CN117820483B - 一种猫n-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用 - Google Patents
一种猫n-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猫N‑端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用，属于宠物快速生物检测技术领域。所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。所述单克隆抗体可用于制备猫N‑端脑利钠肽前体蛋白检测试剂盒和检测试纸条。本发明所提供的猫N‑端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条用于对N‑端脑利钠肽前体蛋白特异性的检测识别，具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
Description
技术领域
本发明涉及宠物快速生物检测技术领域，具体涉及一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用。
背景技术
心脏病是宠物最常见的疾病之一，约10-15%的宠物会患有不同程度的心脏病。其中猫常受肥厚型心肌病的影响，在品种猫中患病率约为10-15%，如缅因猫、波斯猫、折耳猫、英国短毛猫等品种为先天性心脏病高发品种。肥厚型心肌病在猫中最常见的表现是猝死或晕厥，一旦被确诊患病的猫，大多数都会死于充血性心力衰竭、猝死或猫心源性动脉血栓栓塞。
当猫发生心力衰竭时，心肌细胞因负荷加重而呈过度拉伸状态，心室心肌细胞会释放N-端脑利钠肽前体（NT-proBNP），因此猫血中NT-proBNP浓度往往可以反映心室容积扩大、心室超负荷和心脏功能损伤的程度。NT-proBNP水平的变化可以作为评估心脏病治疗效果的重要手段。
目前，猫的心脏病普通检查方式主要包括听诊、表观检查、病史及临床症状调查等等。随着宠物诊疗技术的进步，仪器设备的使用逐渐普及化，通过借助仪器设备，猫的心脏病检查方式还包括X射线检查、超声检查、心电图检查及相关的血液学检查等等。关于N-端脑利钠肽前体的检测较少，一方面是由于检测的仪器价格较为昂贵，另一方面的原因则是研究成果目前较少。因此，亟需通过免疫学等手段设计、筛选N-端脑利钠肽前体单克隆抗体来实现对N-端脑利钠肽前体蛋白特异性检测识别，为猫心脏病诊断提供检测依据。
发明内容
为此，本发明提供了一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体，其含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 11所示。
第二方面，编码所述猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
第三方面，下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有所述猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的表达盒；
（a2）含有所述猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的重组载体；
（a3）含有所述猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的重组菌；
（a4）含有所述猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的转基因细胞系。
第四方面，猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体在在制备猫N-端脑利钠肽前体蛋白检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；
优选地，所述试剂盒为夹心荧光抗原检测试剂盒或竞争荧光抗原检测试剂盒。
第五方面，所述试纸条和试剂盒的检测样品是猫血清或猫血浆中的一种。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及其应用。与前述现有同类产品相比，本发明的测定猫N-端脑利钠肽前体蛋白的荧光定量试纸条可以准确地定量检测出猫N-端脑利钠肽前体蛋白的含量，可以根据猫N-端脑利钠肽前体蛋白含量，监测感染性疾病早期炎症，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗，有很高的临床价值。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定图；
图2为本发明实施例提供的猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光微球检测试纸条的特异性鉴定图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、猫N-端脑利钠肽前体蛋白的制备
1.猫N-端脑利钠肽前体蛋白基因合成
选取如SEQ ID NO. 1所示的猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的氨基酸序列：HHHHHHHPLGGPGPASEASAIQELLDGLRDTVSELQEAQMALGPLQQGHSPAESWEAQEEPPARVLAPHDNVLRALRRLG，将该基因序列做密码子优化后进行基因合成，合成至pET-28a载体上，以BL21感受态为宿主菌进行保种。
2.表达及纯化
取保种的pET-28a/BL21种子液按照1:1000的比例接种至10mL含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，220rpm过夜培养。次日，取出活化后的菌液，按照1:100的比例接种至500mL含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，220rpm培养约4h，当菌液OD600nm值为0.6时可进行诱导。加入终浓度为0.1mM的IPTG溶液，于16℃诱导16h。
3.蛋白纯化
（1）样品准备：收集100ml表达的菌液，离心（10000r/min，20min），弃上清，用25mL的缓冲A液（50mM Tris+300mM NaCl，pH8.2）重悬菌体，超声破碎（功率400W，超声40min），菌液呈澄清透亮的状态，收上清（12000r/min，10min）。在上样前用0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
（2）样品纯化：将柱装入层析柱，用5倍柱体积的buffer A进行平衡；将样品缓慢加入到平衡好的His镍柱子中；用5倍柱体积的buffer A进行清洗；用5～10倍体积的BufferB，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
（3）超滤浓缩：纯化后蛋白含量较低，用20kDa的超滤浓缩管浓缩蛋白并降低咪唑浓度。浓缩过程中，逐渐向超滤管中添加1×PBS缓冲液，将原咪唑替换为PBS。
4.SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE检测纯化效果，如图1所示，发现在14kDa左右有一道明显的条带，与预期蛋白大小相符，证明已成功表达目的蛋白。
实施例2、猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体的制备
1.动物免疫
用超滤离心管将重组蛋白浓缩至1mg/ml，加入等体积完全弗氏佐剂，充分乳化。取2只6周龄、体重约16g的雌性BALB/C小鼠，每只小鼠50µg皮下多点注射并腹腔注射。分别在2周后和4周后用不完全弗氏佐剂以相同的抗原量、注射体积和途径进行第2次和第3次免疫。第3次免疫后从尾静脉取血清间接ELISA法测定效价。细胞融合前3天加强免疫，每只小鼠腹腔注射无佐剂的猫N端脑钠肽蛋白50µg。
2.细胞融合
在第3次免疫4周后，采用不含佐剂猫N端脑钠肽对小鼠进行最后追加免疫。脱颈椎处死小鼠，取出脾脏，分离脾细胞。融合当日收集处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞，按2∶1比例将骨髓瘤细胞与脾细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，混匀2种细胞。缓慢加入PEG，边加边轻轻搅拌进行细胞融合，用DMEM培养基终止PEG的作用。离心，将细胞悬浮于预热的HAT培养基。按150µg/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
3.阳性杂交瘤细胞的筛选
用HAT选择培养液培养融合后杂交瘤细胞7天，HT培养液维持2周，改用RPMI1640培养液培养。观察杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时开始采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性杂交瘤细胞系。采用有限稀释法筛选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养。扩大化培养后当杂交瘤细胞阳性率达到100%时定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价并将定株细胞冻存于液氮中。
4.单克隆抗体的制备
选取10只体重16g左右健康成年雌性Balb/c小鼠，在每只小鼠腹腔中注射0.5ml石蜡油进行预处理。2周后腹腔接种杂交瘤细胞。明显产生腹水后将小鼠脱颈处死，收集腹水。用Protein G HP.F.F亲和纯化柱纯化抗体并分装冷冻保存。
采用双抗体夹心酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌猫N端脑钠肽抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到猫N端脑钠肽单克隆抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4溶液（-20℃保存）。
实施例3、猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体的鉴定
1.单克隆抗体亚类鉴定
使用Sigma公司的IgG亚类鉴定试剂盒对实施例2中得到的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4亚类进行检测，结果表明Ab1、Ab2、Ab3和Ab4亚类都是IgG1型。
2.单克隆抗体配对鉴定
通过计算P/N值（阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值）可知，Ab4包被与Ab4标记配对为检测猫N端脑钠肽的最佳组合。
表1单克隆抗体配对鉴定结果
实施例4、猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆
1.杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×107时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2.cDNA第一链的合成
使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取到的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。
3.基因扩增
设计Light链，Heavy链的上游及下游引物。
引物：F: AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
Rκ: AACATTGATGTCTTTGGGGTAGAA
Rλ: AATCGTACACACCAGTGTGTGGG
RH: AGGGATCCAGAGTTCCAGGT
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。模板3μL，上游引物（10μM）2.5μL，下游引物（10μM）2.5μL，2×Taq酶25μL，无菌水17μL。
降落PCR反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃ 30s，循环15次；72℃ 7min结束程序。
4.PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（购自天根）回收Kappa链，Lambda链和Heavy链扩增片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。
Kappa链和Heavy链测序结果如下：
Heavy链氨基酸序列（SEQ ID No. 2）
MQLLSCIALSLALVTNSQVQLQQSGAELVKPGASVRMSCRAFGYTFSSYLIEWMKQNHGKSLEWIGNFYSYDHQYIATKYYEKFKGKAKLTVEKSSSTVYLELSRLTSDDSAVYYCARRGYGRFYHFDYWGQGTTLTVSS。
Heavy链核苷酸序列（SEQ ID No. 3）
ATGAAAGGCAGCTGGGCTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGGCTGGGGCAGCGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCATAGGCCTGAACAGCGCCTGAAGTGGATTGTAAGGGTTGATCATGCGAATGTTAATACTAAATGTGACCCGGAGTTCCAGGGCCAGGCCACTATAACAGCCGACACATCTAAGAACACAGCCGTACTGCAAAGAAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACTGTCGTCTATTACTGTTCTAGATTTGGGTACTACGGCTACAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
Kappa链氨基酸序列（SEQ ID No. 4）
MVFTPQILGLMLFWISASQGDMVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRLPTWFSHNLHWYQQKSPTTPRLLIKYASQSISGITSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPWTFGGGTKLEIK。
Kappa链核苷酸序列（SEQ ID No. 5）
ATGGTTTTCACACCCCAGATACTTGGACTTATGCTTTTTTGGATTTCAGCCTCCCAAGGTGATATGGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGTTACCCACATGGTTTAGCCACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACCTACGACTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCACCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA。
5.可变区核苷酸序列和氨基酸序列及同源性分析
将重链和轻链基因序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示，单克隆抗体重链可变区基因序列与小鼠Ig μ链活性V区VDJ4C1 mRNA基因序列（Sequence ID:M13328.1）同源性最高，同源性为384/424，同源性百分比为91%。单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与抗癌胚抗原单克隆抗体T84.66可变区氨基酸序列（Sequence ID: CAA36980.1）同源性最高，同源性为112/140，同源性百分比为80%。单克隆抗体轻链可变区基因序列与小家鼠品系BALB/cJ抗约氏疟原虫TRAP/SSP2抗体TY12轻链可变区序列（Sequence ID:OK484355.1）同源性最高，同源性为358/382，同源性百分比为94%。单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列（Sequence ID: AAT76277.1）同源性最高，同源性为113/127，同源性百分比为89%。编码猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。
6.CDR区分析
本发明实施例的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体VH和VL均由互补决定区和框架区组成；互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。
将重链可变区和轻链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html用Kabat定义方案进行分析，得出其CDR区。
抗体重链CDR区：
CDR-H1（SEQ ID No. 6）：DTYMH；
CDR-H2（SEQ ID No. 7）：RVDHANVNTKCDPEFQG；
CDR-H3（SEQ ID No. 8）：FGYYGYNYAMDY。
抗体轻链CDR区：
CDR-L1（SEQ ID No. 9）：RLPTWFSHNLH；
CDR-L2（SEQ ID No. 10）：YASQSIS；
CDR-L3（SEQ ID No. 11）：QQSNSWPWT。
实施例5、猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条的制备
猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条结构由底板、样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线、质控线和结合物释放垫组成。
具体制作步骤：
步骤一：时间分辨荧光微球标记猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体和鸡IgY
1.猫N-端脑利钠肽前体蛋白标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为300nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μL MES（50mmol/L，pH 6.0）。16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mLMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1mL MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.1mg猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1 h；
6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1mL（0.02M Tris-HCL+20%蔗糖+20%海藻糖，pH 8.0）重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
2.鸡IgY标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μL MES（50mmol/L，pH 6.0）。16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mLMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入的MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1mL MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.01mg鸡IgY，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1h；
6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1mL复溶液重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
复溶液：含20％海藻糖、20%蔗糖（质量分数）、pH 8.0的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤二：结合物释放垫的制备
结合物释放垫的前处理：配制含5%蔗糖、5%海藻糖、0.5%国药Tween 20、0.1%酪蛋白、pH 8.0的0.02 M Tris-HCL结合垫处理液）。将玻璃纤维放入上述配制的结合垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上摇晃30min后脱水，40℃烘箱过夜烘干。
用金标喷金仪将制备好的时间分辨荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体和鸡IgY均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂4μL有时间分辨荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体和鸡IgY的结合物，然后置于40℃环境中16h后取出，置于干燥环境中保存备用。
步骤三：样品垫的处理
样品垫处理液：配制含0.8% BSA（IgG Free）、0.1%酪蛋白、0.6%曲拉通-100、0.03%PC-300、pH 8.0的0.1M Tris-HCL样品垫处理液。将玻璃纤维放入上述配制的样品垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上摇晃30min后脱水，40℃烘箱过夜烘干。
步骤四：硝酸纤维素膜的制备
将猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将兔抗鸡IgY包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。
包被过程：用0.05mol/L、pH 7.2磷酸缓冲液将猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃条件下干燥16h，备用。
步骤五：各部件的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水纸的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水纸的末端与PVC底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线（T）和质控线（C），检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
实施例6、实施例5中所述试纸条的使用
步骤一：样本的制备
采用抗凝管采血或在采血管中加入抗凝剂，采血后3000r/min，5min离心，取上清混匀备用。
步骤二：试纸条检测
将所需试纸条和样本稀释液恢复至室温（20~25℃）。以移液器吸取100μL血清或血浆样本垂直加入样本稀释液中，充分混匀，此为待测液。用移液器吸取100μL待测液垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，室温反应5min，用荧光免疫分析仪对试纸条进行读值。若未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，应用新的试纸条重新测试。
步骤三：检测结果判读
浓度≤100pmol/L，表明处于正常生理状态，浓度>100表明体内猫N端脑钠肽含量偏高，具体结果解释如表2所示。
表2猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条具体检测结果判读
实施例7、实施例5中所述试纸条的评价
1.灵敏度测定
将猫N-端脑利钠肽前体蛋白阳性质控品用样本稀释液配制成系列浓度（ng/mL）：93.75、187.5、375、750、1500、3000，分别用试纸条进行检测，结果如表3所示，T线发光值随阳性质控样浓度的增高而增高，说明猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条的灵敏度较好。
表3猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条灵敏度测试
2.特异性测定
用猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条测试六种同样浓度标准品，其中五种分别添加37.5mg/dL血红蛋白、2500mg/dL脂质、800mg/dL胆固醇、15mg/dL总胆红素、100mg/dL维生素C，结果如图2所示。五份添加干扰物质的测试结果与未添加的测试结果基本一致，相对偏差小于10%，则可知，这5种物质对猫N端脑钠肽的检测基本上不存在干扰，且在检测中具有一定的特异性，本身具有非常高的抗干扰能力。
3.稳定性测定
将制备好的试纸条放置在4℃、25℃、37℃环境中进行加速试验，分别在0d、3d、7d、14d、30d及60d取出，并用其检测实际样品，对实测浓度和实际样品浓度数值进行误差分析，结果见表4。CV均<10%，表明本发明所提供的试纸条具有良好的稳定性。
表4猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条的稳定性验证
4.符合率测定
选择商品化猫NT-proBNP试剂盒（BIONOTE）作为对照参考。收集40份猫血清/血浆样本，在同一条件下用自产试纸条与BIONOTE试纸条同时进行检测，读取结果。真实样本检测的结果见表6，与BIONOTE试剂盒对比符合率在97.5%，证明本发明提供的试纸条具有良好的准确性。
表5猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条与BIONOTE试剂盒符合率结果
表6猫N-端脑利钠肽前体蛋白荧光定量检测试纸条与BIONOTE试剂盒结果比对
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 11所示。
2.根据权利要求1所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的VH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示；
编码所述单克隆抗体的VL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示。
3.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有权利要求2所述核苷酸序列的表达盒；
（a2）含有权利要求2所述核苷酸序列的重组载体；
（a3）含有权利要求2所述核苷酸序列的重组菌；
（a4）含有权利要求2所述核苷酸序列的转基因细胞系。
4.根据权利要求1-2任一所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体在制备猫N-端脑利钠肽前体蛋白检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测的样品为猫血清或猫血浆中的一种。
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Citations (4)
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