CN102391993B

CN102391993B - 布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17c8及其产生的单克隆抗体

Info

Publication number: CN102391993B
Application number: CN2011103632955A
Authority: CN
Inventors: 汪舟佳; 陈泽良; 王玉飞; 于爽; 杜昕颖; 苑锡铜; 袁静; 黄留玉
Original assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Current assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102391993A

Abstract

本发明提供了以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971及其产生的单克隆抗体。所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；3)筛选并培养杂交瘤细胞；4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。实验证明，杂交瘤细胞株17C8CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能够反应，特异性较高，因而可用于布鲁氏菌的检测中。根据本发明单抗株的特性，可以建立检测布鲁氏菌抗原和血清的方法，应用前景广阔。

Description

布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体。

背景技术

布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病。布鲁氏菌能引起哺乳动物的流产、不孕、睾丸炎及关节炎等，同时由于它容易形成气溶胶，具有很高的传染性，所以还被用作生物战剂。

传统的布鲁氏菌检测采用血清学的方法，主要包括玫瑰花环试验、试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、抗人球蛋白试验(COOMB’S)，以及能够标准化的ELISA方法等。血清学方法的不足之处在于它的敏感性较低，而且与霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏、EHEC、沙门氏菌、福氏志贺菌等容易发生交叉反应。因此，制备布鲁氏菌高亲和力的单克隆抗体，且制备的抗体能够识别各个种型的布鲁氏菌，将为布鲁氏菌病诊断方法的研究奠定很好的基础。

发明内容

本发明的目的是提供用于布鲁氏菌检测的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。

本发明所提供的以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株，名称为17C8，细胞株17C8已于2011年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4971。

由杂交瘤细胞株17C8产生的单克隆抗体命名为17C8anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，也属于本发明的保护范围。

17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌毒株(如544A、16M、临床株S95(与16M为同种菌)等)以及疫苗株(如S2、S19、M5、104M等)均能够产生特异性免疫反应。

本发明的另外一个目的是提供一种制备上述单克隆抗体的方法。

具体来讲，本发明单克隆抗体的制备方法，可包括以下步骤：

1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；

2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；

3)筛选并培养杂交瘤细胞；

4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。

在上述单克隆抗体的制备方法中，步骤1)中的布鲁氏菌全菌抗原可为活菌或灭活菌，优选为活菌抗原，浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。

步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。

步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。

步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌区分布鲁氏菌毒株和疫苗株的单克隆抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。

本发明还提供了一种检测布鲁氏菌的试剂盒。

本发明所提供的检测布鲁氏菌的试剂盒，包含有杂交瘤细胞株17C8 CGMCCNo.4971产生的单克隆抗体。

本发明提供了以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8 CGMCCNo.4971及其产生的单克隆抗体。实验证明，杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能够反应，与其它菌株不反应，特异性较高，因而可用于布鲁氏菌的检测中。根据本发明单抗株的特征，可以建立检测布鲁氏菌抗原和血清的方法，应用前景广阔。

生物材料说明：

本发明杂交瘤细胞株，名称为17C8，为单克隆细胞株，该细胞株已于2011年6月16日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4971。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为小鼠三次免疫后的血清抗体效价趋势图

图2为三次亚克隆后挑选细胞上清ELISA检测结果

图3A-图3C为扩大培养各代杂交瘤细胞抗体效价检测结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971及其产生的单克隆抗体的获得

1、菌株培养

取-80℃保存菌种-布鲁氏菌强毒株Brucella melitensis 16M(简称16M，购自生物制品检定所)，按1∶100比例接种于TSB培养基(购自生物梅里埃公司)中，37℃、200rpm振荡培养48h。用接种环挑取少量，在TSA平板(购自北京欣经科生物技术有限公司)上划线分纯，37℃培养72h后，挑取单个菌落接种5mL TSB培养基中，37℃、200rpm振荡培养48h。按1∶100比例转接到200mL TSB培养基中，培养至对数中期。在菌液中加入终浓度为4％(体积百分浓度)甲醛溶液，室温作用10min灭活细菌。将灭活的16M菌液6000rpm离心10min，收集菌体，然后用PBS稀释至1×10⁸CFU/mL，和活菌1×10⁹CFU/mL一起作为全菌免疫抗原。

2、动物免疫

整个免疫过程将小鼠(SPF级，Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购于军事医学科学院实验动物中心)分为两组(每组4只)进行，A组为灭活全菌抗原免疫组，B组为活菌免疫组。取全菌抗原(活菌1×10⁹CFU/mL或灭活菌1×10⁸CFU/mL)与弗式完全佐剂(购自Sigma公司)按1∶1比例混合，乳化抗原直至达到油包水状态。采取皮下注射方式免疫，每只0.2mL。分别于初次免疫后第四周和第六周用弗式不完全佐剂(购自Sigma公司)按同样方法分别对小鼠进行第二次免疫和第三次免疫。每次免疫一周后，由小鼠尾静脉取血50μl测定抗体效价。选择血清效价高的小鼠脾脏进行细胞融合实验。融合前3天，取效价较高的小鼠以腹腔注射方式，注射1.5×10⁸CFU/mL全菌抗原0.5mL，作为加强免疫一次。

3、抗体效价测定

取免疫小鼠和健康小鼠尾静脉血50μl，室温静置1h，4℃放置2h，3000rpm离心10min，收集血清，4℃保存备用。采用间接ELISA方法对上述收集血清进行抗体效价测定。检测血清或腹水效价时，对血清或腹水用PBS做倍比(依次稀释800倍、1600倍、3200倍、6400倍)稀释，100μl/孔，以正常小鼠血清为阴性对照。用同样方法检测细胞上清的效价，无菌条件下取细胞上清，100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照。另外，酶联板两孔加入阳性血清作为阳性对照。以450nm单波长测定各孔0D值，以空白孔调零。以OD＞0.2作为判定阳性，以与阴性对照孔0D值比值(P/N)大于2.1为限，判定为效价临界值。

三次免疫后血清抗体效价测定结果如表1-表3和图1所示，可以看出：随着免疫次数的增加，小鼠血清的效价明显升高，并且布鲁氏菌活菌免疫组免疫后的抗体效价优于灭活全菌抗原免疫组。因此，下一步细胞融合中选择了活菌全抗原免疫后效价最高的B组4号小鼠作为细胞融合对象。

表1第一次免疫后效价(1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400为稀释比例)

表2第二次免疫后效价(1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400为稀释比例)

表3第三次免疫后效价(1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000为稀释比例)

4、滋养细胞制备

取1只健康Balb/c小鼠(雌雄均可)，6～7周龄，颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精5min后取出，腹部朝上固定于解剖板上，放入超净工作台内；用眼科镊子将腹部皮肤提起，用剪刀剪一小口，然后用剪刀向上下两侧钝性分离皮肤，充分暴露腹腔，用酒精棉擦拭消毒腹膜；用镊子提起腹膜，注射器注入5mL RPMI-1640(购自HyClone公司，含20％FCS(胎牛血清，购自HyClone公司)，1％双抗(青霉素+链霉素，购自北京欣经科生物技术有限公司)培养基，针芯来回抽几次，充分冲洗腹腔内细胞，用原注射器抽回腹腔内液体，注入50mL离心管，如此反复操作3～4次，1000rpm离心10min，弃上清；用20～50mL RPMI-1640完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到细胞培养板中，置培养箱备用。滋养细胞应在融合或克隆前1天制备。

5、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞准备

融合前一周复苏SP2/0细胞(购自军事医学科学院微生物流行病研究所)，融合前一天给细胞换新鲜含1％双抗(青霉素+链霉素)及10％(或20％)FCS的RPMI-1640培养基(购自HyClone公司)，视细胞生长情况而定。轻摇细胞培养瓶，弃培养基，加入无血清含1％双抗的RPMI-1640培养基(购自HyClone公司)培养基，吹打细胞，将液体移至50mL离心管中，补液至50mL，1000rpm离心5min收集细胞。重复洗3-4次。

6、分离脾细胞

取加强免疫后效价最高的小鼠，常规解剖取脾。将脾脏置于一干净培养皿中(培养皿事先用少量无血清含1％双抗(青霉素+链霉素)的RPMI-1640培养基润湿)，放在200目的细胞筛上，用玻璃注射器针芯小心将脾脏研磨。用含1％双抗(青霉素+链霉素，购自北京欣经科生物技术有限公司)的RPMI-1640培养基冲洗脾。吸取研磨后的液体加入50mL离心管中，补液至50mL，1000rpm离心8min，弃上清。重复洗3-4次。

7、细胞融合

取少量培养基将SP2/0细胞悬起，移入装有脾细胞的离心管中，混合，补液至50mL，1000rpm离心8min，弃上清。SP2/0∶脾细胞＝1∶5或1∶10，若有过量应适当去除。轻弹混合后的细胞，并置于37℃水温的烧杯中，缓慢加入0.8-0.9mL PEG1500(购自Sigma公司)，边加边搅动，1min完成，继续搅拌1min，轻轻搅起PEG1500，静置90s。加入1mL无血清RPMI-1640，边加边搅拌，搅起PEG1500。继续加入1mL无血清RPMI-1640中止反应，边加边搅动。加入40mL无血清RPMI-1640，边加边搅动(使PEG1500稀释后失去促融合作用)，1000rpm离心5min，洗掉PEG1500，并弃上清。用2mL融合细胞培养液(含1％双抗(青霉素+链霉素，购自北京欣经科生物技术有限公司)，2％HAT，20％FCS的RPMI-1640培养基)轻轻将底部融合细胞吹起，并用RPMI-1640培养基定容至50mL。轻弹细胞，倒入平皿，分装至昨日已铺滋养细胞的96孔板上(100μl/孔)，放入CO₂孵箱。

8、阳性杂交瘤细胞株的筛选、亚克隆及扩大培养

融合后观察96孔板中细胞状态，并记录细胞生长、死亡情况，了解融合后细胞生长规律、筛选时细胞的克隆数以及生长规律。采用ELISA方法对阳性杂交瘤细胞株进行筛选，具体方法为：(1)加待测样品：无菌条件下取细胞上清，100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照。另外，酶联板两孔加入阳性血清作为阳性对照，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

(1)加二抗：1000倍稀释的酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育20-30min，洗板4次，拍干。

(2)显色反应：加入显色液100μl/孔，37℃显色15-30min。

(3)终止反应：加入终止液50μl/孔，490nm波长测定OD值。

(4)结果判定：以490nm单波长测定各孔OD值，以空白孔调零。以OD＞0.2作为判定阳性，以与阴性对照孔OD值比值(P/N)大于2.1为限，判定为效价临界值。

检测融合后细胞上清时，为了避免假阳性，采取全部检测的原则，不漏掉任何一个阳性克隆孔。亚克隆的方法采用有限稀释法，针对阳性杂交瘤细胞株的亚克隆共进行3-4次，直到检测孔阳性率为100％。亚克隆培养后，如单克隆数较多，则只检测单克隆的细胞上清效价，如果单克隆个数少，则可以选择2-3个单克隆的细胞孔上清进行测定。亚克隆后杂交瘤细胞阳性率达到100％后，取阳性细胞孔中细胞转移到24孔板中，进行重点传代培养。并对每一代进行效价测定，以保证获得的细胞株能够稳定分泌抗体。三次亚克隆后挑选细胞上清ELISA检测结果如图2所示，挑选的亚克隆细胞株均能分泌一定量的抗体，其结果均可判定为阳性。融合效果以及三次克隆的阳性克隆率如表4所示，第三次克隆阳性率可判定为100％，因此得到了能够分泌单克隆抗体的细胞株。细胞经过3轮亚克隆，成功筛选出具有稳定分泌抗布鲁氏菌抗体杂交瘤细胞共42株，对这些阳性细胞株进行扩大培养，由96孔细胞培养板转至24孔细胞培养板中，孵箱培养，大约每周进行细胞传代，每传一代对细胞上清进行抗体效价检测，以确定传代细胞是否能够稳定分泌抗体。扩大培养各代杂交瘤细胞抗体效价检测结果如图3A-图3C(共针对42株细胞)分别所示，仅有三株细胞在第6代时没有分泌抗体，但是在第7代时又重新分泌抗体，其它细胞株的细胞上清中的抗体分泌虽然有所波动，但是均能够稳定分泌抗体。稳定分泌抗体的细胞每一代则按照冻存方法进行冻存。每株细胞冻存三管。

表4融合效果以及阳性克隆率

9、杂交瘤细胞的冻存和复苏

冻存：将扩大培养后仍然能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，从24孔板轻轻吹起，放入离心管中1000rpm离心10min，弃掉上清，加入细胞冻存液，吹吸均匀，转移到灭菌细胞冻存管中，封口。依次放入4℃ 30min、-20℃ 30min、-80℃过夜。第二天再将细胞冻存管快速转移至液氮罐中，做好标签。稳定分泌抗体的细胞株，每代保存三管。

复苏：取出液氮保存的细胞管，37℃水浴中迅速解冻，1000rpm离心5min，弃上清，加入细胞完全培养基，转入细胞培养瓶于二氧化碳培养箱中培养。

10、单克隆抗体亚型测定

取阳性克隆细胞上清100μl/孔，孵育30min，洗涤3次，用Sigma公司的IgG亚类测定试剂盒方法测定单克隆抗体亚型。

取第3次克隆后为阳性的细胞进行扩大培养，取扩大培养后仍为阳性的细胞株上清用Sigma公司的IgG亚类测定试剂盒进行测定，结果：所有细胞上清检测均为IgG3亚型。

11、单克隆抗体的大量制备及纯化

采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单抗：取健康Balb/c雌性小鼠，每只腹腔注射1mL液体石蜡，正常饲养1-2周，备用。将培养的阳性克隆杂交瘤细胞从细胞培养板上吹打下来，1000rpm离心10min，弃上清液，收集细胞。用PBS将细胞悬浮，混匀，并将细胞计数，调至10⁶个/mL，每只经液体石蜡预处理后的小鼠腹腔注射0.5mL阳性克隆杂交瘤细胞。每天观察小鼠腹部，约7-9天后，小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，间隔2天后重复收集腹水，或者待小鼠腹部膨大至青色，直接处死解剖收集腹水，将腹水3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层。腹水倍比稀释后用ELISA方法检测抗体效价。检测结果表明杂交瘤细胞株17C8产生的腹水效价较高(见表5)，可达1∶51200。采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化IgG，并用核酸定量分析仪测定纯化后的浓度，IgG含量达10.59mg/mL，检测结果表明获得了纯度较高的单克隆抗体，小管分装，-20℃冻存。

表5单克隆抗体腹水效价检测结果

12、单克隆抗体特异性分析

分别以霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏、EHEC、沙门氏菌、福氏志贺菌、羊种标准布鲁氏菌菌株16M、羊种布鲁氏菌临床分离株S95灭活菌(与16M为同种菌株)、牛种标准布鲁氏菌菌株544A以及布鲁氏菌疫苗株M5、S19、104M、S2(上述菌株均购自生物制品检定所)作为包被抗原。取纯化后的单克隆抗体，用PBS按1∶20000比例稀释，采用间接ELISA方法对17C8分泌的单克隆抗体(步骤11纯化的)进行特异性检测。

结果如表6和表7所示，17C8分泌的单克隆抗体对于霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏、EHEC、沙门氏菌及福氏志贺菌的ELISA反应值均判定为阴性值，表明这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均不能与上述几种菌发生抗体抗原特异性反应，表明这株杂交瘤细胞株具有较好的布鲁氏菌特异性。杂交瘤细胞株17C8与毒株544A、S95、16M以及疫苗株M5、104M、S2、S19反应均呈阳性。实验结果表明，本发明的杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体可用于布鲁氏菌抗原和血清的免疫检测中，该细胞株已于2011年6月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4971。

表6杂交瘤细胞株17C8分泌的单克隆抗体特异性检测结果

表7杂交瘤细胞株17C8与所有布鲁氏菌菌株均有反应

实施例2、样本检测实例

用制备好的杂交瘤细胞株17C8分泌的单克隆抗体包被酶联板，阳性对照用灭活的羊种布鲁氏菌16M溶于健康人血清中，使终浓度达到10⁸CFU/mL，阴性对照用健康人血清。用ELISA的方法对20份布病患者血清进行检测，具体方法包括以下步骤：

(1)包被：杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体，1∶20000比例稀释，每孔加100μl，4℃过夜，洗涤3次，拍干。

(2)封闭：用封闭液封闭包被的酶联板，150μl/孔，37℃作用2h；

(3)洗涤：洗涤3次，拍干；

(4)加待检样品：布病患者血清1∶50比例稀释，每孔加100μl，同时设置阳性和阴性对照。37℃孵育30min；

(5)洗涤：同步骤(3)

(6)加二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶1000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用20-30min，然后用洗液洗3次，拍干；

(7)显色反应：加入显色液100μl/孔，37℃显色15-30min；

(8)终止反应：加入终止液终止反应，50μl/孔；

(9)结果判定：以490nm单波长测定各孔OD值，以空白孔调零。以OD＞0.2作为判定阳性，以与阴性对照孔OD值比值(P/N)大于2.1为限，判定为效价临界值。

21份布病患者血清检测结果如下表(表8)，有6份样本检出为阳性，15份为阴性，阳性对照OD值为2.781，阴性对照OD值为0.119。以上结果表明，本发明的含有杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971可用于布鲁氏菌的免疫检测中。

表821份布病患者血清检测结果

	阳性	阴性
			检测结果	6份	15份

Claims

1.以布鲁氏菌强毒株Brucella melitensis16M全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8CGMCC No.4971。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株17C8CGMCC No.4971产生的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：与布鲁氏菌毒株以及布鲁氏菌疫苗株能够产生特异性免疫反应；所述布鲁氏菌毒株为544A、临床株S95或16M，所述疫苗株为S2、S19、M5或104M。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株17C8CGMCC No.4971在制备布鲁氏菌检测试剂或药物中的应用。

5.权利要求2或3所述的单克隆抗体在制备布鲁氏菌检测试剂或药物中的应用。

6.一种检测布鲁氏菌的试剂盒，包含有权利要求2或3所述的单克隆抗体。