CN114280305A

CN114280305A - 牛筋草epsps蛋白胶体金检测试纸及其应用

Info

Publication number: CN114280305A
Application number: CN202110587643.0A
Authority: CN
Inventors: 陈景超; 李香菊; 崔海兰; 于惠林
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。所述检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗。利用本发明的检测试纸可实现现场对牛筋草叶片、茎和种子等样品中EPSPS蛋白的快速、灵敏检测。

Description

牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术领域，具体地说，涉及一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。

背景技术

草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，是全球应用最广的除草剂之一。草甘膦的靶标是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，EPSPS是生物体内芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键酶；草甘磷是通过抑制EPSPS的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有灭生性作用，这限制了草甘膦在农业生产中的应用。美国孟山都公司通过向植物中转入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS等基因，成功培育出了商业化的转基因抗草甘膦作物，为草甘膦的应用开辟了新途径。目前已经获得了大豆、玉米、棉花、油菜、烟草、甜菜、花生、小麦、水稻或向日葵等抗草甘膦转基因作物。

草甘膦的长期使用，引起杂草对草甘膦产生抗性，导致转基因作物减产。杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，抗性的分子检测方法主要有：(1)EPSPS序列保守位点PCR检测；(2)EPSPS基因表达量qPCR检测；(3)EPSPS蛋白免疫印迹检测等，其中PCR与qPCR的方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，成本较高。蛋白免疫印迹检测方利用免疫学原理对目的蛋白进行定性定量鉴定，利用靶标蛋白抗体可以通过Western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测植株中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。

胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对牛筋草植株进行快速的检测鉴定，该方法对场地、仪器、技术人员的要求相对较低，检测时间短。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸(牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸)，所述检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫(吸收垫)依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2-3mm；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线(T线和C线)，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗；

其中，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体(鼠抗EPSPS单克隆抗体)由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株FL-374-08分泌产生。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2021年4月14日。

抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的获得方法如下：将编码牛筋草EPSPS蛋白(SEQID NO:1)的基因经过优化重组构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该重组EPSPS蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体。该单克隆抗体对EPSPS蛋白特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对牛筋草不同器官中的EPSPS蛋白进行精准检测。

优选地，所述样品垫为玻璃纤维素膜。

本发明检测试纸中的硝酸纤维素膜可以替换成醋酸纤维素膜。

所述胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的制备方法包括：

取120mL胶体金溶液，加入0.1M的K₂CO₃溶液2400μL，搅拌5min后，加入1600μg抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min。加入终浓度为0.1％的BSA，静置30min；4℃，9000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用4mL复溶液(含1％BSA、5％蔗糖和5％吐温-20的10mM PBS液)复溶，即得。

所述胶体金溶液的配制方法包括：取超纯水99mL于烧杯中，加入1％氯金酸储存液1mL，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，加热至溶液沸腾，迅速加入现制备的柠檬酸三钠水溶液2.2mL，继续搅拌加热，溶液沸煮出现透明的橙红色后，继续沸煮15-20min，自然冷却至室温，加超纯水定容。倒入棕色瓶，4℃避光保存。

其中，柠檬酸三钠水溶液的配制方法包括：将1g柠檬酸三钠溶解于99mL超纯水中，混匀即得。

优选地，金标垫上包被的胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的浓度为0.4mg/mL。每条试纸上的包被量为0.24-0.4μg。

优选地，所述检测线包被的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL。每条试纸上的包被量为0.15-0.45μg。也可以将单抗替换成多抗。

优选地，所述质控线包被的抗鼠IgG二抗的浓度为1mg/mL。

优选地，所述样品垫的大小为4mm×15mm，金标垫的大小为3mm×4mm，硝酸纤维素膜的大小为4mm×28mm，吸水垫的大小为4mm×19mm。

优选地，所述检测线与质控线之间的间距为6-6.5mm。

优选地，所述背板(底板)为PVC板。

本发明的牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸的结构示意图见图1；其中，1为结果观察区，2为标记区，3为质控区(C)，4为检测区(T)，5为加样区。

第二方面，本发明提供所述检测试纸在牛筋草EPSPS蛋白检测中的应用。

本发明的牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸的具体检测步骤及原理如下：

先将速测试纸垂直插入检测样品中，不超过箭头位置(图1)；样品溶液沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，如果样品溶液中含牛筋草蛋白EPSPS，那么EPSPS蛋白将与金标垫上的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体结合，并与NC膜上的鼠抗EPSPS单克隆抗体结合，8-10min后，可于观察区中观察到检测区的颜色变化，即出现阳性条带；如果样品溶液中不含牛筋草蛋白EPSPS，那么检测区则观察不到阳性条带。而无论样品溶液中是否含牛筋草蛋白EPSPS，当样品溶液到达硝酸纤维素膜时，金标试纸条上的鼠抗EPSPS单克隆抗体均可与控制区包被的抗鼠IgG二抗结合，从而显色。

因此，本发明牛筋草蛋白EPSPS的手持式胶体金速测试纸的结果判断标准为：

阴性结果(-)，只出现1条C线；

阳性结果(+)：同时出现T线和C线。

本发明的牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸，对叶片、种子和散粮等复杂基质具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于牛筋草蛋白EPSPS的快速检测，具有以下特有优势：

(一)操作简单，无需专门的仪器设备，便于田间等现场直接进行检测。

(二)检测时间短，5-8min即可完成检测；结果判定标准统一，即阴性结果(-)，只出现1条C线；阳性(+)：同时出现T线和C线。

(三)检测灵敏度高，可检测出样品中痕量(约100μg/kg)的牛筋草EPSPS蛋白。

附图说明

图1为本发明的牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸的结构示意图；其中，1为结果观察区，2为标记区，3为质控区(C)，4为检测区(T)，5为加样区。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中，抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的获得方法如下：将编码牛筋草EPSPS蛋白的基因经过优化重组构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该重组EPSPS蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体。具体方法如下：

一、EPSPS蛋白的表达纯化

(一)EPSPS蛋白的小试表达

1、序列合成：根据蛋白序列(SEQ ID NO:1)，优化密码子，合成基因序列(SEQ IDNO:2)并克隆到载体pET30a上，序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列信息见表1：

表1

2、菌种活化：将构建的pET30a-EPSPS阳性质粒转化BL21(DE3)，涂布LB固体培养基(卡那浓度50μg/mL)。次日，挑取单克隆菌落接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养12h-14h。

3、小试表达：次日，菌种以1:50比例接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养至OD＝0.4-0.6，吸取1mL菌液离心处理后作为诱前对照。4mL菌液加入浓度为0.8mM的IPTG，25℃诱导表达6h后菌液8000rpm、4℃离心1min，收集菌体。SDS-PAGE鉴定蛋白的形式，结果显示有明显目的蛋白的表达。

4、蛋白表达形式的鉴定：上述表达的菌体加入1mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率40％、超声2s、间隔2s、时间30min。12000rpm、4℃离心1min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式，结果显示目的蛋白主要以可溶形式表达。

(二)蛋白的大量表达和纯化

1、菌种活化：固体平板上挑取pET30a-EPSPS单克隆菌落接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养12h-14h。

2、小试表达：次日，菌种以1:50接入800mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养至OD＝0.4-0.6，加入浓度为1mM的IPTG，25℃诱导表达6h后菌液8000rpm、4℃离心15min，收集菌体。

3、菌种裂解：加100mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s、时间15min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清和沉淀。

4、上清纯化：收集的上清利用高亲和性NI树脂进行纯化，收集流穿液、洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示200mM咪唑洗脱时蛋白纯度最佳。将200mM咪唑洗脱液透析去除咪唑，SDS-PAGE检测透析效果，结果显示(图1)蛋白透析后纯度和浓度均可行。经检测，最终目的蛋白纯度大于90％，浓度3mg/mL，蛋白量12mg。

(三)结果

pET30a-EPSPS蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度1mM，诱导温度25℃，诱导时间6h。蛋白主要在上清表达，上清经Ni柱纯化，透析去除咪唑，最终所得EPSPS蛋白的浓度2mg/mL，纯度大于90％，得到冻干蛋白10mg。

二、抗体制备

(一)多抗制备

1、免疫原制备：将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，以备免疫兔子。

2、免疫策略：将蛋白免疫2只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接ELISA检测。

间接ELISA方法如下：

1)用0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释表达纯化的蛋白至1μg/mL，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h或4℃静置过夜。

2)甩去板孔中液体，加入250μL洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。

3)加入检测样本，每孔100μL，同时加入阳性对照(步骤2中所取阳性兔血清)、阴性对照(免疫前兔血清)和空白对照(不加兔血清)37℃反应45min，

4)重复步骤2)；

5)加入HRP标记的羊抗兔酶标二抗，每孔100μL，37℃反应45min。

6)重复步骤2)；

7)加入显色剂，每孔100μL，室温避光反应15min。

8)加入终止液，每孔100μL，使用酶标仪在波长450读取OD值，抗血清效价见表2：

表2

3、多克隆抗体纯化：兔血清离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein A小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5mL0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

(二)单抗制备

1、免疫原制备：将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，以备免疫小鼠。

2、免疫策略：将蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接ELISA检测。

间接ELISA方法如下：

3)加入检测样本，每孔100μL，同时加入阳性对照(步骤2中所取阳性小鼠血清)、阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，

4)重复步骤2)；

5)加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100μL，37℃反应45min。

6)重复步骤2)；

7)加入显色剂，每孔100μL，室温避光反应15min。

8)加入终止液，每孔100μL，使用酶标仪在波长450读取OD值，抗血清效价见表3：

表3

3、细胞融合：最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，3天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70％乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，

4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，3天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。

5、克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性细胞株5株。

6、扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。

(三)腹水制备与纯化

1、腹水制备：提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。

2、单克隆抗体纯化：腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

(四)抗体筛选

1、效价检测

以间接ELISA方法对纯化后的抗体进行效价检测，结果见表4：

表4

2、亚型检测

用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果均为IgG类抗体。

3、抗体配对

利用双抗夹心ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。

双抗夹心的ELISA方法如下：

a、用CB将包被抗体稀释至10μg/mL，每孔100μL，37℃包被3h；

b、洗板3-5次，拍干，加入阳性标品/阴性对照/阳性样本/阴性样本，每孔100μL，25℃反应45min；

c、洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，每孔100μL，25℃反应45min；

d、洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min；

e、加入100μL终止液，OD₄₅₀读取OD值，结果见表5：

表5

其中FL-374-08的配对效果最好，因此采用FL-374-08(由保藏编号为CGMCCNo.22308的杂交瘤细胞株分泌产生)与兔多抗来制备试剂盒。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1牛筋草蛋白EPSPS的手持式胶体金速测试纸的制作

本实施例提供的牛筋草蛋白EPSPS的手持式胶体金速测试纸(牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡)由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫(吸收垫)和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2-3mm；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线(T线和C线)，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗。

其中，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株分泌产生。

所述质控线包被的抗鼠IgG二抗的浓度为1mg/mL。

所述样品垫的大小为4mm×15mm，金标垫的大小为3mm×4mm，硝酸纤维素膜的大小为4mm×28mm，吸收垫的大小为4mm×19mm。

所述检测线与质控线之间的间距为6-6.5mm。

所述背板(底板)为PVC板。

其中，胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的制备方法如下：

所述胶体金溶液的配制方法如下：取超纯水99mL于烧杯中，加入1％氯金酸储存液1mL，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，加热至溶液沸腾，迅速加入现制备的柠檬酸三钠水溶液2.2mL，继续搅拌加热，溶液沸煮出现透明的橙红色后，继续沸煮15-20min，自然冷却至室温，加超纯水定容。倒入棕色瓶，4℃避光保存。

其中，柠檬酸三钠水溶液的配制方法如下：将1g柠檬酸三钠溶解于99mL超纯水中，混匀即得。

检测卡的制作方法如下：在底板上依次粘贴样品垫和固定有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫。在金标垫上固定0.4mg/mL抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的检测线固定1.5mg/mL抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体以及在质控线固定抗鼠IgG二抗。然后置于37℃真空干燥30min，即得。

实施例2牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡检测实际标准品的效果评价

1、向样品杯中加入200μL空白样品液(pH7.4，0.2mol/L PBS液，配制方法如下：将8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾和0.2g氯化钾用双蒸水溶解定容至1L)，将速测试纸插入样品杯，在室温条件下反应8分钟后在结果观察区中观察显色结果。结果表明，观察区中T线不显色，C线显色。

2、向样品杯中加入100μL 0.1μg/ml的EPSPS蛋白标准品(用上述PBS液进行配制)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察区中C线、T线同时显色。

EPSPS蛋白标准品为EPSPS重组蛋白，其是将牛筋草中的EPSPS基因(SEQ ID NO:2)经过优化后构建入大肠杆菌表达系统，重组表达纯化得到。

实施例3牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡检测实际叶片样本的效果评价

1、向样品杯中加入200μL空白样品液(pH7.4，0.2mol/L PBS液，配制方法如下：将8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾和0.2g氯化钾用双蒸水溶解，定容至1L)，将速测试纸插入样品杯，在室温条件下反应8分钟后在结果观察区中观察显色结果。结果表明，观察区中T线不显色，C线显色。

2、向样品杯中加入200μL牛筋草叶片样本提取液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)，按照与阴性样品同样的操作步骤。结果表明，观察区中控制线C线和检测线T线均显色。

实施例4牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡检测实际种子样本的效果评价

2、向样品杯中加入200μL牛筋草种子样本提取液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)，按照与阴性样品同样的操作步骤。结果表明，观察区中控制线C线和检测线T线均显色。

实施例5牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡检测实际散粮样本的效果评价

2、向样品杯中加入200μL牛筋草茎组织样本提取液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)，按照与阴性样品同样的操作步骤。结果表明，观察区中控制线C线和检测线T线均显色。

本发明的牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸可实现现场对叶片、种子和茎部组织等样品中牛筋草EPSPS蛋白的快速、灵敏检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用

<130> KHP211111571.0

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 539

<212> PRT

<213> 牛筋草(Eleusine indica L. Gaertn.)

<400> 1

Asn Arg Ser Gln Thr Asn Leu Asp Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro

1 5 10 15

Asn Pro Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ala Ser Ala Met Ala Ala Met Ala

20 25 30

Ser Lys Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Leu Asp Leu Ala Ser Pro Ala

35 40 45

Leu Ser Arg Arg His Arg Leu Asn Ser Ala Arg Pro Ser Arg His Pro

50 55 60

Ala Ala Ala Ser Cys Ser Leu Arg Ala Arg Gly Arg Asp Arg Arg Ser

65 70 75 80

Ala Val Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Gly

85 90 95

Ala Glu Glu Val Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Val Val

100 105 110

Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ser

115 120 125

Ala Leu Ala Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu

130 135 140

Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu Ser Val

145 150 155 160

Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly

165 170 175

Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu

180 185 190

Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala

195 200 205

Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg

210 215 220

Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Lys

245 250 255

Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile

260 265 270

Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu

275 280 285

Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr

290 295 300

Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu

305 310 315 320

His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr

325 330 335

Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser

340 345 350

Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu

355 360 365

Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val

370 375 380

Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr

385 390 395 400

Val Thr Gly Pro Gln Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala

405 410 415

Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala

420 425 430

Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala

435 440 445

Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu

450 455 460

Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile

465 470 475 480

Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp

485 490 495

Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val

500 505 510

Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp

515 520 525

Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn

530 535

<210> 2

<211> 1629

<212> DNA

<213> 牛筋草(Eleusine indica L. Gaertn.)

<400> 2

catatgaatc gtagccagac caacctggat gcgcgtccac cgccgccgcc gccgaacccg 60

ccaccgccgt caccgcgtgc gtccgcaatg gcagcaatgg cttctaaggc tgctgcagct 120

actgtttctc tggatctggc aagcccggca ctgagccgcc gtcaccgtct gaattctgcg 180

cgtccgagcc gtcacccggc ggcggctagc tgctctctgc gtgcgcgtgg tcgtgatcgt 240

cgtagcgcgg ttgttgttgc tgcggctgcg gcggcagcgc cggcgaaagc gggcgcggaa 300

gaagtggttc tgcagccgat caaagaaatc agcggcgttg tgaaactgcc gggctctaaa 360

agcctgagca accgcattct gctgctgtcc gcgctggcgg aaggtaccac cgttgttgac 420

aacctgctga acagcgaaga tgttcactac atgctgggcg ctctgaaaac gctgggcctg 480

tctgttgaag ctgacaaagc ggcgaaacgt gcagttgttg tgggatgtgg tggcaaattc 540

ccggttgaaa aagatgcgaa agaagaagta cagctgttcc tgggcaacgc gggcaccgct 600

atgcgtccgc tgaccgcggc ggtgaccgca gcgggcggca acgcgaccta cgtgctggat 660

ggcgttccgc gtatgcgtga acgtccgatc ggcgatctgg ttgttggcct gaaacagctg 720

ggcgctgatg ttgattgctt tttaggcacc gactgtccgc cggttcgcgt taaaggtatc 780

ggtggtctgc cgggcggtaa agttaaactg agcggttcta tctccagcca gtacctgtct 840

gctctgctga tggcagcccc gctggccctg ggtgacgttg aaatcgaaat catcgataaa 900

ctgatctcca tcccgtacgt tgaaatgacc ctgcgtctga tggaacgttt cggcgttaaa 960

gcagaacact ctgactcttg ggatcgtttc tacatcaaag gtggccagaa atacaaatct 1020

ccgaaaaacg cgtacgtgga gggtgatgca tcttctgcga gctacttcct ggctggcgcc 1080

gcgatcaccg gtggcaccgt aactgttgaa ggttgcggca ccacctctct gcagggcgat 1140

gttaaattcg cggaagttct ggaaatgatg ggtgctaaag tgacctggac cgaaaccagc 1200

gttaccgtga ccggcccgca gcgcgaaccg ttcggtcgta aacacctgaa agcaattgat 1260

gttaacatga acaaaatgcc ggatgttgcg atgaccctgg ctgttgttgc gctgttcgca 1320

gatggcccga ctgctatccg tgatgtagcg agctggcgcg ttaaagaaac cgaacgtatg 1380

gtggcgatcc gtaccgaact gaccaaactg ggtgcgagcg ttgaagaagg tccggattac 1440

tgcatcatca ccccgccgga aaaactgaac gttaccgcta tcgataccta cgatgatcac 1500

cgcatggcga tggcatttag cctggcagcg tgcgcagatg ttccggtgac catccgtgat 1560

ccgggttgca cccgtaaaac cttcccggat tacttcgatg ttctgagcac cttcgttaaa 1620

aacctcgag 1629

Claims

1.牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸，其特征在于，所述检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2-3mm；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗；

其中，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株FL-374-08分泌产生。

2.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的制备方法包括：

取120mL胶体金溶液，加入0.1M的K₂CO₃溶液2400μL，搅拌5min后，加入1600μg抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入终浓度为0.1％的BSA，静置30min；4℃，9000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用4mL复溶液复溶，即得；所述复溶液为：含1％BSA、5％蔗糖和5％吐温-20的10mM PBS液；

所述胶体金溶液的配制方法包括：取超纯水99mL于烧杯中，加入1％氯金酸储存液1mL，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，加热至溶液沸腾，迅速加入现制备的柠檬酸三钠水溶液2.2mL，继续搅拌加热，溶液沸煮出现透明的橙红色后，继续沸煮15-20min，自然冷却至室温，加超纯水定容；倒入棕色瓶，4℃避光保存；其中，柠檬酸三钠水溶液的配制方法包括：将1g柠檬酸三钠溶解于99mL超纯水中，混匀即得。

4.根据权利要求3所述的检测试纸，其特征在于，金标垫上包被的胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的浓度为0.4mg/mL。

5.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述检测线包被的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL。

6.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述背板为PVC板。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测试纸，其特征在于，所述样品垫的大小为4mm×15mm，金标垫的大小为3mm×4mm，硝酸纤维素膜的大小为4mm×28mm，吸水垫的大小为4mm×19mm。

8.根据权利要求7所述的检测试纸，其特征在于，所述检测线与质控线之间的间距为6-6.5mm。

9.权利要求1-8任一项所述检测试纸在牛筋草EPSPS蛋白检测中的应用。