CN117088977B - 一种犬c反应蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种犬C反应蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用，属于生物技术领域。所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。所述单克隆抗体可用于制备犬C反应蛋白检测试剂盒和检测试纸条。本发明所提供的犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条用于检测犬C反应蛋白，大大提高了检测灵敏度，降低了检测成本以及缩短了检测时间。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种犬C反应蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用。
背景技术
C反应蛋白（CRP）是动物机体受到病原微生物感染或机体组织损伤等炎症刺激后，由肝脏细胞及时合成的一种急性蛋白。不同种类疾病CRP变化规律不同，犬CRP对疾病敏感度高，能在疾病早期快速升高，及时反映病情。而且CRP的浓度不受到抗生素及免疫抑制剂的影响，受年龄、性别和体重的影响也不大。在治疗中可以准确的对疾病的发展进行监测，犬类受到寄生虫感染之后机体则会出现相同的急性期反应，产生固有免疫应答。
急性期CRP与寄生虫感染有一定的联系，当受到寄生虫感染后血清中CRP含量会出现不同程度的升高。犬只发生肿瘤时机体血清中CRP含量有时也会呈现上升趋势，特别是发生恶性肿瘤时上升情况尤其明显，肿瘤出现溃烂或转移情况时CRP含量会大幅上升。血清中CRP水平不能作为肿瘤发生诊断的主要指标，但可以帮助掌握病情，判定是否存在肉眼无法看到的肿瘤，对患有肿瘤的犬实行持续CRP测定也能够检测肿瘤的复发以及转移等诸多相关情况。犬消化系统疾病主要有胃肠炎、胰腺炎等，多数由细菌感染所致，因此血清中CRP含量会明显上升。细菌性肠炎同样会导致CRP含量上升，所以CRP还能够用在炎性肠炎的诊断和疗效判定。此外，肠梗阻等肠道疾病同样会导致血清中CRP含量的变化。正常犬CRP血清含量很少，通常健康的犬都远远低于10 mg/L，15-20 mg/L被认为是全身炎症的发生，而CRP浓度≥35 mg/L应被视为全身炎症的强力指标。
近30年来，研究者探索出了多种CRP检测方法，主要包括：乳胶凝集法、ELISA以及免疫层析法。在这些检测方法中，乳胶凝集法是半定量检测法，目前已经基本上被淘汰；ELISA能检出极低浓度CRP，但试验流程繁琐、消耗时间长且极低浓度CRP的临床意义有限；胶体金免疫层析局限于定性检测，不能进一步定量反应犬体内CRP浓度。
综上所述，目前市面上的检测方法存在各种技术缺陷缺点，亟需通过免疫学等手段设计、筛选犬C反应蛋白单克隆抗体来实现对犬C反应蛋白特异性检测识别。
发明内容
为此，本发明提供了一种犬C反应蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种犬C反应蛋白单克隆抗体，其含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第31-37位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第52-67位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第100-109位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第24-40位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第56-62位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第95-103位所示。
第二方面，编码所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
第三方面，犬C反应蛋白单克隆抗体是以大肠杆菌载体系统所表达的犬C反应蛋白作为抗原制备获得。
第四方面，犬C反应蛋白单克隆抗体在在制备犬C反应蛋白检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；
优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒。
第五方面，本发明提供一种犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条，所述试纸条是由底板、样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组成；所述结合物释放垫上喷涂有犬C反应蛋白单克隆抗体标记的时间分辨荧光微球；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬C反应蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有兔抗鸡IgY。
所述结合物释放垫1/4被覆盖于样品吸收垫下，所述结合物释放垫上还包被有时间分辨荧光微球标记的鸡IgY。
第六方面，本发明提供一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：
1）制备具有包被有犬C反应蛋白单克隆抗体的检测线和包被有兔抗鸡IgY的质控线的硝酸纤维素膜；
2）制备喷涂有时间分辨荧光微球标记的犬C反应蛋白单克隆抗体与时间分辨荧光微球标记的鸡IgY的结合物释放垫；
3）将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次固定在底板上。
第七方面，本发明提供一种检测犬C反应蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1）样本的制备；
2）上述所述的试纸条检测；
3）检测结果判读。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种犬C反应蛋白单克隆抗体，利用该抗体制备的犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。而且可以减少购买商品化CRP单克隆抗体昂贵的成本。本发明试纸条可实现犬C反应蛋白现场的快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的pET-32a-CRP菌液诱导表达SDS-PAGE鉴定图；
图2为本发明实施例提供的犬CRP单克隆抗体重链可变区核苷酸序列比对结果图；
图3为本发明实施例提供的犬CRP单克隆抗体重链可变区氨基酸序列比对结果图；
图4为本发明实施例提供的犬CRP单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列比对结果图；
图5为本发明实施例提供的犬CRP单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列比对结果图；
图6为本发明实施例提供的犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条的构成图；
图7为本发明实施例提供的犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条特异性测定结果图。
图中，1、底板；2、样品吸收垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水纸；5、检测线；6、质控线；7、结合物释放垫；
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、犬C反应蛋白制备
1.犬C反应蛋白基因合成
根据NCBI上公布的犬CRP基因序列（登录号：NM.001314116.1），将该基因序列做密码子优化后交由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成，合成至pET-32a载体上，以BL21感受态为宿主菌进行保种。
2.表达纯化
取保种的pET-32a/BL21种子液按照1:1000的比例接种至10 mL含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，220 rpm过夜培养。次日，取出活化后的菌液，按照1:100的比例接种至500 mL含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，220 rpm培养约4h，当菌液OD600nm值为0.6时可进行诱导。加入终浓度为0.1 mM的IPTG溶液，于25℃诱导8 h。
3.蛋白纯化
1）样品准备：收集100 mL表达的菌液，离心（10000 r/min，20 min），弃上清，用25mL的缓冲A液（50 mM Tris+300mM NaCl，pH8.2）重悬菌体，超声破碎（功率400 W，超声40min），菌液呈澄清透亮的状态，离心（12000 r/min，10 min），收上清。在上样前用0.22 μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2）样品纯化：将柱装入层析柱，用5倍柱体积的buffer A进行平衡；将样品缓慢加入到平衡好的HIS镍柱子中；用5倍柱体积的buffer A进行清洗；用5～10倍体积的bufferB，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
3）超滤浓缩：纯化后蛋白含量较低，用20 kDa的超滤浓缩管浓缩蛋白并降低咪唑浓度，将原咪唑替换为PBS。
4.SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE检测纯化效果，如图1所示，发现在25 kDa左右有一道明显的条带，与预期蛋白大小相符，证明已成功表达目的蛋白。
实施例2、犬C反应蛋白单克隆抗体的制备
1.动物免疫
用超滤离心管将实施例1制备的犬CRP蛋白浓缩至1 mg/mL，加入等体积完全弗氏佐剂，充分乳化。取2只6周龄、体重约16 g的雌性BALB/C小鼠，每只小鼠50 µg皮下多点注射并腹腔注射。分别在2周后和4周后用不完全弗氏佐剂以相同的抗原量、注射体积和途径进行第2次和第3次免疫。第3次免疫后从尾静脉取血清间接ELISA法测定效价。细胞融合前3天加强免疫，每只小鼠腹腔注射无佐剂的实施例1制备的犬CRP蛋白50 µg。
2.细胞融合
在第3次免疫4周后，采用不含佐剂的实施例1制备的犬CRP对小鼠进行最后追加免疫。脱颈椎处死小鼠，取出脾脏，分离脾细胞。融合当日收集处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞，按2∶1比例将骨髓瘤细胞与脾细胞混合，1000 r/min离心10 min，弃上清，混匀2种细胞。缓慢加入PEG，边加边轻轻搅拌进行细胞融合，用DMEM培养基终止PEG的作用。离心，将细胞悬浮于预热的HAT培养基。按150 μg/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.单克隆杂交瘤细胞的筛选和克隆化
用HAT选择培养液培养融合后杂交瘤细胞7天，HT培养液维持2周，改用RPMI1640培养液培养。观察杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时开始采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性杂交瘤细胞系。采用有限稀释法筛选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养，得到并建立稳定分泌犬CRP抗体的杂交瘤细胞株。扩大化培养后当杂交瘤细胞阳性率达到100%时定株，测定定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价并将定株细胞冻存于液氮中。
4.单克隆抗体制备
采用体内诱生法，选取10只体重16 g左右健康成年雌性BALB/C小鼠，在每只小鼠腹腔中注射0.5 mL石蜡油进行预处理。2周后腹腔接种杂交瘤细胞。明显产生腹水后将小鼠脱颈处死，收集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法和Protein G亲和纯化柱进行纯化抗体并分装冷冻保存。
实施例3、犬C反应蛋白单克隆抗体的鉴定
1.单克隆抗体亚类鉴定
使用Sigma公司的IgG亚类鉴定试剂盒对实施例2中得到的犬C反应蛋白单克隆抗体进行检测，结果表明实施例2中得到的犬C反应蛋白单克隆抗体为IgG1型。
2.单克隆抗体特异性鉴定
分别取犬C反应蛋白、犬瘟热病毒蛋白和犬冠状病毒蛋白按照1 μg/mL进行包被，1mg/mL的实施例2中制备的单克隆抗体做1:5000稀释，验证单抗的特异性。结果如表1所示，实施例2中制备的犬C反应蛋白单克隆抗体与犬瘟热病毒、犬冠状病毒均不发生特异性反应，表示其特异性良好。
表1单克隆抗体特异性鉴定结果
实施例4、CRP单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆
1.杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×107时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2.cDNA第一链的合成
使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取到的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。
3.基因扩增
设计Light链，Heavy链的上游及下游引物。
引物：FL: TGCTGAACTCTTGGACCGAC
RL: CTCGTTCCGGTTGAAGCTCT
FH: CTGCAAGTGAAGGTGTTGCC
RH: CAAAGTGACTTGCGTGGTGG
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μL。模板3 μL，上游引物（10 μM）2.5 μL，下游引物（10 μM）2.5 μL，2×Taq酶25 μL，无菌水17 μL。
降落PCR反应条件为：98℃ 30 s；98℃ 15 s，64℃-58℃ 30 s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30 s；98℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循环15次；72℃ 7 min结束程序。
4.PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（购自天根）回收Light链和Heavy链扩增片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。
Light链和Heavy链测序结果如下：
Heavy链氨基酸序列（SEQ ID No. 1）
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLNSPGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDEDNYNPSLHSQLTISKDTSRNQVFLTITGVDTADTATYYCARSGYSVSSFAYWGQGTLVTVSA
Heavy链核苷酸序列（SEQ ID No. 2）
CAGGTCACACTGAAGGAGAGCGGACCAGGAATCCTGAAGCCCAGCCAGACACTGAGCCTGACCTGCAGCTTCAGCGGCTTCAGCCTGAACTCCCCAGGAATGAGCGTGGGTTGGATCAGACAGCCTTCAGGAAAGGGACTGGAGTGGCTCGCTCACATTTGGTGGGACGACGAGGACAACTACAACCCCAGCCTGCACAGCCAGCTGACAATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGTTCCTGACCATCACCGGAGTGGACACAGCCGATACCGCCACCTACTATTGCGCCAGGAGCGGCTACTCGGTGTCCAGCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCAGCT
Light链氨基酸序列（SEQ ID No. 3）
DVVMTQSPLSLPVSLRRSGQHQLQKQRRAWCTATATPTCIGTCRDQAQSPELLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVSWTFGGGTKLEIK
Light链核苷酸序列（SEQ ID No. 4）
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTCTGAGCCTGCCAGTGTCTCTGCGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCGCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCATTGGTACCTGCAGAGACCAGGCTCAGTCTCCAGAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTTCTGCAGCCAGAGCACCCACGTGTCTTGGACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAAATCAAG
5.可变区核苷酸序列和氨基酸序列及同源性分析
将重链和轻链可变区核苷酸序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示CRP单克隆抗体重链可变区核苷酸序列与合成构建克隆抗体1129_emAb_AAV_单链抗体前体核苷酸序列（Sequence ID: MK689356.1）同源性最高，同源性为245/297，同源性百分比为82%，结果见图2。CRP单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白重链氨基酸序列（Sequence ID: AAA16769.1）同源性最高，同源性为102/120，同源性百分比为85%，结果见图3。
CRP单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列与抗Pfs25 1G2免疫球蛋白轻链核苷酸序列（Sequence ID: OM331741.1）同源性最高，同源性为292/339，同源性百分比为86%，结果见图4。CRP单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小鼠抗体PME77，Ig V Kappa链氨基酸序列（Sequence ID: prf||1607190A）同源性最高，同源性为80/114，同源性百分比为70%，结果见图5。编码CRP单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。
6.CDR区分析
本发明实施例的犬C反应蛋白单克隆抗体抗体VH和VL均由互补决定区和框架区组成；互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。
将重链可变区和轻链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html用Kabat定义方案进行分析，得出其CDR区。
抗体重链CDR区：
CDR-H1：SPGMSVG；
CDR-H2：HIWWDDEDNYNPSLHS；
CDR-H3：SGYSVSSFAY。
抗体轻链CDR区：
CDR-L1：QKQRRAWCTATATPTCI；
CDR-L2：KVSNRFS；
CDR-L3：SQSTHVSWT。
实施例5、犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条的制备
犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条结构如图6所示，由底板1、样品吸收垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4、检测线5、质控线6和结合物释放垫7组成。
具体制作步骤：
步骤一：时间分辨荧光微球标记犬C反应蛋白单克隆抗体和鸡IgY
1.犬C反应蛋白标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200 nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100 μL微球加入900μL MES（50 mmol/L，pH 6.0）。16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入1 mL MES重悬微球，再次16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20 mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20 mg/mL NHS和EDC；取10 μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5 μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20 min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入相1 mL MES重悬微球；16000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.02 mg犬C反应蛋白单克隆抗体，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2 h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1 h；
6）去除未结合的抗体：16000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1 mL（0.02M Tris-HCL+20%蔗糖+20%海藻糖，pH 8.0）重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
2.鸡IgY标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200 nm的时间分辨荧光微球超声5 min，取100 μL微球加入900 μL MES（50 mmol/L，pH 6.0）。16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入1mL MES重悬微球，再次16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入的MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20 mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20 mg/mL NHS和EDC；取10 μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5 μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20 min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000 r/min离心10 min，去掉上清，加入相1 mL MES重悬微球；16000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.01 mg鸡IgY，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2 h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1 h；
6）去除未结合的抗体：16000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1 mL复溶液重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
复溶液：含20％海藻糖、20%蔗糖（质量分数）、pH 8.0的0.02 mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤二：结合物释放垫的制备
结合物释放垫的前处理：配制含5%蔗糖、5%海藻糖、0.5%国药Tween 20、0.1%酪蛋白、pH 8.0的0.02 M Tris-HCL结合垫处理液）。将玻璃纤维放入上述配制的结合垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上60 rpm摇晃30 min，1200 r/min，脱水14 min，40℃烘箱过夜烘干。
用金标喷金仪将制备好的时间分辨荧光微球标记的犬C反应蛋白单克隆抗体和鸡IgY均匀喷涂在结合物释放垫上，每1 cm结合物释放垫喷涂2.5 μL有时间分辨荧光微球标记的犬C反应蛋白单克隆抗体和鸡IgY的结合物，然后置于40℃环境中16 h后取出，置于干燥环境中保存备用。
步骤三：样品垫的处理
样品垫处理液：配制含0.8% BSA（IgG Free）、0.1%酪蛋白、0.6%曲拉通-100、0.03%PC-300、pH 8.0的0.1 M Tris-HCL样品垫处理液。将玻璃纤维放入上述配制的样品垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上60 rpm摇晃30 min，1200 r /min，脱水14min，40℃烘箱过夜烘干。
步骤四：硝酸纤维素膜的制备
将犬C反应蛋白单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将兔抗鸡IgY包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。
包被过程：用0.05 mol/L、pH 7.2磷酸缓冲液将犬C反应蛋白单克隆抗体稀释到0.5 mg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0 μL/cm；用0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将兔抗鸡IgY稀释到20 μg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0 μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃条件下干燥16 h，备用。
步骤五：各部件的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水纸的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水纸的末端与PVC底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线（T）和质控线（C），检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
实施例6、实施例5中所述试纸条的使用
步骤一：样本的制备
采用抗凝管采血，或在采血管中加入抗凝剂，采血后混匀备用。
步骤二：试纸条检测
取已恢复至室温的上述样本，以移液器准确吸取10 μL垂直加入样本稀释液中混匀，再用移液器吸取样本稀释液测液80 μL垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应5min，用荧光免疫分析仪对试纸条进行判读。若未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，应用新的试纸条重新测试。
步骤三：检测结果判读
数值≤10 mg/L，表明处于正常生理状态，数值>10 mg/L表明体内犬C反应蛋白含量偏高。
具体结果解释如表2所示。
表2犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条具体检测结果判读
实施例7、实施例5中所述试纸条的评价
1.灵敏度测定
将犬C反应蛋白阳性质控品用样本稀释液配制成系列浓度（mg/L）：3.125、6.25、12.5、25、50、100，各浓度重复三次，分别用试纸条进行检测，在3.125-100 mg/L之间存在线性关系，如表3所示。
表3犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条灵敏度测试
2.特异性测定
添加6种干扰物质后，同时添加同样浓度的标准品，与不添加干扰物的标准品的测定结果相比基本上没有差异，而且每种添加物测定的相对偏差均小于10%。则可知，这6种物质对CRP的检测基本上不存在干扰，且在检测中具有一定的特异性，本身具有非常高的抗干扰能力，如图7所示。
3.稳定性测定
将制备好的试纸条放置在4℃、25℃、37℃环境中进行加速试验。分别在0 d、4 d、7d、14 d、28 d及56 d取出，并用其检测实际样品，每个样品重复测量3次。具体结果分别如表4、表5、表6所示。对实测浓度和实际样品浓度数值进行误差分析，CV均<10%，表明本发明所提供的试纸条具有良好的稳定性。
表4犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条4℃条件下稳定性测试
表5犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条25℃条件下稳定性测试
表6犬C反应蛋白荧光定量检测试纸条37℃条件下稳定性测试
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种犬C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如中SEQ ID No. 1所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如中SEQ ID No. 3所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第31-37位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第52-67位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第100-109位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第24-40位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第56-62位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第95-103位所示。
2.根据权利要求1所述的犬C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的VH的核苷酸序列如中SEQ ID No. 2所示；
编码所述单克隆抗体的VL的核苷酸序列如中SEQ ID No. 4所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的犬C反应蛋白单克隆抗体在制备犬C反应蛋白检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
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