CN109879961B

CN109879961B - 一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体及其杂交瘤细胞株制备与应用

Info

Publication number: CN109879961B
Application number: CN201910230635.3A
Authority: CN
Inventors: 苑庆华; 何永胜; 周跃辉; 王玉芳; 臧丹戎; 黄炎彬; 张鹏远
Original assignee: Tianjin Xinuo Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Tianjin Xinuo Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109879961A

Abstract

本发明涉及一种抗隐球菌荚膜多糖杂交瘤细胞株及其所分泌抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，抗体能与隐球菌荚膜多糖特异性结合，并可用于隐球菌感染的体外检测，其抗体效价高达百万以上，具有极好的亲和力，具有很好的特异性结合能力；以该抗体为原料开发的胶体金标记免疫诊断试剂的检测限为0.5ng/ml，在灵敏度、特异性、稳定性，抗体各方面均有较佳表现。

Description

一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体及其杂交瘤细胞株制备与应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体领域，尤其是涉及一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体及其杂交瘤细胞株制备与应用。

背景技术

免疫诊断试剂是体外诊断试剂中发展最快的的细分领域，利用抗原与抗体之间的特异性结合进行定性或定量检测。

近年来，随着临床上广谱抗生素、糖皮质激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂的应用，各种侵入性诊疗技术的开展及HIV-1感染人群的日益增多，深部真菌感染的发病率也逐年增多。隐球菌是临床上深部真菌感染的常见病原体之一，引起人类感染的隐球菌主要是新生隐球菌和格特隐球菌，主要引起隐球菌性脑膜炎和肺隐球菌病。荚膜多糖是隐球菌的细胞壁外结构，是重要的毒理因子，是隐球菌感染的生物标志物。因此隐球菌荚膜多糖的检测对于临床隐球菌感染辅助诊断具有重要意义。

目前，临床上检测隐球菌的方法主要是培养法、墨汁染色镜检法、胶体金法等。其中，培养法为检测隐球菌的“金标准”，检测需3-10天，灵敏度低，耗时长，极易造成延误治疗；脑脊液墨汁涂片可以早期、快速诊断隐球菌脑膜炎，但是诊断的特异性和敏感性依赖于检验者的技术水平，且检出率低；乳胶凝集法操作复杂。相比于其他方法，胶体金法快速、简便，准确度高，特异性好，在临床检测及医学研究方面的使用越来越普及。市场上仅有一家快速免疫检测产品用于隐球菌的临床检测，即美国Immuno-Mycologics公司隐球菌抗原检测试剂盒(胶体金免疫层析法)，售价昂贵。因此，研发具有自主知识产权的隐球菌荚膜多糖快速诊断产品对于隐球菌感染的早期诊断、及时治疗，提高我国的医疗卫生水平具有重要意义。

开发胶体金法的隐球菌荚膜多糖诊断试剂，首先需要提取隐球菌荚膜多糖抗原，获得高纯度的抗原后，需进行抗原改造，突破隐球菌荚膜多糖抗原做为半抗原的免疫原性弱的瓶颈，在小鼠体内激起良好的免疫反应，进而采用杂交瘤技术，筛选高亲和力和特异性的抗体，用于相关体外诊断试剂的开发。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株、含上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的试剂盒以及它们在检测隐球菌荚膜多糖中的用途。

本发明采用的技术方案是：一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为3A8，保藏号为CGMCCNo：17382。

一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，序列包括重链可变区序列和轻链可变区序列，重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；

重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:1GFTFSSYFMSW(CDRH1)

SEQ ID NO:2VINSNGDNTYYPD(CDRH2)

SEQ ID NO:3RDGYFSHYFDS(CDRH3)

轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:4RSSQSLVHSNGNTYLHW(CDRL1)

SEQ ID NO:5RVSNRFS(CDRL2)

SEQ ID NO:6SQGTHVPWT(CDRL3)

优选地，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

SEQ ID NO:7

QVKLQESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYFMSWVRQTPEKRLELAVINSNGDNTYYPDTVKGRFTISRDNAENTLYLQMSSLKSEDTALYYCARRDGYFSHYFDSWGQGTTLTVSSA

SEQ ID NO:8

ISDVVMSQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPAQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVS

抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体由杂交瘤细胞株3A8所分泌。

一种核酸分子，核酸分子包含编码抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的核苷酸序列；

优选地，核酸分子编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，核酸分子编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

SEQ ID NO:9

CAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTTCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGTCATTAATAGTAATGGTGATAATACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCGAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTGCAAGACGGGATGGTTACTTTTCGCATTATTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACTGTCTCTTCAGCC

SEQ ID NO:10

ATCAGTGATGTTGTGATGAGCCAAACTCCACTCTCCCTTCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGCAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACTTGCAGAAGCCAGCCCAGTCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGTTTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAGGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCAT

抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株或抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体在检测试剂盒中的应用。

包括抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的试剂盒，试剂盒是基于免疫检测的试剂盒。

优选地，试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒或者试剂盒是微流体芯片；

优选地，试剂盒为胶体金免疫试剂盒。

优选地，检测病原隐球菌；

优选地，检测隐球菌荚膜多糖抗原。

胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡的制备方法，制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，具体制备方法为：

步骤一向胶体金溶液中边搅拌边加入0.1M K₂CO₃溶液，调节pH值后加入抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，搅拌后加入10％的牛血清白蛋白溶液，2％PEG20000，搅拌后低速离心取上清，再高速离心后取沉淀，用胶体金重悬液定容形成金标抗体；

步骤二将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，烘干制成金标垫；

步骤三向抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体中加入1％的硫柳汞钠溶液，混匀后形成检测线包被液，再向羊抗鼠IgG中加入PBS和1％的硫柳汞钠溶液，混匀后形成质控线包被液，将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜上，烘干后获得包被膜；

步骤四将包被膜贴在底板上，将金标垫和吸水纸搭上包被膜，层压后切割获得胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡；

优选地，步骤一中调节pH值为9.5；

优选地，步骤一中低速离心为1000-2000转/分钟，优选为1500转/分钟，高速离心为10000-150000转/分钟，优选为11000转/分钟；

优选地，步骤二和步骤三中烘干温度为37℃，烘干湿度小于30％。

抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，通过CTAB法提取隐球菌荚膜多糖，纯化后获得隐球菌荚膜多糖偶联载体，用偶联载体的隐球菌荚膜多糖免疫小鼠，细胞融合后利用有限稀释法进行细胞亚克隆，获得稳定分泌特异性抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A8。

本发明具有的优点和积极效果是：

首先，其抗体效价高达百万以上，具有极好的亲和力，与(1,3)-β-D葡聚糖、白色念珠菌甘露聚糖、曲霉菌半乳甘露聚糖无交叉反应，具有很好的特异性结合能力；

其次，以该抗体为原料开发的胶体金标记免疫诊断试剂的检测限为0.5ng/ml，经1960例临床样本与进口试剂的对比结果表明，其灵敏度为97.59％，特异性为98.34％；

通过系统性评价，包括抗体亚型及效价、试剂盒灵敏度、特异性、稳定性，抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒；

总之，本发明的单克隆抗体在抗体效价、特异性、检测效果等多方面都展示出很好的性能，从而本发明提供了一种可用于体外诊断试剂且综合能力突出的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。

附图说明

图1是本发明的的抗体3A8的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面对本发明方案做出具体说明。

本发明涉及一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，生物材料命名为3A8，属杂交瘤细胞，其微生物保藏编号是CGMCC No：17382，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2019年2月28日，检测为存活。

由该杂交瘤细胞株3A8所分泌的一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；

重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:1GFTFSSYFMSW(CDRH1)

SEQ ID NO:2VINSNGDNTYYPD(CDRH2)

SEQ ID NO:3RDGYFSHYFDS(CDRH3)

轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:4RSSQSLVHSNGNTYLHW(CDRL1)

SEQ ID NO:5RVSNRFS(CDRL2)

SEQ ID NO:6SQGTHVPWT(CDRL3)

重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

一种核苷酸分子，核苷酸分子包含编码抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的核苷酸序列。其中，编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:10

抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体通过系统性评价，包括对抗体亚型及效价、试剂盒灵敏度、特异性和稳定性的评价，抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒。可以制作成胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者制作为微流体芯片；制作的试剂盒能够检测隐球菌荚膜多糖抗原，其检测病原为隐球菌。

使用胶体金法制备隐球菌荚膜多糖检测卡，制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，制备方法为：

步骤二将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，烘干制成金标垫；

步骤四将包被膜贴在底板上，将金标垫和吸水纸搭上包被膜，层压后切割获得胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡。

具体制备方法如下：

步骤一向胶体金溶液中边搅拌边加入0.1M K₂CO₃溶液，调节pH值为9.5后加入2mg/mL抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，搅拌后加入10％的牛血清白蛋白溶液，2％PEG20000，搅拌后4℃低速离心，低速离心为1000-2000转/分钟，弃沉淀取上清，再将获得的上清液4℃高速离心后，高速离心为10000-150000转/分钟，弃上清取沉淀，再用胶体金重悬液定容离心所得沉淀形成金标抗体；

步骤二裁切玻璃纤维素膜呈条状，将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，烘干温度为37℃，烘干湿度小于30％烘干2小时制成金标垫；

步骤三向2mg/mL的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体中加入1％的硫柳汞钠溶液，震荡混匀后形成检测线包被液，再向20mg/mL的羊抗鼠IgG中加入PBS和1％的硫柳汞钠溶液，混匀后形成质控线包被液，将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜上，质控线与检测线相距5mm，烘干温度为37℃，烘干湿度小于30％烘干16小时后获得包被膜；

步骤四裁切吸水纸呈条状，将包被膜贴在底板上，将金标垫和吸水纸搭上包被膜，层压后切割获得胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡。

下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明内容，本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的制备方法

1.多糖提取

用液体沙氏培养基培养隐球菌(菌种编号为ATCC 208821)，在20-25℃培养3-4天，菌液灭活后离心取上清，向上清液中加醋酸钠至终浓度为5％，调节pH＝5.0；加3倍体积无水乙醇，4℃过夜，可见底部奶油状沉淀；弃上清后沉淀为隐球菌荚膜多糖，将沉淀风干，称重(或通过浓度计算质量)沉淀经0.2M NaCl溶解，50KD透析袋透析24h，4℃悬挂浓缩；缓慢加多糖沉淀质量三倍的0.3％的CTAB，静置后离心，所得沉淀经10％乙醇洗涤两次，沉淀溶于1M NaCl，此时加2.5倍体积无水乙醇，即有沉淀出现，静置后离心，所得沉淀再次醇沉，既得精制隐球菌荚膜多糖。精制隐球菌荚膜多糖经2M NaCl溶解，此时沉淀似甘油状，需搅拌溶解，透析24h已完全除去CTAB，后经蒸馏水透析1d，测定相关数据。

2.偶联载体

取精制隐球菌荚膜多糖NaCl溶液2ml(浓度为1mg/ml)，调节pH至5.8；加入乙晴溶解的CDAP(浓度为10mg/ml)100ul，混匀；30s后，用三乙胺调节p H至8.1，室温反应2.5min；加入ADH溶液(浓度为50mg/ml)100ul，用0.1mol/L HCl维持p H在8.05～8.15之间反应2h；反应结束后，将溶液装入透析袋中，在4℃条件下以生理盐水透析过夜后，测定衍化度；载体蛋白溶解至2mg/ml，按照质量多糖：载体为1:3混合均匀，调节pH＝5.6，冰浴条件下加入EDAC溶液至终浓度为0.5M，调节pH为5.6，室温反应3h；反应结束后4℃0.2M氯化钠透析1d；偶联物进行葡聚糖凝胶柱过柱纯化；0.2M氯化钠平衡柱子；样品5000转/min，10min，离心处理，上样，上样量为3ml；0.2M氯化钠作为流动相，进行洗脱，逐管接取流出液即为隐球菌荚膜多糖偶联载体，1.5ml/管；逐管测定多糖(苯酚硫酸法)及蛋白浓度(BCA法)。绘制曲线确定偶联效果，进行SDS-PAGE鉴定，计算偶联比。

3.小鼠免疫

用隐球菌荚膜多糖偶联载体免疫6周龄左右的雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备，偶联物中糖含量为0.1mg/ml，多糖：蛋白偶联比为1:3；按照免疫剂量分为3组，每组3只小鼠；按照多糖含量计算，第一组免疫剂量为1ug/只，第二组免疫剂量为2.5ug/只，第三组免疫剂量为10ug/只。首免，取适量偶联物，经蒸馏水稀释至300ul，加入等量弗氏完全佐剂300ul乳化均匀，皮下多点注射免疫小鼠；两周后，取相同剂量进行二免，二免为腹腔注射免疫小鼠，两周后再追加免疫一次，亦为腹腔注射免疫小鼠，7天后鼠尾采血，ELISA测定小鼠血清效价。具体步骤为：GXM 5ug/ml，100ul/孔，4℃过夜包被ELISA板，甩干，PBST洗涤3次。5％脱脂乳粉，200ul/孔，37度封闭2h。小鼠鼠尾采血，3000转/min，离心后收集血清，从1:1000开始用PBS进行倍比稀释至1:512000，备用。甩干，PBST洗涤3次，1:1000倍起加入PBS稀释的一抗，100ul/孔，37度，1h。甩干，PBST洗涤3次,加PBS 1:6000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37度，45min。甩干，PBST洗涤5次,加100ulTMB/孔，37℃，显色10min，终止，读值。

4.细胞融合

融合前三天进行小鼠加强免疫，接种量同前次免疫，不加佐剂，腹腔注射。融合前一天准备饲养层细胞，取6-8周龄小鼠Balb/c 1只，取眼球放血后颈椎脱位致死，放于75％酒精中消毒5min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌注射器吸取HAT选择培养液10ml注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培养基。加入40ml HAT培养液中，铺入到4块96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。融合前一周复苏骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞)，用含10％胎牛血清的PRMI-1640培养基培养，37℃，5％CO2培养箱中传代培养。将处于对数生长期的细胞收集至离心管中，细胞计数，把细胞稀释为107个/ml备用。取加强免疫3天的Balb/c小鼠，摘眼球放血制备阳性血清，脱颈椎处死，75％酒精消毒5min，在超净工作台无菌取出脾脏，在无菌平皿中冼涤数次，剥离结缔组织。将脾脏放在微孔铜网上，加入新鲜的RPMI-1640培养液，先用注射器吸取培养液由脾脏一段注入，吹下脾细胞，反复数次之后，用注射器的内塞轻轻将剩余脾脏研磨，直到无明显的红色组织块。将平皿中脾细胞悬液轻轻吹打后转移到50ml离心管中，1000r/min离心5min，收集脾细胞，计数后备用。将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞按细胞数量10:1混合，加入50ml的离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，在手心轻轻摩擦使两种细胞充分混匀，将离心管至于100mL蓝盖瓶内，蓝盖瓶内装有37℃热水，将预热好的1ml DMSO/PEG在1min内逐滴加入融合管内，先慢后快，边加边轻轻旋转离心管。然后立即加入无抗无血RPMI-1640培养液终止反应，第一分钟加1ml，第二分钟加2ml，第三分钟加3ml，第四分钟加4ml。37℃水浴5min，后800r/min离心5min，弃上清，将沉淀以HAT悬起，混匀到40ml含37℃预热的20％小牛血清的HAT选择培养液中，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，100μL/孔，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱培养。7d后将用新鲜的HAT培养基对细胞板半换液，10天后用HT培养基全换液。将96孔板中检测阳性的细胞采用有限稀释法进行亚克隆：首先按照上述方法制备饲养层细胞，取待克隆杂交瘤细胞进行细胞计数，用HT培养基将细胞稀释至5-8个细胞/ml，加入到已铺饲养细胞的96孔细胞板中100μL/孔，每株杂交瘤细胞克隆一块96孔细胞板，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。约5天后数出细胞孔里的克隆数，标记，7天时并换新的培养基，待细胞铺满整个孔底的1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株，冻存。将检测阳性确定定株的杂交瘤细胞扩大培养并冻存。具体过程如下：将生长旺盛、状态良好的杂交瘤细胞用无抗无血DMEM轻轻从细胞瓶上吹下，1000r/min离心5min，弃去上清。加入冻存液(含40％RPMI-1640培养液、50％胎牛血清、10％DMSO)，将细胞吹散后分装到细胞冻存管中。将冻存管放入冻存盒置于-70℃冰箱中，一天后将冻存管转移入液氮中，做好记录。

5.腹水制备

取10-12周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×10⁶个细胞/只。每天注意观察，约7-10天，待小鼠腹部出现明显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16号针头刺入腹腔，收集腹水。待腹水再生积聚后，再次收集。将收集的腹水3000r/min离心10min，取中间澄清部分，用滤纸过滤后，分装，-70℃保存。

6.抗体纯化

用辛酸-硫酸铵法进行腹水纯化，步骤如下：取腹水3ml(n)，1000g离心，取澄清部分，加入6ml(n x 2)乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，调节PH至4.5，搅拌缓慢加入正辛酸99ul(nx 33)，于4度静置1-2h，12000g，离心10min，取上清，弃沉淀，上清经滤纸过滤，加入溶液体积十分之一的10XPBS，并调节PH至7.4，缓慢加入等体积的过饱和硫酸铵(加入2/3时可看到蛋白析出)，于4℃静置1h，10000g离心20min，弃上清，留沉淀，沉淀用PBS复溶至3ml(n)，于50kd透析袋，PBS，4℃透析过夜。

7.抗体亚类鉴定

按照SIGMA试剂盒说明书，以捕获ELISA的方法进行单抗的亚类鉴定，具体如下：将单抗亚类鉴定试剂1:1000稀释后，加入酶标孔中，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；将抗体1:1000倍稀释后加样，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；HRP酶标羊抗鼠IgG二抗以1:6000稀释后加样，100μL/孔，室温孵育30min；显色10～20min。以OD450读值明显高于其他孔所加亚类试剂为单抗所属亚类类型。抗体3A8的抗体亚型为IgG1。

8.抗体效价测定

采用间接ELISA法进行纯化后抗体效价测定，步骤如下：GXM分别稀释至5ng/ml，100ul/孔，同时设立不包被对照，4℃过夜包被，甩干，PBST洗涤3次；5％脱脂乳粉，200ul/孔，37度封闭2h；甩干，PBST洗涤3次，加入从1:1000倍开始进行倍比稀释的抗体(浓度为1mg/ml)，共计12个梯度，同时设立不包被对照100ul/孔，37℃，1h。甩干，PBST洗涤3次,加PBS 1:6000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，45min。甩干，PBST洗涤5次,加100ulTMB/孔，37℃，显色10min，终止，读值。纯化后抗体稀释至1mg/ml，效价达到了1:1280000以上。

9.抗体纯度及分子量鉴定

采用SDS-PAGE法进行抗体分子量及纯度鉴定；制胶，分离胶为12％，浓缩胶为5％；制样，20ul样品+20ul buffer，混匀，煮沸3min；每孔上样20ul，同时设立蛋白预染Marker对照；80伏30min，120伏2h；电泳完毕后，放入考马斯亮蓝溶液进行染色；脱色，去离子水煮沸脱色，每次5min，共计3次；纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，条带清晰，无杂带，如图1所示，在50KDa和25KDa处各有清晰的条带。

实施例2胶体金免疫试纸条制备

将抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体进行胶体金标记，制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，命名为隐球菌荚膜多糖检测卡(胶体金法)，具体工艺如下：

步骤一金标抗体制备

量取50mL胶体金溶液，加至已灭菌干燥处理的烧杯中，置于电热磁力搅拌器上进行搅拌，500-600rpm，边搅拌边加入0.1M K₂CO₃溶液，调节pH至9.5；标记：加入抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体0.3mL(2mg/mL)，转速同上，搅拌1h；封闭：加入10％的牛血清白蛋白(BSA)溶液5mL，2％PEG20000 2.5ml，转速同上，搅拌1h；低速离心：1500转/分钟，4℃离心30min，弃沉淀，取上清；高速离心：上清11000转/分钟，4℃离心50min，弃上清，沉淀用胶体金重悬液定容至5mL。

步骤二金标垫制备

用数控裁条机裁切玻璃纤维素膜，规格为20mm×300mm×20条；取5mL金标抗体；用三维平面点膜喷金仪将金标抗体喷于玻璃纤维素膜上，调用程序1，速度为100mm/sec、喷金量为8.0ul/cm，喷金压力为1.0kg/cm²，喷金长度为300mm，共计20条；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30％，烘干2h。

步骤三包被膜制备

检测线包被液配制：取0.5mL抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体(2mg/mL)，加入10uL1％的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；质控线包被液配制：取0.1ml羊抗鼠IgG(20mg/mL)，加入0.4mL PBS、10uL 1％的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；用三维平面点膜喷金仪将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜(NC膜)上，调用程序0，质控线为1号泵，检测线为3号泵，速度为100mm/sec、划膜量均为0.8uL/cm，划膜长度为300mm，质控线划在距膜顶端12mm处，检测线划在距膜顶端17mm处，质控线与检测线相距5mm。用铅笔标出质控线(C线)和检测线(T线)的位置；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30％，烘干16h。

步骤四制卡

用数控裁条机裁切吸水纸，规格为20mm×300mm×20条；组装：将包被好的NC膜贴在底板上，保证边缘对齐，上述制备好的金标垫、吸水纸进行贴膜制成大板，层压参数：金标垫搭上NC膜2mm，吸水纸搭上NC膜5mm；切条：将组装好的大板用微电脑自动斩切机切割成宽度为3.0mm的试纸条。装卡：将切好的试纸条装配到完好的塑料卡中，用压壳机压紧。封袋：将1个卡和1个干燥剂一起放入铝箔袋中，使用封口机进行封口，封口宽度2mm。

实施例3胶体金免疫试纸条临床样本比对

将通过实施例2制备的隐球菌荚膜多糖检测卡(胶体金法)作为考核试剂进行临床试验，选取美国Immuno-Mycologics公司的隐球菌抗原检测试剂盒(胶体金免疫层析法)为对比试剂，盲法检测入组血清和脑脊液样本，对检测结果进行统计分析，考察上述试纸条和对比试剂的检测结果的一致性。脑脊液样本中，考核试剂和对比试剂检测结果阳性结果一致的例数为321例，仅考核试剂检测结果为阳性的例数为22例，仅对比试剂检测结果为阳性的例数为10例，阴性结果一致的例数为504例，考核试剂和对比试剂检测结果阳性符合率96.98％、阴性符合率95.82％、总符合率96.27％，Kappa系数0.9219。血清样本中，考核试剂和对比试剂检测结果阳性结果一致的例数为124例，仅考核试剂检测结果为阳性的例数为3例，仅对比试剂检测结果为阳性的例数为1例，阴性结果一致的例数为975例，考核试剂和对比试剂检测结果阳性符合率99.20％、阴性符合率99.69％、总符合率99.64％，Kappa系数0.9822。脑脊液样本和血清样本的Kappa系数均大于0.75，为高度一致，认为两系统等效，证明了通过本方案制备的隐球菌荚膜多糖检测卡(胶体金法)具有较好的临床应用价值。

实施例4抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体氨基酸序列测序

1)总RNA提取，单链cDNA合成：

用Trizol法(试剂盒购自Invitrogen)提取3A8杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶(购自Invitrogen)将总RNA逆转为cDNA文库。

重链骨架区上游引物

P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’(SEQ ID NO:11)

重链可变区下游引物

P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’(SEQ ID NO:12)

轻链前导肽上游引物

P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’(SEQ ID NO:13)

轻链可变区下游引物

P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’(SEQ ID NO:14)

配制PCR反应体系(50μl)如下：

cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10X pfu BufferⅡ:5μl；ddH2O:补足至50μl。

反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环30次：95℃45s，60℃45s，72℃45s；最后，72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：

VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。

连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系(25μl)如下：

菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10μM)：1μl；dNTP Mixture(各2.5Mm)2μl；Taq DNA聚合酶(5U/μl)：0.5μl；10×Taq Buffer(Mg2+plus)：2.5μl；补水至25μl。反应条件同前。

选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体3A8的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。

重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:1GFTFSSYFMSW(CDRH1)

SEQ ID NO:2VINSNGDNTYYPD(CDRH2)

SEQ ID NO:3RDGYFSHYFDS(CDRH3)

轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：

SEQ ID NO:4RSSQSLVHSNGNTYLHW(CDRL1)

SEQ ID NO:5RVSNRFS(CDRL2)

SEQ ID NO:6SQGTHVPWT(CDRL3)

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示，编码隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:10

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 天津喜诺生物医药有限公司

<120> 一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体及其杂交瘤细胞株制备与应用

<130> 2019

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Phe Met Ser Trp

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ile Asn Ser Asn Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Asp Gly Tyr Phe Ser His Tyr Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

Trp

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Gln Gly Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Ala

35 40 45

Val Ile Asn Ser Asn Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Asp Gly Tyr Phe Ser His Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ile Ser Asp Val Val Met Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

1 5 10 15

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

20 25 30

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Ala

35 40 45

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu

65 70 75 80

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

85 90 95

Gln Gly Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

100 105 110

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser

115 120

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgaagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatttca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcagtc attaatagta atggtgataa tacctactat 180

ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccgagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccttgt attactgtgc aagacgggat 300

ggttactttt cgcattattt tgactcctgg ggccaaggca ccactctcac tgtctcttca 360

gcc 363

<210> 10

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcagtgatg ttgtgatgag ccaaactcca ctctcccttc ctgtcagtct tggagatcaa 60

gcctccatcc ttgcagatct agtcagagcc ttgtacacag caatggaaac acctatttac 120

attggtactt gcagaagcca gcccagtctc ccaagctcct gatctacaga gtttccaacc 180

gattttctgg ggtcccagac aggttcagtg gcagtggatc agggacagtt ttcacactca 240

agatcagcag agtggaggct gaggatctgg gagtttattt ctgctctcaa ggtacacatg 300

ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa 360

ctgtatccat 370

Claims

1.一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为3A8，保藏号为CGMCC No：17382。

2.一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，其特征在于：序列包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ ID NO:3所示的CDRH3，轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3。

3.根据权利要求2所述的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，其特征在于：重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求2或3所述的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，其特征在于：由权利要求1所述的杂交瘤细胞株3A8所分泌。

5.权利要求1所述的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株或权利要求2-4中任一所述的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体在制备病原隐球菌检测试剂盒中的应用。

6.包括权利要求2-4中任一所述抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒或者微流体芯片。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：用于检测病原隐球菌或用于检测隐球菌荚膜多糖抗原。

9.胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡的制备方法，其特征在于：制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，具体制备方法为：

步骤一向胶体金溶液中边搅拌边加入0.1M K₂CO₃溶液，调节pH值后加入权利要求2-4中任一所述的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，搅拌后加入10%的牛血清白蛋白溶液，2%PEG20000，搅拌后1000-2000转/分钟低速离心取上清，再10000-150000转/分钟高速离心后取沉淀，用胶体金重悬液定容形成金标抗体；

步骤二将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，37℃烘干制成金标垫；

步骤三向抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体中加入1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成检测线包被液，再向羊抗鼠IgG中加入PBS和1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成质控线包被液，将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜上，37℃烘干后获得包被膜；

步骤四将包被膜贴在底板上，将所述金标垫和吸水纸搭上所述包被膜，层压后切割获得胶体金法隐球菌荚膜多糖检测卡。