CN103819561A

CN103819561A - 抗cd24单克隆抗体、其可变区序列及其应用

Info

Publication number: CN103819561A
Application number: CN201410027795.5A
Authority: CN
Inventors: 王旻; 涂孝洁; 何花; 张娟; 罗晨
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明公开了一种具有中和人白细胞分化抗原CD24生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。本发明以抗原肽与血蓝蛋白偶联物CD24-KLH作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。本发明同时克隆了抗CD24抗体可变区氨基酸序列。本发明的抗CD24抗体可与CD24特异性结合，因此可以用于治疗与CD24表达过量、异常、失控相关的疾病。

Description

抗CD24单克隆抗体、其可变区序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能特异性结合人白细胞分化抗原CD24的单克隆抗体、其可变区序列及其应用。

背景技术

人白细胞分化抗原CD24(cluster of differentiation 24)是一种新近发现并重点研究的肿瘤标志物。

当前研究表明，CD24分子是表观分子量介于30～70kDa之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。CD24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的O-或N-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)锚定在细胞膜的表面。

在生理情况下，CD24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的CD24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。

P选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，CD24是其配体之一。CD24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，CD24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。研究进一步发现，CD24表达与肝癌细胞的干性紧密相关，CD24可能成为一种新的肝癌干细胞表面标志物。

由此可见，CD24有望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。

发明内容

本发明目的一在于提供一种抗CD24单克隆抗体制备方法。

本发明目的二在于提供了一种抗CD24单克隆抗体。

本发明目的三在于提供抗CD24单克隆抗体的可变区氨基酸序列。

本发明以CD24核心区多肽与血蓝蛋白KLH偶联物(CD24-KLH)作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。

本发明克隆的抗体重链、轻链可变区氨基酸序列及其高变区如有SEQ ID No.1～16所示。

本发明的单克隆抗体可与CD24特异性结合。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测Protein G亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1为腹水样品；泳道2为上样收集液；泳道3为20mM磷酸钠缓冲液洗柱收集液；泳道4～6为100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)洗脱收集液(每分钟收集1 ml，共收集3ml)，泳道7～10为100mM甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱收集液(每分钟收集1ml，共收集4ml)。

图2为Western Blot鉴定纯化后抗体与CD24之间相互作用。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1市售CD24-Fc(购自北京义翘神州)；泳道2为市售Fc(购自北京义翘神州)。

图3为PCR扩增抗体重轻链可变区基因琼脂糖电泳结果。泳道M为标准分子量DNA；泳道1为PCR扩增抗体重链可变区基因产物；泳道2为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。

图4为竞争性ELISA测定单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4亲和力。

具体实施方式

实施例1抗CD24单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

1.免疫原

CD24核心区由33个氨基酸残基组成，其分子量约为3.2kD，免疫原性较弱。本发明将抗原肽CD24与血蓝蛋白KLH偶联，以偶联物CD24-KLH作为免疫原，增强了CD24核心区多肽的免疫原性。本发明所用CD24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，纯度＞90％。

2.免疫动物

本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，为SPF级别，由扬州大学比较医学院提供。免疫佐剂为QuickAntibody，购自北京康碧泉公司。免疫流程参照QuickAntibody说明书进行，具体如表1所示。

表1.免疫途径与周期

3.细胞融合

1)细胞准备

A.饲养层细胞

于融合前一天取ICR小鼠(SPF级，购自扬州大学比较医学院)腹腔巨噬细胞，重悬于HAT培养液(购自GIBCO公司，含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)。接种于96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

B.骨髓瘤细胞

小鼠骨髓瘤细胞株SP20-Ag14(本实验室保存)不合成和分泌任何一种小鼠免疫球蛋白重链和轻链，此细胞对8-氮杂鸟嘌呤具有抗性，而在HAT选择性培养基不能生长。融合前一个星期，用普通的DMEM完全培养基(含15％FBS，购自GIBCO公司)分瓶培养杂交瘤细胞，以使细胞能生长良好。每一个融合准备250ml生长密度为2×10⁶cells/ml处于对数生长中期的健康细胞。

C.免疫小鼠脾脏细胞

处死免疫的小鼠，用酒精浸润后取出脾脏。预先准备好10cm²无菌培养皿，放入细胞筛网，并加入10ml无血清DMEM培养基。把脾脏置于细胞筛网上，并用无菌手术剪将脾脏剪成碎片。注射器内芯挤压研磨脾脏后，用5 ml DMEM不完全培养基冲洗，使细胞通过过筛网进入50ml离心管中。收集脾脏细胞悬液，用于融合。

2)融合

A.准备20ml无血清的DMEM培养基和1ml PEG1450(购自Sigma公司)放于37℃保温。

B.收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，常温下1500rpm离心5min，用无血清培养基洗两次，然后将其悬浮于10ml无血清培养基中。将5×10⁸脾细胞和1×10⁸骨髓瘤细胞充分混合，1500rpm离心5min，弃上清。轻轻敲击管子底部使细胞松散。

C.取出在37℃预热的培养基和PEG，把细胞置于37℃水浴中，1min内匀速缓慢逐滴加1ml PEG，加完后及时用无血清的培养基终止。离心弃上清并用50ml HAT培养液重悬细胞，轻轻混匀。

D.将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔100μl。置37℃，5％CO₂培养箱中培养4天。根据细胞生长状态，在筛选前用HAT培养液半换液1～3次，避免孔内培养基变黄。

E.融合后7天后，改用含有HT培养液全换液。24h后，吸取细胞培养上清，间接ELISA检测筛选阳性克隆。

3)杂交瘤的单克隆化

挑选阳性值较高的克隆孔，采用有限稀释法将孔中的细胞分别稀释至每毫升含5、10和50个细胞，然后接种于96孔板中，每孔接种100μl。37℃、5％CO₂湿润培养7～10天，出现肉眼可见的克隆即可检测细胞培养上清。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

实施例2CD24特异性抗体的制备和纯化

1.腹水收集

提前一周用0.5ml石蜡油(购自Sigma公司)注射小鼠腹腔。致敏一周后，将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×10⁶cells/ml，注射0.5ml细胞悬液至小鼠腹腔中。7～10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集腹水。4℃，5000g离心20min，去除腹水中细胞碎片与油脂，然后加入等体积甘油保存于-20℃。

2.CD24特异性抗体的纯化

采用Protein G亲和层析柱纯化抗体。具体步骤如下：A.用10倍柱体积水清洗ProteinG亲和层析柱。B.用10倍柱体积20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)冲洗ProteinG亲和层析柱。C.将所需纯化样品泵入层析柱。D.用100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5，pH2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1M Tris缓冲液(pH9.0)中和收集物。E.10mM pH7.2缓冲液透析脱盐。F.用SDS-PGAGE电泳初步鉴定抗体，图1结果显示50kD及25kD处出现目的条带。

3.CD24特异性抗体的特征分析

1)免疫球蛋白亚型鉴定

采用武汉三鹰生物技术有限公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，鉴定细胞株G7、A7、E4、G5、B4分泌抗体亚型，结果为：此5株细胞株分泌的免疫球蛋白重链亚型均为IgG1，轻链亚型均为Kappa。

2)Western Blot鉴定单克隆抗体的特异性

以纯化抗体作为一抗，鉴定其与CD24的反应，图2显示所得抗体可与市售CD24-Fc融合蛋白中CD24部分特异性结合。

3)竞争性ELISA测定抗体亲和力

根据Friguet等测定亲和力的方法，设计抗原竞争结合抗体实验测定亲和常数，固定抗体浓度为10pmol·L^-1，改变抗原浓度形成一系列反应系统。7个不同浓度的50μL抗原(0、1.95×10^-11、3.91×10^-11、7.81×10^-11、1.56×10^-10、3.13×10^-10、6.25×10^-10mol.L^-1)分别与50μL单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4混合，4℃过夜反应。将CD24多肽溶解在0.05mol.L^-1碳酸缓冲液(pH9.6)中，终质量浓度为10μg.mL^-1，加到96孔板中，每孔100μL，4℃包被15h。5％脱脂奶粉封闭2h。分别加入过夜反应的反应液，37℃孵育90min，PBST和PBS分别洗3次。加入1∶5000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体。TMB显色液显色，每孔加入1mol·L^-1H₂SO₄50μL终止反应，采用双波长法于酶标仪上读取数据，各单克隆抗体“A450nm-A630nm”值。抗原初始浓度为a₀，抗体初始浓度为b₀，A₀和A_i分别为初始抗体和结合抗原的抗体的吸收度值。B＝(A₀-A_i)/A₀，B为抗体结合率。K_D＝(1-B)(a₀-b₀B)/B。测出每个反应系统的B值，以B/(1-B)为横坐标，(a₀-b₀*B)为纵坐标作图(图4)，斜率就是亲和力常数K_D。根据线性回归结果，单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4亲和力分别为0.8nM、0.72nM、0.84nM、0.82nM、0.76nM。

实施例3杂交瘤细胞株G7、A7、E4、G5、B4重轻链可变区基因的克隆

1.抗CD24单抗重轻链可变区基因提取、扩增及初步鉴定

1)提取总RNA

收集对数期杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(购自生工生物)提取总RNA，溶于20～50μL无RNA酶水，-70℃保存。

2)RT-PCR合成eDNA第一链

以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链，试剂盒购自生工生物公司，反应按产品说明书进行。

3)PCR扩增轻重链可变区基因

聚合酶为PrimerSTAR高保真聚合酶。所用引物为文献中根据杂交瘤细胞株抗体轻重链可变区上游及下游基因序列所设计的简并引物，其中轻链VL F(上游引物)和VL B(下游引物)以及重链VH F1、VH F2和VHB两对引物序列为：

VL F：gg gag ctc gay att gtg mts acm car wct mca；

VL B：ggt gca tgc gga tac agt tgg tgc agc atc；

VH F1：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tc

VH F2：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tcw gg

VH B：gga aga tct ata gac aga tgg ggg tgt cgt ttt ggc

(简并密码子说明：r＝a，g；y＝c，t；m＝a，c；s＝c，g；w＝a，t)

反应体积50μl，反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃1min，72℃1min，循环30次；72℃10min。取5μL终产物在100g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。图3显示，PCR扩增获得380bp左右重轻链基因。用胶回收试剂盒(购自生工生物)对PCR产物进行纯化。

4)胶回收DNA产物3′端加腺嘌呤(A)

取1μl(5U/μl)rTaq酶，4μl dNTP，5μl10×PCR buffer和40μl纯化电泳产物，反应条件为：94℃，10min，70℃作用40min，4℃，10min。

5)PCR产物连接至T载体

取4.5μl PCR产物，0.5μl pMD18-T载体，5μl ligation buffer solution I，16℃连接4h。

6)连接产物的转化与初步鉴定

采用CaCl₂转化法将连接产物转化至感受态DH5α。具体操作如下：

A.将200μl感受态细胞与10μl DNA轻轻混合，冰浴30min。

B.在42℃循环水浴中放置90s，随即将离心管转移至冰浴3min。

C.每管加入1ml无抗性的LB培养基，37℃孵育1h。

D.离心4000rpm，10min，并重悬于300μl LB培养基当中。将300μl细菌悬液用已无菌处理的玻璃涂菌棒，均匀涂布于Amp+(100μg/ml)抗性琼脂板上。

E.37℃孵箱培养12h后，观察结果。

F.挑取克隆，加入Amp+(100μg/ml)LB培养基当中振荡过夜。

G.取1μl菌液作为模板，同原PCR步骤进行菌落PCR验证。选取阳性克隆，送由生工生物测序。

2.抗CD24单克隆抗体轻重链可变区基因测序及分析

测序结果显示，成功获得五株杂交瘤细胞株抗体可变区基因。利用IMGT-VQUEST数据库(http：//www.imgt.org/)分析抗CD24单克隆抗体轻重链可变区基因，分析结果表明：A7杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.1～8所示；G7杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.9～16所示；E4杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.17～24所示；G5杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.25～32所示；B4杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ IDNo.33～40所示。

Claims

1.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ ID No.1和5所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.2～4和SEQ ID No.6～8所示CDR1～3区氨基酸序列。

2.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.1和5所示重链和轻链的氨基酸序列。

3.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ ID No.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.10～12和SEQ ID No.14～16所示CDR1～3区氨基酸序列。

4.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列。

5.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ ID No.17和21所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.18～20和SEQ ID No.22～24所示CDR1～3区氨基酸序列。

6.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.17和21所示重链和轻链的氨基酸序列。

7.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ ID No.25和29所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.26～28和SEQ ID No.30～32所示CDR1～3区氨基酸序列。

8.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.25和29所示重链和轻链的氨基酸序列。

9.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ ID No.33和37所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.34～36和SEQ ID No.38～40所示CDR1～3区氨基酸序列。

10.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.33和37所示重链和轻链的氨基酸序列。

11.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链可变区序列与权利要求书1、3、5、7和9所述的任一可变区序列是一致的；该基因工程抗体包括但不限于：人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)；或者是人源化抗体(humanized antibody,HAb)；或者是抗体的功能性片段Fab(Fragment of antigen binding，Fab)；或者是单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。

12.一种抗体偶联物，其特征在于，将权利要求1～11中所述任意一项单克隆抗体或者基因工程抗体作为靶向部分，与放射性核素或化学药物或毒素偶联。

13.权利要求1～11中所述任意一项单克隆抗体或者基因工程抗体，其特征在于，选择性地与CD24结合或抑制CD24与CD24配体的结合或中和CD24。

14.权利要求1～12中所述单克隆抗体或者基因工程抗体或者抗体偶联物，其特征在于，能够用于制备与CD24表达异常或过量、失控相关疾病的药物。

15.一种抗CD24单克隆抗体制备方法，其特征在于，以CD24核心区多肽(氨基酸序列如SEQ ID No.41所示)与血蓝蛋白KLH偶联物作为抗原。