CN107058240A - 一株杂交瘤细胞株ab1及其产生的2,4,5‑三氯苯氧乙酸单克隆抗体 - Google Patents
一株杂交瘤细胞株ab1及其产生的2,4,5‑三氯苯氧乙酸单克隆抗体 Download PDFInfo
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Abstract
一株杂交瘤细胞株AB1及其产生的2,4,5‑三氯苯氧乙酸单克隆抗体,属于食品安全检测技术领域。本发明一株2,4,5‑三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13083。此细胞株分泌的单克隆抗体,对2,4,5‑三氯苯氧乙酸具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为4.4 ng/mL),可实现对农产品中2,4,5‑三氯苯氧乙酸残留量的分析检测,为食品中2,4,5‑三氯苯氧乙酸残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株杂交瘤细胞株AB1及其产生的2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体,属于食品安全检测技术领域。
背景技术
2,4,5-三氯苯氧乙酸,也称2,4,5-涕或2,4,5-T,可用作植物的生长调节剂、除草剂。纯品为白色无臭晶体,难溶于水,对人体有一定危害。根据不同植物施用适当计量,可以防止植物落花落果,但用量不当会使植物受到严重伤害。 2,4,5-三氯苯氧乙酸具有一定的毒性,对小鼠的LD50是389mg/kg,而大鼠是500 mg/kg。
目前关于2,4,5-T的检测方法还未有报道。而酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法,且检测时对样本的纯度要求不高,操作简便,可实现对大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法,筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一株2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,由该细胞株制备的抗体对2,4,5-三氯苯氧乙酸具有较好特异性和检测灵敏度,可以用来建立2,4,5-三氯苯氧乙酸的免疫学检测方法。
本发明的技术方案,一株2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.13083。
2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体,它由所述保藏编号为CGMCC No.13083的2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1分泌产生。
所述2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体的应用,用于食品安全检测中2,4,5-三氯苯氧乙酸残留的分析检测。
本发明提供的2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1的制备基本步骤为:
(1)半抗原:
Mol. Wt: 253.93
2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)原药中含活泼基团(-COOH),即将其作为半抗原。
(2)完全抗原的制备:称取2.5mg 2,4,5-T(2,4,5-T与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60︰1),3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,室温搅拌反应10min;再称取3mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC),用100μL无水DMF充分溶解后,加入到2,4,5-T溶液中,室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取10mg BSA,用2mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7.0)溶解(称为B液),再逐滴将A液缓慢加入到B液中,室温反应过夜;然后用0.01M PBS溶液透析,除去未反应的小分子半抗原,得到完全抗原2,4,5-T-DCC-BSA,并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定,计算得偶联率为25;
(3)小鼠的免疫:选择健康的6~8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。将2,4,5-T-DCC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全弗氏佐剂,剂量为100μg/只;多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只;冲刺免疫不用佐剂,直接用生理盐水稀释后腹腔注射,剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月,多次加强免疫之间间隔21天,冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔17-21天。通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制;
(4)细胞融合与细胞株的建立:通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合,采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交瘤细胞,并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔,并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果,通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆,一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得2,4,5-T的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株AB1;
(5)杂交瘤细胞株AB1性质的鉴定:通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
2,4,5-T-DCC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全,通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫(100μg/只)用完全弗氏佐剂,多次加强免疫(50μg/只)用不完全弗氏佐剂,最后一次冲刺免疫用2,4,5-T-DCC-BSA完全抗原(25μg/只,不含佐剂)进行小鼠腹腔注射。取特异性高,IC50低的小鼠脾细胞,通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合,经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆,得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株AB1。
本发明的有益效果:本发明提供的细胞株AB1分泌的单克隆抗体,对2,4,5-三氯苯氧乙酸具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为4.4ng/mL),可实现对农产品中2,4,5-三氯苯氧乙酸残留量的分析检测,为食品中2,4,5-三氯苯氧乙酸残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。
生物材料样品保藏:一株2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期2016年10月31日,保藏编号为CGMCC No.13083。
附图说明
图1是AB1单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明,不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将2,4,5-三氯苯氧乙酸完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养,通过ic-ELISA筛选细胞上清,最终得到了对2,4,5-三氯苯氧乙酸有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株AB1的制备
(1)半抗原:2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)原药中含活泼基团(-COOH),即可作为半抗原。
(2)完全抗原的合成 :称取2.5mg 2,4,5-T(2,4,5-T与牛血清白蛋白(BSA)摩尔比为60︰1),3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,室温搅拌反应10min;再称取3mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC),用100μL无水DMF充分溶解后,加入到2,4,5-T溶液中,室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取10mg BSA,用2mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7.0)溶解(称为B液),再逐滴将A液缓慢加入到B液中,室温反应过夜;然后用0.01M PBS溶液透析,除去未反应的小分子半抗原,得到完全抗原2,4,5-T-DCC-BSA,并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
(3)小鼠的免疫:选择健康的6~8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。取2,4,5--DCC-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂,之后都用不完全弗氏佐剂,冲刺免疫不用佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月,多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天小鼠断尾采血,采用ic-ELISA法测定小鼠血清效价和抑制,选择效价高抑制好的小鼠,在第五次免疫后17-21天冲冲刺免疫,腹腔注射,要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
(4)细胞融合:在冲刺免疫三天后,按照常规PEG(聚乙二醇,分子量为4000)方法进行细胞融合,具体步骤如下:
a、小鼠摘眼球取血,颈椎脱臼法处死小鼠后,立即放入 75% 酒精中消毒,浸泡 5min左右,无菌操作取出小鼠的脾脏,用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液,收集,离心(1200rpm,8min),用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次,最后一次离心后,将脾细胞稀释到一定体积,计数,备用;
b、收集SP2/0细胞: 融合前 7-10 天,将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS(胎牛血清)RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 (1-4)×107,保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时,收集瘤细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行细胞计数;
c、融合过程7min: 第1min,将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中;第2min,静置。第3min和第4min,在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基;第5min 和第6min,在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基;第7min,每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心(800 rpm,10 min),弃上清,细胞轻轻敲散,并向其内加入含20%胎牛血清、2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基(HAT培养基),按照200μL/孔加到 96 孔细胞板,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液;第5天用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液;第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔,第二步选用2,4,5-三氯苯氧乙酸为标准品,用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对2,4,5-三氯苯氧乙酸标准品有较好抑制的细胞孔,采用有限稀释法进行亚克隆,7天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆,最终获得2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体细胞株AB1。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106 2,4,5-三氯苯氧乙酸杂交瘤细胞,从第七天开始收集腹水,将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下,正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白,然后离心,弃沉淀;再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体,离心,弃上清,用0.01 M PBS溶液(pH7.4)溶解后,透析脱盐,最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被:将包被原2,4,5-T-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释,100μL/孔,37℃反应2h;
6.2洗涤:将板内溶液倾去,并用洗涤液洗涤3次,每次3min;
6.3封闭:拍干后,加入200μL/孔封闭液,37℃反应2h。洗涤后烘干备用;
6.4加样:将抗血清从1:1000开始倍比稀释,并加入到各稀释度的包被孔中,100μL/孔,37℃反应30min;充分洗涤后,加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG,100μL/孔,37℃反应30min;
6.5显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100μL的TMB显色液,37℃避光反应15min;
6.6终止和测定:每孔加入50μL终止液以终止反应,然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体2,4,5-三氯苯氧乙酸的IC50为4.4ng/mL,说明对2,4,5-三氯苯氧乙酸有很好的灵敏度,可用于2,4,5-三氯苯氧乙酸免疫分析检测。
溶液的配置:
碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g,分别溶于少量双蒸水后混合,加双蒸水至约800mL混匀,调pH值至9.6,加双蒸水定容至1000mL,4℃贮存备用;
磷酸盐缓冲液(PBS):8.00g NaCl,0.2g KCl,0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12 H2O,溶于800mL纯水中,用NaOH或HCl调pH到7.2~7.4,定容至1000mL;
PBST:含0.05 % 吐温20的PBS;
TMB显色液:A液:Na2HPO4 .12H2O 18.43g,柠檬酸 9.33g,纯水定容至1000mL;B液:60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5︰1混合即为TMB显色液,现用现混。
Claims (3)
1.一株2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13083。
2.2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体,它由所述保藏编号为CGMCC No.13083的2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体杂交瘤细胞株AB1分泌产生。
3.权利要求2所述2,4,5-三氯苯氧乙酸单克隆抗体的应用,其特征在于:用于食品安全检测中2,4,5-三氯苯氧乙酸残留的分析检测。
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