CN102161982B

CN102161982B - 抗人cxcr3分子单抗及其应用

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Publication number: CN102161982B
Application number: CN 201110056456
Authority: CN
Inventors: 邱玉华; 孙杰; 朱华亭; 陈永井
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: CN102161982A

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株产生的一种抗人CXCR3分子单抗，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2011年01月24日；保藏号：CGMCCNo.4550；分类命名：分泌抗人CXCR3分子单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明所述抗人CXCR3分子单抗可以用于肿瘤细胞检测、抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤细胞增殖。

Description

抗人CXCR3分子单抗及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗人CXCR3分子单抗。

背景技术

CXCR3是CXC趋化因子受体3，在正常生理状态下主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞等；其配体主要有CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC，通过受体-配体结合而发挥生物学效应。CXCR3信号转导与许多生物学行为相关，例如淋巴细胞迁移/归巢、造血祖/干细胞迁移、胚胎发育及血管发生等。近年研究发现，在一些自身免疫性疾病、移植排异及HBV、HIV感染等病人外周血淋巴细胞表面高表达CXCR3，且与疾病的发生、发展及预后密切相关；许多恶性肿瘤组织和肿瘤细胞株表面也高表达CXCR3，如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌及肺癌等，且与肿瘤的生长、转移及肿瘤血管发生有着密切的关系。体外实验研究表明，利用CXCR3拮抗剂AMG487阻断CXCR3信号转导，可抑制CXCR3⁺肿瘤细胞株的迁移和增殖。体内研究表明，采用RNA干扰技术抑制CXCR3的表达或利用CXCR3拮抗剂AMG487阻断CXCR3与其配体的结合，可有效抑制结肠癌、黑色素瘤等向特异性器官的转移。

如果可以成功制备得到抗人CXCR3分子单克隆抗体，不仅可以更好的研究CXCR3分子在细胞迁移过程中的作用及机制，更可以提供一种影响肿瘤细胞增殖和迁移的解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人CXCR3分子单克隆抗体以及能产生所述抗人CXCR3分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

1）利用已构建的稳定表达人CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3作为免疫原免疫BALB/c小鼠；

2）获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

3）应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出高分泌抗体的杂交瘤细胞株。

本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2011年01月24日；保藏号：CGMCC No. 4550；分类命名：分泌抗人CXCR3分子单克隆抗体杂交瘤细胞株。

上述技术方案中，步骤1）中稳定表达人CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于L929细胞是鼠源性的成纤维细胞，细胞表面其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，为特异性杂交瘤株的获取提供了便利。

上述技术方案中，步骤1）中，制备L929-huCXCR3细胞的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养；具体地，可以参考文献：邱玉华等人. 人CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及初步功能研究. 《中国免疫学杂志》2010年第26卷第5期：387-391页。所述L929-huCXCR3细胞由发明人所在实验室保藏和提供。采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种：

1）在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体；

2）在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。

本发明同时要求保护上述抗人CXCR3分子单克隆抗体作为生物学检测指标，在肿瘤细胞检测中的应用。

本发明同时要求保护上述抗人CXCR3分子单克隆抗体抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤细胞增殖的应用，以及上述抗人CXCR3分子单克隆抗体在制备抑制肿瘤细胞转移的药物、抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

进一步的技术方案中，本发明同时提供一种抑制肿瘤细胞抑制的药物，所述药物的主要成分为上述人CXCR3分子单克隆抗体。

本发明同时提供一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，所述药物的主要成分为上述人CXCR3分子单克隆抗体。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．间接免疫荧光分析表明，本发明所述单克隆抗体可很好的识别L929-huCXCR3细胞和肿瘤细胞表面的CXCR3分子，并且可以用于Western blot检测。

2. 本发明所述单克隆抗体可阻断CXCR3信号转导，可抑制L929-huCXCR3细胞由IP-10和I-TAC介导的定向迁移，但对Mig介导的迁移效应无抑制作用；可在体外抑制结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29在IP-10介导下的定向迁移，并且可抑制IP-10对Colo205的促增殖效应。

附图说明

图1 为实施例中FCM鉴定SQA-6对L929-huCXCR3细胞表面CXCR3分子的识别，其中，A：L929；B：L929-mock；C：L929-huCXCR3；

图2为实施例中SQA-6的Ig亚类鉴定结果；

图3 为实施例中杂交瘤细胞株SQA-6的染色体数目（1000倍）；

图4 为实施例中SQA-6效价的测定；

图5 为实施例中SQA-6与CXCR3分子结合的Western blot分析；A:L929；B:L929-huCXCR3；C:L929-mock；

图6 为实施例中CXCR3分子在T细胞上的表达，其中，A：新鲜分离的T细胞组；B：PHA组；C：PHA+IL-2 组；

图7 为实施例中FCM分析SQA-6对不同肿瘤细胞株表面CXCR3分子的识别；

图8为实施例中SQA-6对L929-huCXCR3迁移能力的抑制效应；注：^a p>0.05； ^b、c p<0.01；

图9为实施例中SQA-6 对结肠癌细胞株迁移能力的抑制效应；注：^a、b、c p<0.05；

图10为实施例中SQA-6对Colo205细胞的增值抑制效应；注：^a、b p<0.05；^c p<0.01。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：特异性分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立

1）动物免疫：收集生长良好的L929-huCXCR3细胞，用PBS洗两遍，加入丝裂霉素溶液（50 mg/100 mL/1×10⁷个细胞）混匀，置于37℃，45 min后，PBS洗3遍，再用0.3~0.4 mL的生理盐水重悬细胞，加入等体积的福氏完全佐剂（CFA）充分乳化，分别于BALB/c 小鼠颈后部皮下多点及腹腔注射；并于初次免疫后第3周、第5周进行再次免疫，将细胞数量调整为8×10⁶细胞/只，细胞的预处理及注射部位同上，于融合前3~5 d，再次腹腔注射5×10⁶细胞/只，以加强免疫。

2）小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的复苏及培养：SP2/0细胞复苏后，用含15% FCS的DMEM培养基培养，待扩增至足够数量后，以每只小鼠1×10⁷的细胞量注射到预先用Pristane致敏十天左右的BALB/c 小鼠腹腔内。1w后，根据小鼠的生存状态无菌抽取腹水，将含SP2/0细胞的腹水直接加入到含15% FCS的DMEM培养基中传代培养，待细胞生长旺盛、形态良好（浑圆、透亮、大小均一），且细胞活力大于95%时用于融合。融合前24~36 h用新鲜培养基将细胞浓度调整为3×10⁵个/mL。

3）其它细胞的培养：L929-huCXCR3细胞及一些肿瘤细胞的培养：采用含10% FCS的RPMI1640培养基培养人CXCR3基因转染细胞株L929-huCXCR3，并定期用Zeocin加压筛选，以保持目的基因产物的稳定高表达，传代时用0.25%的胰蛋白酶消化；肿瘤细胞HCT116、HT29、Colo205等用含10% FCS的RPMI1640培养基培养，传代时同样用0.25%的胰蛋白酶消化。

4）饲养细胞的制备：于融合前1~2 d，取BALB/c 小鼠，摘除眼球放血，自来水冲洗干净后置于75%酒精中3 min，然后固定于解剖架上，剪开腹部皮肤，用10 mL的注射器无菌吸取3~4 mL DMEM基础培养基，从小鼠下腹部进针，注入到小鼠腹腔内，反复抽吸后吸出细胞，置于预冷的离心管中，离心收集腹腔细胞。然后沿胸骨无菌打开小鼠胸腔，取下胸腺，置于120目的钢丝网中，研磨成单细胞悬液，离心收集细胞。将胸腺细胞与腹腔细胞混合后，基础培养基洗2遍。用含20% FCS的HAT选择培养基，调整细胞浓度为3~4×10⁵个/mL，细胞悬液滴加于96孔培养板中，每孔100 mL（相当于3~4×10⁴个/孔），37℃、5%CO₂培养箱中培养。

5）免疫小鼠脾脏细胞的制备：取加强免疫后3~5 d的BALB/c小鼠，按上述方法处死后，剪开小鼠腹部皮肤，无菌打开小鼠腹腔，在左后腹部取出脾脏，经研磨获取单细胞悬液。用苔盼蓝染色作活细胞计数，洗涤2遍后将细胞重悬于20 mL DMEM基础培养基中，置于培养箱中备用。

6）细胞的融合及选择性培养：将DMEM基础培养基、含20% FCS的HAT选择培养基、50%的PEG溶液置于37℃的培养箱中预热。收集2×10⁷个SP2/0细胞，DMEM基础培养基洗一遍，与1×10⁸个脾脏细胞混合于50 mL离心管中（SP2/0细胞与脾脏细胞的比例为1:5），预热的DMEM基础培养基洗两遍，1200 rpm离心8 min，尽弃上清；用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀并成糊状。将离心管置于37℃的保温杯中，预热半分钟；吸取1 mL预热的50%的PEG溶液，将吸管轻轻插入细胞悬液底部，在1 min 内匀速加完，且边加边轻轻搅拌，37℃水浴中静置90 s。再加入40 mL预热的DMEM基础培养基，室温静置5 min，离心（800 rpm，10 min），弃上清。将细胞重悬于100 mL含20% FCS的HAT选择培养基中，滴入含有饲养细胞的96孔板中，100 mL/孔，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，次日观察有无污染；3~4 d后半量换液，10 d后改用HT培养基培养。

7）阳性杂交瘤的筛选：待细胞克隆布满1/3~1/4培养孔时，即可吸取培养上清用间接免疫荧光法进行筛选。将生长良好的L929-huCXCR3细胞用PBS洗2遍后，分加于流式管中（5×10⁵/管），加入杂交瘤细胞的培养上清（50mL/管）于4℃反应30 min，用含2% FCS的PBS洗2遍，加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗，4℃避光反应30 min，洗涤后用流式细胞仪分析。发现阳性克隆后，次日重取上清用L929-mock细胞进行检测，排除非特异性结合。

8）阳性杂交瘤的克隆化培养：采用有限稀释法，将免疫荧光阳性孔细胞准确计数后，用HAT选择培养基梯度稀释为50个/mL和10个/mL，加稀释后的细胞悬液于含有饲养层细胞的96孔板中（100 mL/孔）。使每孔平均含有5个和1个细胞，37℃、5% CO₂培养箱中培养。适时换夜，并根据细胞的生长状态及时按照已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞继续做亚克隆，直至抗体分泌阳性率大于95%，扩大培养并及时液氮冻存。

结果：通过L929-huCXCR3基因转染细胞连续免疫小鼠3次，第4次加强免疫后的血清抗体效价达1:1000以上，免疫效果较好。采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合率约为80%，检测率在90%以上。将复测的阳性孔连续3次克隆化，获得了1株持续分泌特异性抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为SQA-6（图1）。该杂交瘤细胞株经体外连续传代（40代）培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。

实施例二：杂交瘤染色体数目分析，单克隆抗体的亚类分析。

1）取生长良好的杂交瘤细胞，加入秋水仙素，使其终浓度为0.04~0.08 mg/mL。培养2 h后离心收集细胞（1000 rpm ，10 min），逐滴加入0.5 mL 37℃预热的75 mmol/L的KCl溶液后，随即再补加5~10 mL，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育20 min。向管中加入1 mL新鲜配制的固定液（3份甲醇加1份冰醋酸，临用前配制），离心（1000 rpm ，10 min），弃上清。再加入8~10 mL固定液，用吸管轻轻吹打混匀，固定15~20 min，离心弃上清。再加入5 mL固定液，固定30 min，离心弃上清。再加入1.5 mL固定液，吹打均匀。取-10℃冰冻的载玻片，滴加1~2滴细胞悬液，用新鲜Giemsa溶液（1份Giemsa溶液原液加9份0.075 mol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲液）染色10~20 min，流水冲洗后晾干。二甲苯透明3次，中性树脂封片。在普通显微镜下选择染色体分散良好、不重叠、无散失的标本，于油镜下观察记录并进行显微摄影。

染色体数目分析结果显示，杂交瘤细胞株的染色体数目在100条以上，超过小鼠正常细胞和SP2/0细胞的染色体数，由此表明该杂交瘤细胞株为融合体（图3）。

2）快速定性试纸法鉴定单克隆抗体的类型，结果显示：经快速定性试纸法鉴定SQA-6的重链为IgG1，轻链为k链（见图2），具体方法为：将杂交瘤的培养上清以1:50稀释，取0.2 mL稀释液加入含有亚类定性试剂的小试管中，室温静置1 min，待其自然溶解后轻轻混匀，将亚类定性试纸条轻轻插入管中，5~10 min后，试纸条的一面出现与抗体重链亚类名称相对应的蓝色蛋白显色条带，此即该抗体所属的小鼠Ig亚类；另一面出现与小鼠轻链型别名称相对应的蓝色蛋白条带，此即该抗体的轻链型别。

实施例三：单克隆抗体的制备、纯化及效价测定

1）采用本室建立的小鼠体内诱生腹水的方法生产单克隆抗体。取6~8周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射Pristane 0.5 mL/只。1周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁷/只，同时另一侧再次注射Pristane和福氏不完全佐剂的等体积混合物0.2 mL/只，轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。一周后，视小鼠生存状态抽取腹水，离心去除悬浮物，分装后于-80℃保存。

采用上述方法生产抗体的结果为：腹水形成率在95%以上，腹水的产量平均为3.5 mL/只。

2）Protein G免疫亲和层析法纯化IgG亚类抗体：将腹水解冻， 4℃离心（12000 rpm，20min）去除凝集块、脂肪和纤维蛋白。腹水按1:10稀释后，依次用0.60mm、0.45 mm、0.30mm、0.22mm的滤膜过滤后，上Protein G亲和层析纯化柱。收集纯化的抗体，用紫外分光光度法测定抗体蛋白的浓度，其计算公式为：抗体蛋白浓度（mg/mL）=OD₂₈₀×1.55-OD₂₆₀×0.76。产品无菌过滤后，分装后于-80℃保存。

采用上述方法分离纯化的结果为：纯化所得抗体的蛋白含量在3.5 mg/mL以上。

3) 采用间接免疫荧光法，将生长良好的L929-huCXCR3细胞，用含2%小牛血清的PBS洗涤后加到流式管中，1×10⁶细胞/50mL/管。将腹水纯化获得的抗体蛋白按浓度梯度稀释后，按1mg/test、0.5mg/test、0.25mg/test及0.1mg/test的量分加于各管，4℃反应30 min，用含2%小牛血清的PBS洗两遍，加入PE标记的羊抗鼠二抗，于4℃避光反应30 min。洗涤后用FCM分析，以出现最大阳性率及荧光强度时的最少抗体用量作为抗体的效价。

采用上述间接免疫荧光法分析表明：SQA-6用于间接免疫荧光分析的最小用量约为0.25 mg/1×10⁶个细胞（图4）。

实施例四：单克隆抗体的特异性鉴定

收集生长状态良好的L929-huCXCR3和L929-mock细胞各1×10⁷个，用预冷的PBS洗涤两遍，依次加入细胞膜裂解液（RIPA）0.5 mL和蛋白酶抑制剂（PMSF）100 mL，充分混匀，在冰上用1 mL注射器针筒抽吸3~4次，15 min后再重复3~4次，静置15~20 min，移入1.5 mL离心管中，12000 rpm离心10 min；取上清液30 mL，经12% SDS-PAGE电泳，并转移至硝酸纤维素膜上，用1% TBST封闭液4℃封闭过夜；次日加入纯化的鼠抗人CXCR3的mAb室温孵育1 h，用TBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育30 min，洗涤后加入ECL显色试剂，在暗室用X光片曝光数分钟，进行显影后再定影。

Western Blot结果显示，SQA-6能与L929-huCXCR3细胞裂解提取的CXCR3蛋白特异性结合，在40kD左右形成明显的特异性条带；而L929和L929-mock泳道则无特异性条带出现，表明SQA-6可以特异性识别CXCR3分子（图5）。

实施例五：单克隆抗体检测CXCR3分子在T细胞表面的表达

无菌抽取正常人外周血（肝素抗凝）100 mL，常规Ficoll密度梯度离心分离获得人外周血单个核细胞（PBMC），RPMI1640基础培养基洗2遍后，用含10% FCS的RPMI1640培养基调整细胞浓度为3×10⁶个/mL， 37℃、5% CO2培养箱中培养2 h，离心收集细胞。用含PHA浓度为5 mg/mL的RPMI1640完全培养基培养3 d，再用IL-2浓度为400 U/mL的RPMI1640完全培养基培养3 d，离心收集细胞，用基础培养基洗2遍。加入抗人CXCR3单克隆抗体孵育（0.5mg/ 5×10⁵细胞/50 mL）30 min，洗涤后，加入PE标记的羊抗鼠二抗孵育30 min，洗涤后用FCM检测细胞表面CXCR3分子的表达。同时检测CXCR3在新鲜分离的T细胞和经PHA活化但未用IL-2诱导培养的T细胞表面的表达。

FCM结果显示，CXCR3在新鲜分离的T淋巴细胞表面几乎不表达；在仅用5 mg/mL PHA活化3 d的T细胞表面有较高表达，阳性率为63.7%；在经5 mg/mL的PHA活化3 d再用400 U/mL的IL-2诱导培养3 d的T细胞表面的阳性表达率达95%以上（见图6）。

实施例六：CXCR3在肿瘤细胞膜表面的表达

把结肠癌细胞株Colo205、HCT116、HT29及SW480，以及其它肿瘤细胞8226、XG6、U266、Raji、Daudi和XG1等分加于流式管中，5×10⁵细胞/50 mL/管，加入鼠抗人CXCR3单克隆抗体0.5mg/10 mL/管，4℃反应30 min，PBS洗2遍，加入PE标记的羊抗鼠二抗，4℃避光反应30 min，洗涤后用FCM分析。

流式细胞术分析结果显示，CXCR3在结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29膜表面有较高表达，阳性率分别为95.1%、91.6及90.4%；在SW480细胞膜表面不表达。在8226、XG6及U266细胞膜表面表达较低，阳性率分别为37.7%、23.1%及19.8%；在Raji、Daudi及XG1细胞膜表面不表达（见图7）。

实施例七：单克隆抗体对L929-huCXCR3迁移能力的影响

收集L929-huCXCR3细胞与抗人CXCR3单克隆抗体SQA-6按1×10⁶个细胞/0.5mg mAb的量4℃反应30 min， PBS洗2遍，用小鼠IgG同步作阴性对照，选用8 mm孔径的24孔Transwell板，上孔中加入抗体孵育过的L929-huCXCR3细胞400 mL（1×10⁵个），下孔中加入含50 ng/mL的Mig或IP-10或I-TAC的趋化液600 mL，每组设三个复孔。37℃、5% CO₂孵育5 h，用FCM对下室中的细胞进行计数。（细胞迁移率）%=（迁入下室中的细胞数/加入上室中的细胞总数）×100%。

统计分析结果表明，L929-huCXCR3经SQA-6处理后，在50 ng/mL的Mig诱导下的迁移率为3.35%，对照组的迁移率为3.67%，两者之间无统计学差异（p>0.05）；L929-huCXCR3经SQA-6处理后，由50 ng/mL的IP-10介导的迁移率为4.28%，对照组的迁移率为2.14%，两者具有统计学差异（p<0.01）；L929-huCXCR3经SQA-6处理后，由50 ng/mL的I-TAC介导的迁移率为6.49%，对照组的迁移率为2.02%，两者具有统计学差异（p<0.01）。可见，单抗SQA-6可抑制由IP-10和I-TAC介导的迁移，但对Mig介导的迁移无抑制效应（见图8）。

实施例八：单克隆抗体对结肠癌细胞株迁移能力的影响

将表达CXCR3分子的结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29与抗人CXCR3分子单克隆抗体按1×10⁶个细胞/0.5mg mAb的量4℃反应30 min，PBS洗2遍，并用小鼠IgG作阴性对照。选用8 mm孔径的24孔Transwell板，上室中分别加入抗体孵育过的三种细胞400 mL（1×10⁵个），下室中加入含50 ng/mL IP-10的趋化液600 mL，每组设3个复孔。37℃、5% CO₂孵育5 h，用FCM对下室中的细胞进行计数，计算迁移率。

统计分析结果表明，结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT20经 mAb SQA-6处理后，在50 ng/mL 的IP-10诱导下的迁移率分别为2.28%、2.29%及2.28%，各自对照组的迁移率分别为3.92%、3.63%及3.52%，与各自的对照组相比，均具有统计学差异（p<0.05）（图9）。

实施例九：IP-10对Colo205的促增殖作用及单抗对增殖效应的影响

实验分组：抗人CXCR3 mAb组、小鼠IgG对照组和未加趋化因子组。具体方法如下：用含10% FCS的RPMI1640培养基调整Colo205细胞的浓度为1×10⁵/mL，接种于96孔板中（100mL），抗人CXCR3 mAb组分别加入终浓度依次为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的抗人CXCR3 mAb，对照组加入小鼠IgG；30 min后加入IP-10，使其终浓度为50 ng/mL。每组设三个复孔，37℃、5% CO₂培养。48 h后，每孔加入20 mL的MTT溶液（5 mg/mL），再培养5 h，离心弃上清，加入150 mL的DMSO溶液终止反应，酶联检测仪570 nm处测定OD值。

MTT结果的统计分析表明，IP-10对Colo205细胞具有较强的促增值作用，具有统计学意义（p<0.05）。SQA-6可以抑制IP-10的促增值效应，并且具有浓度依赖性；抗体浓度为10 mg/mL时已具有明显的抑制效应（p<0.05）；抗体浓度为20 mg/mL时抑制效应更为显著（p<0.01）（见图10）。

以上实施例中的统计学分析方法为：利用SPSS17.0统计软件，采用t检验进行统计学分析，数据以均数±标准差（

±S）表示。

Claims

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2011年01月24日；保藏号：CGMCC No. 4550；分类命名：分泌抗人CXCR3分子单克隆抗体杂交瘤细胞株。

2.一种抗人CXCR3分子单抗，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株制备得到。

3.权利要求2所述抗人CXCR3分子单抗在制备抑制肿瘤细胞转移的药物中的应用。

4.权利要求2所述抗人CXCR3分子单抗在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

5.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，其特征在于，所述药物的主要成分为权利要求2所述人CXCR3分子单克隆抗体。