CN113621583A - 一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，本发明的分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCC No.22328。本发明获得的烯酰吗啉单克隆抗体可以用于免疫分析检测，其对烯酰吗啉有较好的检测灵敏度和特异性，IC₅₀值为0.122ng/mL、对烯酰吗啉类似物交叉率小于10％。

Description

一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

烯酰吗啉(Dimethomorph)是一种系统性杀菌剂，可通过抑制真菌细胞壁的形成而对真菌具有活性，有治疗和抗孢子的作用。它被开发用于番茄、黄瓜和其他蔬菜上，以防治由真菌引起的植物疾病，如霜霉病、晚疫病、树冠和根腐病。然而，烯酰吗啉残留对人体具有一定的毒性，同时会对土壤环境造成生态危害。因此，建立一种可靠、高效、灵敏的蔬菜中烯酰吗啉残留检测方法是十分必要的

目前，已有对烯酰吗啉残留的检测的相关报道，主要采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法，然而这些方法样品前处理复杂，检测时需要大型仪器，昂贵且耗时，不适用于大量样品的快速检测。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测烯酰吗啉的前提是得到对烯酰吗啉具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对烯酰吗啉具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的烯酰吗啉单克隆抗体对烯酰吗啉具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.122ng/mL)，可以用于建立烯酰吗啉的免疫学检测方法，检测食品中烯酰吗啉的残留。

本发明的第一个目的是提供一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCC No.22328。

本发明的第二个目的是提供一种烯酰吗啉单克隆抗体，所述的烯酰吗啉单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22328的杂交瘤细胞株分泌得到。

本发明的第三个目的是提供所述的杂交瘤细胞株或所述的烯酰吗啉单克隆抗体在检测烯酰吗啉中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株或所述的烯酰吗啉单克隆抗体。

本发明的第五个目的是提供所述试剂盒在检测烯酰吗啉中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种烯酰吗啉半抗原，其结构式为：

本发明的第七个目的是提供一种烯酰吗啉完全抗原，其结构式为：

本发明的第七个目的是提供一种采用所述的烯酰吗啉完全抗原制备所述的分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤：

S1、将烯酰吗啉完全抗原制备成含抗原完全弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；

S2、将得到的含抗原完全弗氏佐剂对小鼠进行首次皮下免疫，再采用含抗原不完全弗氏佐剂对小鼠进行多次加强皮下免疫，筛选血清中烯酰吗啉抗体含量高的获得免疫的小鼠；

S3、将筛选出的获得免疫的小鼠采用含抗原不完全弗氏佐剂进行一次加强皮下免疫后，再采用含抗原不完全弗氏佐剂进行冲刺免疫；

S4、取S3中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，筛选得到所述杂交瘤细胞株。

进一步地，首次皮下免疫剂量为100μg/只，加强皮下免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。

进一步地，免疫过程包含1次首次皮下免疫、4次加强皮下免疫和1次冲刺免疫。

进一步地，首次皮下免疫与加强皮下免疫之间间隔30天，加强皮下免疫之间间隔21天，加强皮下免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。

进一步地，细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。

进一步地，细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行的。

进一步地，细胞融合后的杂交瘤细胞株采用RPMI-1640培养基培养。

本发明通过对烯酰吗啉进行衍生，得到烯酰吗啉半抗原。烯酰吗啉虽含有吗啉环基团，但起作用的并非吗啉环活性基团，而是其丙烯酰胺活性基团，该半抗原既完全保留烯酰吗啉原有的化学结构，使其特异识别位点更容易被暴露，同时在烯酰吗啉的边侧增加了一个氨基用于偶联蛋白制备免疫原。将该半抗原衍生物与蛋白偶联免疫小鼠，得到了一株针对烯酰吗啉灵敏度更高、特异性更好的单克隆抗体，并基于该单克隆抗体建立了一种快速，灵敏的检测烯酰吗啉的方法。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明获得的烯酰吗啉单克隆抗体可以用于免疫分析检测，其对烯酰吗啉有较好的检测灵敏度和特异性，IC₅₀值为0.122ng/mL、对烯酰吗啉类似物交叉率小于10％，交叉率＝(烯酰吗啉的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％。

生物材料样品保藏：一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCC No.22328。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明烯酰吗啉单克隆抗体对烯酰吗啉的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

抗体稀释液：PBS加入0.1％明胶。

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

烯酰吗啉抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将烯酰吗啉标准品稀释0，0.003，0.008，0.025，0.074,0.222，0.667和2ng/mL等浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图1所示)，获得烯酰吗啉标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1

本发明衍生后的烯酰吗啉半抗原结构如下：

衍生过程如下：

1.以1a，将其溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入O,N-二甲基羟胺盐酸盐、三乙胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)，将混合物在室温下搅拌过夜，干燥后得到2a。

2.将2a溶于四氢呋喃，在氮气保护下冷却，加入4-氯苯基镁，缓慢回到室温，搅拌过夜，干燥后得到化合物3a。

3.将含有氢化钠和膦酸三乙酯(8g)的甲苯溶液中搅拌1小时，在130℃下加入3a过夜，干燥后得到4a。

4.将4a溶于乙醇中，加入氢氧化锂水合物(并在室温下反应过夜。除去乙醇并用乙酸乙酯萃取。调解pH得到沉淀5a。

5.将5a溶于二氯甲烷，并加入吗啉-2-基甲基氨基甲酸叔丁酯，DIEA和HATU，反应4小时，干燥、蒸发、沉淀得到6a。

6.将二氯甲烷和三氟乙酸以5:1的比例混合，加入6a并在室温下搅拌过夜。然后，除去溶剂，得到烯酰吗啉衍生物7a，即为半抗原。

实施例2：烯酰吗啉完全抗原的合成

称取1mg烯酰吗啉半抗原(DMM-NH₂)，溶解于600μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将2.5％戊二醛加入到DMM-NH₂溶液中，室温搅拌反应1h(称为A液)。取5mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至3mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DMM-NH₂-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。

实施例3：烯酰吗啉包被原的合成

将3.7mg烯酰吗啉半抗原(DMM-NH2)溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到烯酰吗啉半抗原(DMM-NH₂)溶液；将2.5％戊二醛加入DMM-NH₂溶液中，室温搅拌进行反应1h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(DMM-NH2-OVA)。

实施例4：分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得：将烯酰吗啉完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1～4)×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用烯酰吗啉为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；

选择对烯酰吗啉标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；

按上述方法进行六次亚克隆，最终获得烯酰吗啉单克隆抗体细胞株5C3。

实施例5：烯酰吗啉单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶烯酰吗啉杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化；

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测得烯酰吗啉单克隆抗体的IC₅₀值为0.122ng/mL，并验证了对氟吗啉等烯酰吗啉结构类似物的IC₅₀以及交叉反应率，具体如表1所示，该单克隆抗体对烯酰吗啉类似物交叉率小于10％，说明对烯酰吗啉有较高的特异性，可用于烯酰吗啉免疫分析检测。(交叉率＝(烯酰吗啉的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％)。

表1烯酰吗啉单克隆抗体对氟吗啉、丁吡吗啉、丁苯吗啉、吗菌灵的IC₅₀及交叉反应率

实施例6：烯酰吗啉单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株5C3通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于烯酰吗啉的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.003，0.008，0.025，0.074，0.222，0.667和2ng/mL的烯酰吗啉标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗烯酰吗啉单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

烯酰吗啉单克隆抗体对烯酰吗啉的抑制标准曲线如图1所示，用ic-ELISA测定烯酰吗啉单克隆抗体的IC₅₀值为0.122ng/mL，其灵敏度为0.04ng/mL，说明该抗体对烯酰吗啉有较好的灵敏度，可用于烯酰吗啉的免疫分析检测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCCNo.22328。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在检测烯酰吗啉中的应用。

3.一种烯酰吗啉单克隆抗体，其特征在于，所述的烯酰吗啉单克隆抗体由权利要求1的杂交瘤细胞株分泌得到。

4.权利要求3所述的烯酰吗啉单克隆抗体在检测烯酰吗啉中的应用。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株。

6.权利要求5所述的试剂盒在检测烯酰吗啉中的应用。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求3所述的烯酰吗啉单克隆抗体。

8.权利要求7所述的试剂盒在检测烯酰吗啉中的应用。

9.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，其结构式为：

10.一种采用权利要求9所述的烯酰吗啉半抗原制备所述的分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、使用烯酰吗啉半抗原制备烯酰吗啉完全抗原，将烯酰吗啉完全抗原制备成含抗原完全弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；

S2、将得到的含抗原完全弗氏佐剂对小鼠进行首次皮下免疫，再采用含抗原不完全弗氏佐剂对小鼠进行多次加强皮下免疫，筛选血清中烯酰吗啉抗体含量高的获得免疫的小鼠；

S3、将筛选出的获得免疫的小鼠采用含抗原不完全弗氏佐剂进行一次加强皮下免疫后，再采用含抗原不完全弗氏佐剂进行冲刺免疫；

S4、取S3中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，筛选得到所述杂交瘤细胞株。

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