CN114317451B - 一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述的杂交瘤细胞株的保藏编号：CGMCC No.NO 45019。本发明将敌草隆的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后一次用敌草隆完全抗原冲刺免疫。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对敌草隆具有较好的检测灵敏度，可以用于果蔬中敌草隆的残留检测。

Description

一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及免疫化学检测领域，具体涉及一种分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

敌草隆属内吸传导型除草剂，具有一定的触杀活力，可被植物的根和叶吸收，以根系吸收为主，杂草根系吸收药剂后，传到地上叶片中，并沿着叶脉向周围传播，抑制光合作用的希尔反应，致使叶片失绿，叶尖和叶缘褪色，进而发黄枯死。敌草隆在低剂量情况下，可作为选择性除草剂使用，高剂量下则可作为灭生性除草剂。目前，敌草隆检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析敌草隆残留物的方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在果蔬中禁用物质分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测敌草隆的前提是得到对敌草隆具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对敌草隆具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备敌草隆单克隆抗体，但在制备能分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备敌草隆半抗原和敌草隆完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出敌草隆单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的敌草隆单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是获得一种能分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的敌草隆单克隆抗体对敌草隆具有较好的检测灵敏度(IC50值为0.3ng/mL)，可以用于建立敌草隆的免疫学检测方法，检测果蔬中中是否含有敌草隆。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为单克隆细胞株，保藏名称为单克隆细胞株；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月21日；保藏编号：CGMCC No.NO 45019。

本发明的一种敌草隆单克隆抗体，所述的敌草隆单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株分泌获得的。

本发明所述的敌草隆单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。

本发明的一种敌草隆半抗原，所述的敌草隆半抗原的结构式如式(I)所示：

本发明的所述的敌草隆半抗原的制备方法，包括如下步骤：

取N-甲基丁酸和3，4-二氯苯异氰酸酯溶于NaOH溶液中，室温下搅拌2小时；反应完成后，过滤，弃沉淀物；在滤液中滴加浓盐酸调pH至2，溶液呈乳白色，静置过夜，弃上清制得敌草隆半抗原；

本发明的一种敌草隆完全抗原，所述的敌草隆完全抗原的结构式如式(II)所示：

本发明的所述的敌草隆完全抗原的制备方法，包括如下步骤：将敌草隆半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到敌草隆半抗原溶液，即A液；将牛血清蛋白用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，制得敌草隆完全抗原。

本发明的所述的分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备敌草隆半抗原及敌草隆完全抗原，将获得的敌草隆完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；

(2)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；

(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中敌草隆抗体含量高的获得免疫的小鼠；

(4)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的敌草隆完全抗原进行；

(5)将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，制得分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

进一步地，在步骤(2)和步骤(4)中，首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天；首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只；免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；在步骤(2)和步骤(4)中，采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血；

在步骤(5)中，所述的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行；所述的细胞融合是通过聚乙二醇PEG4000法进行的；所述的培养基为RPMI-1640培养基；所述的亚克隆次数为3次。

本发明所述的分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株或所述的敌草隆完全抗原或所述的分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备敌草隆单克隆抗体方面的应用。

本发明所述的敌草隆单克隆抗体或所述的敌草隆单克隆抗体的制备方法在识别敌草隆方面的应用。

有益效果：本发明获得的敌草隆单克隆抗体，对敌草隆有较好的检测灵敏度(IC50值为0.3ng/mL)；本发明获得的敌草隆单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。

附图说明

图1为本发明敌草隆单克隆抗体对敌草隆的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明的一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为单克隆细胞株，保藏名称为单克隆细胞株；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月21日；保藏编号：CGMCC No.NO 45019。

本发明的一种敌草隆单克隆抗体，所述的敌草隆单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株分泌获得的。

本发明所述的敌草隆单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。

本发明的一种敌草隆半抗原，所述的敌草隆半抗原的结构式如式(I)所示：

本发明的一种敌草隆完全抗原，所述的敌草隆完全抗原的结构式如式(II)所示：

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5∶1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

敌草隆抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将敌草隆标准品稀释为8个浓度(0.01，0.05，0.15，0.5，1.5，4.5，13.5ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图1所示)，获得敌草隆标准抑制曲线，计算IC50。

敌草隆半抗原的合成

由于敌草隆小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将敌草隆偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于敌草隆分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生，具体步骤如下：

取2.0mmol N-甲基丁酸和2.0mmol 3，4-二氯苯异氰酸酯溶于4.2mL 1M NaOH溶液中，室温下搅拌2小时。反应完成后，过滤，弃沉淀物。在滤液中滴加浓盐酸调pH至2，溶液呈乳白色，静置过夜，弃上清随即得到敌草隆半抗原。如下：

实施例2

敌草隆完全抗原的合成

称取4.9mg敌草隆半抗原，5.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取9.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到敌草隆半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取18mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至4mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。

实施例3

敌草隆包被原的合成

将6.1mg敌草隆半抗原、6.9mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到敌草隆半抗原溶液；将11.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到敌草隆半抗原溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将12mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原。

实施例4

分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得

将敌草隆完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

2、细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用敌草隆为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。

选择对敌草隆标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得敌草隆单克隆抗体细胞株。

实施例5

敌草隆单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶敌草隆杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测得敌草隆单克隆抗体的IC₅₀值为0.3ng/mL，说明对敌草隆有很好的灵敏度，可用于敌草隆免疫分析检测。

实施例6

敌草隆单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于敌草隆的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0.01，0.05，0.15，0.5，1.5，4.5，13.5ng/mL的敌草隆标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗敌草隆单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1∶3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H₂8O₄终止液，450nm测吸光值。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一株分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述的杂交瘤细胞株为单克隆细胞株，保藏名称为单克隆细胞株；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月21日；保藏编号：CGMCC No.NO 45019。

2.一种敌草隆单克隆抗体，其特征在于：所述的敌草隆单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株分泌获得的。

3.权利要求2所述的敌草隆单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.NO 45019的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。

4.权利要求1所述的分泌敌草隆单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备敌草隆单克隆抗体方面的应用。

5.权利要求2所述的敌草隆单克隆抗体在识别敌草隆方面的应用。