行PDCoV鉴别诊断的推广与应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用。
背景技术
目前已发现的猪消化道冠状病毒传染性肠胃炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪代尔塔冠状病毒(PDCoV)，常引起猪肠道疾病，导致呕吐、腹泻、脱水，发病率及死亡率较高。其中，PDCoV属于代尔塔冠状病毒属，为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒，其基因组全长约25kb，包括5’端非编码区，3’端非编码区以及至少7个开放阅读框。其中开放阅读框编码主要的病毒蛋白，包括ORF1a/1b，纤突(Spike，S)蛋白、小膜(Envelope，E)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、非结构蛋白6(NS6)、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白、非结构蛋白7(NS7)。
据研究，PDCoV与天然感染的临床病例相关，这些病例主要表现为仔猪严重腹泻，呕吐和脱水，以及典型的萎缩性肠炎的组织病理学损伤，发病率和死亡率高达50～100％，给养猪业造成严重的经济损失。该病毒感染在我国猪群中已经流行，其感染所导致的临床症状与PEDV和TGEV等其他猪肠道病毒感染症状非常相近，在临床上很难通过肉眼判断对其进行鉴别诊断，目前尚无可用于PDCoV治疗的有效药物或疫苗，也没有用于鉴别诊断PDCoV病毒感染的特异性抗体。
现有报道中，针对PDCoV的单克隆抗体主要是抗S蛋白单抗及抗N蛋白单抗。制备PDCoV单抗的抗原蛋白主要通过原核表达体系获得，但S蛋白其分子量较大，很难在体外表达体系中获得大量全长、保留原始构象、高纯度的蛋白，在其基础上制备的单克隆抗体存在与PDCoV毒株亲和力低、反应性差等问题。由原核表达体系获得的N蛋白活性、免疫原性和纯度较低也导致了其制备的单克隆抗体出现存在与PEDV和TGEV等其他猪肠道病毒交叉反应等特异性差、灵敏性低的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含抗体重链的Ig结构域VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及抗体轻链的Ig结构域VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示；所述VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:5所示。
作为本发明的优选方案，所述单克隆抗体为全长抗体、Fab抗体或F(ab’)2抗体。
作为本发明的优选方案，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明进一步提供了编码前述单克隆抗体的基因，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.8所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了前述任意一种单克隆抗体的应用方法，是以所述单克隆抗体制备用于检测PDCoV的试剂盒。
作为本发明的优选方案，是将所述试剂盒以血清学检测的方式加以使用。
本发明还提供了一种用于PDCoV检测的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1或2所述的任意一种单克隆抗体。
作为本发明的优选方案，该试剂盒是ELISA检测试剂盒、使用免疫层析试纸条的免疫层析诊断试剂盒、免疫组化试剂盒中的任意一种，使用试剂盒时的检测方式为血清学检测。所取待检测样本为静脉血。
与现有技术相比，本发明的技术效果是：
1、本发明提供的抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体为IgG1亚型，抗体的亲和力高，免疫能力强，具有稳定性好，活性高、亲和力强等优点。
2、本发明提供的单克隆抗体灵敏度高、特异性强，与PEDV和TGEV等其他猪肠道病毒无交叉反应；可以用于PDCoV诊断试剂盒开发，能够有效进行PDCoV鉴别诊断的推广与应用。
附图说明
图1为实施例1中表达及纯化的PDCoV N蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析图。
图2为实施例2中PDCoV N蛋白免疫小鼠后血清抗体效价分析。1-5分别为5只不同小鼠的血清样本。
图3为实施例2中单克隆抗体的效价测定分析。
图4为实施例3中单克隆抗体的Western分析及特异性检测。
图5为实施例2中单克隆抗体在间接免疫荧光方法检测PDCoV中的应用。
图6为实施例2中单克隆抗体在间接免疫荧光方法中的特异性分析，该单抗不与PEDV病毒反应。
图7为实施例2中单克隆抗体在间接免疫荧光方法中的特异性分析，该单抗不与TGEV反应。
图8为实施例5中单克隆抗体在Western blot方法检测PDCoV中的应用。
具体实施方式
本发明通过真核表达体系获得纯度高、活性好、接近天然蛋白构象的PDCoV核衣壳蛋白，并免疫小鼠获得分泌特异性抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆细胞株。
“CDR”(complementarity－determining regions)在免疫学中叫做互补决定区或互补决定簇，它是Ig和TCR蛋白质的短片段，含有不同Ig或TCR间的大多数序列差异并能与抗原相接触。在本发明所述抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体中，在每一条抗原受体多肽链上有3个CDR，每个完整Ig或TCR分子上有6个CDR，分别为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VH和VL分别指抗体重链和抗体轻链的Ig结构域。这些“超变”片段表现为环状结构，一起形成能与抗原的三维结构互补的表面。
实施例1：PDCoV N蛋白的制备
实验方法：
重组表达质粒构建：N蛋白基因序列如SEQ ID NO：10所示，使用特异性引物(F：GGGTTCCGGCAGCGGTTCTGCTGCACCAGTAGTCCCTACTACTGACG，序列SEQ ID NO.11；R：CGCTGCTGATTCCTGCTTTATCTC，序列SEQ ID NO.12)，以病毒基因组cDNA为模板进行PCR，用同源重组方法将PCR纯化产物，插入到pFASTBac真核表达载体，获得有N蛋白基因序列的重组质粒pFASTBac-PDCoV-N。将测序验证正确的pFASTBac-PDCoV-N表达载体质粒转化至大肠杆菌DH10Bac中，涂布于含100μLX-gal和5μL IPTG的LB平板上，37℃过夜培养，进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落于5mL含有三抗(卡那霉素、四环素和庆大霉素)的LB液体培养基中，振荡培养14h，取菌液做划线培养分离单菌落并保存。
真核表达：利用试剂盒抽提PDCoV N蛋白重组杆状病毒质粒，将1μL杆粒(质量小于5μg)加入200μL SF900Π培养基，将16μL转染试剂加入184μL SF900Π培养基，各放置5min后混合，孵育25min。期间，用无三抗的SF900Π培养基清洗SF9细胞两次。待孵育完成后，往细胞培养瓶中缓慢加入共孵育混合物，再补充无三抗的SF900Π培养基600μL。转染5h后换液，先用含有三抗的SF900Π培养基清洗细胞两次，再往培养瓶中加入5.5ml含有三抗的SF900Π培养基，每天观察细胞病变情况。5天后收获细胞冻融后离心取上清，得到P1代病毒储液，分装于1.5mL EP管中，每管500μL，置于-80℃保存。取1瓶75cm2方瓶的SF9细胞，中加入500μL P1代病毒储液，置于27℃烘箱中孵育，每天观察有无病变，3～5天后收获细胞，冻融后离心取上清，得到P2代病毒储液，分装于1.5mL EP管中，每管500μL，置于-80℃保存。采用同样的方法扩增P3代病毒储液。取2瓶75cm2方瓶的SF9细胞，将细胞转入含100mL SF 900ⅡSFM培养基的锥形瓶中培养，细胞计数板记下初始细胞密度，置于27℃培养箱中振荡培养，每12h进行细胞计数。待细胞密度达到1.2×106～2.0×106个细胞/mL时，向细胞中加入6mL P3代病毒储液，轻轻混匀，继续于27℃培养箱中振荡培养。72h左右收获细胞，冻融后离心取上清。
蛋白纯化：取2mL镍琼脂糖凝胶，加到12mL亲和层析柱空柱中，混匀镍柱填料。待镍柱内乙醇流尽后，向镍柱中加满50mM PBS洗涤缓冲液，平衡镍柱。将收集到的细胞上清小心的加入镍柱内，控制流速在5s一滴，收集流穿液。向镍柱中加三倍体积的5mM咪唑洗脱杂蛋白，收集洗脱液。再加入3mL 400mM咪唑，将镍柱内的琼脂糖凝胶吹匀，待镍琼脂糖沉淀后，收集洗脱下来的目的蛋白，分装，置于-20℃保存。
SDS-PAGE分析：配制SDS-PAGE胶；分别取40μLSF9细胞上清、过柱流穿液、5mM咪唑洗脱液、目的蛋白，加入10μL 5×Loading Buffer吹打混匀，在沸水锅内加热10min；组装好电泳槽，倒满电泳液，上样，按照先80V 30min后120V 90min的程序进行电泳；电泳结束后，将胶置于考马斯亮蓝染液中，37℃摇床上摇2h进行染色，后置于脱色液中脱色，每隔1h换一次脱色液，待条带清晰可见后置于凝胶成像仪上拍照观察结果。
Western blot分析：将SF9细胞上清、过柱流穿液、5mM咪唑洗脱液、目的蛋白进行SDS-PAGE电泳。转膜：剪去与需要转移的聚丙烯酰胺凝胶相同大小的PVDF膜，转膜前将PVDF膜在甲醇中激活1min后转入湿转缓冲液中浸泡，滤纸、海绵直接放入湿转缓冲液中浸泡。按照(+)厚海绵-薄滤纸-PVDF膜-胶-薄滤纸-厚海绵(-)顺序，200mA湿转1h。转膜结束后，将PVDF膜放入新配制的5％的脱脂奶粉封闭液中，37℃摇床封闭1h。封闭结束后，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min。一抗孵育：用0.5％脱脂奶粉1∶2000稀释鼠源His单抗，4℃摇床过夜孵育。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min。二抗孵育：用0.5％的脱脂奶粉1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃摇床孵育1h。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min。加200μL显色液，置于凝胶成像仪进行拍照记录实验结果。
实验结果：
成功获得PDCoV N基因片段(1029bp)，并用融合PCR将蜂素信号肽及His标签融合后连接至pFASTBac载体上，经PCR及测序验证，获得重组pFASTBac-PDCoV N质粒。成功将质粒导入大肠杆菌DH10Bac中，经蓝白斑筛选后及PCR测序，获得重组大肠杆菌DH10Bac-pFASTBac-PDCoV N。抽取杆粒导入SF9细胞，成功获得P1、P2、P3代次的杆状病毒，并获得了大量表达PDCoV N蛋白的SF9细胞上清。将获得的细胞上清进行镍柱纯化，获得纯度较好的PDCoV N蛋白，大小约为42kDa，蛋白浓度为126μg/mL。蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及Western Blot结果见附图1。获得的PDCoV N蛋白可用于后续单克隆抗体制备。
实施例2：PDCoV N单克隆抗体的制备
实验方法：
动物免疫：将纯化得到的重组PDCoV N蛋白与FCA等体积乳化后，背部皮下多点免疫小鼠。两周后换用FIA佐剂等体积乳化后免疫小鼠，间隔两周后进行第三次免疫，同时测定小鼠血清抗体效价。细胞融合前3天，腹腔注射重组PDCoV N蛋白用以冲击免疫。
细胞融合：获取免疫小鼠的新鲜血液和脾脏。将血液分离得到血清，用作单抗筛选时的阳性对照。将脾脏放入六孔板的一个孔中，清洗并去除脾脏外的组织、筋膜和脂肪。将洗净的脾脏放于铜网上。用灭菌过的试管碾压脾脏，直至脾脏被碾碎，滤过铜网。将过滤后的细胞转移至离心管中，1200rpm，28℃离心10min。将四个75cm2方瓶的SP2/0细胞用1640培养基重悬，转移至离心瓶中，1200rpm，28℃离心10min。用培养基将上述两个步骤获得的细胞重悬后合为一瓶，1200rpm，28℃离心10min。再用新的培养基重悬离心重复清洗一次后弃去上清。将离心管悬置在37℃水浴中，1min内滴入37℃预热的PEG1450，边滴边摇动离心管，静置30s后，1min内滴入1mL 1640培养基，静置30s，之后在1min内分别滴入2mL、3mL、4mL、5mL、6mL 1640培养基，分别静置30s以终止融合。1200rpm，28℃离心10min，弃去上清，加入1640筛选培养基(含有三抗+20％血清+50×HAT)重悬，分入10个96孔板中，37℃培养。
阳性杂交瘤细胞筛选及单克隆化：用建立的ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞。用2.5μg/mL的重组PDCoV N蛋白4℃包被过夜。次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h后弃去。用PBST洗涤3次，每次3min。将杂交瘤培养上清分别加入检测酶标板对应孔，l00μL/孔，37℃孵育1h后弃去液体，用PBST洗涤3次，每次3min。用阳性和阴性小鼠血清4000倍稀释分别作为阳性和阴性对照。用二抗稀释液1∶5000稀释羊抗小鼠酶标二抗，以100μL/孔加入酶标板，37℃反应1h，用PBST洗涤3次，每次3min。每孔加入l00μL TMB显色液37℃避光反应10min。每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色，测定450nm处吸光度值，筛选阳性孔细胞。
用含HAT的完全培养基将阳性孔细胞重悬，进行细胞计数，按单克隆化稀释后加入96孔板，37℃培养10天。观察细胞生长情况，每3-4天时加培养基50μL，在第10天时吸取100μL细胞上清进行ELISA检测，初步确定阳性单克隆细胞株，进行保存。
单抗腹水制备及效价测定：选取4周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射1mL灭菌的液体石蜡。约一周后取长满两个75cm2方瓶的单克隆细胞株，重悬进行细胞计数。用1640培养基配成约2×106个/mL的细胞悬液。给注射了液体石蜡的小鼠腹腔注射杂交瘤细胞悬液，每只小鼠腹腔注射1mL。接种后7天左右可见小鼠腹部明显膨大，此时可由腹腔抽取腹水。抽取的腹水13000rpm/min离心10min，收集上清，-20℃保存备用。将小鼠腹水用一抗稀释液从1∶2000倍比稀释到1∶2048000。按所建立的ELISA方法进行腹水效价的测定。
实验结果：
PDCoV N免疫小鼠后，小鼠血清抗体水平显著上升，检测结果如附图2所示。取免疫小鼠的脾细胞与瘤细胞进行细胞融合后，成功筛选得到PDCoV N单克隆抗体，命名为2H7。获得小鼠腹水10mL，经ELISA检测腹水效价达到1∶1024000，结果如附图3所示。
实施例3：单克隆抗体的特异性分析
实验方法：
取PDCoV病毒液20μL，分别加入5μL 5×Loading buffer，于水浴锅中煮样10min。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；以阳性单克隆化杂交瘤细胞上清作为一抗，羊抗鼠HRP标记抗体作为二抗，进行Western blot及分析。以PEDV及TGEV病毒液作为对照，检验杂交瘤细胞分泌抗体的特异性。
实验结果：
如附图4所示，该单抗可与PDCoV结合产生特异性反应，且不与PEDV和TGEV反应。
实施例4：单克隆抗体在间接免疫荧光方法检测PDCoV中的应用
实验方法：
96孔细胞汇合度达到80％时，弃去旧培养基，用缓冲液洗涤两次，加入病毒液，每孔100μL，37℃培养箱培养22h后弃去旧培养基。每孔加入50μL 4％多聚甲醛，在室温固定30min。弃去固定液，用PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入50μL 0.2％Triton X-100，室温透化15min。弃去透化液，用PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔加入1:500稀释的单克隆抗体腹水作为一抗，37℃孵育1h，以小鼠PDCoV多抗血清作一抗对照。弃去上清，用PBS轻轻洗涤两遍，加入1∶1000稀释的FITC标记的荧光二抗，每孔50μL，于37℃避光孵育1h。加入1∶200稀释的DAPI，每孔50μL，室温染核2min，用PBS轻轻洗涤两遍，进行荧光显微镜观察。
实验结果：
如附图5所示，单克隆抗体2H7可与病毒结合，显示病毒在细胞内的分布情况，且用小鼠PDCoV多抗血清作为一抗进行IFA检测背景较多噪点，且非特异性荧光较多，以单抗作为一抗进行IFA检测时结果更特异、清晰。附图6、附图7为PEDV及TGEV感染细胞对照试验，可见PEDV及TGEV的细胞样本中无荧光信号产生，说明该单克隆抗体特异性较好，可用于PDCoV等猪消化道病毒的鉴别诊断。
实施例5：单克隆抗体在Western blot方法检测PDCoV中的应用
实验方法：
取PDCoV病毒液、PDCoV N蛋白各20μL，分别加入5μL 5×Loading buffer，于水浴锅中煮样10min。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，以带有his标签的无关蛋白作为对照；以1:500稀释的单抗腹水作为一抗，以小鼠PDCoV多抗血清作一抗对照。羊抗鼠HRP标记抗体作为二抗，进行Western blot分析。
实验结果：
如附图8所示，单克隆抗体2H7可与全病毒及N蛋白结合反应，显示病毒N蛋白在细胞内的表达情况，且不与无关蛋白反应。以单抗作为一抗时的Western结果比用小鼠PDCoV多抗血清作为一抗时条带更特异、清晰。
实施例6：单克隆抗体编码基因序列分析
实验方法：
用试剂盒提取抗PDCoV N单克隆抗体2H7的杂交瘤细胞的总RNA，逆转录成cDNA。根据抗体重链和轻链的恒定区设计2对简并引物，分别进行PCR扩增，目的片段回收并克隆至T载体测序。
实验结果：
解析得到单克隆抗体2H7包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:5所示。轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.8所示；编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例7：单克隆抗体的具体应用示例
按下述配方制备ELISA试剂盒：
1)10mM pH 7.4PBS缓冲液
NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，KH2PO4 0.27g，加去离子水至800mL，调pH至7.4，定容至1L。
2)10mM pH7.4 PBST缓冲液
10mM pH7.4 PBS缓冲液，每升加入tween-20 500μL。
3)封闭液
取灭菌的10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入各组分终浓度为蔗糖0.05g/mL、proclin-300 0.1％、BSA0.02 g/mL。过滤除菌，无菌分装。
4)一抗稀释液
取10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入终浓度为0.05g/mL甘露醇、0.05g/mL蔗糖、0.1％proclin-300、0.01g/mL BSA。
5)酶标二抗稀释液
取10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入终浓度为0.05％吐温-20(Tween-20)、0.1％proclin-300、0.01g/mL BSA。
6)CBS包被液
取一粒CBS胶囊剂，溶于100mL去离子水中，震荡混匀。
7)终止液
8％浓硫酸111mL，去离子水899mL。
8)0.1％酪蛋白盐
取灭菌的10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入0.1％的酪蛋白盐粉末，沸水浴至粉末溶解。
将该试剂盒以下述方式进行使用：
1)用pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释的PDCoV多克隆抗体，100μL/孔包被酶标板，4℃包被14h；
2)弃去包被液，用PBST洗板3次，每次3min，最后一次拍干；
3)加入封闭液，200μL/孔，置于湿盒中37℃封闭2h；
4)弃去封闭液，拍干；加入用一抗稀释液稀释的待检样品，100μL/孔，同时设2孔阳性对照和阴性对照。置于湿盒中37℃孵育60min；
5)弃去孔中液体，用洗涤液洗板3次，每次3min，最后一次拍干；
6)加入用一抗稀释液稀释的PDCoV单克隆抗体，100μL/孔，置于湿盒中37℃孵育30min；弃去孔中液体，洗涤液洗板3次，最后一次拍干；
7)加入用酶标二抗稀释液稀释的HRP标记抗猪IgG抗体，100μL/孔，置于湿盒中37℃孵育30min；弃去孔中液体，洗涤液洗板3次，最后一次拍干；
8)加入TMB显色液(A液、B液各50μL)，100μL/孔，37℃避光显色10min；
9)加入反应终止液，50μL/孔，混匀后立即测定OD450nm值。
实施例8：单克隆抗体的具体应用示例
按下述配方制备免疫层析胶体金快速检测试剂盒：
1)包被液
取50mM pH 9.6的CBS缓冲液，加入3％甲醇。
2)NC膜封闭液
取10mM pH 7.4PBS缓冲液，加入0.5％ Tween 20、0.5％ PEG2000、2％ BSA和0.02％NaN3。
3)金标抗体稀释液
取10mM硼酸盐缓冲液(BB，pH 8.2)，加入8％蔗糖、2％BSA和0.05％NaN3的。
4)免疫层析胶体金胶体金免疫层析试纸条
检测线(T线)包被PDCoV多克隆抗体，质控线C线包被羊抗鼠IgG，NC膜上C线、T线从上往下依次排列，金标记的PDCoV单抗2H7固定于金标垫。
将该试剂盒以下述方式进行使用：
检测时取适量待测样本滴于加样孔，若样本中含有PDCoV病毒，会与包被于T线的多抗结合，并与相应的金标2H7单克隆抗体结合，从而显色。
实施例9：单克隆抗体的具体应用示例
按下述配方制备免疫组化试剂盒：
1)10mM pH 7.4PBS缓冲液
NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，KH2PO4 0.27g，加去离子水至800mL，调pH至7.4，定容至1L。
2)10mM pH7.4 PBST缓冲液
10mM pH7.4 PBS缓冲液，每升加入tween-20 500μL。
3)固定液
4％多聚甲醛。
4)透化液
0.5％ Triton-X100。
5)一抗稀释液
取10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入终浓度为0.05g/mL甘露醇、0.05g/mL蔗糖、0.1％proclin-300、0.01g/mL BSA。
6)酶标二抗稀释液
取10mM pH7.4 PBS缓冲液，加入终浓度为0.05％吐温-20(Tween-20)、0.1％proclin-300、0.01g/mL BSA。
将该试剂盒以下述方式进行使用：
1)取待测样本加入固定液，4℃过夜。
2)弃去固定液，用PBS洗3次，每次3min。
3)加入透化液，室温作用15min。
4)弃去透化液，用PBS洗3次，每次3min。
5)加入用一抗稀释液稀释的PDCoV单克隆抗体，置于湿盒中37℃孵育1h。
6)弃去一抗，用PBS洗3次，每次3min。
7)加入用酶标二抗稀释液稀释的HRP标记抗猪IgG抗体，置于湿盒中37℃孵育1h；弃去二抗，用PBS洗3次，每次3min。
8)用显微镜观察成像。
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Claims (7)
1.一种抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7，其特征在于，所述单克隆抗体包含抗体重链的Ig结构域VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及抗体轻链的Ig结构域VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示；所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:5所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体、Fab抗体或F(ab’)2抗体。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.6所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.编码权利要求3所述单克隆抗体的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.8所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
5.权利要求1或2所述任意一种单克隆抗体的应用方法，其特征在于，是以所述单克隆抗体制备用于检测PDCoV的试剂盒。
6.一种用于PDCoV检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的任意一种单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是ELISA检测试剂盒、使用免疫层析试纸条的免疫层析诊断试剂盒、免疫组化试剂盒中的任意一种，使用试剂盒时的检测方式为血清学检测。
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