CN116769023B - 鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 - Google Patents

鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Download PDF

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CN116769023B CN202311030864.3A CN202311030864A CN116769023B CN 116769023 B CN116769023 B CN 116769023B CN 202311030864 A CN202311030864 A CN 202311030864A CN 116769023 B CN116769023 B CN 116769023B
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Abstract

本发明提供鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗Mp1p抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗Mp1p基因工程抗体的研发奠定了基础；该鼠源抗Mp1p单克隆抗体效价高，特异性强，可用于马尔尼菲篮状菌的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。

Description

鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗 体及应用
技术领域
本发明属于抗体制备领域，尤其是涉及鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
背景技术
马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei），旧称为马尔尼菲青霉（Penicilliummarneffei），马尔尼菲篮状菌是温度依赖性双相真菌，在25℃时呈菌丝相生长，菌落呈短绒状，随着菌龄增长，颜色由灰粉色到棕色，培养基可见棕红或酒红色色素，镜下观察分生孢子柄透明、光滑。一般单轮生活或双轮生，分生孢子球形或椭圆形，细胞壁光滑（2-3um），并从瓶梗的基部连续产生分生孢子，呈链状排列；在37℃培养时菌落为粗糙、奶油色酵母样，镜下观察为球形或椭圆形（2-6um），呈裂殖而不是芽殖，或形成腊肠状细胞，或长方形的关节孢子样，同时可见大量短的菌丝体，感染人或动物时以酵母相存在于宿主体内。甘露聚糖蛋白（Mp1p）是存在于马尔尼菲篮状菌细胞壁中的特异性抗原，公认的马尔尼菲篮状菌感染检测生物标志物。
马尔尼菲篮状菌是一种新兴的病原体，由于该病流行区域不断扩大，且病死率极高，给人类健康带来极大的危害，又因临床表现及常规实验检查结果不典型，经常被误诊为其他疾病。马尔尼菲篮状菌病确诊依靠病原学培养，骨髓和淋巴结活检组织培养是最敏感的诊断方法，其次是皮损刮取物和血液培养，粪便、尿液、脑脊液和关节液中也可分离出马尔尼菲蓝状菌，虽然病原学培养阳性为诊断马尔尼菲篮状菌病的金标准，但一般需要3-14d，早期诊断困难，尤其在无皮疹患者中更易延误，导致病死率增高，所以，开发早期诊断方法对患者进行及时预防和治疗十分重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
本发明采用的技术方案是：鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，一个生物样本命名为HB9，保藏编号为CGMCC No.45520；另一个生物样本命名为FA4，保藏编号为CGMCC No.45521。
鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体，抗体HB9包括重链变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ IDNO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1 GFSFSDYYMY
SEQ ID NO:2 TINDGGSYTYYPDSVTG
SEQ ID NO:3 DRMSGSPLFDY
SEQ ID NO:4 RASASVNYIH
SEQ ID NO:5 ATSSLAS
SEQ ID NO:6 QQWRSGPLT
或者，
抗体FA4包括重链变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ IDNO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3；
SEQ ID NO:11 GYTFTNYYLH
SEQ ID NO:12 MIWPGDGSTKFNERFKD
SEQ ID NO:13 KVWSGGYYFDY
SEQ ID NO:14 RASKSVSSSGYNYIH
SEQ ID NO:15 LASSLES
SEQ ID NO:16 QYSRELLLT
优选地，抗体HB9重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
SEQ ID NO:7
MDFGLSWVFLVLVLKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATINDGGSYTYYPDSVTGRFTISRDNAKSILYLQMTGLKSEDTAMYYCVRDRMSGSPLFDYWGQGATLTVSAAKTTAPIV
SEQ ID NO:9
MTQTPAILSASPGEKVTMTCRASASVNYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSSLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSGPLTFGSGTRLEIERADAAPTVS
或者，
抗体FA4重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
SEQ ID NO:17
MSCTASGYTFTNYYLHWVKQGPGQGLEWIGMIWPGDGSTKFNERFKDKTTLTADKSSNTVNMFLSSLTSDDSAVYFCARKVWSGGYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTAPIV
SEQ ID NO:19
MTQSPSSLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYNYIHWYQLKPGQPPKLLIYLASSLESGVPARFSGGGSGTDFTLNIHPVEEGDAATYYCQYSRELLLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSLW
优选地，抗体HB9由保藏编号为CGMCC No.45520的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株产生；抗体FA4由保藏编号为CGMCC No.45521的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株产生。
核酸分子，包含编码鼠抗Mp1p单克隆抗体的核苷酸；
所述核酸分子编码抗体HB9的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体HB9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
SEQ ID NO:8
ATGGACTTCGGGTTGAGCTGGGTTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATGATGGTGGTAGTTATACCTACTATCCAGACAGTGTGACGGGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAGCATCCTGTACCTACAAATGACCGGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGATCGGATGTCTGGGAGTCCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCGCCACTCTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCAATCGTC
SEQ ID NO:10
ATGACCCAGACTCCAGCAATCCTGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCGCAAGTGTAAATTACATTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAGCCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGAAGTGGCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAGAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
或者，
所述核酸分子编码抗体FA4的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体FA4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
SEQ ID NO:18
ATGTCCTGCACGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATTTACACTGGGTGAAGCAGGGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGAATGATTTGGCCTGGAGATGGAAGTACTAAGTTCAATGAGAGATTCAAGGACAAGACCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGTCAACATGTTTCTCAGCAGCCTGACCTCTGACGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGAAAGTTTGGTCAGGGGGTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAGCCCCAATCGTC
SEQ ID NO:20
ATGACACAGTCTCCTTCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCTCTTCTTCTGGCTATAATTATATTCACTGGTACCAACTGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAGCCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCGGTGGCTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGGGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGTACAGTAGGGAGCTTCTTCTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAGCGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCCTCTGG
鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体在制备检测鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白抗原试剂中的应用。
优选地，将鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
一种检测马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白的试剂盒，含有鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体。
优选地，具体为双抗体夹心法免疫检测试剂盒，其双抗体夹心法免疫检测试剂中含有鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体。
优选地，抗体FA4为包被抗体，抗体HB9为金标抗体；或者抗体HB9为包被抗体，抗体FA4为金标抗体。
本发明具有的优点和积极效果是：提供了鼠源性抗Mp1p单克隆抗体，将鼠源性抗Mp1p单克隆抗体制备成胶体金标记的双抗体夹心检测试剂，检测马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白，特异性好，灵敏度高，与隐球菌荚膜多糖、曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、1，3-β-D葡聚糖、肽聚糖、脂多糖均无交叉反应，检测血清样本灵敏度91.4%，特异性96.0%；可以有效解决马尔尼菲篮状菌感染的早期快速检测问题。
附图说明
图1抗体HB9的纯化后蛋白电泳图；1.Marker; 2. HB9；
图2抗体FA4的纯化后蛋白电泳图；3. Marker ; 4.FA4；
图3抗体HB9的腹水效价测定结果；
图4抗体FA4的腹水效价测定结果；
图5抗体HB9的交叉反应测定结果；
图6抗体FA4的交叉反应测定结果；
生物材料：HB9，保藏日期为2023年3月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCCNo.45520，属杂交瘤细胞；
生物材料：FA4，保藏日期为2023年3月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No.45521，属杂交瘤细胞。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，其中一株生物材料命名为HB9，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No.45520；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2023年3月23日，检测为存活。另有一株鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株生物材料命名为FA4，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No.45521；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2023年3月23日，检测为存活。
本发明涉及鼠抗Mp1p杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌鼠抗Mp1p单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗Mp1p基因工程抗体的研发奠定了基础。
鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株HB9产生的抗体HB9，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ ID NO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ IDNO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1 GFSFSDYYMY
SEQ ID NO:2 TINDGGSYTYYPDSVTG
SEQ ID NO:3 DRMSGSPLFDY
SEQ ID NO:4 RASASVNYIH
SEQ ID NO:5 ATSSLAS
SEQ ID NO:6 QQWRSGPLT
抗体HB9重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:7
MDFGLSWVFLVLVLKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATINDGGSYTYYPDSVTGRFTISRDNAKSILYLQMTGLKSEDTAMYYCVRDRMSGSPLFDYWGQGATLTVSAAKTTAPIV
轻链可变区序列
SEQ ID NO:9
MTQTPAILSASPGEKVTMTCRASASVNYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSSLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSGPLTFGSGTRLEIERADAAPTVS
编码抗体HB9重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码抗体HB9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:8
ATGGACTTCGGGTTGAGCTGGGTTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATGATGGTGGTAGTTATACCTACTATCCAGACAGTGTGACGGGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAGCATCCTGTACCTACAAATGACCGGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGATCGGATGTCTGGGAGTCCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCGCCACTCTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCAATCGTC
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:10
ATGACCCAGACTCCAGCAATCCTGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCGCAAGTGTAAATTACATTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAGCCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGAAGTGGCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAGAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株FA4产生的抗体FA4，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ IDNO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3；
SEQ ID NO:11 GYTFTNYYLH
SEQ ID NO:12 MIWPGDGSTKFNERFKD
SEQ ID NO:13 KVWSGGYYFDY
SEQ ID NO:14 RASKSVSSSGYNYIH
SEQ ID NO:15 LASSLES
SEQ ID NO:16 QYSRELLLT
抗体FA4重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:17
MSCTASGYTFTNYYLHWVKQGPGQGLEWIGMIWPGDGSTKFNERFKDKTTLTADKSSNTVNMFLSSLTSDDSAVYFCARKVWSGGYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTAPIV
轻链可变区序列
SEQ ID NO:19
MTQSPSSLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYNYIHWYQLKPGQPPKLLIYLASSLESGVPARFSGGGSGTDFTLNIHPVEEGDAATYYCQYSRELLLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSLW
编码抗体FA4重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，编码抗体HB9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:18
ATGTCCTGCACGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATTTACACTGGGTGAAGCAGGGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGAATGATTTGGCCTGGAGATGGAAGTACTAAGTTCAATGAGAGATTCAAGGACAAGACCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGTCAACATGTTTCTCAGCAGCCTGACCTCTGACGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGAAAGTTTGGTCAGGGGGTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAGCCCCAATCGTC
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:20
ATGACACAGTCTCCTTCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCTCTTCTTCTGGCTATAATTATATTCACTGGTACCAACTGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAGCCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCGGTGGCTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGGGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGTACAGTAGGGAGCTTCTTCTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAGCGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCCTCTGG
杂交瘤细胞HB9和杂交瘤细胞FA4所产生的鼠源性抗Mp1p单克隆抗体可用于检测Mp1p抗原，由这种鼠源性抗Mp1p单克隆抗体制备的腹水与Mp1p抗原反应效价高达106，并且与1，3-β-D葡聚糖、隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、曲霉菌半乳甘露聚糖不产生交叉反应，基于这些特性上述单克隆抗体可用于马尔尼菲蓝状菌的检测。本方案所涉及的两种抗体配对，可以制成双抗体夹心法免疫检测试剂，抗体FA4为包被抗体，抗体HB9为金标抗体；或者抗体HB9为包被抗体，抗体FA4为金标抗体，其中优选抗体FA4作为包被抗体，抗体HB9作为标记抗体，制得的检测试剂灵敏性更高。
下面结合附图对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株的筛选
将编码马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白（Mp1p）的基因构建在pet28a载体上并全基因合成，将合成的重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中，挑取重组菌转化子进行扩大培养，OD达到0.4-0.6之间加入终浓度1mM IPTG诱导剂进行诱导表达4h。离心收集菌体并进行超声破碎，离心收集上清过镍柱纯化，将洗脱目的蛋白过夜透析到1×PBS中，电泳验证蛋白纯度，BCA法定测定蛋白浓度。用于动物免疫。
首次免疫剂量为100ug/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，皮下多点注射，与二次免疫间隔时间为2周；二次免疫免疫剂量为50ug/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，腹腔注射，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：1024000以上进行细胞融合。
融合前3天免疫50ug抗原，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合（以10：1比例），融合时在37℃水浴的环境下，将50%的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10mL无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。
融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测OD值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至 24 孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37°C、5% CO2孵箱培养；培养 10 天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24 孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为HB9和FA4，分别为鼠源IgG2a亚型和鼠源IgG1亚型，轻链为κ链。
实施例2：鼠源性抗Mp1p单克隆抗体的制备
2.1 腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/0.5mL/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的抗体进行粗纯，粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1mL Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。纯化后结果见附图1和附图2。
2.2 单克隆抗体效价检测
以间接ELISA方法进行腹水效价测定。包被Mp1p 0.1ug/mL，100uL/孔。1%BSA作为封闭液。将腹水从1：1000开始进行倍比稀释，共稀释12个梯度，Abcam 酶标抗体作为二抗1：20000稀释后使用，OD为450nm读值，同时设定不包被组CBS进行对照，抗体稀释2048000倍时的OD值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达1：2048000。结果见附图3和附图4，抗体HB9和抗体FA4制备的腹水与Mp1p反应效价高达106。
2.3 与其他多糖的交叉反应性
用间接ELISA方法检测单克隆抗体与其他糖的交叉反应性。将隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、（1,3）β-D葡聚糖和曲霉菌半乳甘露聚糖按照0.1ug/mL浓度进行包被，纯化后的抗体作为一抗，Abcam抗鼠酶标抗体作为二抗。结果见图5和图6。可见抗体HB9 和抗体FA4与其他糖无交叉反应，表明该抗体具有很强的特异性。
实施例3：鼠源性抗Mp1p单克隆抗体的基因验证
RT-PCR法克隆Ig可变区基因
总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法（试剂盒购自Invitrogen）提取HB9 和FA4杂交瘤细胞株的总RNA，用M-mLV逆转录酶（购自Invitrogen）将总RNA逆转为cDNA文库。
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’
重链可变区下游引物
P2：5’ AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT 3’
轻链前导肽上游引物
P3：5’ GACATTGTSATGACCCAGWCTCCA 3’
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’
配制PCR反应体系（50μl）如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10 X pfu Buffer Ⅱ:5μl；ddH2O:补足至50μl。
反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：
VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple) 载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。
连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系（25μl）如下：
菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10 μM) ：1μl；dNTP Mixture (各2.5Mm) 2 μl；Taq DNA聚合酶 (5U/μl)：0.5 μl；10×Taq Buffer (Mg2+ plus)：2.5 μl；补水至25μl。反应条件同前。
选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体HB9和FA4的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。
实施例4：双抗体夹心法检测试剂盒的制备及应用
基于上述单克隆抗体开发双抗体夹心法免疫检测试剂，包括但不限于：胶体金法、乳胶法、荧光层析法、酶联免疫法、化学发光法。在本实施例中，以胶体金免疫层析技术为例，开发马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒（胶体金法），用于检测人血清样本中的马尔尼菲篮状菌抗原，并进行了临床样本检测，试剂盒制备过程及检测结果如下：
4.1 金标抗体制备
量取50mL胶体金溶液，加至已灭菌干燥处理的烧杯中，置于电热磁力搅拌器上进行搅拌，500-600rpm，边搅拌边加入0.1M K2CO3溶液，调节pH至9.5；标记：加入鼠抗Mp1p单克隆抗体HB9 0.5mL（2mg/mL），转速同上，搅拌1h；封闭：加入10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液5mL，2%PEG20000 2.5mL，转速同上，搅拌1h；低速离心：1500 转/分钟，4℃离心30min，弃沉淀，取上清；高速离心：上清11000转/分钟，4℃离心50min，弃上清，沉淀用胶体金重悬液定容至5mL。
4.2 金标垫制备
用数控裁条机裁切玻璃纤维素膜，规格为22mm×300mm×20条；取5mL金标抗体；用三维平面点膜喷金仪将金标抗体喷于玻璃纤维素膜上，调用程序1，速度为100mm/sec、喷金量为8.0uL/cm，喷金压力为1.0kg/cm2，喷金长度为300mm，共计20条；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30%，烘干16h。
4.3 包被膜制备
检测线包被液配制：取鼠抗Mp1p单克隆抗体FA4（2mg/mL）0.5mL，加入10uL 1%的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；质控线包被液配制：取0.1mL羊抗鼠IgG（20mg/mL），加入0.4mL PBS、10uL 1%的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；用三维平面点膜喷金仪将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜（NC膜）上，调用程序0，质控线为1号泵，检测线为3号泵，速度为100mm/sec、划膜量均为0.8uL/cm，划膜长度为300mm，质控线划在距膜顶端12mm处，检测线划在距膜顶端17mm处，质控线与检测线相距5mm。用铅笔标出质控线（C线）和检测线（T线）的位置；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30%，烘干16h。
4.4 制卡
用数控裁条机裁切吸水纸，规格为17mm×300mm×20条；组装：将包被好的NC膜贴在底板上，保证边缘对齐，上述制备好的金标垫、吸水纸进行贴膜制成大板，层压参数：金标垫搭上NC膜2mm，吸水纸搭上NC膜2mm；切条：将组装好的大板用微电脑自动斩切机切割成宽度为3.0mm的试纸条。装卡：将切好的试纸条装配到完好的塑料卡中，用压壳机压紧。封袋：将1个卡和1个干燥剂一起放入铝箔袋中，使用封口机进行封口，封口宽度2mm。
4.5 临床样本检测
与临床参考标准进行比对，收集金标准确诊患者血清样本35例，排除患者血清样本50例，用上述试剂盒样品进行检测，其中，确诊患者检测阳性32例，排除患者检测阴性48例，灵敏度91.4%，特异性96.0%，总符合率94.1%，与临床参考标准符合率高。认为以该抗体为原料开发的试剂盒具有较好的临床应用价值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为HB9，保藏编号为CGMCC No.45520；或者命名为FA4，保藏编号为CGMCC No.45521。
2.鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体HB9包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ ID NO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
或者，
抗体FA4包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ IDNO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3。
3.根据权利要求2所述的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体HB9重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
或者，
抗体FA4重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO:19所示。
4.根据权利要求2或3所述的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体HB9由保藏编号为CGMCC No.45520的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株产生；
抗体FA4由保藏编号为CGMCC No.45521的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株产生。
5.核酸分子，其特征在于：包含编码权利要求2或3所述的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体的核苷酸；
所述核酸分子编码抗体HB9的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体HB9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，
所述核酸分子编码抗体FA4的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体FA4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
6.权利要求2-4中任一所述的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体在制备检测鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白抗原试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
8.一种检测马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2-4中任一所述的鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：具体为双抗体夹心法免疫检测试剂盒，其双抗体夹心法免疫检测试剂中含有鼠抗马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：抗体FA4为包被抗体，抗体HB9为金标抗体；或者抗体HB9为包被抗体，抗体FA4为金标抗体。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021179246A1 (en) * 2020-03-12 2021-09-16 The University Of Hong Kong Antibodies targeting talaromyces marneffei mp1p protein and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021179246A1 (en) * 2020-03-12 2021-09-16 The University Of Hong Kong Antibodies targeting talaromyces marneffei mp1p protein and methods of use thereof
CN115244078A (zh) * 2020-03-12 2022-10-25 香港大学 靶向马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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马尔尼菲青霉与马尔尼菲青霉病;成先桂;;中国真菌学杂志(02);全文 *

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