CN117567634B - 一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用。其中，犬胰脂肪酶单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过哺乳动物细胞表达系统成功表达出犬胰脂肪酶cPL蛋白，免疫小鼠后通过有限稀释法筛选出一株对犬胰脂肪酶具有高亲和力、高灵敏度、高特异性的单克隆抗体，将该单克隆抗体应用于犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条，可检测浓度为200ng/mL的犬胰脂肪酶，具有鉴定犬胰腺炎的临床诊断意义。

Description

一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用
技术领域
本发明涉及宠物快速生物检测技术领域，具体涉及一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用。
背景技术
近年来国内宠物主人的消费能力、宠物保有量以及宠物医院的数量在不断增加，宠物家庭渗透率和行业成熟度持续提升。宠物主人对于生化、超声、PCR、抗原抗体检测等专业性和功能性的检查接受度逐渐增加，宠物诊疗需求呈快速增长态势。
然而，由于饲养不当和宠物主人的溺爱，临床上常发的犬猫病例多见于消化系统。而其中胰腺炎的发病率也是越来越高，犬胰腺炎是胰腺因胰蛋白酶的自身消化作用异常引起的一种炎症病症。急性胰腺炎时胰腺腺泡受损导致腺泡内储存的脂肪酶大量释放，胰腺的淋巴管和毛细血管通透性增加，胰脂肪酶大量进入血液，使得血清脂肪酶增高。该病的各个阶段所表现出来的症状各不相同，从轻度患犬的食欲减退和伴有模糊性腹痛引起的精神沉郁等发展到较严重患犬的急性剧烈呕吐、出血性腹泻、休克甚至死亡。虽然胰腺炎是犬猫特别常见的消化系统疾病之一，但是由于该病临床表现比较复杂，诊断和分类有时难以统一，因此胰腺炎的诊断和治疗越来越受到兽医师的重视。能够准确诊断胰腺炎从而使犬猫得到及时的治疗在兽医临床上有着重要的意义。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。
在诊断上，犬胰腺炎的非特异性症状直接造成了早期诊断和治疗的双重困难，而犬胰脂肪酶在犬胰腺炎的诊断上有很高的特异性，且胰脂肪酶不易受药物和其他消化液的干扰，所以其指标变化有助于进行犬胰腺炎的早期诊断，犬胰脂肪酶的正常水平介于0~200ng/mL，测定胰脂肪酶对急性胰腺炎的诊断及鉴别诊断具有重要价值。
发明内容
为此，本发明提供一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种犬胰脂肪酶单克隆抗体，所述犬胰脂肪酶单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1的第50-54位、69-86位、119-129位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第46-58位、74-80位、113-121位所示。
进一步地，所述犬胰脂肪酶单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种核酸分子，其包含编码如上任一所述的单克隆抗体的核苷酸序列。
进一步地，编码所述犬胰脂肪酶单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；
编码所述犬胰脂肪酶单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种表达载体，其包含如上任一所述的核酸分子。
根据本发明实施例的第四方面，提供一种宿主细胞，其包含如上任一所述的核酸分子，或如上所述的表达载体。
根据本发明实施例的第五方面，提供一种检测试剂，包括如上任一所述的犬胰脂肪酶单克隆抗体。
根据本发明实施例的第六方面，提供如上所述的检测试剂在检测含犬胰脂肪酶的生物样品中的应用。
本发明具有如下优点：
本发明通过哺乳动物细胞表达系统成功表达出犬胰脂肪酶cPL蛋白，免疫小鼠后通过有限稀释法筛选出一株对犬胰脂肪酶具有高亲和力、高灵敏度、高特异性的单克隆抗体，将该单克隆抗体应用于犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条，可检测浓度为200ng/mL的犬胰脂肪酶，具有鉴定犬胰腺炎的临床诊断意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的犬胰脂肪酶cPL蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图2为本发明实施例提供的犬胰脂肪酶单克隆抗体纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图3为本发明实施例提供的犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条标准曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 犬胰脂肪酶的表达及纯化
1、基因合成
从NCBI数据库中下载犬胰脂肪酶（cPL）的基因序列（GenBank:XM025467344.3），将该基因序列做密码子优化后交由基因公司（通用生物(安徽)股份有限公司）进行基因合成，合成至pCDNA3.1载体上。将合成的重组质粒转化至DH5α感受态细胞中，涂布在Amp+培养基平板上，筛选出单菌落，对该单菌落进行摇菌培养即可得到pCDNA3.1-cPL重组菌种。
2、蛋白表达
将pCDNA3.1-cPL重组菌种进行活化培养，按照去内毒素质粒大提试剂盒说明书操作，提取pCDNA3.1-cPL重组质粒，将pCDNA3.1-cPL重组质粒转染HEK293悬浮细胞（购自Gibco公司）进行蛋白表达。
转染步骤如下：
（1）转染当天进行细胞计数，活率95%以上，密度为3×106个/mL。以转染20mL细胞为例：取20μg质粒，用稀释液将体积补足为0.5mL，轻柔混匀后静置5min；再取PEI（1mg/mL）溶液0.1mL，加入0.4mL稀释液将体积补足为0.5mL，充分混匀后静置5min；将静置后的PEI加入质粒中，轻柔混匀后再静置10min。
（2）静置后，将质粒-PEI混合液逐滴加入20mL细胞中，边滴加边轻轻晃动摇瓶，最后置于摇床培养。
（3）转染后18-24h第一次添加补料液，FA6补料液添加5%，FB添加1%。转染后72h第二次添加补料液，两种补料液用量不变。
（4）转染后5-7天，观察细胞活率约50%时，可收取表达产物。
3、蛋白纯化
离心收取转染表达后的细胞上清。用Ni预装柱（GE）对细胞上清液进行纯化。先用10倍柱体积的双蒸水冲洗柱子，再用10倍柱体积的缓冲A液（50mM Tris+300mM NaCl，pH8.0）平衡柱子，然后将细胞上清液用0.45μm滤膜过滤后开始上样。上样结束后，再用缓冲A液平衡柱子，直至UV峰值基线平稳。先用10% B液（50mM Tris+300mM NaCl+500mM 咪唑，pH8.0）洗杂，直至UV峰值基线平稳，再用50% B液洗脱目的蛋白，当UV值升高时开始收集洗脱液，直到UV峰值基线下降至100mAu以下停止收集。收集到的目的蛋白洗脱液用1×PBS透析，透析后测浓度并于-20℃保存备用。
如图1所示，纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，在60kDa左右的位置有一条明显的目的蛋白条带，与目的蛋白预期大小相符，纯化后cPL蛋白纯度可达95%。
实施例2 犬胰脂肪酶单克隆抗体的制备
1、小鼠免疫
取3只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只免疫30μg实施例1制备的cPL蛋白。首次免疫时，将cPL蛋白与弗氏完全佐剂做等体积乳化，皮下多点注射免疫小鼠。共免疫三次，每两周免疫一次，二次免疫和三次免疫均用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，免疫剂量和方式不变。三次免疫后一周对小鼠进行尾静脉采血，取血清并通过间接ELISA方法测其效价。免疫后小鼠血清效价最高可达1∶5.12×105。取60μg的cPL蛋白用1×PBS稀释成200μL，腹腔注射对小鼠进行加强免疫，三天后可进行细胞融合。
2、SP2/0骨髓瘤细胞的培养
将冻存在液氮中的SP2/0骨髓瘤细胞取出一支，立即将其转移到37℃恒温水浴锅中，不时轻柔晃动冻存管，当细胞融化至半冰晶状态时取出。在无菌环境内操作，把冻存管中的SP2/0细胞转入50mL无菌离心管中，取预热的1640完全培养基10mL缓慢滴加入离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。将细胞团轻柔打散，取5mL培养基重悬细胞并将其转移至T75细胞培养瓶中。另外补加5mL培养基，“十字”方向晃动细胞瓶，放入CO2细胞培养箱，37℃环境下培养。显微镜观察细胞状态，当密度约为80%时，对SP2/0细胞进行传代培养。
3、细胞融合
（1）取加强免疫后的实验鼠进行眼眶采血，收集在EP管中，37℃静置2h后，4000rpm离心10min，收集血清为后续筛选单克隆抗体作为阳性对照使用。小鼠脱颈处死并将其放在75%酒精中浸泡消毒。
（2）脾细胞的制备：在生物安全柜内使用已灭菌的剪刀和镊子剪开小鼠外皮，更换一套新的已灭菌的剪刀镊子剪开小鼠腹腔，再用一套已灭菌的剪刀和镊子小心取出脾脏，剪掉多余的脂肪。准备一支无菌15ml离心管，加入10ml DMEM培养基，将脾脏放入该离心管中，脾脏润湿后小心弃去多余培养基。再吸取10ml的DMEM培养基置于无菌平皿中，用毛玻璃片研磨脾脏，制成单细胞悬液并通过200目尼龙网过滤到无菌离心管中，在50ml无菌离心管中加入30ml的DMEM，用吸管冲洗尼龙网，将装有脾细胞悬液的离心管离心，1500rpm，5min，弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入30ml DMEM培养基重悬后再离心一次，然后弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入10ml DMEM培养基重悬。
（3）细胞融合：1000rpm，5min离心收集生长良好的SP2/0细胞于50ml离心管中，轻轻打散SP2/0细胞团，加入30ml DMEM培养基重悬，再离心一次后，加入10ml DMEM培养基重悬，再将脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混合，1000rpm离心5min，弃去上清，轻轻打散细胞团，置于37℃水浴环境中，吸取1ml PEG融合剂滴加到离心管中，1min内加完1ml，此时细胞团为红色均质流沙状，转动管壁感觉像毛玻璃状。
（4）终止融合：吸取9ml预热DMEM培养基来终止融合，共分为三个阶段。第一阶段为前1min内滴加1ml，第二阶段为1min内滴加1ml，第三阶段为3min内滴加完剩余的7ml培养基。然后在37℃水浴中静置稳定5min后，800rpm离心5min。
（5）铺板：弃去上清，轻轻打散细胞团，加入HAT培养基（例如要铺5块96孔板，200μl/孔，除去已提前铺好100μl/孔的饲养层细胞，则需要加入50ml的HAT培养基），混匀细胞后，将融合细胞悬液均匀铺于已加入饲养层细胞的96孔细胞板中，100μl/孔，放入CO2细胞培养箱37℃条件下培养。
4、阳性杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后7天，观察到细胞团比较大时，用间接ELISA法对细胞上清进行检测。以1μg/mL的cPL蛋白和犬细小病毒VP2重组蛋白（带有His标签）分别作为检测用的抗原，阳性对照是融合小鼠的血清，阴性对照为PBS免疫小鼠血清。选取显色反应最强、同时与犬细小病毒VP2重组蛋白不反应的杂交瘤细胞孔确定为阳性孔。将筛选到的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法亚克隆。将亚克隆后鉴定得到的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，转移至T75细胞瓶中，培养至细胞数量约80%时，可收集为制备腹水做准备。
5、腹水制备
细胞瓶中加入10mL的无菌1×PBS，吹下细胞层，重悬后将其转移到15mL离心管中，1000r/min离心10min。弃掉上清，沉淀另取1mL无菌1×PBS重悬混匀，用1mL注射器吸取。每只小鼠注射约500μL的细胞悬液，注意小鼠生长状态，一周后待小鼠腹部涨大时方可收集腹水。收集小鼠腹水于离心管中，8000r/min离心20min，吸取中间腹水层。
6、抗体纯化
对收集到的腹水先进行辛酸-硫酸铵法粗纯化。取腹水并记录腹水名称，离心，记体积。加3ml pH=4.0 0.06M乙酸乙酸钠缓冲液，混匀5min，加入10μl辛酸，4℃搅拌15min。用注射器通过脱脂棉过滤一次。12000rpm、15min 4℃离心。取上清，加入等上清液体积的饱和硫酸铵至终浓度为50%，边加边搅拌，4℃静置3h。12000rpm、15min 4℃离心。弃上清，向离心管中加入1.8ml 0.01M PBS（pH=7.2）至沉淀完全溶解。用枪确定总体积，加1/2体积的饱和硫酸铵至浓度为33%，边加边搅拌，4℃过夜。12000rpm、15min 4℃离心。弃上清，加0.45ml0.01M PBS溶解沉淀。处理透析袋（煮沸5min，用纯水洗净捡漏）。将溶解后溶液加入透析袋置于0.01M PBS过夜透析。再使用Protein G预装柱对粗纯化的单抗进行二次纯化，收集抗体，测浓度并分装。
如图2所示，通过SDS-PAGE电泳分析，纯化后的单克隆抗体纯度达95%。
实施例3 犬胰脂肪酶单克隆抗体的鉴定
1、浓度测定
采用核酸蛋白浓度测定仪测定该单克隆抗体浓度为2.673mg/mL。
2、灵敏度鉴定
采用间接ELISA方法检测单克隆抗体灵敏度。cPL蛋白按照1μg/mL进行包被，将1mg/mL的单抗做梯度稀释，验证单抗的灵敏度。结果如表1所示，灵敏度可达到1∶80000。
表1单克隆抗体灵敏度鉴定
3、特异性鉴定
采用间接ELISA方法检测单克隆抗体特异性。分别取cPL蛋白、犬细小病毒VP2蛋白（CPV VP2）、犬瘟热病毒N蛋白（CDV N）、犬C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）按照1μg/mL进行包被，1mg/mL的单克隆抗体做1∶5000稀释，验证单抗的特异性。结果如表2所示，与CPV VP2蛋白、CDV N蛋白、CRP、SAA均无交叉反应，表明特异性良好。
表2单克隆抗体特异性鉴定
实施例4 犬胰脂肪酶单克隆抗体的重链和轻链可变区基因克隆
1、杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养杂交瘤细胞，使细胞数量达1×107时用总RNA提取试剂盒试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2、cDNA第一链的合成
使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。
3、基因扩增
设计Lambda链，Kappa链，Heavy链的下游引物及上游通用引物。
引物：
F：AAGCAGTGGTATCAACGCAGA；
Rκ：AACATTGATGTCTTTGGGGTAGAA；
Rλ：AATCGTACACACCAGTGTGTGGG；
RH：AGGGATCCAGAGTTCCAGGT。
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。模板3μL，上游引物（10μM）2.5μL，下游引物（10μM）2.5μL，2×Taq酶25μL，无菌水17μL。
降落PCR反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min结束程序。
4、PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（购自天根）回收Kappa链，Lambda链和Heavy链扩增片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MGWIWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTGHYIQWVKQRPGKSLEWIGYIRSLQCVLLGTTQKFKGKATFTVDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYCGREAYGDYEAMDYWGQGTSVTVSS。
轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
MDFQMQIISLLLISVTVIVSNGEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSPQLEVYLPDYLHWYQQKPGFSPKLLIYRSSKLTPGVPARFSGGGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGRTLPFTLRGGESSWNIN。
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：
ATGGGATGGATCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTACAGCAGTCTGGACCTGAGCTAGTGAAGACTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTCACTACATTCAGTGGGTCAAGCAGAGGCCAGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAGATCATTACAATGCGTGCTACTAGGTACAACCCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTTACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGTTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGGAAGAGAGGCCTATGGTGACTACGAGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：
ATGGATTTTCAGATGCAGATTATCAGCTTGCTGCTAATCAGTGTCACAGTCATAGTGTCTAATGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTCCTCAGCTCGAAGTCTATCTTCCAGATTACTTGCATTGGTATCAACAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATCGATCATCCAAACTGACTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAGGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTCGTACTTTACCGTTCACGTTGCGAGGCGGGGAATCAAGCTGGAACATAAAT。
5、可变区核苷酸序列及氨基酸序列同源性分析
将重链和轻链基因序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示单克隆抗体重链可变区核苷酸序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区（Sequence ID:AF207706.1）同源性最高，同源性为378/427，同源性百分比为89%；单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列（Sequence ID:AAG35719.1）同源性最高，同源性为108/142，同源性百分比为76%。单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列与小鼠免疫球蛋白Kappa链可变区（Sequence ID:AJ007954.1）同源性最高，同源性为362/397，同源性百分比为91%；单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白Kappa链可变区氨基酸序列（Sequence ID: CAA07788.1）同源性最高，同源性为100/125，同源性百分比为80%。编码单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。
将重链可变区和轻链可变区序列用Kabat方案进行分析，得出其CDR区。
其中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1的50-54位、69-86位、119-129位，分别为GHYIQ、YIRSLQCVLLGTTQKFKG、EAYGDYEAMDY；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2的46-58位、74-80位、113-121位，分别为SPQLEVYLPDYLH、RSSKLTP、QQGRTLPFT。
实施例5 犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条的制备
1、犬胰脂肪酶标记物的制备
（1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μLMES（50mmol/L，pH 6.0）。16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mlMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入MES重悬微球；
（2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
（3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1ml MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1ml MES重悬微球，备用；
（4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.02mg犬胰脂肪酶单克隆抗体，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
（5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1h；
（6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1ml MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
（7）重悬复溶：最后用1ml（0.02M Tris-HCL+20%蔗糖+20%海藻糖，pH8.0）重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
2、鸡IgY标记物的制备
（1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μLMES（50 mmol/L，pH 6.0），16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mlMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入的MES重悬微球；
（2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
（3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1ml MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1ml MES重悬微球，备用；
（4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.01mg鸡IgY，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
（5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1h；
（6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1ml MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
（7）重悬复溶：最后用1ml复溶液重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
复溶液：含20％海藻糖（质量分数）、20%蔗糖（质量分数）、pH8.0的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液。
3、结合物释放垫的制备
（1）结合垫处理液配制：含5%蔗糖（质量分数）、5%海藻糖（质量分数）、0.5%国药Tween 20、0.1%酪蛋白（质量分数）、pH 8.0的0.02M Tris-HCL。
（2）将玻璃纤维放入上述配制的结合垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上60r/min摇晃30min，1200r/min脱水14min，40℃烘箱过夜烘干。
（3）用金标喷金仪将制备好的时间分辨荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆抗体和鸡IgY均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂2.5μL，然后将其置于40℃环境中16h后取出，置于干燥环境中保存备用。
4、样品垫的处理
（1）样品垫处理液配制：配制含0.8% BSA（IgG Free）、0.1%酪蛋白、0.6%曲拉通-100、0.03%PC-300、pH 8.0的0.1M Tris-HCL样品垫处理液。
（2）将玻璃纤维放入上述配制的样品垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上60r/min摇晃30min，1200r/min脱水14min，40℃烘箱过夜烘干。
5、硝酸纤维素膜的制备
将犬胰脂肪酶单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成检测线T，将兔抗鸡IgY包被在硝酸纤维素膜上构成质控线C。
包被过程：用0.05mol/L、pH7.2的磷酸缓冲液将犬胰脂肪酶单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线T，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将兔抗鸡IgY稀释到20μg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线C，包被量为1.0μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃条件下干燥16h，备用。
6、各部件的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线T和质控线C，检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
实施例6 犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条的应用
1、犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条的使用方法
（1）样本的制备
采用抗凝管采血，或在采血管中加入抗凝剂，采血后混匀备用。
（2）试纸条检测
取已恢复至室温的上述样本，以移液器准确吸取20μL全血样本垂直加入样本稀释液中充分混匀，即为待测液。再用移液器吸取待测液100μL垂直滴于加样孔中，室温（20-25℃）反应5min，然后将试纸卡插入荧光免疫分析仪中，按下“标准测试”自动读值。样本加入不足或液体未完全爬过检测线，仪器将出现“无效”结果，此时，应使用新卡重新测试。
（3）检测结果判读
数值≤200ng/mL，表明处于正常生理状态；数值>200ng/mL表明体内犬胰脂肪酶含量偏高。
2、犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条灵敏度鉴定
将犬胰脂肪酶阳性质控品用样本稀释液配制成系列浓度（ng/mL）：31.25、62.5、125、250、500、1000、2000，分别用试纸条进行检测，结果如表3所示，在31.25-2000ng/mL之间存在线性关系，如图3所示。
表3试纸条灵敏度鉴定
3、犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条特异性鉴定
用犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条测试5倍稀释的犬胰腺炎阳性样本、犬细小病毒阳性样本、犬瘟热病毒阳性样本、犬C反应蛋白阳性样本和血清淀粉样蛋白A阳性样本。结果如表4所示，犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条对犬细小病毒阳性样本、犬瘟热病毒阳性样本、犬C反应蛋白阳性样本和血清淀粉样蛋白A阳性样本检测结果均为阴性，T线发光值都很低，说明该检测试纸条与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A均没有交叉，特异性较好。
表4试纸条特异性鉴定
4、犬胰脂肪酶荧光微球抗体检测试纸条稳定性测定
将制备好的试纸条放置在4℃、37℃环境中进行加速试验。分别在0d、7d、14d及28d取出，并用其检测实际样品。对实测浓度和实际样品浓度数值进行误差分析，结果如表5~表6所示，CV均<10%，表明本发明所提供的试纸条具有良好的稳定性。
表5试纸条稳定性测定（4℃）
表6试纸条稳定性测定（37℃）
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种犬胰脂肪酶单克隆抗体，其特征在于，所述犬胰脂肪酶单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1的第50-54位、69-86位、119-129位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第46-58位、74-80位、113-121位所示。
2.根据权利要求1所述的犬胰脂肪酶单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
3.一种核酸分子，其特征在于，其包含编码权利要求1-2中任一项所述的犬胰脂肪酶单克隆抗体的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，
编码所述犬胰脂肪酶单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
编码所述犬胰脂肪酶单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求3或4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求3或4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体。
7.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求1-2中任一项所述的犬胰脂肪酶单克隆抗体。
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