CN112779225B - 一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌醚菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。将醚菌酯的完全抗原免疫BALB/c小鼠，将高效价、低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株杂交瘤细胞株AE。AE分泌的单克隆抗体，对醚菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.5ng/mL)，为食品中醚菌酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
醚菌酯(kresoxim-methyl)又称(E)-2-甲氧亚氨基-[2-(邻甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，是一种高效、广谱、新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。对草莓白粉病、甜瓜白粉病、黄瓜白粉病、梨黑星病、葡萄白腐病等病害具有良好的防效。它能控制治疗子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲、卵菌纲等大多数病害。对孢子萌发及叶内菌丝体的生长有很强的抑制作用，具有保护、治疗和铲除活性。有很好的渗透性及局部内吸活性，持效期长，被广泛用于防治果树类、蔬菜类、茶树、烟草等作物上的病害。由于醚菌酯具有高效广谱的杀菌活性，可一次性或多次用于蔬菜、果树及禾谷类作物；若乱用、滥用或使用不当，药物可能通过食物链传递到人群，对人体的健康产生潜在风险。
因此，《GB 2763—2019食品中农药最大残留限量》中规定了醚菌酯在各种食品中的最大残留限量标准(MRL)，如其在糙米中的MRL为0.1mg/kg，在黄瓜中的MRL为0.5mg/kg，在苹果和梨中的MRL均为0.2mg/kg，在葡萄干中的MRL为2mg/kg，以及在草莓中的MRL为1mg/kg。
为了有效监督监测醚菌酯的使用情况，防止药物的不规范使用，有必要开发一种高灵敏度、高特异性的检测方法，而目前检测方法如高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等仪器检测方法，其样品前处理过程极为复杂、成本昂贵，并且仪器方法并不适用于现场检测。免疫学检测方法是一种低成本、快速且高灵敏度高特异性的检测方法，而且操作简便、成本低，已广泛适用于药物残留检测领域。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
发明内容
本发明的目的是在于提供一株醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对醚菌酯具有较高的检测灵敏度，可以用来建立醚菌酯的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。
醚菌酯单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.19680的杂交瘤细胞株AE分泌产生。
醚菌酯半抗原，结构简式如下：
Figure BDA0002980701050000021
醚菌酯半抗原的制备方法：称取2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于甲醇、水和吡啶的混合溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，水浴持续搅拌反应后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入三氯甲烷溶解，再加入纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。
进一步地，步骤如下：称取100mg的2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于10mL甲醇、水和吡啶的混合溶液；所述混合溶液中甲醇：水：吡啶体积比依次为4：1：1；加入226mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于70℃水浴持续搅拌反应6h后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入5mL三氯甲烷溶解，再加入5mL纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。
醚菌酯完全抗原的制备方法：称取醚菌酯半抗原，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应，得到醚菌酯半抗原活化液；将钥孔血蓝蛋白KLH用硼酸缓冲溶液溶解，称为蛋白A液；在室温条件，将醚菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯完全抗原。
进一步地，步骤为：称取4.0mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入7.0mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.9mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应8h，得到醚菌酯半抗原活化液；将钥孔血蓝蛋白10mg，用3mL硼酸缓冲溶液溶解，称为蛋白A液；在室温条件，将醚菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯完全抗原。
醚菌酯包被原的制备方法，称取醚菌酯半抗原，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应，得到醚菌酯半抗原活化液；称取鸡卵白蛋白OVA，溶解于硼酸缓冲溶液中，称为B液；在室温条件下，将醚菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯包被原。
进一步地，步骤为：称取4.8mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入7.7mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.6mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h，得到醚菌酯半抗原活化液；称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，称为B液，在室温条件下，将醚菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯包被原。
分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE的制备方法：取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和亚克隆，得到一株醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE；步骤为：
(1)小鼠的免疫：醚菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原(不含佐剂)进行腹腔注射；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制率；
(2)细胞融合与细胞株建立：通过PEG法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基选择性培养，ic-ELISA检测细胞孔的阳性和抑制率，通过有限稀释法对阳性及抑制率较高的杂交瘤细胞进行亚克隆，最终筛选获得醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE；
(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度。
所述醚菌酯单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中醚菌酯残留的分析检测。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株AE分泌的单克隆抗体，对醚菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.5ng/mL)，可实现对果蔬、谷物中醚菌酯残留量的检测，为食品中醚菌酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。
附图说明
图1醚菌酯单克隆抗体的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将醚菌酯完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对醚菌酯有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株AE。
实施例1完全抗原和包被原的制备：
所用醚菌酯半抗原，其特征在于，有如下结构式：
Figure BDA0002980701050000041
醚菌酯半抗原的合成方案过程如下：称取100mg的2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于10mL甲醇、水和吡啶的混合溶液(甲醇：水：吡啶＝4：1：1，v/v/v)，加入226mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于70℃水浴持续搅拌反应6h后，取出，室温条件下避光过夜。随后，氮吹，加入5mL三氯甲烷溶解，再加入5mL纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。
完全抗原的制备：称取4.0mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入7.0mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.9mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应8h﹙称为醚菌酯半抗原活化液﹚。将钥孔血蓝蛋白10mg，用3mL硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液)，在室温条件，将醚菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原﹙TDF-KLH﹚。
包被原的制备：称取4.8mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入7.7mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.6mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h﹙称为醚菌酯半抗原活化液﹚。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，将醚菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原﹙TDF-OVA﹚。
实施例2分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE的制备
(1)小鼠的免疫：醚菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释完全抗原后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
(2)细胞融合：在最后一次加强免疫三天后，按照常规PEG法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入体积浓度75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用醚菌酯为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对醚菌酯标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株AE。
(4)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
4.1包被：将包被原TDF-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
4.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
4.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
4.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
4.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
4.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定醚菌酯单克隆抗体的IC50为0.5ng/mL，说明对醚菌酯有很好的灵敏度，可用于醚菌酯免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温-20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (3)

1.一株分泌醚菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。
2.醚菌酯单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19680的杂交瘤细胞株AE分泌产生。
3.权利要求2所述醚菌酯单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中醚菌酯残留的分析检测。
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Title
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Hapten synthesis and monoclonal antibody-based immunoassay development for the detection of the fungicide kresoxim-methyl;Mercader J V et al.;《Journal of agricultural and food chemistry》;20080206;第56卷(第5期);全文 *
Structure–immunogenicity relationship of kresoxim-methyl regioisomeric haptens;López-Moreno R et al.;《Organic & Biomolecular Chemistry》;20130909;第11卷(第42期);全文 *

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