CN114316058A - 一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株dcf及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了免疫检测技术领域的一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF及其应用。该分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF，保藏编号为CGMCC NO.45013，其分泌的环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用于建立环酰菌胺的免疫学检测方法，检测食品中环酰菌胺的残留，具有重要的应用前景。

Description

一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF及其应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF及其应用。

背景技术

环酰菌胺(fenhexamid)是由拜耳公司开发的一种具有内吸性、保护性的新型酰胺类杀菌剂，可抑制真菌孢子萌发和菌丝体生长，主要用于灰霉病、菌核病及黑斑病等的防治，而且对一些已经产生抗性的菌种亦能表现出一定的活性。由于环酰菌胺在环境中降解较快，不易挥发，与生态具有良好的相容性，具有对作物安全、有利的毒理数据和良好的生态效果等特点，使得其成为理想的综合有害物治理用药。目前，有关环酰菌胺在食品中的残留有较多的研究。国内已经规定了其在蔬菜、水果、坚果等20多种农产品中的残留限量，因此，研究建立环酰菌胺的残留检测方法具有重要意义。

对于环酰菌胺残留的检测，常采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法。但这些方法存在样品前处理复杂和检测时间长等不足，不适用于大量样品的快速检测。因此，亟需建立一种针对环酰菌胺的高效、快速的检测方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测环酰菌胺的前提是得到对环酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对环酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF及其应用。

使用酶联免疫法检测环酰菌胺的前提是得到对环酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，制备对环酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的关键在于半抗原和抗原的设计和合成。所谓半抗原，是指这样一类小分子物质，其单独存在时不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，当其与大分子蛋白质或非抗原的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，即免疫反应性，但不具备免疫原性。通过对环酰菌胺进行化学修饰，引入可与载体蛋白偶联的活性基团。引入活性基团的种类、引入活性基团的位置，都会影响后续所制备单克隆抗体对环酰菌胺的特异性和灵敏度。目前，尚未有关于环酰菌胺半抗原的制备。

本发明第一方面提供一种环酰菌胺半抗原，其分子结构式如式I所示：

本发明第二方面提供一种环酰菌胺完全抗原，由所述环酰菌胺半抗原与载体蛋白偶联得到。

优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述环酰菌胺完全抗原分子结构式如式II所示：

本发明第三方面提供分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞，由所述环酰菌胺完全抗原免疫动物后制备得到。

本发明第四方面提供一种环酰菌胺单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞分泌产生。

本发明第五方面提供一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF，其保藏编号为CGMCC NO.45013。

本发明第六方面提供一种环酰菌胺单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株DCF分泌产生。

本发明第七方面提供上述杂交瘤细胞、上述杂交瘤细胞株DCF或上述环酰菌胺单克隆抗体在检测环酰菌胺中的应用或在制备环酰菌胺检测试剂盒中的应用。

本发明第八方面提供一种环酰菌胺检测试剂盒，包含上述杂交瘤细胞、上述杂交瘤细胞株DCF或上述环酰菌胺单克隆抗体。

优选地，所述环酰菌胺检测试剂盒还包括环酰菌胺包被原；

所述环酰菌胺包被原由环酰菌胺半抗原与鸡卵白蛋白偶联得到。

本发明的上述技术方案中，环酰菌胺半抗原的制备方法，步骤如下：将环酰菌胺溶于丙酮中，加入6-溴己酸乙酯、无水碳酸钾、碘化钾，回流，过滤混合物并将丙酮蒸发，将残留物溶解在乙醇和NaOH中，并回流过夜，然后用HCl将溶液酸化至pH<2，并用乙酸乙酯萃取三次，获得环酰菌胺半抗原。

本发明的上述技术方案中，所述环酰菌胺完全抗原的制备方法，步骤如下：将所述环酰菌胺半抗原FH-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到环酰菌胺半抗原FH-COOH溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于无水DMF后，加入到FH-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将载体蛋白，如牛血清蛋白BSA，用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，得到环酰菌胺完全抗原。

本发明的上述技术方案中，分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF的制备方法，包含如下步骤：

(1)使用环酰菌胺半抗原制备环酰菌胺完全抗原，将获得的环酰菌胺完全抗原制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；

(2)将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；

(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中环酰菌胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；

(4)将筛选出的小鼠用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的环酰菌胺完全抗原进行；

(5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF。

优选地，首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。

优选地，首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。

优选地，所述免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。

优选地，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。

优选地，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。

优选地，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行的。

优选地，所述步骤(5)中的培养基为RPMI-1640培养基。

优选地，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。

本发明的上述技术方案中，所述环酰菌胺单克隆抗体的制备方法，步骤如下：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射杂交瘤细胞株DCF，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。

优选地，所述环酰菌胺单克隆抗体的制备方法，具体为：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞株DCF，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种环酰菌胺半抗原和环酰菌胺完全抗原，并进一步制备分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF。杂交瘤细胞株DCF分泌的环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺具有较好的特异性(对环酰菌胺类似物交叉率小于1％)和检测灵敏度(IC₅₀值为0.869ng/mL)，可以用于建立环酰菌胺的免疫学检测方法，检测食品中环酰菌胺的残留，具有重要的应用前景。

附图说明

图1为本发明环酰菌胺半抗原的质谱图。

图2为本发明环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺的抑制标准曲线。

保藏说明

分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年12月16日，保藏编号45013。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

本发明实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12

0.005、碳酸氢钠2000。

本发明实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL。

PBST：含0.05％吐温20的PBS。

抗体稀释液：PBS加入0.1％明胶。

TMB显色液：A液：Na₂HPO_4.12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

本发明中涉及的环酰菌胺抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将环酰菌胺标准品稀释0，0.037，0.11，0.33，1，3，9和27ng/mL浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，获得环酰菌胺标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1：环酰菌胺半抗原的合成

本发明环酰菌胺半抗原结构如下，环酰菌胺半抗原简称为FH-COOH：

环酰菌胺半抗原的合成过程如下：

将172mg环酰菌胺溶于10mL丙酮中，加入123mg 6-溴己酸乙酯、83mg无水碳酸钾、8mg碘化钾，回流48h，过滤混合物并将丙酮蒸发，将残留物溶解在6.7mL乙醇和3.3mL 1MNaOH中，并回流过夜，然后用2.5M的HCl将溶液酸化至pH<2，并用乙酸乙酯萃取三次，获得环酰菌胺半抗原。环酰菌胺半抗原的质谱图如图1所示。

实施例2：环酰菌胺完全抗原的合成

称取8mg环酰菌胺半抗原(FH-COOH)，5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到FH-COOH溶液中，室温搅拌反应4-6h(称为A液))。取5mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至2mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原FH-COOH-BSA，结构如下，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。

实施例3：环酰菌胺包被原的合成

将4mg环酰菌胺半抗原(FH-COOH)、2.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到环酰菌胺半抗原(FH-COOH)溶液；将4.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到FH-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将5mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(FH-COOH-OVA)。

实施例4：分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得：将环酰菌胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；在第3次免疫过程结束后第7天进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制，筛选出血清中环酰菌胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；将筛选出的小鼠再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫。

2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1～4)×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用环酰菌胺为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；

选择对环酰菌胺标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得环酰菌胺单克隆抗体细胞株DCF。

实施例5：环酰菌胺单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶环酰菌胺杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测得环酰菌胺单克隆抗体的IC₅₀值为0.869ng/mL、对环酰菌胺类似物交叉率小于1％，说明对环酰菌胺有很好的灵敏度，可用于环酰菌胺免疫分析检测。

环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺类似物的IC₅₀及交叉率如表1所示。

交叉率＝(环酰菌胺的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％。

表1.环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺类似物的IC₅₀及交叉率

药物名称	IC<sub>50</sub>(ng/mL)	交叉率(％)
			环酰菌胺	0.869	100
氟吡菌胺	200	<1
			环丙酰菌胺	>500	<1
苯酰菌胺	>500	<1
			吡噻菌胺	>500	<1

实施例6：环酰菌胺单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株DCF通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于环酰菌胺的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.037，0.11，0.33，1，3，9和27ng/mL的环酰菌胺标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗环酰菌胺单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值。

环酰菌胺单克隆抗体对环酰菌胺的抑制标准曲线如图2所示，用ic-ELISA测定环酰菌胺单克隆抗体的IC₅₀值为0.869ng/mL，说明该抗体对环酰菌胺有较好的灵敏度，可用于环酰菌胺的免疫分析检测。

(6)添加回收及样品前处理：

选择黄瓜为检测样品：

将待测样品切碎，放入食品加工机中捣碎成匀浆。分别称取三份匀浆试样于具塞离心管，每份20g，向样品中分别添加5ppb，10ppb，20ppb的环酰菌胺标准品，加50mL乙腈，高速匀浆2min，加入15g无水硫酸镁，盖上盖子，剧烈振摇1min，静置30min，2500r/min离心5min，使乙腈与水相分层，取10mL乙腈提取液至50mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上(水浴温度45℃)浓缩至近干，用5mL的10％乙腈PBS溶液复溶。

采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为96％，99％，106％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种环酰菌胺半抗原，其特征在于，分子结构式如式I所示：

2.一种环酰菌胺完全抗原，其特征在于，由权利要求1所述环酰菌胺半抗原与载体蛋白偶联得到。

3.根据权利要求2所述的环酰菌胺完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述环酰菌胺完全抗原分子结构式如式II所示：

4.分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，由权利要求2或3所述环酰菌胺完全抗原免疫动物后制备得到。

5.一种环酰菌胺单克隆抗体，其特征在于，由权利要求4所述的杂交瘤细胞分泌产生。

6.一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株DCF，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO.45013。

7.一种环酰菌胺单克隆抗体，其特征在于，由权利要求6所述的杂交瘤细胞株DCF分泌产生。

8.权利要求4所述杂交瘤细胞、权利要求5所述环酰菌胺单克隆抗体、权利要求6所述杂交瘤细胞株DCF或权利要求7所述环酰菌胺单克隆抗体在检测环酰菌胺中的应用或在制备环酰菌胺检测试剂盒中的应用。

9.一种环酰菌胺检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述杂交瘤细胞、权利要求5所述环酰菌胺单克隆抗体、权利要求6所述杂交瘤细胞株DCF或权利要求7所述环酰菌胺单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的环酰菌胺检测试剂盒，其特征在于，所述环酰菌胺检测试剂盒还包括环酰菌胺包被原；

所述环酰菌胺包被原由环酰菌胺半抗原与鸡卵白蛋白偶联得到。

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