CN112501128B - 一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.19179。本发明先合成氯吡脲半抗原和完全抗原，再使用弗氏佐剂混合乳化，注射免疫BALB/c小鼠。筛选出高效价，低IC50的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并五次亚克隆，最终得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对氯吡脲具有较好的检测灵敏度，可用于制备氯吡脲的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，用于食品中氯吡脲的残留检测。

Description

一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
氯吡脲的英文通用名为：Forchlorfenuron，化学名称：1-(2-氯-4-吡啶)-3-苯基脲；氯吡脲属苯脲类细胞分裂素，其生理作用主要有：1)促进细胞分裂，扩大细胞体积；2)促进器官形成和蛋白质的合成；3)增强抗逆性、延缓衰老；4)打破顶芽优势；5)诱导休眠芽的形成；6)促进坐果、果实膨大；7)提高光合作用效率；8)诱导单性结实。其生理作用与一般嘌呤型细胞分裂素类似，但作用质量浓度更低，活性更高。它在质量浓度高时还可用作除草剂。
氯吡脲作为一种新型高效植物生长调节剂，其生长促进作用效果优异，被广泛应用于果树、蔬菜、粮食作物等，我国已在猕猴桃、甜瓜等作物上获得登记，目前其使用范围还有进一步扩大的趋势。但人体摄入量过多必然危害健康，长期接触氯吡脲会引起体内蛋白质代谢的紊乱、轻度的肺气肿和体形消瘦。
目前，氯吡脲检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析氯吡脲残留物的方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测氯吡脲的前提是得到对氯吡脲具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对氯吡脲具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株ABC08，保藏编号CGMCC No.19179，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。此杂交瘤细胞株分泌的氯吡脲单克隆抗体对氯吡脲具有较好的检测灵敏度(IC50值为0.39ng/mL)，可以用于建立氯吡脲的免疫学检测方法，检测食品中氯吡脲的残留。
本发明的第二个目的是提供了一种制备上述氯吡脲免疫原的方法，包括以下步骤：
(1)合成氯吡脲半抗原：
a)将氯吡脲溶于DMSO，再加入KOH，得到混合溶液a；
b)将β-巯基丙酸溶于DMSO并转移至恒压滴定装置中，在搅拌下将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到混合溶液a中，油浴加热，缓慢升温至100℃，保温2h后，撤去油浴，自然冷却至室温，得到混合溶液b；
c)向混合溶液b中加入水，用HCl溶液调节pH值为3～4，将此混合液转移到分液装置中，用二氯甲烷提取，收集有机相；
d)用NaHCO3水溶液洗涤二氯甲烷提取液，收集水相；用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层；再用HCl溶液调节水相pH值为3～4，然后用乙酸乙酯萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层；
e)步骤(d)得到的提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得粘稠液体，加入丙酮溶液溶解，静置有白色晶体析出，过滤即得到氯吡脲半抗原。
(2)合成氯吡脲完全抗原：
f)将氯吡脲半抗原和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应，得到氯吡脲半抗原溶液；
g)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用DMF充分溶解后，加入到氯吡脲半抗原溶液中，室温搅拌反应得到A液；
h)取BSA，用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应得到C液；然后用PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
所述氯吡脲半抗原的分子式如下：
Figure BDA0002830625330000021
所述氯吡脲完全抗原的分子式如下：
Figure BDA0002830625330000031
本发明的第三个目的是提供了一种氯吡脲单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.19179的氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。
所述氯吡脲单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中氯吡脲残留的分析检测。
本发明的第四个目的是提供氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤1：将得到的氯吡脲完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下多点注射，将其注射进入BALB/c小鼠体内进行首次免疫和多次加强免疫：首次免疫采用完全弗氏佐剂，多次加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤2：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中氯吡脲抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤3：将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的氯吡脲完全抗原进行；
步骤4：将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA法筛选出阳性细胞孔；
步骤5：选用氯吡脲为标准品，进一步利用间接ELISA法测定步骤5中筛选出的阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行五次亚克隆，最终筛选出获得能分泌氯吡脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
作为本发明第五个方面，提供上述氯吡脲单克隆抗体的制备方法：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.19179的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的氯吡脲单克隆抗体低温保存。
进一步地，所述氯吡脲单克隆抗体的制备方法：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.19179的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。
作为本发明的第六个方面，提供一种试剂盒，含有上述单克隆细胞株或氯吡脲单克隆抗体。
所述试剂盒，用于食品安全检测中氯吡脲残留的分析检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明探索了利用一种能分泌氯吡脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备氯吡脲单克隆抗体的新方法，为动物性组织中氯吡脲的残留检测提供了免疫学方法。
(2)本发明利用获得的氯吡脲单克隆抗体，特异性强，对氯吡脲的检测灵敏度高(IC50值为0.39ng/mL)；
(3)本发明获得的氯吡脲单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测、食品中氯吡脲残留的检测，有良好的实际应用价值。
生物材料保藏
一种分泌氯吡脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株ABC08，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19179，保藏日期为：2019年11月28日。
附图说明
图1为本发明氯吡脲单克隆抗体对氯吡脲的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
氯吡脲抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01,0.03,0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03,0.1,0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将氯吡脲标准品稀释为8个浓度(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图1所示)，获得氯吡脲标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：氯吡脲半抗原的合成
由于氯吡脲小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将氯吡脲偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于氯吡脲分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
称取氯吡脲4.95g(20mmol)于100ml三口烧瓶中，用20ml DMSO溶解，再加入KOH2.25g(40mmol)。另称取β-巯基丙酸2.10g(20mmol)，用10ml DMSO溶解并转移至50ml恒压滴液漏斗中。在搅拌下将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中，于油浴上使之缓慢升温至100℃，保温2h后，撤去油浴。待产物自然冷却至室温后，加入50ml水，以6mol·L-1HCl溶液调节pH值为3。将此混合液转移到250ml分液漏斗中，用90ml二氯甲烷分3次提取，收集有机相。用75ml 1mol·L-1NaHCO3水溶液分3次洗涤二氯甲烷提取液，收集水相。用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层。再用6mol·L-1HCl溶液调节水相pH值为3，然后用90ml乙酸乙酯分3次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液。用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层。提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量粘稠液体。加入少量丙酮溶液溶解，静置过夜，有白色晶体析出。过滤即得到氯吡脲半抗原。
实施例2：氯吡脲完全抗原的合成
称取5.5mg氯吡脲半抗原，4.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取6.9mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到氯吡脲半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取8mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至4mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例3：氯吡脲包被原的合成
将3.0mg氯吡脲半抗原、2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到氯吡脲半抗原溶液；将3.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到氯吡脲半抗原溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到C液；将10mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到D液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液E；用PBS溶液透析反应液C，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原。
实施例4：分泌氯吡脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
将氯吡脲完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；在第四次加强免疫结束后第7天进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制能力，筛选出血清中氯吡脲抗体含量高的获得免疫的小鼠；将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行第五次加强免疫，然后进行冲刺免疫，冲刺免疫不用弗氏佐剂，直接用生理盐水稀释后的氯吡脲完全抗原进行腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与第五次加强免疫之间间隔18-21天。
2、细胞融合
在冲刺免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0瘤细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合前半小时左右，收集SP2/0瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到混合细胞液中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
首先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，再用氯吡脲为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；选择对氯吡脲标准品有较好抑制的阳性细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后仍用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)进行检测。按上述方法进行五次亚克隆，最终获得氯吡脲单克隆抗体细胞株。
实施例5：氯吡脲单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106氯吡脲杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得氯吡脲单克隆抗体的IC50值为0.39ng/mL，说明对氯吡脲有很好的灵敏度，可用于氯吡脲免疫分析检测。
实施例6：氯吡脲单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于氯吡脲的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30ng/mL的氯吡脲标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗氯吡脲单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值，参见图1；
(6)添加回收及样品前处理：
选择黄瓜为检测样品，将待测样品洗净、切碎，在捣碎机中搅碎、混匀。分别称取三份样品匀浆，每份5g，向样品中分别添加1ppb、5ppb、25ppb的氯吡脲标准品(根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度)，剧烈振荡2min。加入10mL丙酮，1gNaCl，5g无水NaSO4，超声波振荡15min，4000rpm离心10min，收集上清液，取上清液1mL，氮气吹干，用5mLPBS复溶(即稀释了五倍以减少样品基质的影响)。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为92％，93％，89％。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (7)

1.一株单克隆细胞株，已于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株ABC08，保藏编号CGMCC No.19179，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种氯吡脲单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌产生。
3.权利要求2所述氯吡脲单克隆抗体的应用，其特征在于，用于食品安全检测中氯吡脲残留的分析检测。
4.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的单克隆细胞株，或权利要求2所述的氯吡脲单克隆抗体。
5.权利要求4所述的试剂盒在检测氯吡脲含量中的应用。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于食品安全检测中氯吡脲残留的分析检测。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于食品安全检测中氯吡脲残留的分析检测。
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Suarez-Pantaleon, Celia等.Forchlorfenuron-mimicking haptens: from immunogen design to antibody characterization by hierarchical clustering analysis.《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》.2011,第9卷(第13期),第4863-4872页. *
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