TW202128765A - 一種雙特異性抗體 - Google Patents
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Abstract
本披露涉及一種雙特異性抗體。具體地,本披露涉及抗CEA/CD3雙特異性抗體及其應用。本披露涉及包含能夠特異性結合CEA和特異性結合CD3的雙特異性抗體,以及包含所述雙特異性抗體的組合物,及其作為藥物的用途。
Description
本申請要求申請日為2019年11月21日的中國專利申請CN201911148796.4的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本披露涉及抗體藥物領域。具體地包括抗CEA/CD3雙特異性抗體藥物以及其應用。
這裡的陳述僅提供與本披露有關的背景信息,而不必然地構成現有技術。
癌胚抗原(CEA,又稱為CEACAM-5或CD66e)是最早被人們發現的腫瘤相關抗原之一,它是一種具有約180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成員,並且含有經由糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨與細胞膜連接的7個域(Thompson J.A.,J Clin Lab Anal.5:344-366,1991)。CEA最初由Gold P和Freedman SO在結腸癌組織提取物中發現並報道(Gold and Freedman 1965;Gold and Freedman1965),隨後報導了利用敏感的放射性免疫分析的方法在結腸癌病人和其他腫瘤病人的血清中檢測到CEA,而在健康人或其他疾病患者血清中CEA的含量極低(Thomson,Krupey et al.1969)。CEA在癌細胞中表達升高,升高的CEA促進細胞間黏著,進而促進細胞的轉移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(增刊8):30-6,2003)。CEA常見表達在上皮組織,包括胃腸、呼吸和泌尿生殖道的細胞,及結腸、宮頸、汗腺和前列腺的細胞(Nap等,Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988;
Nap等,Cancer Res.,52(8):2329-23339,1992)。目前已見WO1999043817A1、WO2004032962A1、WO2005086875A3、WO2012117002A1等專利申請公開了多種抗CEA抗體。
雙特異性T細胞銜接器(BiTE)可以同時針對腫瘤細胞表面抗原和T細胞表面的CD3抗原,利用T免疫細胞重定向達到殺傷腫瘤細胞的作用。這類雙特異性抗體,以Blinatumomab為標誌,經歷了第一代不含Fc的BiTE,第二代含Fc的對稱結構,到目前第三代含Fc的非對稱結構的改造和優化,延長了藥物的半衰期,保證了有效性的同時,也提高了安全性。第三代雙特異性抗體以羅氏的TCB為代表,包括CD20-TCB和CEA-TCB,藉由2:1的差異化設計,提高了腫瘤抗原的親和力,同時控制了CD3的親和力,在臨床前體內藥效模型以及最新的臨床數據中,都表現出顯著的療效,同時CD3的毒副作用也得到了很好的控制。
第三代雙特異性抗體的缺陷和不足主要體現在,鏈的數目較多,不同鏈的表達比例難以控制,同時分子結構複雜,錯配問題嚴重,為下游工藝開發提出了很大挑戰。
本披露提供了一種新的雙特異性抗體。
在一些實施方案中,本披露的雙特異性抗體包含抗CEA抗體部分和抗CD3抗體部分,其中:
該抗CEA抗體部分包括抗CEA抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區:
a)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:7、8和9所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、11和12所示;或者
b)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:13、14和15所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:16、17和18所示;或者
c)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:7、19和9所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、11和12所示。
在一些實施方案中,本披露的雙特異性抗體的抗CD3抗體部分包括抗CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:37、38和39所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:40、41和42所示。
在一些實施方案中,本披露的雙特異性抗體的抗CEA抗體部分包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
(d)該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示,或與SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;和/或
該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示,或與SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;或者
(e)該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:22所示,或與SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;和/或
該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示,或與SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性。
在一些實施方案中,前述(d)或(e)所述具有至少90%序列同一性是指具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
在一些實施方案中,本披露的雙特異性抗體的抗CEA抗體部分包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示;和該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示;或者
該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:22所示;和該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在一些實施方案中,本披露的雙特異性抗體的抗CD3抗體部分或抗CEA抗體部分是scFv結構或Fab片段結構。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體具有IgG-(scFv)2結構或IgG-scFv結構。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中該抗CD3抗體部分包含抗CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
該抗CD3抗體的重鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的重鏈可變區序列相同,和
該抗CD3抗體的輕鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的輕鏈可變區序列相同。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的抗CD3抗體部分包含CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
該抗CD3抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO:52所示,和該抗CD3抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO:51所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的CEA抗體部分為IgG型抗體,其中該IgG型抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的CEA抗體部分為IgG型抗體,其中該IgG型抗體包含兩條序列不完全相同的重鏈和兩條序列完全相同輕鏈。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的CEA抗體部分為IgG型抗體,其中該IgG型抗體包含兩條序列完全相同重鏈和兩條序列完全相同輕鏈。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的抗CEA抗體部分為IgG抗體,該IgG抗體包含抗體輕鏈和抗體重鏈,其中,
(f)該重鏈包括第一重鏈和第二重鏈,該第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:28和29所示,或分別與SEQ ID NO:28和29所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和
該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(g)該重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示,或與SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和
該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(h)該重鏈包括第一重鏈和第二重鏈,該第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:32和33所示,或分別與SEQ ID NO:32和33所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和
該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或者
(i)該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示,或與SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和
該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
在一些實施方案中,前述(f)至(i)所述具有至少80%序列同一性是指具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的抗CEA抗體部分為IgG抗體,其中:
(f-2)該抗CEA抗體包含兩條序列不同的重鏈和兩條序列相同的輕鏈,其中第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:28和29所示,或分別與SEQ ID NO:28和29所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(g-2)該抗CEA抗體包含兩條序列相同的重鏈和兩條序列相同的輕鏈,其中該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示,或與SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(h-2)該抗CEA抗體包含兩條序列不同的重鏈和兩條序列相同的輕鏈,其中第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列如分別SEQ ID NO:32和33所示,或分別與SEQ ID NO:32和33所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(i-2)該抗CEA抗體包含兩條序列相同的重鏈和兩條序列相同的輕鏈,其中該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示,或與SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體的該抗CEA抗體部分為IgG抗體,該IgG抗體包含抗體輕鏈和抗體重鏈,其中,
(f-1)該重鏈包括第一重鏈和第二重鏈,該第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:28和29所示;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或
(g-1)該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或
(h-1)該重鏈包括第一重鏈和第二重鏈,該第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:32和33所示;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示;或
(i)該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
在一些實施方案中,如前該的雙特異性抗體的抗CD3抗體部分包含CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:
該抗CD3抗體的重鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的重鏈可變區序列相同,和/或
該抗CD3抗體的輕鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的輕鏈可變區序列相同;較佳地,該抗CD3抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:52所示;和/或該抗CD3抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中該抗CD3抗體部分為抗CD3的單鏈抗體,該單鏈抗體的胺基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,該抗CEA抗體重鏈與抗CD3單鏈抗體藉由肽鍵或接頭連接。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體具有IgG-(scFv)2結構。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體鏈1和鏈2,該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);和
該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;較佳地,
(j)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示,或與SEQ ID NO:44所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和
該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或
(k)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示,或與SEQ ID NO:46所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和
該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體包括鏈1和鏈2,
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體包括兩條序列相同的鏈1和兩條序列相同的鏈2,
該鏈1胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示,和該鏈2胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或
該鏈1胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示,和該鏈2胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體具有IgG-scFv結構,該抗CD3單鏈抗體連接於knob重鏈C-末端或者連接於hole重鏈C-末端。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體包括鏈1、鏈2和鏈3,該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(knob)-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc(knob)直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);
該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;和
該鏈3從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(hole);或
該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(hole)-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc(hole)直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);
該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;和
該鏈3從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(knob);較佳地,
(1)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:28所示,或與SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示,或與SEQ ID NO:43所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或者
(m)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:32所示,或與SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:45所示,或與SEQ ID NO:45所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
在一些實施方案中,前述(l)或(m)所述具有至少80%序列同一性是:具有至少80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中包括鏈1、鏈2和鏈3,
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:28所示,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或者
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:32所示,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:45所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
在一些實施方案中,如前所述的雙特異性抗體,其中包括一條鏈1、兩條序列相同的鏈2和一條鏈3,
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:28所示,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或者
該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:32所示,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:45所示,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
本披露還提供一種核酸分子,其編碼如前所述的雙特異性抗體。
在一些實施方案中,如前所述的核酸分子,其包含編碼如前所述的雙特異性抗體的各多肽鏈的序列。
在一些實施方案中,如前所述的核酸分子,其包含編碼選自以下一種或多種多肽鏈的核酸序列:
VH(CEA)-CH1-Fc-scFv(CD3)、VL(CEA)-CL、VH(CEA)-CH1-Fc(knob)-scFv(CD3)、VH(CEA)-CH1-Fc(hole)、VH(CEA)-CH1-Fc(hole)-scFv(CD3)和VH(CEA)-CH1-Fc(knob)。
本披露還提供一種宿主細胞,其包含如前所述的核酸分子。
在一些實施方式中,該宿主細胞為原核細胞(大腸桿菌等)或真核細胞(酵母菌、哺乳動物細胞等),較佳地,該真核細胞為哺乳動物細胞,包括但不限於293細胞、CHO細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞和NS0細胞。其中該哺乳動物細胞不包括直接來源自人的胚胎細胞。
本披露還提供一種醫藥組成物,其含有治療有效量的根據如前所述的雙特異性抗體,或根據如前所述的核酸分子,以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑;較佳地,該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的雙特異性抗體或醫藥組成物單位劑量中含雙特異性抗體的量為0.1-3000mg,更佳為1-1000mg。
本披露還提供一種治療與CEA陽性細胞相關的疾病的方法,該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,或如前所述的醫藥組成物,其中該疾病較佳為CEA陽性腫瘤或癌症;更佳的,該疾病選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌。
本披露還提供如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,或如前所述的醫藥組成物在製備治療與CEA陽性細胞相關的疾病的藥物中的用途,更佳的,該疾病選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、
胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌。
本披露還提供如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,或如前所述的醫藥組成物用作藥物,較佳地,該藥物用於治療與CEA陽性細胞相關的疾病,該疾病選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌。
本披露還提供如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,或如前所述的醫藥組成物在製備治療癌症的藥物中的用途;較佳的,其中該癌症選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌;更佳地,其中該癌症為CEA陽性癌症。
本披露還提供一種治療癌症的方法,該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,如前所述的醫藥組成物;較佳地,其中該的癌症選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌;更佳地,其中該癌症為CEA陽性癌症。
本披露還提供如前所述的雙特異性抗體,或如前所述的核酸分子,或如前所述的醫藥組成物用作治療癌症的藥物,較佳地,該癌症選自:黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌;更佳地,其中該癌症為CEA陽性癌症。
圖1顯示流式細胞術檢測雙特異性抗體與粒細胞的結合。
圖2A顯示hu63-18T,hu67-19B和hu67-18T在CEA陽性細胞LS174T存在的情況下,均能有效激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系;圖2B顯示在CEA陰性腫瘤細胞系HCT116存在時,各雙特異性抗體均不能激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系;圖2C顯示在無腫瘤細胞系存在時,各雙特異性抗體均不能激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系。
圖3顯示雙特異性抗體在人PBMC重建的小鼠LS174T模型中的抗腫瘤療效。
術語(定義)
為了更容易理解本披露,以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義,本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本披露所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
說明書和權利要求書中所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指代,除非上下文清楚表明並非如此。
除非上下文另外清楚要求,否則在整個說明書和申請專利範圍中,應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義,而不是排他性或窮舉性意義;也即,“包括但不僅限於”的意義。
術語“和/或”,例如“X和/或Y”應當理解為意指“X和Y”或“X或Y”並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。
本披露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“雙特異性抗體”指能夠對兩個目標抗原或目標抗原表位特異性結合的,包含抗體或抗體的抗原結合片段(如單鏈抗體)的蛋白分子。在能夠結合CEA和CD3兩個靶點的雙特異性抗體中,包含能夠抗CEA的抗體部分和能夠抗CD3的抗體部分。所稱“抗體部分”既可以是能夠特異性結合CEA或CD3的全長抗體或全長IgG抗體,也可以是能夠特異性結合CEA或CD3的全長抗體或全長IgG抗體的抗原結合片段。在一些實施方案中,本披露所述的雙特異性抗體具有IgG-(scFv)2的結構。在一些實施方案中,其中該雙特異性抗體包含兩條序列相同的鏈1和兩條序列相同的鏈2。在一些實施方案中,本披露所述的雙特異性抗體具有IgG-scFv的結構。在一些實施方案中,其中該雙特異性抗體包含4條鏈,其包括一條鏈1、兩條序列相同的鏈2和一條鏈3。
術語針對抗原的“結合區”或“結合區域”是指在多特異性蛋白分子或在抗體分子中,能夠與抗原特異性結合的區域或部分(part),抗原結合區可以是能直接與抗原結合的配體結合結構域部分,也可以是能直接與抗原結合的包含抗體可變區的結構域。
本披露所述的“抗體”指免疫球蛋白,天然的抗體通常是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,
其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(Fv區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區和4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本披露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體和人源化抗體。本披露抗體除包括全長抗體外,還包括能結合抗原的抗原結合片段。
術語“鼠源抗體”在本披露中為根據本領域知識和技能製備的來源於鼠的針對人CEA(或其表位)的單株抗體。製備時用CEA抗原(或其表位)注射試驗對象,然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本披露一個較佳的實施方案中,該鼠源抗CEA抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”,是將第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體,可以減輕異源性抗體誘發的免疫應答反應。例如,建立嵌合抗體,要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤,然後
從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因,再根據需要選殖人抗體的恆定區基因,將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中,最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本披露一個較佳的實施方案中,該CEA嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該的CEA嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區,較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區,或者引入胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變,和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”,也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody),是指將非人物種的CDR序列移植到人的抗體可變區框架,即在不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分,從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得),以及在Kabat,E.A.等人,1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變,以保持活性。本披露的人源化抗體也包括進一步由酵母菌展示對CDR進行親和力成熟突變後的人源化抗體。
由於抗原的接觸殘基,CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可能是體細胞高度突變的結果。因此,可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘
基可藉由檢查動物單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系,那麼可將序列與亞類共有序列或具有高相似性百分數的動物抗體序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果,從而在結合中發揮重要作用。
在本披露一個的實施方案中,該抗體或其抗原結合片段可進一步包含人源或鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區,或進一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區;較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區,或者引入胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變、和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
本披露中所述人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的“常規變體”是指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體,示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體,具體替換如現有技術已知的YTE突變、L234A和/或L235A突變、S228P突變、和/或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合),這些突變已被證實使得抗體具有新的性能,但不改變抗體可變區的功能。
“人抗體”(HuMAb)、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用,可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體,該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。在某些技術中,將人重鏈和輕鏈基因座的元素元件引入到源於胚胎幹細胞系的生物體的細胞株中,這些細胞系中的內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向破壞。轉基因生物可以合成對人抗原特異的人抗體,並且該生物可
以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體,其中重鏈和輕鏈是由源於一個或更多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建,或者由體外活化的B細胞構建,所有的這些都是本領域已知的。
術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用,指基本上完整形式的抗體,與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指輕鏈和重鏈包含恆定區的抗體。本披露“抗體”包含“全長抗體”及其抗原結合片段。
術語“IgG-(scFv)2結構”是指由兩條具有VHa-CH1-Fc-scFvb結構的重鏈和兩條序列相同的VLa-CL結構的輕鏈組裝而成的雙特異性抗體結構,其中VHa和VLa形成結合a抗原或a抗原表位的抗原結合片段,scFvb是結合b抗原或b抗原表位的單鏈抗體。兩條重鏈的Fc序列可以相同也可以不同。
術語“IgG-scFv結構”是指由一條具有VHa-CH1-Fc(knob)-scFvb結構的重鏈(稱knob重鏈)、一條具有VHa-CH1-Fc(hole)結構的重鏈(稱hole重鏈)和兩條序列相同的VLa-CL結構輕鏈組裝而成的雙特異性抗體結構;或者由一條具有VHa-CH1-Fc(knob)結構的重鏈(稱knob重鏈)、一條具有VHa-CH1-Fc(hole)-scFvb結構的重鏈(稱hole重鏈)和兩條序列相同VLa-CL結構的輕鏈組裝而成的雙特異性抗體結構,其中VHa和VLa形成結合a抗原或a抗原表位的抗原結合片段,scFvb是結合b抗原或b抗原表位的單鏈抗體。
在一些實施方案中,本披露的全長抗體包括輕鏈可變區與輕鏈恆定區連接的輕鏈,和重鏈可變區與重鏈恆定區連接的重鏈所形成的全長抗體。本
領域技術人員可以根據實際需要選擇不同的抗體來源的輕鏈恆定區、重鏈恆定區,例如人抗體來源的輕鏈恆定區和重鏈恆定區。
術語抗體的“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如,CEA)或其表位的能力的一個或更多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段,其是由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段;(ii)F(ab')2片段,其是包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段;(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段;(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段;(v)dsFv,其是由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的穩定的抗原結合片段;(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼,但可使用重組方法,藉由合成的接頭連接它們,從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見,例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段,並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體,例如,IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
Fab是藉由用酶處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量的片段,並具有抗原結合活性的抗體片段,其中重鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
F(ab')2是藉由用酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下游部分而獲得的片段,分子量為約100,000,並具有抗原結合活性,包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2中的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的片段,具有抗原結合活性。本披露的Fab'可以藉由用還原劑處理本披露的F(ab')2來生產。
此外,可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中,並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域;VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域;VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構:NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成,例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用於本披露的其他接頭由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immuno l.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。
雙抗體是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中,兩個抗原可以是相同或不同的。
雙特異性抗體和多特異性抗體是指能同時結合兩個或多個抗原或抗原決定簇的抗體,其中包含能結合CEA和CD3的scFv或Fab片段。
dsFv例如可以藉由以下方式獲得:將VH和VL中的一個胺基酸殘基取代為半胱胺酸殘基,藉由半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵而獲得的片段。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較于原蛋白質或多肽,變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變,包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個、2個、3個或更多個胺基酸的插入、缺失或替換。
術語“抗體框架”或“FR區”,是指可變結構域VL或VH的一部分,其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講,其是不具有CDR的可變結構域。
術語“互補決定區”、“CDR”或“高變區”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常,每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3),每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界,包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)、“Chothia”編號規則(Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規
則(Lefranc,M.P.等,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)等。例如,對於經典格式,遵循Kabat規則,該重鏈可變結構域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3);輕鏈可變結構域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則,VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3);並且VL中的胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循IMGT規則,VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3),VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)。遵循IMGT規則,抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗體所特異性結合的部位(例如,CEA分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常,抗體以大約小於10-7M,例如大約小於10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小的親和力(KD)結合。
術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。例如,在本披露中抗體與細胞表面抗原的親和力採用FACS法或Biacore測定KD值。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的,較佳是雙鏈DNA或單鏈mRNA或修飾的mRNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時,核酸是“有效連接的”。例如,如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄,那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
胺基酸序列“同一性”指在比對胺基酸序列時,必要時引入間隙,以達成最大序列同一性百分比,且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分,第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基同一的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的,比對可以藉由屬於本領域技術的範圍內的多種方式來實現,例如使用公開可得到的計算機軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定適用於測量比對的參數,包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
術語“表達載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中,載體是“質粒”,其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中,載體是病毒載體,其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如,具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組,從而隨宿主基因組一起複製(例如,非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法,如冷泉港的抗體實驗技術指南,5-8章和15章。例如,鼠可以用人CEA或其片段免疫,所得到的抗體能被覆性、純化,並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結
合片段同樣可以用常規方法製備。發明該的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或更多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體,從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員,例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、293細胞和NS0細胞。
本披露工程化的雙特異性抗體可用常規方法製備和純化。比如,編碼雙特異性抗體各條鏈的cDNA序列,可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術,哺乳動物類表達系統會導致雙特異性抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人CEA和CD3特異性結合的雙特異性抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如,用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體,用SDS-PAGE檢測抗體片段,收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的
混合物和多聚體,也可以用常規方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑,例如包含本披露的任一種雙特異性抗體的組合物,該受試者具有一種或多種疾病症狀,而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化,例如受試者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本披露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-
Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸,使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉,一般而言,多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁,(第4版))。另外,結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代於下表“示例性胺基酸保守取代”中陳述。
示例性胺基酸保守取代
“有效量”或“有效劑量”指獲得任一種或多種有益的或所需的預防/治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途,有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作,包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用,有益的或所需的結果包括臨床結果,諸如減少各種本披露靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀,減少治療病症所需的其它藥劑的劑量,增強另一種藥劑的療效,和/或延緩患者的本披露靶抗原相關病症的進展。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源;如果兩個序列中的100個位
置有95個匹配或同源,那麼兩個序列為95%同源。通常,當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如,可以藉由BLAST算法執行比較,其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法:BLAST算法(BLAST ALGORITHMS):Altschul,S.F.等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.等人,(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,T.L.等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,J.等人,(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用,並且所有這類名稱都包括後代。因此,單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物,而不考慮傳代數目。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下,其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
“醫藥組成物”表示一種混合物,其含有一種或多種本文所述雙特異性抗體或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物、與其他化學組分的混合物;該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗粘附劑、粘合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。
此外,本披露包括用於治療與目標抗原(例如CEA)陽性細胞相關的疾病的藥劑,該藥劑包含本披露的抗CEA抗體或雙特異性抗體作為活性成分。
本披露中與CEA陽性細胞相關的疾病沒有限制,只要它是與CEA陽性細胞相關的疾病即可,例如利用本披露的分子誘導的治療反應可藉由結合人類CEA,然後阻遏CEA與其受體/配體的結合,或殺傷過表達CEA的腫瘤細胞。因此,當處於適於治療應用的製備物和製劑中時,本披露的雙特異性抗體對這樣一些人是非常有用的,他們患有腫瘤或癌症,較佳黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌、甲狀腺髓樣癌等。
此外,本披露涉及用於免疫檢測或測定目標抗原(例如CEA)的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原(例如CEA)的試劑、用於免疫檢測或測定表達目標抗原(例如CEA)的細胞的方法和用於診斷與目標抗原(例如CEA)陽性細胞相關的疾病的診斷劑,其包含本披露的特異性識別目標抗原(例如人CEA)並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的雙特異性抗體作為活性成分。
在本披露中,用於檢測或測定目標抗原(例如CEA)的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與CEA陽性細胞相關的疾病可以藉由用本披露的雙特異性抗體檢測或測定表達CEA的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞,可以使用已知的免疫檢測方法,並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外,可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本披露中,對用於檢測或測定目標抗原(例如CEA)的活體樣品沒有特別限制,只要它具有包含表達目標抗原(例如CEA)的細胞的可能性即可,例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法,含有本披露的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑,例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
在以上說明書中提出了本披露一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本披露,但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍,本披露的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和權利要求書中,除非上下文中有清楚的另外指明,單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義,本文使用的所有技術
和科學術語都具有本披露所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本披露的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本披露的範圍。
[實施例]
實施例1:CEA重組蛋白和穩定轉染細胞的製備
一、重組CEA抗原及細胞表面表達CEA蛋白的序列
編碼帶Fc、His標簽的人CEA蛋白序列分別克隆到哺乳動物細胞表達載體中,在293E細胞中表達、純化後,獲得重組蛋白,用於後續各實施例的實驗中。同時將不帶標簽的人CEA基因、人CEACAM1基因和猴CEA基因轉染到CHO細胞中,形成在細胞表面表達CEA蛋白的CHO細胞株,用於後續抗體的篩選和鑒定。相關蛋白胺基酸序列如下:
1、人CEA-his(hCEA-His)蛋白序列:
(SEQ ID NO:1)
2、人CEA-Fc(hCEA-Fc)蛋白序列:
(SEQ ID NO:2)
3、猴CEA-His(cynoCEA-His)蛋白序列:
(SEQ ID NO:3)
4、CHO細胞表面表達的人CEA(hCEA-CHO)蛋白序列:
(SEQ ID NO:4)
5、CHO細胞表面表達的猴CEA(cynoCEA-CHO)蛋白序列:
(SEQ ID NO:5)
6、CHO細胞表面表達的人CEACAM1(CEACAM1-CHO)蛋白序列:
(SEQ ID NO:6)
二、相關蛋白的純化
1、帶His標簽蛋白的純化
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質,用PBS緩衝液(pH 7.4)平衡鎳管柱,沖洗2-5倍管柱體積,將上清樣品以一定流速上Ni Sepharose excel管柱。用PBS緩衝液沖洗管柱,至A280讀數降至基線,再用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱,除去非特異結合的雜蛋白,並收集流出液,最後用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白,並收集沖提峰。收集的沖提液濃縮後用脫鹽管柱將樣品緩衝液換成PBS溶液,以備後續實驗使用。
2、含Fc的蛋白、嵌合抗體及融合瘤抗體的純化
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質,含Fc的重組蛋白、嵌合抗體表達上清用Protein A管柱進行純化,融合瘤表達上清用Protein G管柱進行純化。上清液以一定流速上管柱。用PBS沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用pH 3.0的100mM乙酸沖提目的蛋白,用pH 8.0的1M Tris-HCl中和。沖提樣品濃縮換成PBS後分裝備用。
實施例2:小鼠抗人CEA單株抗體的製備
1、免疫和融合
小鼠的免疫使用hCEA-His蛋白和cyno-CEA-His蛋白,或hCEA-CHO細胞和cynoCEA-CHO細胞進行交叉免疫。蛋白免疫的用量為第一次免疫50μg,之後的免疫用25μg,細胞免疫為每次107個細胞/隻,每兩週免疫一次。免疫3次後取血測定血清中抗體的效價,選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合,採用PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×106個/mL的密度用MC半固體完全培養基(含20%FBS、1×HAT、1×OPI和2% Methyl cellulose的RPMI-1640培養基)重新懸浮,分裝於35mm細胞培養皿中,37℃,5%CO2孵育7-9天。融合後第7-9天,根據細胞純株大小,挑取單細胞純株至加有200μL/孔的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)的96孔細胞培養板中,37℃,5%CO2培養3天進行檢測。
2、融合瘤細胞篩選
抗體的初步篩選用基於細胞表面抗原的酶聯免疫吸附分析法(ELISA)進行。將細胞鋪在Elisa板(Corning,Cat# 3599)中,37℃培養箱中培養過夜,待細胞完全貼壁,快要長滿整個孔時,去上清液,用PBS清洗一次,加入細胞固定液
(Beyotime,Cat# P0098),室溫放置45min。去固定液,洗板機洗板3次,加入5%脫脂奶粉,37℃封閉3h以上。去封閉液,洗板機洗板3次。封閉好的細胞板可以置於-20℃保存或直接使用。使用時加入梯度稀釋的融合瘤細胞培養上清液,37℃孵育1h,洗板機洗3遍,加入100μL 10000倍稀釋的Goat anti-mouse IgG H&L(HRP)二抗(Abcam,Cat# ab205719),37℃孵育1h,洗板機洗3遍。加入100μL TMB(KPL,Cat# 5120-0077)置於37℃顯色10min,加入100μL 1M硫酸終止反應,用酶標儀讀取450nm的吸光值。測試抗體與細胞表面的CEA結合而不會被可溶性CEA(sCEA)競爭掉時,將抗體與sCEA孵育30min後再加入細胞板中。
將篩選出的陽性純株進行擴增凍存保種和二到三次亞選殖直至獲得單細胞純株。選擇出的融合瘤選殖用無血清細胞培養法進一步製備和純化抗體。得到的融合瘤抗體用流式細胞儀檢測抗體與細胞表面CEA蛋白的結合情況(方法見本披露測試例1),挑選出結合活性好的融合瘤細胞株。其中,單株融合瘤細胞株mAb63和mAb67的結合活性檢測結果見表1。
3、融合瘤抗體序列測定
選擇單株融合瘤細胞株mAb63和mAb67,克隆單株抗體的序列。過程如下:收集對數生長期融合瘤細胞,用Trizol(Invitrogen,Cat# 15596-018)提取RNA,反轉錄為cDNA。用cDNA為模板進行PCR擴增後送測序公司測序,得到的DNA序列對應的抗體胺基酸序列如下表2所示。
實施例3:鼠源抗人CEA單株抗體的人源化
藉由常規抗體人源化改造方法製備人源化抗體,獲得mAb63和mAb67的人源化抗體。此外,在mAb63人源化抗體的HCDR2中引入一個胺基酸突變,
突變後的HCDR2的序列為:DIFPK S GNTDYNRKFKD(SEQ ID NO:19,劃線的胺基酸為突變後的胺基酸),HCDR2中單個胺基酸的突變並不會影響mAb63人源化抗體的活性。人源化獲得的輕重鏈可變區序列分別如下表3所示:
5、人源化抗體的製備
分別構建抗體輕鏈和重鏈的表達載體,將人源化的抗體輕/重鏈分別交叉配對組合,轉染293E細胞後,收集培養上清純化即得到人源化的全長抗體。人源化抗體重鏈恆定區可選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其變體的恆定區。示例性的,使用下列人重鏈IgG1恆定區變體1(如SEQ ID NO:24所示)或使用下列分別具有knob和hole結構的人IgG1重鏈恆定區knob變體(如SEQ ID NO:25所
示)和人IgG1重鏈恆定區hole變體(如SEQ ID NO:26所示)與前述人源化重鏈可變區連接形成抗體全長重鏈;人源化抗體輕鏈恆定區可選自選自人源κ、λ鏈或其變體的恆定區。示例性的,使用人輕鏈恆定區κ鏈(如SEQ ID NO:27所示)與前述人源化輕鏈可變區連接形成抗體全長輕鏈。
示例性的抗體的恆定區變體序列如下:
人IgG1重鏈恆定區變體1:(SEQ ID NO:24)
人IgG1重鏈恆定區knob變體:(SEQ ID NO:25)
人IgG1重鏈恆定區hole變體:(SEQ ID NO:26)
人輕鏈恆定區κ鏈:(SEQ ID NO:27)
將不同人源化抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區分別與不同類型人輕鏈恆定區和人重鏈恆定區連接後形成的人源化抗體輕鏈和重鏈。抗CEA抗體序列以及CD3單鏈抗體序列如下表4所示。
實施例4、雙特異性抗體的構建
將CEA特異抗體hu67-18、hu63-18、hu67-19或hu63-19與CD3特異抗體(CD3 scFv),藉由搭橋PCR,構建成IgG-(scFv)1或IgG-(scFv)2的形式,所形成雙特異性抗體具體的分子(hu63-18T、hu67-18T、hu63-19B、hu67-19B)及序列如下:
hu63-18T:
hu63-18T鏈1:(SEQ ID NO:28)
hu63-18T鏈2:(SEQ ID NO:31)
hu63-18T鏈3:(SEQ ID NO:43)
hu63-19B
hu63-19B鏈1:(SEQ ID NO:44)
hu63-19B鏈2:(SEQ ID NO:31)
hu67-18T
hu67-18T鏈1(SEQ ID NO:32)
hu67-18T鏈2(SEQ ID NO:35)
hu67-18T鏈3(SEQ ID NO:45)
hu67-19B:
hu67-19B鏈1(SEQ ID NO:46)
hu67-19B鏈2(SEQ ID NO:35)
陽性對照分子的胺基酸序列如下:
RG7802(來源自專利申請WO2017055389)
>RG7802鏈1(SEQ ID NO:47)
>RG7802鏈2(SEQ ID NO:48)
>RG7802鏈3(SEQ ID NO:49)
>RG7802鏈4(SEQ ID NO:50)
測試例
測試例1、BIAcore檢測雙特異性抗體對CEA和CD3的親和力實驗
用偶聯有抗人Fc抗體的CM5生物傳感芯片親和捕獲IgG,然後於芯片表面流經抗原,用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後,用3M MgCl2將生物傳感芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1:1 Model。
測試例2、細胞水平抗體結合能力測定
採用FACS的方法對雙特異性抗體與細胞表面抗原結合能力進行檢測。對細胞表面抗原CD3和CEA的結合,分別用Jurkat細胞(ATCC,PTS-TIB-152)和HPAFII細胞(ATCC,CRL-1997)進行檢測。
在96孔U型底板(康寧,3795)中加入FACS緩衝液(98% PBS,2% FBS)重新懸浮的細胞(2×106細胞/mL,90μL),並加入10μL梯度稀釋的抗體,4℃孵育1h,FACS緩衝液清洗2次,隨後每孔加入APC抗人-IgG Fc抗體(biolegend,Cat# 409306,1:200稀釋),4℃孵育30分鐘,清洗2次後用FACS緩衝液重新懸浮細胞,最後用FACS CantoII(BD)讀取螢光信號值。
與Jurkat細胞結合
hu67-18T和hu63-18T與Jurkat細胞的結合最弱,EC50分別為225和275.5nM,hu67-19B由於有兩個CD3結合結構域,與Jurkat的結合能力最強,EC50為15.1nM。
與HAPFII細胞結合
hu67-18T、hu67-19B和hu63-18T與HPAFII細胞的結合能力類似,EC50分別為3.25、4.92和3.52nM。
測試例3、雙特異性抗體與粒細胞(granulocyte)結合情況測試
據報道,粒細胞表面有內源CEACAM1,CEACAM6,CEACAM8的表達,因此可以藉由檢測抗體是否與粒細胞結合,來判斷抗體是否與CEACAM其他家族成員CEACAM1,CEACAM6和CEACAM8具有交叉結合活性。
採集新鮮人外周血後,根據Ficoll Paque Premium 1.084的說明分離粒細胞,進行密度梯度離心,離心完成後可觀察到分層,用吸管分別吸取位於中間層的PBMC和分佈於底部紅細胞上方的粒細胞至50mL離心管中,加入紅細胞裂解液,室溫放置10分鐘,離心丟棄上清,得到粒細胞。用FACS緩衝液((PBS+2%FBS)洗1次,計數後在96孔U底板中加入106細胞/孔。將梯度稀釋的抗體加入粒細胞中,置於4℃孵育1小時。用FACS緩衝液洗2次,加入二抗(PE抗人-IgG Fc抗體,Cat#409304,Bio Legend)4℃孵育半小時後,在FACS CantoII上進行流式檢測讀取螢光信號值。
結果顯示(見圖1),hu63-18T,hu67-18T,hu67-19B和陰性對照抗體一樣,在3個不同濃度條件下,均不與粒細胞結合,而對照抗體A5B7-IgG1(其中抗體A5B7的抗原結合部分序列源自WO2007071422)與粒細胞有結合,且呈現
濃度依賴效應。在同次實驗中,抗-CEACAM1(APC抗-CD66a抗體,Cat#10822-MM02-A,Sino Biological Inc),抗-CEACAM6(CE ACAM6/CD66c抗體(PE),Cat#10823-R408-P,Sino Biological In)和抗-CEACAM8(CE ACAM8/CD66b抗體(APC),Cat#11729-MM04-A,Sino Biological In)的抗體與粒細胞結合均呈現明顯的陽性信號,說明粒細胞表面確實有CEACAM1,CEACAM6和CEACAM8的表達。
測試例4、體外PBMC殺傷實驗
雙特異性抗體介導的PBMC對腫瘤細胞的殺傷實驗藉由定量檢測調亡信號Caspase3/7的活性來評定。
將腫瘤細胞以3×105個細胞/mL,100μL/孔的密度鋪在白色透明底96孔板中,並留出只加培養基不加細胞的空白對照孔,放置於37℃,5%CO2培養箱培養20~24h。第二天,抽取新鮮人外周血100mL,並根據Ficoll Paque Premium 1.077的使用說明書使用密度梯度離心的方法分離PBMC,用RPMI1640+10%FBS完全培養基重新懸浮PBMC,計數後調整密度至1×106個細胞/mL。將前一天的腫瘤細胞板取出,每孔取出95μL培養基,接著加入90μL/孔的PBMC細胞懸液。隨後向90μL的細胞懸液中加入濃度梯度稀釋的抗體10μL,將抗體樣品濃度為0的對照孔作為陰性對照孔,並留有只加培養基不加抗體的空白對照孔,以及加入200nM RG7802的陽性對照孔,置於37℃,5% CO2培養箱中培養48h。第四天,取出細胞培養板,置於室溫放置5~10分鐘,用Multidrop自動分液器向每孔中加入50μL的Caspase-Glo 3/7試劑,使用酶標儀讀取化學發光信號值。用Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。
對於CEA結合位點(CEA binding site)大於15000的腫瘤細胞
(MKN45,HPAFII,LS174T和KatoIII)採用以下公式,計算各個分子的殺傷活性,將對應96孔板的200nM RG7802定義為100%:%200nM RG7802細胞裂解=(信號樣品孔-信號陰性對照孔)/(信號200nM RG7802-信號陰性對照孔)。
對於CEA結合位點小於15000或CEA陰性的腫瘤細胞(HCC1954,HT29和HCT116),將陰性對照孔的讀值定義為0%,%裂解=(信號樣品孔-信號陰性對照孔)/信號陰性對照孔-信號空白對照孔)。
細胞來源如下:MKN45細胞(南京科佰生物科技有限公司,Cat# CBP60488)、HPAFII(ATCC,CRL-1997)、LS174T(ATCC,CL-188)、KatoIII(ATCC,HTB-103)、HCT116(ATCC,CCL-247)。
對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷活性
選用了多種CEA陽性和CEA陰性的腫瘤細胞系,並分別檢測雙特異性抗體介導的PBMC對這些腫瘤細胞的殺傷活性。結果顯示,hu67-18T、hu67-19B和hu63-18T對CEA陽性的腫瘤細胞系均顯示出明顯的殺傷活性,而對CEA陰性的腫瘤細胞系不具有殺傷活性。陰性對照抗體(hu67-19B中抗-CEA抗體的序列被替換成抗-螢光素酶的抗體序列)則對所有細胞系均無殺傷活性,說明hu67-18T、hu67-19B和hu63-18T所表現的殺傷活性是CEA靶點介導的。
測試例5、體外T細胞激活實驗──對Jurkat細胞系的激活
雙特異性抗體對Jurkat重組細胞系激活,是檢測Jurkat細胞表面CD3被激活後NFAT驅動的螢光素酶報告基因(螢光素酶)的表達。
接種腫瘤細胞系LS174T(CEA陽性)和HCT116(CEA陽性)在白色透明底96孔板中,3×105細胞/mL,100μL/孔,放置於37℃,5%CO2培養箱培養20~24h。次日移除腫瘤細胞培養上清後,加入Jurkat-LuciaTM NFAT細胞(invivogen,rep-qlcg5)細胞懸液(6×105細胞/mL,75μL/孔),以及梯度稀釋的抗體(25μL/孔),並設有抗體濃度為0的陰性對照孔和空白對照孔(只有培養基,沒有細胞或抗體)。對於不加腫瘤細胞的Jurkat細胞激活實驗,則是第二天直接向空白96孔板中加入Jurkat細胞懸液和梯度稀釋抗體。細胞置於37℃,5%CO2培養箱培養5-6h。共培養結束後,取出細胞培養板,置於室溫放置5~10分鐘,每孔中加入50μL的Quanti-Luc Gold Detection Reagent(Invivogen,rep-qlcg5),使用多功能酶標儀讀取化學發光信號值。
結果顯示,hu63-18T,hu67-19B和hu67-18T在CEA陽性細胞LS174T存在的情況下,均能有效激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系,而陰性對照抗體則不能激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系(見圖2A)。在CEA陰性腫瘤細胞系HCT116或無腫瘤細胞系存在時,各雙特異性抗體均不能激活Jurkat-LuciaTM NFAT細胞系,和陰性對照抗體類似(見圖2B和圖2C)。說明hu63-18T,hu67-19B和hu67-18T對Jurkat細胞的激活是CEA靶點特異的,且非CEA靶點特異的Jurkat細胞激活的程度非常低,預示著雙特異性抗體分子良好的安全性。
測試例6、人PBMC重建的小鼠LS174T模型的藥效實驗
本測試例利用人PBMC重建的NDG小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)LS174T模型(ATCC,CL-188)來評價本發明測試的CD3-CEA雙特異性抗體在小鼠體內的抗腫瘤療效。
將LS174T細胞(5×106細胞/小鼠/100μL)在體外與新鮮抽取的PBMC混合後接種於NDG小鼠右肋部皮下,當荷瘤小鼠腫瘤體積達到80-100mm3左右時將小鼠隨機分組,每組7-8隻,將分組當天定義為該實驗第0天(Day0),並於第1天、第5天和第8天腹腔注射各抗體,共給藥3次,每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。
hu63-18T(圖3)的體內抑瘤效果呈現劑量依賴效應,在第15天時0.44mpk劑量下的抑瘤率為67.65%(p<0.001),2.19mpk劑量組的腫瘤平均體積小於分組時的體積,抑瘤率大於100%(p<0.001),8只小鼠中有6隻小鼠的腫瘤完全消退。觀察至第21天時,2.19mpk劑量組中已消退的腫瘤仍然沒有復發跡象。
hu67-19B(圖3)的體內抑瘤效果呈現劑量依賴效應,在第15天時0.1mpk和0.5mpk劑量下的抑瘤率分別為48.45%(p<0.01)和98.36%(p<0.001)。
hu67-18T(圖3)的體內抑瘤效果呈現劑量依賴效應,在第15天時0.44mpk和2.19mpk劑量下的抑瘤率分別為68.34%(p<0.001)和98.61%(p<0.001)【0171】做為陽性對照,在第15天時,RG7802在0.5mpk和2.5mpk劑量下的抑瘤率分別為11.12%和59.38%(p<0.001)。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)
上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTIV\CAL CO.,LTD.)
<120> 一種雙特異性抗體
<130> 702121CPCT
<150> 201911148796.4
<151> 2019-11-21
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 人CEA-his(hCEA-His)蛋白序列
<400> 1
<210> 2
<211> 883
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 人CEA-Fc(hCEA-Fc)蛋白序列
<400> 2
<210> 3
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 猴CEA-His(cynoCEA-His)蛋白序列
<400> 3
<210> 4
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CHO细胞表面表達的人CEA(hCEA-CHO)蛋白序列
<400> 4
<210> 5
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CHO细胞表面表達的猴CEA(cynoCEA-CHO)蛋白序列
<400> 5
<210> 6
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CHO细胞表面表達的人CEACAM1(CEACAM1-CHO)蛋白序列
<400> 6
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 HCDR1
<400> 7
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 HCDR2
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 HCDR3
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 LCDR1
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 LCDR2
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<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<223> mAb63 LCDR3
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<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
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<221> 結構域
<223> mAb67 HCDR1
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<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
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<221> 結構域
<223> mAb67 HCDR2
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<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
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<221> 結構域
<223> mAb67 HCDR3
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<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
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<223> mAb67 LCDR1
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<213> 鼠(Mus musculus)
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<213> 鼠(Mus musculus)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 結構域
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<221> 結構域
<223> 人IgG1重鏈恆定區hole變體
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<221> 結構域
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<221> 鏈
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<223> CD3抗體LCDR2
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<223> CD3抗體LCDR3
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<211> 215
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 鏈
<223> RG7802鏈3
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<210> 50
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> RG7802鏈4
<400> 50
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD3輕鏈可變區
<400> 51
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD3重鏈可變區
<400> 52
Claims (17)
- 一種雙特異性抗體,其包含抗CEA抗體部分和抗CD3抗體部分,該抗CEA抗體部分包括抗CEA抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:a)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:7、8和9所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、11和12所示;或b)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:13、14和15所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:16、17和18所示;或c)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:7、19和9所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、11和12所示。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體,其中該抗CD3抗體部分包括抗CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:37、38和39所示,和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:40、41和42所示。
- 如請求項1或2所述的雙特異性抗體,其中該抗CEA抗體部分包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:d)該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示,或與SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;和/或該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示,或與SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;或e)該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:22所示,或與SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性;和/或該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示,或與SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列有至少90%序列同一性。
- 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性抗體,其中該抗CD3抗體部分包含抗CD3抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:該抗CD3抗體的重鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的重鏈可變區序列相同,和/或該抗CD3抗體的輕鏈可變區與如SEQ ID NO:36所包含的輕鏈可變區序列相同;較佳地,該抗CD3抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:52所示;和/或該抗CD3抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
- 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性抗體,其中該抗CEA抗體部分為IgG型抗體,其中,(f)該抗體包含兩條胺基酸序列不同的重鏈和兩條胺基酸序列相同的輕鏈,其中第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:28和29所示,或分別與SEQ ID NO:28和29所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或(g)該抗體包含兩條胺基酸序列相同的重鏈和兩條胺基酸序列相同的輕鏈,其中該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示,或與SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或(h)該抗體包含兩條胺基酸序列不同的重鏈和兩條胺基酸序列相同的輕鏈,其中第一重鏈和第二重鏈的胺基酸序列如分別SEQ ID NO:32和33所示,或分別與SEQ ID NO:32和33所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或(i)該抗體包含兩條胺基酸序列相同的重鏈和兩條胺基酸序列相同的輕鏈,其中該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示,或與SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;和該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
- 如請求項1至5中任一項所述的雙特異性抗體,其中該抗CD3抗體部分為抗CD3的單鏈抗體,該單鏈抗體的胺基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
- 如請求項6所述的雙特異性抗體,其中該抗CEA抗體重鏈與抗CD3單鏈抗體藉由肽鍵或接頭連接。
- 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體具有IgG-(scFv)2結構或IgG-scFv結構。
- 如請求項8所述的雙特異性抗體,其中具有IgG-(scFv)2結構的雙特異性抗體包含鏈1和鏈2,該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);和該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;較佳地,j)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示,或與SEQ ID NO:44所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或k)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示,或與SEQ ID NO:46所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
- 如請求項8所述的雙特異性抗體,其中具有IgG-scFv結構的雙特異性抗體包含鏈1、鏈2和鏈3,其中:該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(knob)-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc(knob)直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;和該鏈3從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(hole);或該鏈1從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(hole)-scFv(CD3),其中VH(CEA)-CH1-Fc(hole)直接或藉由接頭融合至scFv(CD3);該鏈2從胺基末端到羧基末端包含VL(CEA)-CL;和該鏈3從胺基末端到羧基末端包含VH(CEA)-CH1-Fc(knob);較佳地,l)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:28所示,或與SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示,或與SEQ ID NO:43所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈 2的胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示,或與SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性;或m)該鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO:32所示,或與SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,該鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO:45所示,或與SEQ ID NO:45所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性,和該鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO:35所示,或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列有至少80%序列同一性。
- 一種分離的核酸分子,其編碼如請求項1至10中任一項所述的雙特異性抗體。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項11所述的核酸分子。
- 一種醫藥組成物,其含有治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的雙特異性抗體,或如請求項11所述的核酸分子,以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
- 一種如請求項1至10中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項11所述的核酸分子或如請求項13所述的醫藥組成物在製備治療癌症的藥物中的用途,其中該癌症較佳為CEA陽性癌症。
- 如請求項14所述的用途,其中該癌症選自黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌。
- 一種治療與CEA陽性細胞相關的疾病的方法,該方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的雙特異性抗體、或如 請求項11所述的核酸分子、或如請求項13所述的醫藥組成物,其中該疾病較佳為CEA陽性腫瘤或癌症。
- 如請求項16所述的治療與CEA陽性細胞相關的疾病的方法,其中該CEA陽性細胞相關疾病選自黑色素瘤、腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膽囊癌、食管癌和甲狀腺髓樣癌。
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