CN114107219B - 一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明所述的分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22340。本发明提供的交瘤细胞株分泌的杀虫脒单克隆抗体可以用于免疫分析检测，其对杀虫脒有较好的检测灵敏度和特异性，IC50值为0.279ng/mL、对杀虫脒类似物交叉率小于2％。

Description

一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂 交瘤细胞株及其应用。
背景技术
杀虫脒(Chlordimeform)又称杀螨脒或克死螨，是一种高效的有机杀螨剂和防 治稻螟的杀虫剂，上世纪60年代起被广泛用于防治水稻、果树、棉花的虫害。
对于杀虫脒残留的检测，常采用仪器分析方法。但这些方法存在样品前处 理复杂和检测时间长等不足，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消 费者的利益，有必要建立一种针对杀虫脒的高效、快速的检测方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样 本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用 于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用 酶联免疫法检测杀虫脒的前提是得到对杀虫脒具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对杀虫脒具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体 的方法十分关键。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤 细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的杀虫脒单克隆抗体对杀虫脒具有较好 的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.279ng/mL)，可以用于建立杀虫脒的免疫 学检测方法，检测动植物中杀虫脒的残留。
本发明的第一个目的是提供一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.22340。
本发明的第二个目的是提供一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下 步骤：
S1、使用杀虫脒半抗原制备杀虫脒完全抗原，将所得的杀虫脒完全抗原制 备成含抗原完全弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；
S2、对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用S1中 所述含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用S1中所述含抗原不完全弗氏佐剂，冲 刺免疫采用S1中所述杀虫脒完全抗原；
S3、取S2中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合， 得到所述杂交瘤细胞株。
进一步地，在S1中，所述杀虫脒半抗原CDM-COOH结构式为：
Figure SMS_1
进一步地，在S1中，所述杀虫脒完全抗原CDM-COOH-KLH结构式为：
Figure SMS_2
进一步地，在S1中，所述杀虫脒完全抗原的制备方法包括如下步骤，将 所述杀虫脒半抗原CDM-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于有机溶剂中，反应得到混合液，后将 混合液加入到钥孔血蓝蛋白KLH溶液中进行反应，得到所述杀虫脒完全抗原。
进一步地，所述将杀虫脒半抗原CDM-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS 和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的摩尔比为1：1.8-2.2： 1.8-2.2。
进一步地，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
进一步地，所述孔血蓝蛋白KLH溶液是经过碳酸盐缓冲溶液CBS稀释 得到。
进一步地，在S2中，整个免疫过程包括1次首次免疫、3-5次加强免疫 和1次冲刺免疫。
进一步地，在S2中，整个免疫过程中首次免疫与加强免疫之间间隔28-31 天，加强免疫之间间隔20-22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18-21天。
进一步地，在S2中，整个免疫过程中首次免疫的剂量为95-105μg/只， 加强免疫的剂量为45-55μg/只，冲刺免疫的剂量为20-30μg/只。
进一步地，在S2中，所述加强免疫过程中对免疫动物进行采血，通过间 接ELISA检测免疫动物血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中杀虫脒 抗体含量高的获得免疫的免疫动物，将筛选出的免疫动物用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫。
进一步地，所述采血是在加强免疫过程结束后第6-8天进行。
进一步地，在S2中，所述首次免疫和加强免疫是通过背部皮下注射入免 疫动物体内。
进一步地，在S2中，所述冲刺免疫通过腹腔注射入免疫动物体内。
进一步地，在S3中，细胞融合是将融合的细胞通过培养基培养，利用间 接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，得到 杂交瘤细胞株。
进一步地，所述培养基为RPMI-1640培养基。
进一步地，所述亚克隆的次数为2-4次。
进一步地，在S3中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行 的。
进一步地，在S3中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束2-4天后进行。
本发明的第三个目的是提供一种所述杂交瘤细胞株在制备杀虫脒单克隆 抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种杀虫脒单克隆抗体，所述杀虫脒单克隆抗 体由保藏编号为CGMCC No.22340的杂交瘤细胞株分泌得到。
进一步地，向免疫动物腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.22340的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，获得所述杀虫脒单 克隆抗体。
进一步地，向8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7 天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.22340的杂交瘤细胞株， 从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的杀虫脒单克隆 抗体置于-20℃保存。
本发明的第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤 细胞株和/或所述的杀虫脒单克隆抗体。
本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤 细胞株、所述的杀虫脒单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。
本发明的第七个目的是提供一种所述的杂交瘤细胞株、所述的杀虫脒克隆 抗体、所述的组合物或所述的试剂盒在检测杀虫脒中的应用，尤其是应用于食 品安全检测中杀虫脒残留的分析检测。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供的交瘤细胞株分泌的杀虫脒单克隆抗体可以用于免疫分析检 测，其对杀虫脒有较好的检测灵敏度和特异性(IC50值为0.279ng/mL、对杀虫 脒类似物交叉率小于2％，交叉率＝(杀虫脒的IC50/类似物的IC50)×100％。
生物材料保藏
分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株，所述杂交瘤细 胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22340。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例 并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明的杀虫脒单克隆抗体对杀虫脒的抑制标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人 员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
(1)下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸 20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯 氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、 L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨 酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水 磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、 酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰 胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B120.005、 碳酸氢钠2000。
(2)下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，分别溶于少 量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至 1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，定容 至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：PBS加入0.1％明胶。
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混 合即为TMB显色液，现用现混。
(3)下述实施例中涉及的检测方法如下：
杀虫脒抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗 体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL，并 用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将 杀虫脒标准品稀释0，0.01，0.03，0.11，0.33，1，3和9μg/mL等浓度，按照 ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图1所示)，获得杀虫 脒标准抑制曲线，计算IC50。
实施例
一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法，具体包括以下 步骤：
A、杀虫脒半抗原的合成
本实施例衍生后的杀虫脒半抗原结构如下：
Figure SMS_3
衍生过程如下：
Figure SMS_4
(1)2a的制备(反应1)
在反应容器中加入1a、Pd(OAc)2(0.04eq.)、P(O-TOl)3(0.06eq.)和1b(1.2eq.),加入NEt3(0.3M)，通过冷冻-泵循环法置换3次气体，在Ar氛围下60℃搅拌2h， 升温至80℃搅拌24h。反应完全后，用二氯甲烷进行萃取，无水硫酸钠干燥， 旋干，过柱分离。
(2)3a的制备(反应2)
在反应容器中加入2a，再加入5-10mol％的Pd/C，加适量乙醇溶解，用氢 气置换气体3次，氢气氛围下室温搅拌4h，滤去Pd/C，收集滤液旋干，过柱分 离。
(3)4a的制备(反应3)
在反应容器中加入3a，加入3eq.NaOH水溶液，适量乙醇，50℃下反应3h， 冷却后用盐酸酸化至pH＝2-4，用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，旋干， 过柱分离。
(4)5a的制备(反应4)
在反应容器中加入4a，4b(1.1eq.)，加入THF于65℃下反应3h，冷却加 入5％稀盐酸搅拌3h，加水萃取，收集水相并旋干。
B、杀虫脒完全抗原的合成
称取2.25mg杀虫脒半抗原(CDM-COOH)，1.47mg N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min； 再称取2.15mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到CDM-COOH溶液中，室温搅拌反应4-6h(称为A液)。 取6mg KLH，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至3mg/mL(称为B液)， 再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析， 除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原CDM-COOH-KLH，并通过紫外吸 收扫描方法进行鉴定。
C、杀虫脒包被原的合成
将1.95mg杀虫脒半抗原(CDM-COOH)、1.56mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到 杀虫脒半抗原(CDM-COOH)溶液；将2.95mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到CDM-COOH溶液中， 室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将6mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度 为0.01mmol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢 加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(CDM-COOH-OVA)。
D、分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
(1)小鼠的免疫：将杀虫脒完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对6-8 周龄的BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫 用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减 半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再 减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫 之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔20天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
(2)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为 4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细 胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养 基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％ FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中，融合前要求SP2/0 瘤细胞数量达到(1-4)×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合 时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中； 第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基； 第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10 s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)， 弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中， 按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行 RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT 的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分 两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用杀虫脒为标准品， 用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对杀虫脒标准品有较好抑制 的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；按上述方法进行3次亚克隆，最终获得杀虫脒单克隆抗体细胞株。
E、杀虫脒单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每 只小鼠腹腔注射1×106杀虫脒杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过 辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化；
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白， 然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体， 离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到 纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得单克隆抗体对杀虫脒的IC50值为0.279ng/mL、 对杀虫脒类似物交叉率小于2％，说明对杀虫脒有很好的灵敏度，可用于杀虫脒 免疫分析检测。其中，交叉率＝(杀虫脒的IC50/类似物的IC50)×100％，杀虫脒 类似物的IC50值和交叉率如表1所示：
表1
化合物 IC50(ng/mL) 交叉率(％)
杀虫脒 0.279 100
4-氯邻甲苯胺 20 1.4
双甲脒 ＞100 ＜1
啶虫脒 ＞100 ＜1
单甲脒 ＞100 ＜1
F、杀虫脒单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于杀虫脒的ELISA添 加回收试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被 96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每 孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST 洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.01，0.03，0.11，0.33，1，3 和9μg/mL的杀虫脒标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入 到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 以1：32000稀释的抗杀虫脒单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1：3000稀释的HRP标记 的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
杀虫脒单克隆抗体对杀虫脒的抑制标准曲线如图1所示，用ic-ELISA测定 杀虫脒单克隆抗体的IC50值为0.279ng/mL，说明该抗体对杀虫脒有较好的灵敏 度，可用于杀虫脒的免疫分析检测。
对比例
CN109917127 A公开了一种杀虫脒检测试剂盒及其应用，其采用半抗原为 杀虫脒原药经过溴化乙醇进行取代后，通过琥珀酸酐反应得到杀虫脒-HS，所制 备的抗体为多克隆抗体，该方法的LOD值为0.1ng/mL；而本发明实施例通过 一系列化学合成反应，在完全保留杀虫脒化学结构的基础上，衍生出羧基用于结合蛋白从而制备免疫原，并通过细胞融合获得能够特异性识别杀虫脒的单克 隆抗体，LOD值为0.04ng/mL。
与对比例相比，本发明中的半抗原使杀虫脒的特异识别位点更容易暴露， 有利于产生针对杀虫脒灵敏度更高的抗体，且本发明中所获得的抗体为单克隆 抗体，具有无限增殖的能力，并具有更高的灵敏度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限 定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它 不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所 引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22340。
2.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备杀虫脒单克隆抗体中的应用。
3.一种杀虫脒单克隆抗体，其特征在于，所述杀虫脒单克隆抗体由权利要求1中所述杂交瘤细胞株分泌得到。
4.一种用于检测杀虫脒的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求3所述的杀虫脒单克隆抗体。
5.一种用于检测杀虫脒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求3所述的杀虫脒单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的一种或多种。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求3所述的杀虫脒克隆抗体、权利要求4所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在检测杀虫脒中的应用。
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