CN106636004B - 一种tmv-cmv-pvy三重病毒胶体金快速检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TMV‑CMV‑PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体，三种抗体分别由杂交瘤细胞株BALB/c‑15‑50、BALBc‑15‑27、BALBc‑15‑8分泌产生；所述NC膜上设置有检测线和控制线，检测线上包被有三种病毒的特异抗原；控制线上包被有胶体金标记的二抗。该试纸条尤其是对广东烟区的TMV、CMV、PVY的检测，快速、灵敏、准确、成本低、操作简便，实现一次取样，多病毒同时诊断，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，推广应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于病原物检测技术领域。更具体地，涉及一种TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染烟草的主要病毒。它们引发的病毒病每年导致烟草产业巨大的经济损失。快速、准确地定性检测相关病毒是生产上防控病害、减少损失的重要手段之一。
在科学研究中，植物病毒的检测方法主要有生物学检测法(症状类型辨别、鉴别寄主等)、电镜技术、血清学检测法(酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等)和分子生物学检测法(包括PCR技术、核酸探针技术等)等。分离病毒照电镜虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用。血清学检测方法比较费时、费力。免疫荧光、ELLSA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价并且适合于基层应用的病毒诊断方法。
1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化学。Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法观察沙门氏菌。许多学者进一步证实胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位。胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay，GICA)作为一种新的免疫学检测方法，是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特 的诊断技术。这项技术将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单(多)克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起，具有简单、快速、准确、无污染、操作简单和无需特殊设备等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。20世纪90年代初到中期，胶体金标记免疫层析诊断技术开始进入商业化应用。利用这种技术开发的胶体金快速检测试纸条具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，可在现场(临床)对目标病原进行初筛，节省大量的人力、物力。在医学领域，这种技术除用于激素、传染病病原的抗原和抗体、细菌、寄生虫的检测外，还发展到了对毒品等小分子物质的检测。检测的标本类型也涵盖了血清、血浆、全血、尿、粪便及唾液等，显示出了广阔的前景和巨大的应用价值。
目前，胶体金试纸条在国内主要应用于医学领域和畜牧兽医领域，植物病毒方面很少见到。在农牧领域，较少有成熟的产品，更多的出现在相关的科研项目中。孙艳等(2011)应用胶体金技术进行了黄瓜细菌性角斑病(Pseudomona.s.syringaepv.Lachrymans)的快速检测研究。国内涉及到烟草病毒病检测的商用胶体金试纸条非常少。国外的商品化试纸条非常昂贵，价格在50～60元人民币/张，不适于生产上大批烟苗的检测使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种广东烟区TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条。核心技术是开发针对烟草苗期主要病毒烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)的多重胶体金检测试纸条。实现一次取样，多病毒同时诊断，让烟农操作方便，诊断及时准确。
本发明的目的是提供一株可以产生TMV特异单抗的杂交瘤细胞株BALB/c-15-50，一株可以产生CMV特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-27，以及一株一株可以产生PVY特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-8。
本发明另一目的是提供一种TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条。
本发明的再一目的是提供所述TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株产生TMV的特异单抗的BALB/c小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-15-50，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
同时，由上述杂交瘤细胞株BALB/c-15-50分泌产生的TMV特异单抗也在本发明的保护范围之内。
一株产生CMV的特异单抗的BALB/c小鼠杂交瘤细胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
同时，由上述杂交瘤细胞株BALBc-15-27分泌产生的CMV特异抗体也在本发明的保护范围之内。
一株产生PVY的特异单抗的BALB/c小鼠杂交瘤细胞株BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
同时，由上述杂交瘤细胞株BALBc-15-8分泌产生的PVY特异抗体也在本发明的保护范围之内。
另外，由上述TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体制备的TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体，所述NC膜上设置有检测线(T线)和控制线(C线)，且检测线(T线)位于胶体金垫和控制线(C线)之间的位置；检测线(T线)上包被有三种病毒的特异抗原；控制线(C线)上包被有胶体金标记的二抗。
上述TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条在TMV、CMV和/或PVY病毒的检测方面，具有很好的应用前景，尤其是针对广东烟区的TMV、CMV和/或PVY病毒，检测灵敏度可以达到1g/100mL。
本发明利用竞争抑制法，成功构建了TMV-CMV-PVY的三重检测试纸条。 其基本原理如下：
胶体金标记的TMV、CMV、PVY特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，三种病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的测试线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。
当待测样本含有TMV、CMV、PVY当中的一种或几种时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的相应病毒的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。
当待测样本没有TMV、CMV、PVY当中的任意一种病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次针对植物病毒构建了三重病毒的检测试纸条，创新性很强，开发的TMV-CMV-PVY三重病毒快速检测试纸条利用胶体金免疫层析技术，结合了色谱层析和免疫反应的原理，实现了快速、准确地定性检测病原的目的，可以在田间快速、大规模的检测样品，检测结果准确、可靠。与ELISA方法相比，本发明的试纸条具有快速、灵敏、直观、成本低廉、操作简便、对人体无害、易于大量样本的检测等特点，实现一次取样，多病毒同时诊断，让烟农操作方便，诊断及时准确。
更重要的是，本发明的试纸条检测的病毒的特异性很强，是专门针对广东烟区的TMV、CMV、PVY的检测。该试纸条采用的关键抗体是专门针对广东烟区TMV、CMV、PVY的流行株系构建得到，所制备的针对性的单克隆抗体灵敏度非常高，可以达到1g/100mL，对广东烟区TMV、CMV、PVY三种病毒的快速检测具有重要的意义。
另外，本发明的可以同时实现三种病毒的检测，整个产品体积小、携带方便， 不需要仪器设备，操作简单。可现场检测，在3～10min内即可出结果；结果可由肉眼根据T线颜色的深浅进行判断。一次取样，多病毒同时诊断，让烟农操作方便，诊断及时准确。这种方法非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，具有强大的推广应用前景。
附图说明
图1为CP-T-GD连接到pET30a-GST载体的重组载体示意图。
图2为CP-T-GD蛋白小量表达检测电泳图；M：marker，1：目标蛋白，2：未诱导对照。
图3为CP-T-GD蛋白大量表达检测电泳图；M：marker，1：上清，2：沉淀。
图4为CP-T-GD蛋白纯化结果；M：marker，1：样品稀释100倍。
图5为CP-C-GD连接到pET30a-GST载体的重组载体示意图。
图6为CP-C-GD蛋白小量表达检测电泳图；M：marker，1：目标蛋白，2：未诱导对照。
图7为CP-C-GD蛋白大量表达检测电泳图；M：marker，1：上清，2：沉淀。
图8为CP-C-GD蛋白纯化结果；M：marker，1：样品稀释100倍。
图9为CP-P-GD连接到pET30a-GST载体的重组载体示意图。
图10为CP-P-GD蛋白小量表达检测电泳图；M：marker，1：目标蛋白，2：未诱导对照。
图11为CP-P-GD蛋白大量表达检测电泳图；M：marker，1：上清，2：沉淀。
图12为CP-P-GD蛋白纯化结果；M：marker，1：样品稀释100倍。
图13为胶体金快速检测试纸条的示意图。
图14为TMV-CMV-PVY三重病毒胶体快速金检测试纸条检测效果；(左边为阴性性样本，右边为阳性样本)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1广东烟区TMV、CMV、PVY病毒株的分离
1、2012～2014年，从广东省韶关市的南雄、始兴、乳源、乐昌，清远市的连洲，梅州市的五华、蕉岭、大埔和梅县等9个地县29个镇，33个村的烟田里表现普通花叶病的烟草植株上进行取样。取样点覆盖广东省的所有烟区。共72个样品。将之分别进行生物学和ELISA(酶联免疫吸附测定)的分离、鉴定。
共分离得到49个TMV分离物，24个CMV分离物，13个PVY分离物，都已得到ELISA检测验证。生物学鉴定结果表明：所采TMV、CMV、PVY分离物都属于各自的普通株系。
2、分别对三种病毒的全CP(coat protein))基因进行扩增。将PCR产物胶回收后与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆扩大繁殖培养，碱裂解法抽提质粒后，进行双酶切鉴定，得到含有重组质粒的阳性转化子。将三种阳性转化子送北京奥科生物技术有限公司测序。
测序得到的TMV CP基因为470bp(序列如SEQ ID NO.1所示)、CMV CP基因为654bp(序列如SEQ ID NO.2所示)、PVY CP基因为796bp(序列如SEQ ID NO.3所示)，将之分别命名为CP-T-GD、CP-C-GD、CP-P-GD。
进入NCBI的数据库，用Blast工具将CP-T-GD、CP-C-GD、CP-P-GD三个序列分别与数据库里的数据进行比对分析。
3、分析结果显示：CP-T-GD序列与其他报道的TMV CP基因的序列的相似性为16.5％～95％。CP-C-GD序列与其他报道的CMV CP基因的序列的相似性为69.5％～97％。CP-P-GD序列与其他报道的PVY CP基因的序列的相似性为80.5％～95％。这说明本研究获得的在广东烟区占主要优势地位的TMV、CMV、PVY分离物与普通的TMV、CMV、PVY株系存在一定差异。
实施例2制备三种CP基因原核表达特异蛋白
将CP-T-GD、CP-C-GD、CP-P-GD分别构建到pET30a-GST载体上，转化BL21菌株，进行原核表达，分别纯化表达蛋白。
1、制备CP-T-GD原核表达蛋白，相关信息汇总如下表1所示。
表1
具体方法如下。
(1)目的基因序列：根据大肠杆菌密码子优化后序列，两端加酶切位点EcoR I和Xho I。合成目的基因到pUC57载体。
(2)通过酶切、连接，将目的基因连接到pET30a-GST载体，构建后的重组载体示意图如附图1所示。
基因片段酶切：43μl重组质粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃过夜反应。(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI)。
载体酶切：43μl载体(pET30a-GST)质粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl10×Buffer，37℃过夜反应。(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI)。
连接：1μl载体酶切片段，3μl基因酶切片段，1μl连接酶(BPI)，5μl2×RapidBuffer，混匀，室温反应30min。
(3)将重组载体转化BL21感受态细胞：
1)取出-80℃保存的100μl感受态细胞(BL21)，放在冰上缓慢解冻；
2)将感受态细胞加入1μl重组质粒的管中，混匀，冰上放置30min；
3)42℃热激90s；
4)冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基；
5)37℃培养45min；
6)5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板；
7)晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。然后测序验证正确。
(4)小量表达检测：
1)从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养；
2)培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200rpm培养2h；
3)取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)；
4)加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测(15％SDS-PAGE)。
结果如附图2所示，有正确表达条带。
(5)大量表达：
1)挑选验证正确的菌株，接5～10μl活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养；
2)将培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导4h；
3)大量收菌：用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min，弃上清；
4)超声破菌：沉淀用25ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声；
5)电泳确定表达形式：取100μl超声(500W,90次，每次3s，间隔6s)后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后，沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μl 2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测(15％SDS-PAGE)。
结果如附图3所示，蛋白有表达，主要表达在沉淀中。
(6)蛋白质纯化(洗包涵体)：
1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min；
2)12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存；
3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min；
4)12000rpm，离心10min，弃上清；
5)重复3)、4)一次；
6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白；
7)12000rpm，离心10min，收集上清，取50μl电泳(15％SDS-PAGE)。
结果如附图4所示，纯化得到目的蛋白CP-T-GD。
2、制备CP-C-GD原核表达蛋白，相关信息汇总如下表2所示。
表2
具体方法同上述CP-T-GD蛋白制备。
构建后的重组载体示意图如附图5所示。
蛋白小量表达检测如附图6所示，有正确表达条带。
蛋白大量表达检测如附图7所示，蛋白有表达，主要表达在沉淀中。
蛋白纯化结果如附图8所示，纯化得到目的蛋白CP-C-GD。
3、制备CP-P-GD原核表达蛋白，相关信息汇总如下表3所示。
表3
具体方法同上述CP-T-GD蛋白制备。
构建后的重组载体示意图如附图9所示。
蛋白小量表达检测如附图10所示，有正确表达条带。
蛋白大量表达检测如附图11所示，蛋白有表达，主要表达在沉淀中。
蛋白纯化结果如附图12所示，纯化得到目的蛋白CP-P-GD。
实施例3构建表达TMV、CMV、PVY三种病毒特异单抗的杂交瘤细胞株
利用实施例2得到的三种CP基因原核表达特异蛋白，用相应的表达蛋白免疫小鼠；进行融合试验，得到分别产生三种病毒的特异单抗的阳性杂交瘤细胞株。
1、构建表达TMV病毒特异单抗的杂交瘤细胞株，方法如表4所示。
表4
具体方法如下：
(1)免疫
1)用“TMV”，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：1、2，3，4。
2)初免两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
3)第一次加强免疫两周后，皮下第二次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
4)第二次加强免疫两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
5)第二次加强免疫一周后，眼眶取血，测血清效价。
(2)免疫效价检测：
用“TMV”，2ug/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血 清200倍稀释。
表5免疫效价(效价为大于最大OD/2的最小OD读数所对应的稀释度)
| 编号 | 200 | 400 | 800 | 1600 | 3200 | 6400 | 12800 | 25600 | 51200 | 102400 | 空白 | 阴性 |
| TMV-1 | 1.63 | 1.534 | 1.438 | 1.33 | 1.144 | 0.887 | 0.648 | 0.419 | 0.238 | 0.141 | 0.031 | 0.046 |
| TMV-2 | 1.619 | 1.543 | 1.503 | 1.314 | 1.128 | 0.943 | 0.706 | 0.52 | 0.302 | 0.158 | 0.034 | 0.049 |
| TMV-3 | 1.54 | 1.5 | 1.386 | 1.177 | 1.018 | 0.723 | 0.612 | 0.429 | 0.242 | 0.14 | 0.033 | 0.045 |
| TMV-4 | 1.633 | 1.577 | 1.499 | 1.309 | 1.073 | 0.87 | 0.695 | 0.487 | 0.274 | 0.16 | 0.025 | 0.035 |
根据结果选取冲击2号小鼠做细胞融合实验。融合前，用免疫原“TMV”50ug，腹腔冲击免疫2号小鼠。
(2)细胞融合
取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
1)实验器材：灭菌的手术器械(包括三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿)，湿盒，2个500ml烧杯，2个50ml离心管，3个15ml离心管。
2)实验试剂：IMDM培养基；IMDM完全培养基(含15％血清)；2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA，货号：M0262-100G；新生牛血清10ml；PEG1500：厂家：Roche，货号：78364；HAT：厂家：Sigma，货号：H0262-10VL；HT：厂家：Sigma，货号：H0137-10VL。
3)融合实验步骤
a.将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。
b.小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。
c.在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。
d.用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。
e.将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。
f.将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。
g.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。
(3)挑克隆
挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。
(4)单克隆细胞1筛
用“TMV”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到19株阳性杂交瘤细胞株。
1)实验试剂：
包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6
PBS缓冲液pH7.4
封闭液：2％牛奶in PBS
洗液：PBS－T(0.05％吐温，PBS)
显色液:1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2in柠檬酸缓冲液)
终止液：2M硫酸
二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP
2)实验步骤
用包被液稀释“TMV”，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。
a.2％牛奶封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。
b.加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1000倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。
c.加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗 液洗涤3次。
d.显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。
e.每孔加入50ul终止液终止。
f.双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。包括对免疫蛋白筛选呈阳性的杂交瘤细胞株的数据、阳性对照读数、空白对照读数以及阴性对照读数。
根据结果筛选得到对免疫蛋白筛选呈阳性的杂交瘤细胞株，共19株。
(5)单克隆细胞2筛
将19株阳性的细胞株，用“TMV”及标签蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到5株阳性杂交瘤细胞株。
(6)将筛选出来的5株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到3株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。
1)实验试剂
包被抗体：(Southern Biotech)
封闭液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；
显色液:0.2ml A液+10ul 30％H2O2in 10ml B液(A液：15mg/ml ABTS in H2O；B液：柠檬酸缓冲液,pH4.0)
2)各型亚类二抗：(Southern Biotech)实验步骤：
a.用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5ug/ml，每孔加0.1ml，4℃，过夜。
b.PBS-T洗2次，每孔加入200ul封闭液，370C孵育2h。
c.PBS-T洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，370C孵育1h。
d.PBS-T洗3次；用封闭液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，370C孵育1h。
e.PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min内于双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。
表6
最终得到3株杂交瘤细胞株，均为G1亚型。选取最好的一株培育保存，并命名为BALB/c-15-50，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
杂交瘤细胞株BALB/c-15-50可以产生TMV的特异单抗。
2、构建表达CMV病毒特异单抗的杂交瘤细胞株，方法同上。
表7
最终得到13株产生CMV的特异单抗的杂交瘤细胞株，选取最好的一株培育保存，并命名为杂交瘤细胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3、构建表达PVY病毒特异单抗的杂交瘤细胞株，方法同上。
表8
最终得到19株产生PVY的特异单抗的杂交瘤细胞株，选取最好的一株培育保存，并命名为BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例4制备TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条
1、实验材料
(1)胶体金颗粒：枸橼酸钠还原法制备(30nm)
(2)TMV、CMV、PVY三种病毒的特异性抗体
将实施例3的三种阳性杂交瘤细胞株进行培养表达，进行Protein A过柱纯化，得到三种病毒的特异单克隆抗体。
(3)二抗：Goat-anti-Rabbit Ig G
特异抗体胶体金标记的pH为8.2，胶体金标记二抗的pH为9.0。
金标抗体用BSA做稳定剂。
2、仪器设备：
JY-EQ03连续式划膜仪，JY-EQ02喷金机，JY-EQ01斩切式切刀，I JY-EQ05压壳机。
3、耗材：
JY-D101 DB-6底板，JY-X115 H5072吸水纸，JY-BX101金标垫，JY-JZ112 fusion 3样品垫，JY-C111 A-11塑料卡。
4、试纸条的组装
(1)如附图13所示，将背衬(背衬)、样品垫、吸水垫(吸水滤纸)、硝酸纤维素膜(NC膜)、金标垫(胶体金垫)粘在一起，利用切条机将其切成4.5mm宽的试纸条，于4℃干燥保存备用。
(2)试纸条组装条件：
试纸条的组装要求在室温恒定干燥的环境下，湿度大或温度过高会影响玻璃纤维、NC膜的性质和二抗、包被抗体、金标抗体的活性，进而影响试纸条的层析速度及显色反应。各部分组装时，要粘贴紧密不要划到NC膜，否则会影响出线效果。本试纸条在室温25℃、湿度低于40％条件下进行组装。
5、本发明的TMV-CMV-PVY三重病毒检测试纸条的结构描述如下：
由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV、CMV、PVY特异抗体，所述NC膜上设置有检测线(T线)和控制线(C线)，且检测线(T线)位于胶体金垫和控制线(C线)之间的位置；检测线(T线)上包被有三种病毒的特异抗原；；所述胶体金垫上的金标抗体可以与检测线上的抗原结合反应并显色；控制线(C线)上包被有胶体金标记的二抗。
该试纸条的检测基本原理如下：
胶体金标记的TMV、CMV、PVY特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，三种病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的测试线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。
当待测样本含有TMV、CMV、PVY当中的一种或几种时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的相应病毒的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。
当待测样本没有TMV、CMV、PVY当中的任意一种病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。
实施例5胶体金快速检测试纸条的样品检测
1、取感染了TMV、CMV、PVY三种病毒的烟草，以及健康烟草的叶片作为实验材料，各0.2g，加PBS缓冲液(pH8.0，0.01M)，进行研磨，不要用自来水稀释叶子。
各取50uL研磨液加到制备好的试纸条样品垫上，五分钟后判读结果。
2、结果如附图14所示。感病烟草样本的试纸条C处质检带出现明显的红棕色条带，实验结果为阳性。
健康烟草样本的试纸条C处质检以及T处检测带带出现明显的4条红棕色条带，实验结果为阴性。
结果显示，本发明的TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条对TMV、CMV、PVY三种病毒的检测效果良好。
实施例6胶体金快速检测试纸条的灵敏度测试
1、将0.1g烟草病样用0.01mol/L的PBS稀释6个系列浓度，与样品处理液等体积混合后，终浓度为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL，以PBS与样品处理液等体积混合为阴性对照，测定试纸条灵敏度。
2、结果显示，当烟草病样的浓度为10-3mg/mL时，试纸条的检测条带模糊不清。因此，本发明试纸条的检测灵敏度可达到10-2mg/mL。
Claims (3)
1.TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体组合在制备TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条中的应用，其特征在于，所述TMV特异抗体由杂交瘤细胞株BALB/c-15-50分泌产生，所述杂交瘤细胞株BALB/c-15-50于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述CMV特异抗体由杂交瘤细胞株BALBc-15-27分泌产生，所述杂交瘤细胞株BALBc-15-27于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述PVY特异抗体由杂交瘤细胞株BALBc-15-8分泌产生，所述杂交瘤细胞株BALBc-15-8于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体，所述NC膜上设置有检测线和控制线，且检测线位于胶体金垫和控制线之间的位置；检测线上包被有三种病毒的特异抗原；控制线上包被有胶体金标记的二抗；
其中，所述TMV特异抗体、CMV特异抗体和PVY特异抗体如权利要求1中所述；所述TMV、CMV和/或PVY病毒是指广东烟区的TMV、CMV和/或PVY病毒。
3.权利要求2所述TMV-CMV-PVY三重病毒胶体金快速检测试纸条在TMV、CMV和/或PVY病毒的检测方面的应用，其特征在于，所述TMV、CMV和/或PVY病毒是指广东烟区的TMV、CMV和/或PVY病毒。
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