CN107964537B - 用于检测gr79转基因植物的单克隆抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13483。本发明还提供了由该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，以及它们在检测GR79‑EPSPS转基因植物上的用途。本发明杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体能够用于GR79‑EPSPS蛋白的杂交免疫检测，具有特异性强、灵敏度高等优点，可用于GR79‑EPSPS转基因植物的种子、叶片等不同器官的定性定量检测。

Description

用于检测GR79转基因植物的单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于转基因植物检测领域，具体涉及一种用于检测GR79转基因植物的单克隆抗体；还涉及该单克隆抗体的用途。
背景技术
草甘膦(英文名：Glyphosate；化学名称：N-(膦酸甲基)甘氨酸；商品名为：农达(Roundup))是美国孟山都公司研发的一种高效、广谱、低毒、低残留的除草剂，是世界上应用最广的除草剂品种之一。草甘膦通过竞争性结合EPSPS(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)，从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物无法合成芳香族氨基酸及其衍生物，以及莽草酸积累，导致植物死亡。但是作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有灭生性作用，这极大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。美国孟山都公司通过向植物中转入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS基因，成功培育出了商业化的转基因抗草甘膦作物，为草甘膦的应用开辟了新途径。目前已经获得了大豆、玉米、棉花、油菜、烟草、甜菜、花生、小麦、水稻或向日葵等抗草甘膦转基因作物。
GR79-EPSPS是中国农业科学院生物技术研究所发明的高抗草甘膦的 EPSPS基因(CN103981199A)，目前，已有多个转GR79-EPSPS基因的棉花品系进入环境释放和生产试验阶段。在转基因植物的研发和对转基因产品进行筛选或安全性评价时，均需要对转入的外源性基因进行检测鉴定。现有的检测方法不仅受到仪器设备、场地等因素的限制，还存在检测时间长、检测成本高等问题，难以推广应用。实践中亟需一种能够快速检测转基因植物中GR79-EPSPS蛋白，且操作简便、结果准确可靠的方法。
利用免疫学原理进行目的蛋白特异性定性定量鉴定的蛋白免疫印迹检测方法，是对转基因植物最精准的鉴定方法之一。利用免疫胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对转基因幼苗或者种子进行简单、快速、准确的检测鉴定。
发明内容
本发明目的在于提供一种小鼠杂交瘤细胞株。
本发明另一目的在于提供一种单克隆抗体
本发明第三目的在于提供上述小鼠杂交瘤细胞株在检测转GR79-EPSPS 基因植物上的用途。
本发明第四目的在于提供上述单克隆抗体在检测转GR79-EPSPS基因植物上的用途。
本发明第五目的在于提供一种免疫胶体金试纸条。
为实现上述目的，本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞株，命名为： Anti-GR79-1-27B10，其保藏编号为CGMCC No.13483。
本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.13483的小鼠杂交瘤细胞株产生。
上述小鼠杂交瘤细胞株在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。
上述单克隆抗体在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。
上述应用中所述的植物是指棉花、玉米、水稻、大豆或油菜等；优选为棉花。
本发明还提供了一种免疫胶体金试纸条，包括在PVC底板上依次装配有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线(T线)上包被上述单克隆抗体，所述质控线(C线)上包被有羊抗鼠IgG抗体。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明单克隆抗体特异性强，可特异性地对转基因作物不同组织器官中GR79-EPSPS蛋白进行检测，鉴定结果准确度、可靠，为GR79-EPSPS转基因作物的鉴定、为转基因育种和转基因安全评价等提供了简单可靠的工具。(2)本发明方法灵敏度高，可GR79-EPSPS蛋白进行定量检测。(3)本发明检测方法可对GR79-EPSPS转基因植物的种子、幼苗及其各个组织器官进行检测，能够缩短育种进程，加快育种速度，降低育种成本，为GR79-EPSPS转基因棉花新品种培育和推广应用奠定了基础。(4) 本发明免疫胶体金试纸条检测简单、检测速度快，为大规模育种后代选择、或者转基因监管的现场检测提供了有力保障。
生物材料保藏
本发明小鼠杂交瘤细胞株是本发明人自行融合筛选得到的，命名为 Anti-GR79-1-27B10，其保藏编号为：CGMCC No.13483，保藏日期为2016年 12月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株。
附图说明
图1为GR79-1抗体针对棉花种子的Western blot检测图谱。其中1C1、 11D3、16C6、21F7、27B10、35G2为细胞株编号。
图2为GR79-1-27B10抗体针对不同转基因棉花种子GR79-EPSPS蛋白的 Westernblot检测图谱；其中1#为对照，为非转基因材料；3#、14#、15# 和21#为不同的GR79-EPSPS转基因棉花材料。
图3为GR79-1-27B10抗体对不同转基因棉花叶片GR79-EPSPS蛋白的 Westernblot检测图谱；其中1#为对照，为非转基因材料；3#、14#、15# 和21#为不同的GR79-EPSPS转基因棉花材料。
图4为GR79-EPSPS蛋白检测电泳图谱；其中1为沉淀，2为上清液。
图5为GR79-EPSPS蛋白纯化产物检测电泳图谱。
图6为GR79-1重组蛋白ELISA标准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的解释和说明，但对本发明不构成任何限制。
除非特别说明，以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社) 中所述条件，或者依据仪器设备或试剂制造商提供的实验方法所建议的条件。实验中所涉及的试剂和耗材均为市售的常规商品。
实施例1本发明小鼠杂交瘤细胞株的筛选和单克隆抗体的制备
按照如下方法进行:
(1)免疫原性肽段的设计
根据《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(CN103981199A) 专利申请中公布的GR79-EPSPS蛋白的氨基酸序列，利用蛋白质库预测 GR79-EPSPS蛋白免疫原性的位点，共获得了3个具有免疫原性的肽段，本发明主要是针对其中的一个具有免疫原性的肽段，该肽段的氨基酸序列组成为： Asp-Gly-Phe-Thr-Ile-Tyr-Pro-Gly-Gln-Pro-Val-Gly-Thr-Thr-Leu-Asn-Pr o-His-Asp-Asp-Cys。将该肽段命名为GR79-1。
(2)多肽偶联
将步骤(1)所得的GR79-1抗原多肽送交北京华大蛋白质研发中心有限公司人工合成免疫原性肽段并进行巯基修饰，巯基修饰的多肽(通过Cys的侧链)用于与KLH、BSA发生共轭反应形成多肽与KLH或者BSA复合物。
(3)动物免疫
按60μg蛋白/只小鼠的量(多肽为KLH偶联的)，皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，编号为：1、2、3。皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg 蛋白/只。皮下第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。眼眶取血，测血清效价。用免疫原50μg，腹腔冲击待融合小鼠。免疫效价检测：对应的抗原(多肽为BSA偶联的) 2μg/mL，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开2倍梯度稀释，空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200倍稀释。
效价结果见表1。
表1.GR79-1相关免疫原免疫效价结果
抗原 3200 6400 12800 25600 空白对照 阴性对照
GR79-1#1 0.764 0.671 0.532 0.36 0.035 0.063
GR79-1#2 0.796 0.649 0.526 0.376 0.016 0.044
GR79-1#3 0.753 0.562 0.430 0.257 0.021 0.052
(4)细胞融合试验
取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合，融合后共获得31株 GR79-1杂交瘤细胞系。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。同时，对获得的杂交瘤细胞系进行亚克隆，目的是保持细胞株的稳定性。
(5)利用转基因棉花材料筛选单克隆抗体
收取步骤(4)中所述杂交瘤细胞分泌的上清，针对天然转基因材料进行抗体识别特异性的鉴定。利用Western blot方法筛选，具体方法如下：
用液氮研磨新鲜棉花种子(或叶片)组织至粉末状，分装到预冷离心管中，每300μL粉末加入800μL蛋白质裂解液(其组成成分及其比例为：62.5 mmol/L pH7.4Tris·HCl，10％甘油，2％SDS，20mmol/L NaF，2mmol/L EDTA， 1mmol/L PMSF，5％β-巯基乙醇)，迅速混匀并置于冰上，冰水混合物中孵育10min，期间震荡混匀4～5次；在4℃、12000rpm离心15min，取上清，转移到新的1.5mL离心管中，-70℃保存。将提取的棉花蛋白质进行 SDS-PAGE后电转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，用制备的抗体室温孵育3h，TTBS(其组成成分及其比例为：2mmol/L Tris·HCl pH7.6, 13.6mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)洗膜3次，每次5min，之后加入羊抗兔二抗室温孵育1h，TTBS洗膜3次，每次5min，加ECL Plus检测液检测，暗室曝光5min。通过对比分析(见图1)最终获得特异性和表达量最高的5株细胞株(分别为：1C1、11D3、16C6、21F7、27B10),依据杂交结果 (Western blot和ELISA检测抗体)最终选择由编号为27B10细胞株产生的的单抗，将此小鼠杂交瘤细胞株命名为：anti-GR79-1-27B10，并于2016年 12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.13483。该小鼠杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体即为本发明单克隆抗体，称为GR79-1-27B10单克隆抗体或简称为单克隆抗体。
实施例2利用本发明单克隆抗体检测不同GR79-EPSPS转基因材料试验 (一)试验材料：转GR79-EPSPS基因棉花材料，分别编号为：3#、14#、 15#和21#；对照为非转基因材料，编号为：1#。
(二)试验方法：
利用实施例1中所得的GR79-1-27B10单克隆抗体对不同转GR79-EPSPS 基因棉花种子及叶片进行Western blot检测，方法步骤同实施例1步骤(5)。
结果(见图2)与对照材料(1#)相比较，3#、15#和21#转GR79-EPSPS 基因棉花材料的种子中高表达GR79-EPSPS蛋白。另外，从图3可以看出，在 3#、14#、15#和21#转GR79-EPSPS基因棉花材料的叶片中高表达GR79-EPSPS 蛋白。上述结果说明，本发明单克隆抗体能特异性地检测GR79-EPSPS蛋白，可用于转GR79-EPSPS基因植物的检测。
实施例3重组标准品蛋白制备
1、将《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(CN103981199A) 专利申请中公布的SEQ ID NO:3所示的GR79-EPSPS的核苷酸序列，克隆于原核表达载体pET30a-GST，转化大肠杆菌菌种BL21(DE3)表达GR79-EPSPS 蛋白。
2、GR79-EPSPS蛋白原核表达
(1)从细菌固体培养板挑取单克隆到LB液体培养基1.5mL中，在37℃、 200rpm下培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导，在37℃、200rpm培养2h。
(2)取步骤(1)中诱导的菌液1ml，在12000rpm下离心1min；弃上清，沉淀用50-100μL 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，在100℃煮5min，电泳检测初筛能够表达外源蛋白的菌株。
(3)挑选高效表达外源蛋白的菌株，接5-10μL活化的菌液到5mL LB 液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养。
(4)将培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，在37℃、200rpm 下培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导4h。
(5)大量收菌：用400mL大离心筒，在6000rpm下离心5min，弃上清。
(6)超声破菌：沉淀用25mL 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声处理(500W，90次，每次3s，间隔6s)。
(7)电泳确定表达形式：取100μL超声后的菌悬液，在12000rpm下离心10min；取50μL上清至另一EP管；上清去除干净后，沉淀用50μL 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μL 2×loading buffer，在100℃煮5min，电泳。结果(见图4)获得GR79-EPSPS(简称GR79)蛋白。
3、GR79-EPSPS蛋白质的纯化
(1)用去离子水洗镍柱(Ni Sepharose 6Fast Flow，GE Healthcare)，至pH 7.0。
(2)挂镍，至pH 2～3。
(3)去离子水洗柱至pH 7.0。
(4)10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱，约100mL。
(5)含0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱，约 50mL。
(6)稀释样品上样。样品中含0.5M氯化钠、10mM Tris-HCl(pH 8.0)。
(7)上样结束后，0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗柱。
(8)分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的10mM Tris-HCl (pH 8.0)0.5M氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰。
(9)电泳检测蛋白纯化效果。结果(见图5)获得纯化的GR79-EPSPS 蛋白。
实施例4用本发明单克隆抗体检测不同GR79-EPSPS转基因棉花材料试验
利用实施例1所得的GR79-1-27B10单克隆抗体对转GR79-EPSPS基因棉花种子及叶片进行ELISA检测。
(一)试验材料：转GR79-EPSPS基因棉花材料，分别编号为：3#、14#、 15#和21#；对照为非转基因材料，编号为：1#。
(二)试验方法：
(1)用液氮研磨新鲜棉花叶片/种子组织至粉末状，分装到预冷离心管中，每300μL粉末加入800μL蛋白质PBS提取解液(其组成成分及其比例为：NaCl 0.8g，KH2PO4 0.02g，Na2HPO4.12H2O 0.29g，KCl 0.02g，叠氮钠0.01g，1mmol/LPMSF，5％β-巯基乙醇，加双蒸水至100ml，调至pH 7.4)，迅速混匀并置于冰上，冰水混合物中孵育10min，期间震荡混匀4～5次，在4℃、 12000rpm下离心15min，取上清，转移到新的1.5mL离心管中，-70℃保存。
(2)分别吸取步骤(1)中提取的蛋白液体100μL加入酶标板中进行样品包被，同时分别将0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、 25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL的原核表达标准蛋白加入酶标板用于绘制标准曲线。4℃包被过夜后，利用200μL2％脱脂奶粉，在37℃封闭2h。封闭结束后吸干孔内反应液，将200μL PBST(其组成成分及其比例为：NaCl 0.8g，KH2PO40.02g，Na2HPO4.12H2O 0.29g，KCl 0.02g， Tween20 0.05ml，叠氮钠0.01g，加双蒸水至100ml，调至pH 7.4)洗涤液注满板孔，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数为3次。洗涤结束后倾去液体后在吸水纸上拍干，加入100μL PBST 稀释1000倍的GR79-1-27B10单克隆抗体，室温孵育30-60min，之后进行洗涤酶标板3次，方法同前。加入100μL OPD-过氧化氢底物，避光反应5-10min，待显色后加入终止液(2mol/L H2SO4溶液)终止反应，利用酶标仪492nm波长进行检测。读取数据进行统计分析，绘制标准曲线(见图6)，依据待测样品的 OD值计算获得GR79-EPSPS蛋白表达量。
结果与非转基因对照材料(1#)比较，3#、15#和21#棉花种子中 GR79-EPSPS蛋白表达量在100μg/g以上(见表2)，而3#、14#、15#和21# 转基因棉花叶片均高表达目的蛋白，表达量达到200μg/g以上(见表3)。上述试验结果说明利用本发明单克隆抗体在转基因棉花种子和叶片中分别检测到了GR79-EPSPS蛋白表达，并且检测灵敏度非常高，可用于转基因植物中 GR79-EPSPS蛋白的定量检测。
表2转基因棉花种子中GR79-EPSPS蛋白浓度检测结果
样本编号 GR79/鲜重(μg/g)
种子1#(CK) 0.0
种子3# 146.2
种子14# 77.1
种子15# 388.0
种子21# 471.6
表3转基因棉花叶片中GR79-EPSPS蛋白检测结果
样本编号 GR79/鲜重(μg/g)
叶片1#(CK) 0.0
叶片3# 543.0
叶片14# 327.9
叶片15# 977.1
叶片21# 966.0

Claims (2)

1.一种小鼠杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.13483。
2.一种单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.13483的小鼠杂交瘤细胞株产生。
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