CN112280745B - 一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明公开了一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19174。将哒螨灵的完全抗原免疫BALB/c小鼠。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞通过培养基培养，再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对哒螨灵具有较好的检测灵敏度（IC50值为9.09 ng/mL），可用于食品中哒螨灵的残留检测。

Description

一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。
背景技术
哒螨灵的英文通用名为：Pyridaben，中文名又称：牵牛星、速螨酮、哒螨酮，化学名称：2-叔丁基-5-(4-叔丁苄基硫)代-4-氯-3(二氢)哒嗪酮；作用机理：哒螨灵属于哒嗪酮类杀虫、杀螨，它触杀性极强，但是没有熏蒸、内吸和传导作用。它主要是抑制肌肉组织、神经组织和电子传递系统染色体I中谷氨酸脱氢酶的合成，从而发挥杀虫作用。主要用途：对所有食植性害螨都具有明显的防治效果，比如全爪螨、叶螨、合瘿螨、小爪螨等，而且在螨的不同生长期都有效，例如在螨的卵期、若螨期、成螨期，在成螨的移动期也有防治效果。在我国主要用于柑桔、苹果、梨、山楂等水果作物上，在蔬菜(茄子除外)、烟草、茶叶、棉花、及观赏植物上也可使用。
目前，哒螨灵检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，还需要一种快速，简单的分析哒螨灵残留物的方法。
酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测哒螨灵的前提是得到对哒螨灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对哒螨灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明人尝试通过杂交瘤细胞制备哒螨灵单克隆抗体，但在制备能分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备哒螨灵半抗原和哒螨灵完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出哒螨灵单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的哒螨灵单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的哒螨灵单克隆抗体对哒螨灵具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为9.09ng/mL），可以用于建立哒螨灵的免疫学检测方法，检测食品中哒螨灵的残留。
本发明的技术方案，一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19174。
本发明提供了上述一种分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
（1）制备哒螨灵半抗原及哒螨灵完全抗原，将获得的哒螨灵完全抗原制备成含抗原的弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
（2）将得到的哒螨灵完全抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
（3）将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中哒螨灵抗体含量高的获得免疫的小鼠；
（4）将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的哒螨灵完全抗原进行；
（5）将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18~21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（3）中的采血为第3次加强免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是通过聚乙二醇（PEG4000）法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤（5）中的亚克隆次数为3次。
哒螨灵单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.19174的杂交瘤细胞株ABC05分泌产生。
本发明提供了上述哒螨灵单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No. 19174的杂交瘤细胞株ABC05，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No. 19174的杂交瘤细胞株ABC05，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
哒螨灵半抗原，其分子式如下：
Figure 699851DEST_PATH_IMAGE002
。
哒螨灵完全抗原，分子式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
哒螨灵完全抗原的制备方法，步骤如下：将哒螨灵半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC用DMF充分溶解后加入到哒螨灵半抗原溶液中，室温反应，即得A液；将牛血清蛋白BSA用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，去除未反应的小分子半抗原，得到哒螨灵完全抗原。
哒螨灵包被原的制备方法，步骤如下：将哒螨灵半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应，得到哒螨灵半抗原溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于无水DMF后，加入到哒螨灵半抗原溶液中，室温搅拌进行反应得到A液；将鸡卵白蛋白OVA用碳酸盐缓冲液CBS稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到哒螨灵包被原。
本发明还提供了所述哒螨灵单克隆抗体的应用，将其应用于食品安全检测中哒螨灵残留的分析检测。
本发明的有益效果：本发明获得的哒螨灵单克隆抗体，对哒螨灵有较好的检测灵敏度（IC50值为9.09ng/mL）；本发明获得的哒螨灵单克隆抗体可以用于免疫分析检测。
生物材料样品保藏：一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19174。
附图说明
图1本发明哒螨灵单克隆抗体对哒螨灵的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基（mg/L）：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
抗体稀释液：含 0.1%明胶的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
哒螨灵抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液（CBS）将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将哒螨灵标准品稀释为8个浓度（0.15，0.45，1.35，4，12，36，110，330ng/mL），按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图（结果如图1所示），获得哒螨灵标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：哒螨灵半抗原的合成
由于哒螨灵小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将哒螨灵偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于哒螨灵分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
称取哒螨灵7.30g（20 mmol）于100 mL 三口烧瓶中，用20 mL DMSO 溶解，再加入KOH 2.25 g (40mmol)。另称取β-巯基丙酸2.10 g（20mmol），用10 mL DMSO 溶解并转移至50 mL 恒压滴液漏斗中。在搅拌下将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中，于油浴上使之缓慢升温至100℃，保温2 h后，撤去油浴。待产物自然冷却至室温后，加入50mL水，以6molּ L-1 HCl溶液调节pH 值为3。将此混合液转移到250 mL 分液漏斗中，用90 mL 二氯甲烷分3次提取，收集有机相。用75 mL 1 molּ L-1 NaHCO3水溶液分3 次洗涤二氯甲烷提取液，收集水相。用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层。再用 6 molּ L-1 HCl溶液调节水相pH值为3，然后用90 mL 乙酸乙酯分3 次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液。用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯提取液，弃水层。提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量黄色粘稠液体。加入少量丙酮溶液溶解，静置过夜，有黄色晶体析出。过滤即得到哒螨灵半抗原。
实施例2：哒螨灵完全抗原的合成
称取实施例1制备得到的5.5mg 哒螨灵半抗原，4.2mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取6.9mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到哒螨灵半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8 h(称为A液)。取8mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液（CBS）稀释至4mg/mL（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例3：哒螨灵包被原的合成
将3.0mg哒螨灵半抗原、2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min，得到哒螨灵半抗原溶液；将3.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于100μL无水DMF后，加入到哒螨灵半抗原溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白（OVA）用1mL浓度为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液（CBS）稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原。
实施例4：分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得：将哒螨灵完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1~4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用哒螨灵为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；
选择对哒螨灵标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得哒螨灵单克隆抗体细胞株ABC05。
实施例5：哒螨灵单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106哒螨灵杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化；
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存；
使用间接竞争ELISA，测得哒螨灵单克隆抗体的IC50值为9.09ng/mL，说明对哒螨灵有很好的灵敏度，可用于哒螨灵免疫分析检测。
实施例6：哒螨灵单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于哒螨灵的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
（1）将用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0.15，0.45，1.35，4，12，36，110，330ng/mL的哒螨灵标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗哒螨灵单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（4）每孔加入100μL用含0.1%明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（5）每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
（6）添加回收及样品前处理：选择黄瓜为检测样品。
待测样品洗净、切碎，在捣碎机中搅碎、混匀。分别称取三份样品匀浆，每份5g，向样品中分别添加20ppb、100ppb、250ppb的哒螨灵标准品（根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度），剧烈振荡2min。加入10mL丙酮，1g NaCl，5g无水NaSO4，超声波振荡15min，4000 rpm离心10min，收集上清液，取上清液1mL，氮气吹干，用5mL PBS复溶（即稀释了五倍以减少样品基质的影响）。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为92%，93%，89%。

Claims (3)

1.一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19174。
2.哒螨灵单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19174的杂交瘤细胞株ABC05分泌产生。
3.权利要求2所述哒螨灵单克隆抗体的应用，其特征在于：将其应用于食品安全检测中哒螨灵残留的分析检测。
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