CN116217718B - 一种猪丹毒抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪丹毒抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一方面公开了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合猪丹毒SpaA蛋白，所述的编码单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括所述的单克隆抗体和猪丹毒SpaA蛋白。该单克隆抗体具有特异性好、亲和力好的优点，可以用于猪丹毒SpaA蛋白抗体的检测以及相关检测产品的开发。

Description

一种猪丹毒抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪丹毒抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的、发生在猪身上的一种病害。急性型呈败血症症状，亚急性型在皮肤上出现紫红色疹块，慢性型为非化脓性关节炎和疣状心内膜炎。猪丹毒是一种急性传染病，广泛分布于世界各地。急性败血症病死率高达80％左右，不死者转为疹块型或慢性型，危害较大。
猪丹毒杆菌属丹毒杆菌属，是一种革兰氏阳性菌，具有明显的形成长丝的倾向，为平直或微弯杆菌，大小为(0.2-0.4)微米×(0.8-2.5)微米。该菌在病猪体内与培养基内形态有所变化，在病料内的细菌单在、成对或成丛排列；在白细胞内通常成丛存在；在陈旧的肉汤培养物及慢性病猪的心内膜疣状物中，多呈长丝状。病菌无运动性，不形成芽孢和荚膜。
近几年的研究发现，猪丹毒杆菌中存在几种相对分子质量为64、66、43kDa的表面蛋白具有免疫保护作用，Makino等人(Makino et al 1998)首先确定了编码蛋白64-66的基因序列，命名为表面蛋白A(spa)，相继发现另外俩个类似基因。血清型1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17和N菌株含有基因SpaA；血清型4、6、11、19和21菌株含有基因SpaB；血清型18菌株有基因SpaC(To and Nagai 2007)。SpaA同血清型菌株的氨基酸序列相似性为96-99％，SpaB的相似性为96-99％，SpaA和SpaB之间的相似性为61-64％，SpaA和SpaC的相似性为63-65％，SpaB和SpaC之间氨基酸序列相似性为66-67％。重组亚单位疫苗可以有效保护宿主抵抗表达同源spa菌株的感染，其中SpaA的保护效果最好，可以达到100％(Imada et al1999)。
目前，猪丹毒市场上主要是灭活疫苗，暂没有亚单位疫苗，也缺乏较好的疫苗抗体评价手段。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目在于提供一种能特异性结合猪丹毒SpaA蛋白的单克隆抗体及其由此开发的用于猪丹毒抗体评价的试剂盒。
本发明一方面公开了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合猪丹毒SpaA蛋白，所述的编码单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
再一方面，本发明还公开了一种检测产品，所述产品包括所述的单克隆抗体。
优选地，本发明所述的产品还包括猪丹毒SpaA蛋白和配套的检测试剂。
再一方面，本发明还公开了一种猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括所述的单克隆抗体和猪丹毒SpaA蛋白以及配套的检测试剂，所述的单克隆抗体的编码重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ IDNO.2所示。
优选地，本发明所述的猪丹毒SpaA蛋白的包被浓度为1μg/ml。
优选地，本发明所述的试剂盒的配套的检测试剂包括样品稀释液、25×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。
再一方面，本发明还公开了一种所述的单克隆抗体在检测猪丹毒SpaA蛋白抗体中的应用。
本发明制备的抗猪丹毒SpaA蛋白的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的猪丹毒SpaA诊断试剂，如胶体金、ELISA等检测试剂盒。
本发明所提供的猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒适用于猪血清中猪丹毒SpaA抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于猪丹毒SpaA抗体的早期筛查、免疫评价(有疫苗时适用)以及流行病学调查等。
附图说明(无)
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中，“抗体”(antibody)是指一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。同一抗体分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)，包括CDRl、CDR2和CDR3，其中，CDR3变化程度更高。VH的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)抗体的CL长度基本一致，但是不同类抗体的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
实施例1：猪丹毒SpaA蛋白的制备
本发明使用的猪丹毒SpaA蛋白由浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司惠赠，其具体制备方法参见中国发明专利CN 113388624 A的实施例。
实施例2：抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的制备
使用常规的杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，简述如下：将实施例1制备的猪丹毒SpaA蛋白作为抗原，对6～8周龄BALB/c雌性小鼠进行3次免疫，三免后3天后取脾细胞与骨髓瘤Sp2/0进行细胞融合。用间接ELISA方法对培养上清进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法细胞克隆，获得1株较好的杂交瘤细胞，命名为4H6。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于小鼠腹水制备，并冻存，于液氮中长期保存。
取6～8周龄BALB/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.5ml/只，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞1×106个。注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，4℃8000rpm离心3min，收集上清液，即为单抗腹水。取1倍体积腹水，加入2倍体积醋酸盐缓冲液(0.06mol/L，pH值4.8)，混合均匀后在室温下边搅拌边加入辛酸(30μl/ml腹水)，4℃澄清2h小时，以4℃12000rpm离心20min，收集上清。再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃静置2小时，4℃3000rpm离心30min，收集沉淀。用2倍体积PBS溶解沉淀后用PBS透析过夜，即获得纯化的腹水抗体，置于-70℃保存备用。使用BCA试剂盒对单克隆抗体进行浓度检测，单克隆抗体的检测结果为1.58mg/ml，将抗体分别分装成0.5ml/管，70℃以下保存备用。
实施例3：单克隆抗体的性能测定
抗体特异性检测：分别取单克隆抗体对链球菌和沙门氏菌提取的总蛋白进行werstern blot检测，以判断其特异性，结果显示，单克隆抗体检测2种抗原均为阴性，检测猪丹毒SpaA蛋白为阳性，说明单克隆抗体的特异性良好。
类及亚类测定：用ELISA试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，鉴定结果显示，单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
单克隆抗体可变区序列的测定：参见中国发明专利(CN 111393525 B)实施例5的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定，编码重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
5.3HRP标记性能测定：使用经典的高碘酸钠法或者市购的HRP标记试剂盒对单克隆抗体进行HRP标记，并使用直接ELISA方法(包被猪丹毒SpaA蛋白，包被量为1μg/ml)测定标记效价(OD值≥1.0时判阳性)，结果为1:10000。说明HRP标记成功，标记效率较高，符合试剂盒开发需要。
实施例4：猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒
使用实施例1的猪丹毒SpaA蛋白和实施例2制备的单克隆抗体建立猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒，以用于猪丹毒的血清抗体检测。
1试剂盒的制备
1.1酶标板的制备：将猪丹毒SpaA蛋白用包被缓冲液(0.05M pH9.6碳酸钠溶液)稀释到1μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃过夜(12～14小时)；取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入封闭液(含2％BSA的PBST溶液)，200μl/孔，37℃孵育2小时。
1.2阳性对照：使用制备的猪丹毒SpaA蛋白与ISA 201佐剂乳化制备疫苗(100μg/ml)免疫健康易感的21日龄仔猪(CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PRRSV抗体抗原均为阴性)，在一免14日和28日分别进行二免和三免，2ml/头/次，三免后7日采血，用间接ELISA方法进行检测，选择效价高于1:10000的猪用于血清制备。对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，3000r/min离心10分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，即为阳性对照。
1.3阴性对照：筛选健康易感的21日龄仔猪(CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PRRSV抗体抗原阴性)，进行颈动脉放血，3000r/min离心10分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，即为阴性对照。
1.4样品稀释液的制备：在1×PBST中加入终浓度为0.1％的防腐剂ProClin300(V/V)和终浓度为2％ BSA(m/V)，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
1.5 25×浓缩洗涤液的制备：为25×PBST溶液中加入终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
1.6酶标抗体的制备：使用样品稀释液1万倍稀释HRP标记的单克隆抗体，即为酶标抗体。
1.7底物溶液的制备：为北京索莱宝生物科技有限公司的单组份TMB显色液或其他通用显色液，定量分装。
1.8终止液的制备：为配制的2M H2SO4，定量分装。
1.9试剂盒的组装：按表1组装试剂盒。
表1试剂盒组装
名称 数量
抗原包被板 2块板(192份/盒)
阳性对照 1ml/管
阴性对照 1ml/管
样品稀释液 12ml/瓶
25×浓缩洗涤液 30ml/瓶
酶标抗体 25ml/瓶
底物溶液 25ml/瓶
终止液 12ml/瓶
说明书 1份
2试剂盒的检测
2.1加样：在每孔中加入50μl样本稀释液，再在对应孔中加入50μl阳性对照、阴性对照和待检血清，振荡混匀。置37℃孵育30分钟。
2.2洗涤：孵育结束后，甩去孔内液体，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3～5次，拍干。
2.3酶标抗体孵育：加入酶标抗体，100μl/孔，置37℃孵育30分钟。
2.4洗涤：孵育结束后，甩去孔内液体，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3～5次，拍干。
2.5显色：加入底物溶液，100μl/孔，置37℃避光孵育10分钟。
2.6终止：加入终止液，50μl/孔，轻微震荡混合均匀。
2.7读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，读取OD450nm值。
2.8S/N值计算按照以下计算公式，计算S/N值。
2.9判定
2.9.1试验成立条件：阴性对照孔每孔OD450nm读数应大于1.0且各孔间最大差值应<0.3，阳性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3。
2.9.2当S/N值大于0.5时判为阴性；当S/N值小于等于0.5时判为阳性。
3试剂盒性能验证：按照上述方法连续生产了3批试剂盒，批号分别为221001、221002、221003，使用这三批试剂盒进行性能验证。
3.1性状检验
试剂盒的外包装洁净、无破损，标签应符合国家有关规定，内包装无破损、无裂痕、无渗漏，品名、批号、保存条件、有效期清晰。其中：
抗原包被板(96孔板)铝箔袋封闭良好，表面光洁、无裂纹、包被板板底清洁、透明、无异物，装量为2块/盒。
阳性对照无色或淡黄色澄清液体，装量为1ml/管，1管/盒。
阴性对照无色或淡黄色澄清液体，装量为1ml/管，1管/盒。
样品稀释液无色或淡黄色澄清液体，装量为12ml/瓶，1瓶/盒。
25×浓缩洗涤液无色澄清液体，低温时有结晶存在，装量为30ml/瓶，1瓶/盒。
酶标抗体无色或淡黄色澄清液体，装量为25ml/瓶，1瓶/盒。
底物溶液无色或淡蓝色澄清液体，装量为25ml/瓶，1瓶/盒。
终止液无色澄清液体，装量为12ml//瓶,，1瓶/盒。
3.2无菌检验将试剂盒中阳、阴性对照、样品稀释液、25×浓缩洗涤液和酶标抗体各组份按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果见表2。
表2五批试剂盒无菌检验结果
批号 221001批 221002批 221003批
阳性对照 无菌生长 无菌生长 无菌生长
阴性对照 无菌生长 无菌生长 无菌生长
样品稀释液 无菌生长 无菌生长 无菌生长
25×浓缩洗涤液 无菌生长 无菌生长 无菌生长
酶标抗体 无菌生长 无菌生长 无菌生长
3.3敏感性验证：三批试剂盒对制备的阳性血清进行梯度检测，最低检测梯度能达到3200倍，说明该试剂盒的敏感性很好。具体数据见表3。
表3敏感性检测结果(S/N值)
样品 221001批 221002批 221003批
阴性对照OD450 1.47 1.44 1.43
阳性对照OD450 0.09 0.09 0.08
1:100 0.06 0.04 0.06
1:200 0.06 0.05 0.05
1:400 0.10 0.08 0.09
1:800 0.16 0.15 0.18
1:1600 0.25 0.29 0.31
1:3200 0.41 0.45 0.48
1:6400 0.68 0.71 0.72
3.4特异性验证：三批试剂盒对7份猪源特异性质控血清进行检测，结果均为阴性，说明本试剂盒的特异性很好。具体数据见表4。
表4特异性检测结果
3.5重复性验证：三批试剂盒对阳性血清和阴性血清的批间和批内的变异系数均小于10％，说明本试剂盒的重复性很好。具体见表5和表6。
表5重复性检测结果(批内)
表6重复性检测结果(批间)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能特异性结合猪丹毒SpaA蛋白，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种检测猪丹毒SpaA蛋白抗体的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述的产品还包括猪丹毒SpaA蛋白和配套的检测试剂。
4.一种猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗体和猪丹毒SpaA蛋白以及配套的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的猪丹毒SpaA蛋白的包被浓度为1μg/ml。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的配套的检测试剂包括样品稀释液、25×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。
7.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备猪丹毒SpaA蛋白抗体检测试剂中的应用。
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Enzyme-linked immunosorbent assay employing a recombinant antigen for detection of protective antibody against swine erysipelas;Yumiko Imada;《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》;第41卷(第11期);第5015-5021页 *

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