CN108949699A - 一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.14700，是将BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂进行首次免疫，不完全弗氏佐剂进行3次加强免疫，不含佐剂的美洛昔康完全抗原进行1次冲击免疫，使得BALB/c小鼠获得免疫；将高效价低IC50的获得免疫的小鼠脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到的细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对美洛昔康具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.1ng/mL)，可以用于食品中美洛昔康的残留检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
美洛昔康(Meloxicam)是一种烯醇类非甾体类抗炎药，具有抗炎、镇痛和解热作用，主要用于缓解骨关节炎、疼痛性骨关节炎、类风湿性关节炎及关节强硬性脊椎炎的症状。在兽医临床领域，国外已有美洛昔康用于奶牛、宠物。等动物的研究报道，国内也有学者报道美洛昔康用于治疗奶牛乳腺炎、母猪术后疼痛及辅助治疗母猪乳腺炎、无乳综合征等。2016年7月26日，澳大利亚农药和兽药管理局(APVMA)发布第15号公报，修订了美洛昔康在食品中的最大残留限量(MRLs)。规定了肥羊、羊肾、羊肝及羊肉中美洛昔康的最大残留限量分别为0.01mg/kg、0.01mg/kg、0.01mg/kg、0.01mg/kg。
因此，建立快速有效的检测美洛昔康含量的方法具有重要意义及市场价值。
目前，检测美洛昔康的方法主要是液相色谱法(HPLC)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，酶联免疫吸附法、免疫亲和色谱柱以及电化学传感器等，但是这些方法均存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的检测方法具有重要意义。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测美洛昔康的前提是得到对美洛昔康具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对美洛昔康具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明人尝试通过杂交瘤细胞制备美洛昔康单克隆抗体，但在制备能分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备美洛昔康半抗原和美洛昔康完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出美洛昔康单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的美洛昔康单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是获得一种能分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的美洛昔康单克隆抗体对美洛昔康具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.1ng/mL)，可以用于建立美洛昔康的免疫学检测方法，检测食品中美洛昔康的残留。
本发明提供了一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2017年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14700。
本发明提供了上述一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
步骤1：制备美洛昔康半抗原，通过美洛昔康半抗原合成美洛昔康完全抗原，将美洛昔康完全抗原与等量油剂混合，再加入乳化剂，乳化后得到不完全弗氏佐剂，在不完全弗氏佐剂中加入分枝杆菌得到完全弗氏佐剂；所述油剂为石蜡油或植物油；所述乳化剂为羊毛脂或叶吐温80；所述分枝杆菌包含死卡苗；
步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中美洛昔康抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的美洛昔康完全抗原进行；
步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用ic-ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
所述步骤1中美洛昔康半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔28天，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程包含1次首次免疫、3次加强免疫和1次冲击免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG1500)法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。
本发明提供了上述一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种美洛昔康半抗原，所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
本发明提供了上述一种美洛昔康半抗原的制备方法，包含如下步骤：
步骤1：将化合物1溶解于甲醇溶液，并加入MeONa进行搅拌，得到混合物1；
步骤2：将得到的混合物进行浓缩，得到化合物2；
步骤3：将化合物2溶解于DMF，并加入4-溴丁酸乙酯进行搅拌，得到混合物2；
步骤4：将得到的混合物2浓缩后进行纯化，得到化合物3；
步骤5：将化合物3溶解于四氢呋喃和水的混合液中，并加入一水合氢氧化锂，调节pH，进行搅拌，得到混合物4；
步骤6：将混合物4用乙胺提取水溶液层，合并有机层，并进行洗涤，干燥，浓缩，得到美洛昔康半抗原；
所述化合物1的分子式如下：
所述化合物2的分子式如下：
所述化合物3的分子式如下：
所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述步骤1为将1g化合物1溶解于50mL甲醇溶液，并加入157mg MeONa于65℃搅拌过夜，得到混合物1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3为将1.20g化合物2溶解于30mL DMF，并加入1.20mg 4-溴丁酸乙酯于80℃搅拌过夜，得到混合物2。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤4为将得到的混合物2浓缩后，用硅胶柱进行纯化，得到化合物3。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5为将800mg化合物3溶解于3mL四氢呋喃和1mL水的混合液中，并加入180mg一水合氢氧化锂，调节pH至4～6，室温搅拌过夜，得到混合物4。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤6为将混合物4用乙胺提取水溶液层，合并有机层，并用盐水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，得到美洛昔康半抗原。
本发明提供了上述一种美洛昔康半抗原或上述一种美洛昔康半抗原的制备方法在制备美洛昔康完全抗原、分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株、美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种美洛昔康完全抗原，所述美洛昔康完全抗原是由美洛昔康半抗原与载体蛋白KLH通过EDC法偶联得到；所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
本发明提供了上述一种美洛昔康完全抗原的制备方法，所述方法为将美洛昔康半抗原(Melo)、1-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺，得到A1液；将钥孔血蓝蛋白(KLH)溶解于硼酸缓冲溶液，得到B1液；将A1液加入到B1液中，得到混合液；将混合液进行分离，即得完全抗原(Melo-KLH)；
所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述美洛昔康半抗原(Melo)与钥孔血蓝蛋白(KLH)的摩尔比为1500:1或3000:1或4500:1。
在本发明的一种实施方式中，所述美洛昔康半抗原(Melo)与钥孔血蓝蛋白(KLH)的摩尔比为1500:1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将1.7mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.2mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.4mgN-羟基琥珀酰亚胺溶解于400μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A1液；将10mg钥孔血蓝蛋白(KLH)溶解于4mL硼酸缓冲溶液，得到B1液；在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，即得完全抗原(Melo-KLH)。
本发明提供了一种美洛昔康包被原，其特征在于，所述美洛昔康包被原是由美洛昔康半抗原与载体蛋白OVA通过EDC法偶联得到；所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
本发明提供了上述一种美洛昔康包被原的制备方法，所述方法为将美洛昔康半抗原(Melo)、1-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺，得到A2液；将鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于硼酸缓冲溶液，得到B2液；将A2液加入到B2液中，得到混合液；将混合液进行分离，即得包被原(Melo-OVA)；
所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述美洛昔康半抗原(Melo)与鸡卵清白蛋白(OVA)的摩尔比为30:1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将1.8mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.4mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.45mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A2液；将5mg鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于2mL硼酸缓冲溶液，得到B2液；在室温条件，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，包被原(Melo-OVA)。
本发明提供了上述一种美洛昔康完全抗原的或上述一种美洛昔康包被原在制备分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株、美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种美洛昔康单克隆抗体，所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.14700的杂交瘤细胞株分泌获得的。
本发明提供了上述一种美洛昔康单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.14700的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.14700的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明提供了上述一种美洛昔康单克隆抗体在识别美洛昔康方面的应用。
本发明提供了应用上述一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种美洛昔康半抗原或上述一种美洛昔康完全抗原或上述一种美洛昔康包被原或上述一种美洛昔康单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。
有益效果：
(1)本发明获得的美洛昔康单克隆抗体，对美洛昔康有较好的检测灵敏度和特异性(IC50值为0.1ng/mL)。
(2)本发明提供了一种全新的美洛昔康半抗原、完全抗原、包被原的合成思路。
(3)本发明获得的美洛昔康单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。
生物材料保藏
一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14700，保藏日期为：2017年09月05日。
附图说明
图1为本发明美洛昔康半抗原的合成过程；
图2为本发明美洛昔康单克隆抗体对美洛昔康的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基：胎牛血清10％、L-精氨酸290mg/L、硝酸钙100mg/L、L-门冬酰胺50mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、L-门冬氨酸20mg/L、无水磷酸二氢钠676.13mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L、氯化钾400mg/L、L-谷氨酸20mg/L、氯化钠6000mg/L、甘氨酸10mg/L、葡萄糖2000mg/L、L-组氨酸15mg/L、还原谷胱甘肽1mg/L、L-羟脯氨酸20mg/L、酚红5mg/L、L-异亮氨酸50mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、L-亮氨酸50mg/L、生物素0.2mg/L、L-赖氨酸盐酸盐40mg/L、D-泛酸钙0.25mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、叶酸1mg/L、L-苯丙氨酸15mg/L、i-肌醇35mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-烟酰胺1mg/L、L-丝氨酸30mg/L、氯化胆碱3mg/L、L-苏氨酸20mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、L-色氨酸5mg/L、核黄素0.2mg/L、L-酪氨酸23.19mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、L-缬氨酸20mg/L、维生素B120.005mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/L pH 7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween–20；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按1:5混合即为TMB(显色液，现用现混)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
美洛昔康半抗原产率检测方法：纯化后终产物质量与原料质量比值。
Melo标准品抑制率检测方法：
间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)：用合成的包被原包板，小鼠血清用抗体稀释液稀释1000、3000、9000及27000倍，配制标准品溶液，酶标板的上四行加PBS 50μL/孔，下四行加标准品溶液50μL/孔，然后对应加入不同浓度的小鼠血清50μL/孔，37℃孵育30min，加入酶标二抗后，显色，终止并测定OD450nm，根据吸光度值计算抑制率，1-添加了抑制物质的孔的OD值/不添加抑制物质的对照孔的OD＝抑制率。
实施例1：美洛昔康半抗原的合成
合成路径如图1。
将1g化合物1溶解于50mL甲醇溶液，并加入157mg MeONa于65℃搅拌过夜，得到混合物1；将得到的混合物进行浓缩，得到化合物2；将1.20g化合物2溶解于30mLDMF，并加入1.20mg 4-溴丁酸乙酯于80℃搅拌过夜，得到混合物2；所述步骤4为将得到的混合物2浓缩后，用硅胶柱进行纯化，得到化合物3；将800mg化合物3溶解于3mL四氢呋喃和1mL水的混合液中，并加入180mg一水合氢氧化锂，调节pH至4～6，室温搅拌过夜，得到混合物4；将混合物4用乙胺提取水溶液层，合并有机层，并用盐水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，得到美洛昔康半抗原。
计算化合物3以及半抗原的产物。
化合物3的产率为53.3％，半抗原的产率为66.4％。
实施例2：美洛昔康完全抗原的合成
将1.7mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.2mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.4mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于400μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A1液；取10mg钥孔血蓝蛋白(KLH)(Melo与KLH摩尔比为1500:1)用适量硼酸缓冲溶液稀释，得到B1液；在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，即得完全抗原(Melo-KLH)。
将1.7mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.2mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.4mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于400μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A1液；取10mg钥孔血蓝蛋白(KLH)(Melo与KLH摩尔比为3000:1)用适量硼酸缓冲溶液稀释，得到B1液；在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，即得完全抗原(Melo-KLH)。
将1.7mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.2mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.4mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于400μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A1液；取10mg钥孔血蓝蛋白(KLH)(Melo与KLH摩尔比为4500:1)用适量硼酸缓冲溶液稀释，得到B1液；在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，即得完全抗原(Melo-KLH)。
实施例3：美洛昔康包被原的合成
将1.8mg美洛昔康半抗原(Melo)、2.4mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.45mgN-羟基琥珀酰亚胺溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反6-8h，得到A2液；将5mg鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于2mL硼酸缓冲溶液，得到B2液；在室温条件，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应过夜得到混合液；将混合液通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原(Melo)，包被原(Melo-OVA)。
实施例4：分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，取三种不同摩尔比的Melo完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠，第一次免疫用完全弗氏佐剂，每只小鼠注射100ug，之后都用不完全弗氏佐剂，每只小鼠注射50ug首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5ul+995ul抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第四次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制率，发现当抗血清稀释倍数为3K且包被原浓度为0.1μg/mL时，用免疫原Melo-KLH 1500:1，Melo-KLH 3000:1和Melo-KLH 4500:1分别免疫的小鼠效价依次为1.648、1.333和1.613，加入50ppb Melo标准品后抑制率分别为71％，52％和51％，显然，用免疫原Melo-KLH 1500:1免疫的小鼠效价和抑制率都最高，故挑选此小鼠进行下一步实验。
2、细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mLRPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用Melo为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对Melo标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测，重复三次，获得细胞株。
实施例5：美洛昔康单克隆抗体的制备
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01MPBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体于-20℃保存。
实施例6：美洛昔康单克隆抗体的鉴定
(1)包被：将包被原Melo-OVA用0.05M pH为9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min，充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体Melo的IC50为0.1ng/mL，说明对Melo有很好的灵敏度，可用于Melo免疫分析检测(所得明美洛昔康单克隆抗体对美洛昔康的抑制标准曲线如图2)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (12)
1.一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2017年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14700。
2.如权利要求1所述的一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：制备美洛昔康半抗原，通过美洛昔康半抗原合成美洛昔康完全抗原，将美洛昔康完全抗原与等量油剂混合，再加入乳化剂，乳化后得到不完全弗氏佐剂，在不完全弗氏佐剂中加入分枝杆菌得到完全弗氏佐剂；所述油剂为石蜡油或植物油；所述乳化剂为羊毛脂或叶吐温80；所述分枝杆菌包含死卡苗；
步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中美洛昔康抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的美洛昔康完全抗原进行；
步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用ic-ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
所述步骤1中美洛昔康半抗原的分子式如下：
3.权利要求1所述的一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
4.一种美洛昔康半抗原，其特征在于，所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
5.如权利要求4所述的一种美洛昔康半抗原的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：将化合物1溶解于甲醇溶液，并加入MeONa进行搅拌，得到混合物1；
步骤2：将得到的混合物进行浓缩，得到化合物2；
步骤3：将化合物2溶解于DMF，并加入4-溴丁酸乙酯进行搅拌，得到混合物2；
步骤4：将得到的混合物2浓缩后进行纯化，得到化合物3；
步骤5：将化合物3溶解于四氢呋喃和水的混合液中，并加入一水合氢氧化锂，调节pH，进行搅拌，得到混合物4；
步骤6：将混合物4用乙胺提取水溶液层，合并有机层，并进行洗涤，干燥，浓缩，得到美洛昔康半抗原；
所述化合物1的分子式如下：
所述化合物2的分子式如下：
所述化合物3的分子式如下：
所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
6.权利要求4所述的一种美洛昔康半抗原或权利要求5所述的一种美洛昔康半抗原的制备方法在制备美洛昔康完全抗原、分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株、美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
7.一种美洛昔康完全抗原，其特征在于，所述美洛昔康完全抗原是由美洛昔康半抗原与载体蛋白KLH通过EDC法偶联得到；所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
8.一种美洛昔康包被原，其特征在于，所述美洛昔康包被原是由美洛昔康半抗原与载体蛋白OVA通过EDC法偶联得到；所述美洛昔康半抗原的分子式如下：
9.权利要求7所述的一种美洛昔康完全抗原的或权利要求8所述的一种美洛昔康包被原在制备分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株、美洛昔康单克隆抗体方面的应用。
10.一种美洛昔康单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.14700的杂交瘤细胞株分泌获得的。
11.权利要求10所述的一种美洛昔康单克隆抗体在识别美洛昔康方面的应用。
12.应用权利要求1所述的一种分泌美洛昔康单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的一种美洛昔康半抗原或权利要求7所述的一种美洛昔康完全抗原或权利要求8所述的一种美洛昔康包被原或权利要求10所述的一种美洛昔康单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。
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