CN108047330B

CN108047330B - Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体

Info

Publication number: CN108047330B
Application number: CN201711434811.2A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 耿丽丽; 束长龙; 宋福平; 彭琦
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108047330A

Abstract

本发明涉及抗原‑抗体蛋白质的技术领域，特别是本申请之一涉及Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体，其能够由保藏编号为CGMCC NO:14900的杂交瘤细胞株产生。

Description

Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及抗原-抗体蛋白质的技术领域，特别涉及用于检测Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体。

背景技术

随着转基因技术的发展，大量的转基因作物进入商品流通领域。目前以广泛用于玉米、大豆、棉花等农作物。cry2Ah1基因来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)，cry2Ah1基因编码Cry2Ah1蛋白，该蛋白对棉铃虫和玉米螟具有良好的杀虫活性。

对转基因农产品的管理，要从转基因农产品检测开始。目前，对于转基因产品的检测主要有以DNA为目标的检测方法，例如以DNA为目标的PCR法、Southern blot法和生物芯片法等；以及以蛋白为目标的检测方法，例如ELISA或胶体金快速检测试纸条等。其中，DNA检测虽然灵敏度高，但是由于不同农作物的不同转化事件cry2Ah1基因的检测没有通用的引物，对样品的采集处理及提取方法重复性差，导致PCR结果假阳性和假阴性率高，检测方法繁琐耗时、检测成本高且需要配备较先进昂贵的仪器，检测人员也要经过专业培训才能胜任。这些缺点使其不能承担国际和国内贸易中进出口产品的大量或常规检测工作，也难于在基层单位推广使用。以蛋白为目标的检测方法，由于灵敏度不够高，也会出现假阳性和/或假阴性率高的问题。

为此，需要开发出一种能够节省时间、降低检测成本且操作更为简单的能够准确检测转cry2Ah1基因的转基因植物的产品。

发明内容

本申请之一提供了一种Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体，其能够由保藏编号为CGMCCNo.14900的杂交瘤细胞株产生。

所述单克隆抗体的亲和力常数为1.58×10¹³l/mol。也就是说，其与抗原的抗原决定簇的特异性结合强度非常高，显著优于制备过程中筛选到的Cry2Ah1蛋白的其他单克隆抗体(筛选过程中的这些单克隆抗体的亲和力常数普遍在10⁸至10⁹l/mol左右)的结合强度，因而，该抗体的应用比现有技术中的所述抗体的应用更具有优势。使用本申请的Cry2Ah1单克隆抗体作为检测含有cry2Ah1基因的转基因植物时的灵敏度和特异性相当高，因而更容易检测到目标基因，而不至于漏检或错检。这将对鉴定含有cry2Ah1基因的转基因植物具有重要的意义，为我国的转基因农产品的管理迈出了坚实的一步。

而且，利用Cry2Ah1蛋白抗原‐抗体反应能够准确检测含有cry2Ah1基因的转基因植物，并且能够节省时间，降低检测成本，操作更为简单。

本申请之二提供了一株保藏编号为CGMCC No.14900的杂交瘤细胞株。

本申请之三提供了本申请之一所述的单克隆抗体的应用。

在一个具体的实施例中，所述应用为在鉴定Cry2Ah1蛋白中的应用；即所述单克隆抗体在检测样品中是否含有如SEQ ID No.2所示蛋白的应用。

在一个具体的实施例中，所述样品选自农田土壤和/或农作物。

在一个具体的实施例中，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。其中，处于生长阶段的农作物和/或收获后的农作物的样品的选取可以为所述农作物的根、茎、叶、花、果实、籽粒中的至少一种，这可以根据本领域的需求或者Cry2Ah1蛋白的组织特异性表达部位进行合适的选择。

本申请之四提供了一种用于检测Cry2Ah1蛋白的试剂盒，其所述试剂盒包括如本申请之一所述的单克隆抗体。

本申请的用于检测Cry2Ah1蛋白的试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、酶免疫层析检测试剂盒、化学发光检测试剂盒以及免疫荧光检测试剂盒。

在一个具体的实施方式中，为ELISA检测试剂盒，该试剂盒中可以包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照以及阴性对照。阳性对照例如可以是原核或真核表达的纯化的Cry2Ah1蛋白；阴性对照例如可以是非转基因大豆种子的全蛋白。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中的所述样品稀释液为含有脱脂奶的磷酸盐缓冲液，优选为含有10％(W/V)脱脂奶的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液为含有Tween-20的磷酸盐缓冲液，优选为含有0.05％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液；

所述显色液包括显色液A和显色液B，所述显色液A含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，并用ddH₂O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄ 2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH₂O定容至100ml；

所述终止液为2mol/L H₂SO₄。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH 4至约pH 10的范围，优选约pH 5至pH 9的范围，更有选约pH 6至约pH 8的范围，最优选约pH 7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和/或氯化钾的磷酸盐缓冲液。

用于检测Cry2Ah1蛋白的ELISA检测试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：

(1)克隆所述Cry2Ah1全蛋白(如SEQ ID NO:2所示的序列)的DNA(如SEQ ID NO:1所示的序列)，并进行蛋白质表达；

(2)利用所述蛋白免疫小鼠产生杂交瘤细胞，然后通过大量的筛选，得到性能优良的分泌抗Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701；其中，单克隆抗体Cry2Ah1BIOTDB1701由保藏号为CGMCC No.14900的杂交瘤细胞株分泌产生。

本申请之五提供了本申请之四所述的试剂盒的应用。

本申请中的短语“特异性结合”是指这样的结合反应，在所述结合反应中结合对的两个成员(例如，抗体和包含该抗体目标表位的分子)彼此结合的亲和性比所述成员对异质混合物其他组分(例如，杂交瘤培养物上清液或其他蛋白的混合物)的亲和性高至少100倍。

在本申请中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

附图说明

图1显示了利用本申请制备的单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701与Cry2Ah1蛋白的Western blot，其中M为蛋白Marker。

图2显示了单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701与转基因材料和非转基因材料的Western blot。

细胞保藏

小鼠骨髓杂交瘤细胞株IPPCAAS6B2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14900，保藏日期为2017年12月20日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。小鼠骨髓杂交瘤细胞株IPPCAAS6B2产生的单克隆抗体为Cry2Ah1 BIOTDB1701。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

抗原的制备

将基因序列Cry2Ah1(SEQ ID No.1)连接到pET-21b表达载体上，并在大肠杆菌中表达，抗性为卡那霉素。最终在Bl21中表达，基本条件为在抗性条件下，25℃低温诱导过夜。

利用His标签对诱导产生的上述蛋白进行纯化，条件为15mM咪唑洗脱，60mM咪唑洗涤，150mM咪唑洗脱，300mM咪唑洗脱。将150mM咪唑洗脱获得的组分用10mM Tris-HCl透析，测定蛋白质浓度为0.9mg/ml。

实施例2

单克隆抗体的制备

1)动物免疫

用Cry2Ah1蛋白按60μg/只小鼠的量，皮下初次免疫6只SPF BALB/c雌性小鼠，编号依次为：1至6。皮下第一次加强免疫；皮下第二次加强免疫，蛋白的免疫量为60μg/只；皮下第三次加强免疫，蛋白的免疫量为60μg/只；皮下第四次加强免疫，蛋白的免疫量为60μg/只；眼眶取血，测血清效价。

2)免疫效价检测

步骤：将Cry2Ah1蛋白用包被液，2μg/ml，4℃包被过夜；2％脱脂牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。结果：选取免疫效价最高2号小鼠，做腹腔冲击细胞融合实验。3)细胞融合实验

用上述纯化的Cry2Ah1蛋白免疫原50μg，腹腔冲击3号小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

实验器材

灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿、湿盒、2个500ml烧杯、2个50ml离心管、3个15ml离心管。

实验试剂

IMDM培养基

IMDM完全培养基(含15％血清)

2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA；货号：M0262-100G

新生牛血清：10ml

PEG1500：厂家：Roche；货号：78364

HAT：厂家：Sigma；货号：H0262-10VL

HT：厂家：Sigma；货号：H0137-10VL

融合实验步骤

i.将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

ii.小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

iii.在平皿中倒入少量无血清的IMDM培养基，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

iv.用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入2ml的HAT，2ml的HT放在孵箱中备用。

v.将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM培养基将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

vi.将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM培养基，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM培养基。离心1000rad/min，5min。

vii.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

4)筛选杂交瘤细胞

待融合的细胞培养至第7天时，即细胞培养至覆盖10％孔底时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA法检测抗体含量，经有限稀释进行二次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株，扩大培养，并将高效价、高特异性的细胞株冻存。

其中，各单克隆抗体的效价转换为亲和力常数Kd进行比较，亲和力常数Kd越高，则效价越高。亲和力常数Kd的测定如下：

包被重组Cry2Ah1蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗3次。每孔加200μl闭液37℃封闭2小时(hour，h)，PBST洗3次。将单克隆抗体从1∶200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBST洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1∶20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBST洗3次。每孔加入100μl含0.1％四甲基联苯胺(TMB)(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10分钟(minutes，min)，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD₄₅₀值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数。

在亲和力常数筛选测定过程中，发明人发现在115个样品中，通常的亲和力常数Kd均在10⁸至10⁹l/mol左右，而仅有一株的亲和力常数Kd突出的高为1.58×10¹³l/mol。最终将筛选出的亲和力常数Kd为1.58×10¹³l/mol的杂交瘤细胞，命名为小鼠骨髓杂交瘤细胞株IPPCAAS6B2，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14900。其产生的单克隆抗体命名为Cry2Ah1 BIOTDB1701。

利用单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701与Cry2Ah1蛋白的Western blot，结果(见图1)显示单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701能够特异识别该蛋白。

利用单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701与转基因材料和非转基因材料的Westernblot，结果(见图2)显示单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701能够特异识别相应的转基因材料。

实施例3

单克隆抗体的特征

1)单克隆细胞亚类鉴定

实验试剂包括：PBS-T为加有0.05％吐温20的PBS溶液。购自于Southern Biotech的包被抗体；封闭液，溶于PBS的2％BSA和3％蔗糖；显色液，0.2ml A液和10μl 30％H₂O₂溶于10ml的B液中(A液：15mg/ml ABTS溶于H₂O；B液：柠檬酸缓冲液，pH4.0)；购自于SouthernBiotech的各型亚类二抗。

实验步骤

A.用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5μg/ml，每孔加0.1ml，4℃，过夜。

B.PBS-T洗2次，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育2h。

C.PBS-T洗3次；每孔加入100μl杂交瘤上清，37℃孵育1h。

D.PBS-T洗3次；用封闭液1：1000(κ，λ)或1：2000稀释的HRP标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。

E.PBS-T洗3次；每孔加50μl底物溶液，10-20min内于双波长(450nm，630nm)测吸光值，记录保存数据。

数据分析结果表明单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701的亚型为IgG2b。

2)单克隆抗体特异性的鉴定

利用间接ELISA方法分别测定单克隆抗体Cry2Ah1 BIOTDB1701与转基因玉米种子的总蛋白、非转基因玉米种子的总蛋白反应特异性，测试材料共1000份。

测定结果显示：单克隆抗体与转基因材料具有100％的特异性反应，而与非转基因材料100％的无交叉反应，表明单克隆抗体是抗Cry2Ah1蛋白的特异性单克隆抗体。

Cry2Ah1

3)纯化单克隆抗体的外观

灯光照射下，肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。

4)无菌试验

采用无菌检查法，取纯化后单克隆抗体原料接种至10ml/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5ml/管)。接种后的改良马丁培养基置20-25℃培养。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。同时以0.9％无菌NaCl溶液同法操作做阴性对照。培养7天后均未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体原料符合无菌要求。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体

<130> LHA1760713

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1899

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

atgaataatg tattgaatag cggaagagct actaatggtg atgcgtataa tgtagtggct 60

catgatccat ttagttttca acataaatca ttagatacca tacaagaaga atggatggag 120

tggaaaaaag ataatcatat tttatatgta gatcctattg ttggaactgt ggctagcttt 180

cttttaaaga aagtggggag tcttgttgaa aaaagaatat taagtgagtt acggaattta 240

atatttccta gtggcagtac aaatctaatg caagatattt taagagagac agaaaaattc 300

ctgaatcaaa gacttaatac agacactctt gcccgtgtaa atgcggaatt gacagggctg 360

caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaat 420

gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc agcaattatt tctaaataga 480

ttaccccagt ttcagatgca aggataccaa ttgttattat tacctttatt tgcacaggca 540

gccaatttac atctttcttt tattagagat gttattctta atgcagatga atggggaatt 600

tcagcagcaa cattacgtac gtatcaaaat cacctgagaa attatacaag agagtactct 660

aattattgta taactacgta tcaaactgcg tttagaggtt taaacacccg tttacacgat 720

atgttagaat ttagaacata tatgttttta aatgtatttg aatatgtatc tatctggtcg 780

ttgtttaaat atcaaagcct tctagtatct tctggcgcta atttatatgc aagtggtagt 840

ggaccacagc agacccaatc atttacttca caagactggc catttttata ttctcttttc 900

caagttaatt caaattatgt gttaaatggc tttagtggcg ctagacttac gcagactttc 960

cctaatattg ttggtttacc tggtactact acaactcacg cattgcttgc tgcaagggtc 1020

aattacagtg gaggagtttc gtctggtgat ataggcgctg tgtttaatca aaattttagt 1080

tgtagtacat ttctcccacc tttgttaaca ccatttgtta gaagttggct agattcaggt 1140

tcagatcggg gggggattaa taccgttacc aattggcaaa cagaatcctt tgagacaact 1200

ttaggtttaa ggagtggtgc ttttacagct cgaggtaatt caaactattt cccagattat 1260

tttatccgta atatttctgg agttccttta gttgttagaa atgaagattt aagaagaccg 1320

ttacactata atcaaataag aaatatagaa agtccttcag gaacacctgg tggattacga 1380

gcttatatgg tatctgtgca taacagaaaa aataatatct atgccgttca tgaaaatggt 1440

actatgattc atttagcgcc ggaagattat acaggattta ctatatcgcc gatacatgca 1500

actcaagtga ataatcaaac gcgaacattt atttctgaaa aatttggaaa tcaaggtgat 1560

tccttaagat ttgaacaaag caacacgaca gctcgttata cccttagagg gaatggaaat 1620

agttacaatc tttatttaag agtatcttca ataggaaatt ccactattcg agttactata 1680

aacggtagag tttatactgc ttcaaatgtt aatactacta caaataacga tggagttaat 1740

gataatggag ctcgtttttc agatattaat atcggtaatg tagtagcaag tgataatact 1800

aatgtaccgt tagatataaa tgtgacatta aattcgggta ctcaatttga gcttatgaat 1860

attatgtttg ttccaactaa tcttccacca ctttattaa 1899

<210> 2

<211> 632

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Ala Thr Asn Gly Asp Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu Asp

20 25 30

Thr Ile Gln Glu Glu Trp Met Glu Trp Lys Lys Asp Asn His Ile Leu

35 40 45

Tyr Val Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys Lys

50 55 60

Val Gly Ser Leu Val Glu Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn Leu

65 70 75 80

Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg Glu

85 90 95

Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala Arg

100 105 110

Val Asn Ala Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe Asn

115 120 125

Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro Leu

130 135 140

Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn Arg

145 150 155 160

Leu Pro Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu

165 170 175

Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile

180 185 190

Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr Tyr

195 200 205

Gln Asn His Leu Arg Asn Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile

210 215 220

Thr Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp

225 230 235 240

Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser Gly

260 265 270

Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe

275 280 285

Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser

290 295 300

Asn Tyr Val Leu Asn Gly Phe Ser Gly Ala Arg Leu Thr Gln Thr Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Gly Thr Thr Thr Thr His Ala Leu Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser Gly Asp Ile Gly

340 345 350

Ala Val Phe Asn Gln Asn Phe Ser Cys Ser Thr Phe Leu Pro Pro Leu

355 360 365

Leu Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp Arg Gly

370 375 380

Gly Ile Asn Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu Thr Thr

385 390 395 400

Leu Gly Leu Arg Ser Gly Ala Phe Thr Ala Arg Gly Asn Ser Asn Tyr

405 410 415

Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val Val

420 425 430

Arg Asn Glu Asp Leu Arg Arg Pro Leu His Tyr Asn Gln Ile Arg Asn

435 440 445

Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Leu Arg Ala Tyr Met Val

450 455 460

Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile Tyr Ala Val His Glu Asn Gly

465 470 475 480

Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile Ser

485 490 495

Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile Ser

500 505 510

Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Ser Asn

515 520 525

Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn Leu

530 535 540

Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr Ile

545 550 555 560

Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn Asn

565 570 575

Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile Gly

580 585 590

Asn Val Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Pro Leu Asp Ile Asn Val

595 600 605

Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Glu Leu Met Asn Ile Met Phe Val

610 615 620

Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

625 630

Claims

1.一种Cry2Ah1蛋白的单克隆抗体，其能够由保藏编号为CGMCC No.14900的杂交瘤细胞株产生。

2.一株保藏编号为CGMCC No.14900的杂交瘤细胞株。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在检测样品中是否含有如SEQ ID No.2所示蛋白的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品选自农田土壤和/或农作物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。

6.一种用于检测Cry2Ah1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在检测样品中是否含有如SEQ ID No.2所示蛋白的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品选自农田土壤和/或农作物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。