CN110606892B - 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用 - Google Patents

一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高亲和力高生物活性的LAG‑3抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种新的抗LAG‑3单克隆抗体。本发明的抗体能够高特异性地结合LAG‑3抗原，具有很高的亲和力和生物活性，以及很低的免疫原性，并且用于制备预防或治疗LAG‑3相关的疾病的药物。

Description

一种高亲和力高生物活性的LAG-3抗体及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及一种高亲和力高生物活性的LAG-3抗体及其应用。
背景技术
淋巴细胞活化基因3(1ymphocyteactivationgene-3，简称LAG-3，也称CD223)蛋白是免疫球蛋白超家族的一员，于1990年由Triebel等人首次发现(J Exp Med,1990,171(5):1393-405)。LAG-3的基因位于人类12号染色体短臂的前端，紧邻CD4基因。LAG-3蛋白为I类跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成。成熟的LAG-3分子包括498个氨基酸，相对分子量约为55kDa。
已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及肿瘤所致的免疫系统功能紊乱中发挥着重要作用。在一些疾病中，LAG-3表达会升高，并因而出现相应的免疫抑制。Gandhi等发现霍奇金淋巴瘤患者血液和肿瘤组织中，淋巴细胞高表达LAG-3；肿瘤组织中特异性CD8+T细胞的功能明显受损，如果去除LAG-3阳性的T细胞，其抗肿瘤功能可以恢复，细胞因子分泌增加。据此推测，LAG-3的表达与特异性T细胞的免疫负调节功能相关，抑制LAG-3分子功能可以增强T细胞的抗肿瘤作用，该分子有可能是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点(Blood，2006,108(7)2280-9)。目前有多家跨国制药公司如BMS公司和Novartis公司在研发针对LAG-3的单克隆抗体。
因此，鉴于LAG-3在各类相关疾病中作用和功能，本领域仍然需要开发适于治疗患者的改善的抗LAG-3特异性抗体。
发明内容
本发明目的是提供了一种高亲和力高生物活性的LAG-3抗体及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:3所示的CDR1，
SEQ ID NO.:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:5所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留LAG-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:6所示的CDR1’，
氨基酸序列为LVS的CDR2’，和
SEQ ID NO.:7所示的CDR3’。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留LAG-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:9所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如权本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述抗体对人LAG-3蛋白(优选野生型)的亲和力的EC50为40-80ng/ml。
在另一优选例中，所述抗体对人LAG-3蛋白(优选野生型)的亲和力的EC50为63.3ng/ml。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1或8所示；和/或所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:2或9所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的(单克隆抗体)抗原结合区域的scFV段为特异性结合于LAG-3的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗LAG-3相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述LAG-3相关疾病选自下组：肿瘤、炎症反应性疾病、或其组合。
在另一优选例中，所述药物或制剂为LAG-3抑制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤为高表达LAG-3的肿瘤。
在另一优选例中，所述药物或制剂用于制备预防和/或治疗与LAG-3(表达阳性的)相关的疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断LAG-3相关疾病。
在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中LAG-3蛋白。
在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制LAG-3，优选地下调或阻断LAG-3的免疫抑制作用。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于增强免疫，优选地刺激免疫细胞(如T细胞)的活化、增殖、分泌细胞因子。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于提高对肿瘤的免疫反应，优选地增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为高表达LAG-3的肿瘤。
本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。
本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中LAG-3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在LAG-3蛋白。
本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的免疫偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。
本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明的第十九方面，提供了一种LAG-3相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人源化LAG-3抗体与过表达人LAG-3的CHO-K1细胞的结合。
图2显示了人源化LAG-3抗体对人LAG-3抗体与MHC II分子结合的阻断作用。
图3显示了人源化LAG-3抗体对T细胞活性的激活作用。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种具有极其优异的亲和力和特异性的抗LAG-3单克隆抗体，基于该抗体而获得的人源化抗体。本发明抗体能够高特异性地结合LAG-3抗原，其具有很高的亲和力和生物活性，并且显著阻断LAG-3与MHC-II的结合，而对于哺乳动物本身没有可见的毒副作用。本发明抗体通过剌激抗原特异性T细胞应答，增强T细胞的抗肿瘤作用，从而最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。在此基础上完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人LAG-3抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
LAG-3
术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3，所述LAG-3包含变体、同等型(isoform)、同源物、直系同源体(ortholog)及旁系同源体(paralog)。
术语“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如具有Uniprot号P18627的人LAG-3的完整氨基酸序列。本领域中亦已知LAG-3，例如CD223。人LAG-3序列与Uniprot号:P18627的人LAG-3的不同之处可在于具有例如保守突变或在非保守区中的突变，且LAG-3与Uniprot号:P18627的人LAG-3具有实质上相同的生物功能。举例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，该表位被本专利公开的抗体特异性结合，或人LAG-3的生物功能是结合MHC-II分子。特定人LAG-3序列在氨基酸序列中通常与Uniprot号:P18627的人LAG-3至少90％相同，且含有在与其他物种(例如鼠类)的LAG-3氨基酸序列相比时鉴别为人氨基酸序列的氨基酸残基。在某些情形下，人LAG-3在氨基酸序列中可与Uniprot号:P18627的LAG-3至少85％或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％相同。在某些实施方案中，人LAG-3序列较Uniprot号:P18627的LAG-3序列显示不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，人LAG-3可较Uniprot号:P18627LAG-3序列显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。可如本文所阐述的测定百分比同一性。
LAG-3与CD4分子结构上具有较高的相似性，都可与MHC-II(主要组织相容性复合体)分子结合，与CD4分子相比，LAG-3与MHC-II分子的结合更为紧密，从而可以与CD4分子竞争与MHC-II分子的结合(Curr Opin Immunol,2009,21(2):179-86；Eur J Immunol,2003,33(4):970-9)。LAG-3主要表达在活化的T淋巴细胞、NK细胞，B淋巴细胞、Treg细胞以及树突细胞上。
LAG-3与CTLA-4、PD-1一样，是一个负性共剌激分子，可负向调控淋巴细胞功能。体外研究显示，LAG-3可抑制抗原诱导的T淋巴细胞增殖反应，阻断了LAG-3之后，T淋巴细胞的活化和增殖、1型辅助性T细胞(type 1T helper cells,Th1)分泌细胞因子的情况均有所改善；Huang等研究表明，活化的CD4+Treg细胞表面LAG-3水平显著升高，且LAG-3是CD4+Tregs细胞发挥最大免疫抑制作用的必需条件(Immunity，2004,21(4):503-13)。此外，抗LAG-3抗体还可维持CD4+和CD8+T淋巴细胞稳态，阻断LAG-3后CD8+T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力显著增强(J Clin Invest,2007,117(11):3383-92)。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其较链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2、IgG3，IgG4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到竣基端依次排列的顺序序为:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗人LAG-3的单克隆抗体。制备时用LAG-3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源LAG-3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，LAG-3)的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括
(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；
(ii)F(ab’)2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；
(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；
(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。
Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，LAG-3分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于1O-8M、1O-9M或lO-10M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别人LAG-3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人LAG-3的氨基酸序列的抗体。
术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约1O-8M、1O-9M或lO-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合LAG-3，由使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
人LAG-3特异性抗体
本发明提供抗人LAG-3抗体(以下简称LAG-3抗体)。具体地，本发明提供一种针对LAG-3的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。本发明LAG-3抗体通过剌激抗原特异性T细胞应答，增强T细胞的抗肿瘤作用，从而最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。
优选地，重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(VL)氨基酸序列的各自CDR选自下组：
a1)SEQ ID NO.:3；
a2)SEQ ID NO.:4；
a3)SEQ ID NO.:5；
a4)SEQ ID NO.:6；
a5)LVS；
a6)SEQ ID NO.:7；
a7)上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有LAG-3结合亲和力的序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2、或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人LAG-3的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.:3、4和5中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有LAG-3结合亲和力的序列，位于重链可变区(VH)的CDR区。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.:6、氨基酸序列:LVS和SEQ IDNO.:7中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有LAG-3结合亲和力的序列，位于轻链可变区(VL)的CDR区。
在本发明的一种更优选实施例中，VH CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ IDNO.:3、4和5中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有LAG-3结合亲和力的序列；VL CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ ID NO.:6、氨基酸序列:LVS和SEQ ID NO.:7中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有LAG-3结合亲和力的序列。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的LAG-3抗体。例如，可以用连接或天然存在的LAG-3蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的LAG-3都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对LAG-3特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。
生产本发明的LAG-3抗体的示例性方法描述于实施例1。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
人源化本发明LAG-3抗体的示例性方法描述于实施例4。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合LAG-3蛋白分子，因而可用于预防和治疗LAG-3相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点
(a)本发明抗体具有优异的生物活性和特异性。
(b)与鼠源抗体和嵌合抗体相比，本发明人源化抗体在保留与LAG-3相当的亲合力的同时，具有更低的免疫原性。
(c)本发明抗体能显著抑制LAG-3与MHC-II受体的结合，其抑制作用优于阳性对照BMS mAb。。
(d)本发明抗体与某些非人哺乳动物(如食蟹猕猴)的LAG-3有与人LAG-3相当的亲和力，便于在动物模型中进行测试和进行质控检测。
(e)本发明抗体通过解除LAG-3对抗原特异性T细胞活性的抑制，能有效激活抗原特异性的T细胞的活性(其作用优于对照抗体BMSmAb)，显著增强T细胞的抗肿瘤作用，从而提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验，通常按常规条件进行，或按照原料/商品制造商建议的条件；未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1抗人LAG-3的小鼠单克隆抗体的制备方法
1.1制备产生鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞
制备鼠源单克隆抗体的方法采用Kohler和Milstein 1975年发明的杂交瘤制备技术。具体步骤简述如下：首先将人LAG-3-Fc蛋白(重组人LAG-3-Fc(Recombinant HumanLAG-3-Fc)，Sino Biological，#16498-H05H)与弗氏佐剂乳化，然后对五只BALB/c小鼠进行多点皮下免疫。三轮免疫后取血清用ELISA法检测效价，滴度达到预定标准后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。经过HAT筛选杂交瘤多克隆细胞，采用ELISA方法，筛选出特异性结合人LAG-3的多克隆细胞株。后进行单克隆化，再次使用ELISA方法筛选特异性结合的单克隆细胞株。将筛选出的单克隆用流式细胞术进行筛选，最终得到表达人LAG-3抗体的单克隆细胞75J19及其他(未列出)。
1.2间接ELSIA——杂交瘤细胞的筛选方法
选择间接ELSIA方法，筛选得到高特异性结合的小鼠杂交瘤细胞。
实验材料：
重组人LAG-3-Fc，Sino Biological#16498-H05H
实验方法：
将重组人LAG-3-Fc用CBS配制成1μg/ml包被液，加入酶标板，2～8℃包被12小时以上，弃去包板残液，加入3％牛奶，每孔200μL，室温封闭1小时。每孔加入不少于200μL的PBST洗1次，将杂交瘤上清稀释至100μg/ml，再10倍稀释10个梯度，100μL/孔加入酶标板。室温孵育1小时，每孔加不少于200μL的PBST，洗涤4次后加入3％牛奶-PBST稀释10000倍的HRP偶联的羊抗鼠IgG Fc(购自Jackson公司)，100μL/孔加样。室温孵育1小时后，每孔加不少于200μL的PBST，洗涤6次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2M H2SO4终止反应，50μL/孔。将中止反应的酶标板置酶标仪上，读取450nm波长读取吸光度OD450值。
实验结果：
表1.杂交瘤单克隆上清对人LAG-3蛋白结合活性
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由表1可以看出，在众多杂交瘤中，杂交瘤75J19(或其产生的抗体)与人LAG-3蛋白结合活性最高。
实施例2抗人LAG-3抗体V-基因序列克隆
抗体可变区基因扩增采用5’RACE技术。简言之，用SMART 5’RACE合成试剂盒(TAKARA，#634859)按厂商说明制备重链和轻链的基因特异性cDNA，然后扩增相应PCR。后将PCR产物克隆到载体pEASY-Blunt Simple质粒(北京全式金，#CB111-02)中，并转化到Stellar大肠杆菌感受态细胞(TAKARA，#636763)中。通过用通用的M13正向或反向引物的菌落PCR筛选克隆，从每个反应选择6-8个克隆用于DNA测序分析。测序结果显示75J19表达的抗LAG-3抗体V区序列如下：
75J19-VH SEQ ID NO.:1
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGHTFTDYYMNWVKQSHAESLEWIGDINPNNGDTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGGGPSVVEGDFWGQGTTLTVSS
75J19-VL SEQ ID NO.:2
DVVMTQTPPTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYTDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQSTHFPFTFGSGTKLEIK
其中，下划线区为CDRs(IMGT定义，单列如下表2)：
表2.鼠源抗LAG-3抗体CDR序列
实施例3嵌合抗体的构建和表达
3.1嵌合抗体的制备
将PCR克隆的小鼠75J19VH和VL区cDNA分别与人IgG1和K链恒定区连接，构建嵌合重链和轻链表达序列。用PCR引物修饰小鼠cDNA序列的5’和3’端，所述引物设计成为各链增加合适的前导序列，并增加使得能克隆到现有重组抗体表达载体pHB-Fc上的限制性位点。
蛋白表达所用的宿主细胞是购自ATCC公司的CHO-K1细胞(#CCL-61)。该细胞经过一系列驯化步骤，驯化成可在无血清培养基(EX-CELLTM302)中进行悬浮培养的CHO-K1细胞。通过电转的方法，将构建好的轻链和重链重组表达质粒转入CHO-K1细胞。放入培养箱中培养3-5天。用间接ELISA测量来自CHO-K1转染上清的抗体浓度。结果显示转染的CHO-K1细胞分泌约30mg/L的嵌合抗体。
3.2间接ELSIA方法检测嵌合抗体结合特征
选择间接ELSIA方法，分析本发明实施例3.1中嵌合抗体(称为Chi75J19，下同)的结合特征，确保选择的抗体识别人LAG3构象型表位。
方法：CBS将重组人LAG-3稀释制得1μg/ml包被液，50Μl/孔，加入酶标板，2～8℃包被12小时以上；弃去包板残液，加入3％牛奶，200μL/孔，室温封闭1小时；PBST洗涤1次，200μL/孔；Chi75J19稀释至100μg/ml，再5倍稀释10个梯度，100μL/孔加入酶标板，室温孵育1小时；然后PBST洗涤4次，200μL/孔；加入3％牛奶-PBST稀释25000倍的GOXHU Fc HRPAFFINITY，100μL/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤6次，200μL/孔，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，室温反应5分钟，然后加2M H2SO4，50μL/孔，终止反应；酶标仪上读取450nm波长下吸光度OD450值；根据OD450值与Chi75J19浓度关系计算EC50和EC90值。
结果：
表3.嵌合抗体Chi75J19对重组人LAG3结合活性
克隆 EC50(ng/ml) EC90(ng/ml)
Chi75J19 168 2690
结果(表3)证明，嵌合抗体Chi75J19能与重组人LAG-3结合，EC50值低于200ng/ml。
实施例4人源化抗体的制备
抗体的人源化采用以下方法。将抗体的可变区序列与NCBI蛋白质数据库中的可用序列比较，通过鉴定和分析，最终确定了适合在其上构建CDR移植重链和轻链的人构架区。
改造时，根据人抗体FR区保守的氨基酸残基以及抗体FR区中重要的氨基酸残基，设计改造位点，对嵌合抗体的重轻链的可变区分别进行人源化突变设计，利用PCR技术扩增并构建人源化点突变抗体表达质粒。将人源化点突变抗体表达质粒分别经CHO-K1(ATCC，NO.CCL-61)细胞表达，纯化后得到人源化抗体蛋白。利用ELISA，受体结合抑制实验，Biacore和细胞活性检测等，获得了一种性能非常优异的人源化LAG-3单克隆抗体(后文也称为B5D1)。
所获得人源化LAG-3抗体的VH和VL序列分别如SEQ ID NO.:8和9所示：
75J19-HC1-B5SEQ ID NO.:8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHTFTDYYMNWVRQAPAEGLEWMGDINPNNGDTIYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAGGGPSVVEGDFWGQGTTVTVSS
75J19-LC1-D1SEQ ID NO.:9
DVVMTQSPPSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYTDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQSTHFPFTFGQGTKLEIK
作为阳性对照的BMS人源化LAG-3抗体(BMS mAb)根据US20140093511提供的人源化序列进行克隆，并瞬时转染进行表达。
实施例5人源化单克隆抗体的抗体-抗原结合试验
采用ELSIA方法测定人源化LAG-3抗体B5D1与人LAG-3的结合特异性。
方法：CBS将Recombinant human LAG-3稀释制得1μg/ml包被液，50μL/孔加入酶标板，2～8℃包被12小时以上；弃去包板残液，加入3％牛奶-PBST，200μL/孔，室温封闭1小时；PBST洗涤1次，200μL/孔；待检测抗体稀释至100μg/ml，再5倍稀释10个梯度，100μL/孔加入酶标板，室温孵育1小时；PBST洗涤4次，200μL/孔；然后加入3％牛奶-PBST稀释25000倍的GOXHU Fc HRP AFFINITY，100μL/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤6次，200μL/孔，拍干；100μL/孔TMB显色液，室温反应5分钟，再加2M H2SO4，50μL/孔，终止反应；酶标仪上读取450nm波长下吸光度OD450值；根据OD450值与抗体浓度关系计算EC50和EC90值。
结果：
表4.人源化LAG-3单克隆抗体B5D1对重组人LAG3结合活性
抗体 EC50(ng/ml) EC90(ng/ml)
B5D1 63.3 1140
结果(表4)证明，经过人源化改造，本发明人意外地获得了对重组人LAG3结合活性不仅没有下降，反而有进一步提高的人源化抗体B5D1。本发明的人源化单克隆抗体B5D1的EC50及EC90值低，与重组人LAG3的结合活性高。EC50与嵌合抗体相比，提高了约165％(168/63.3-100％＝165％)。
实施例6人源化LAG-3单克隆抗体的不同种属免疫交叉反应
本实施例采用ELSIA方法测定抗LAG-3抗体与不同种属LAG-3的抗原-抗体结合能力。
方法：CBS分别将重组人LAG-3、重组食蟹猕猴(Recombinant Cynomolgus)LAG-3稀释制得1μg/ml包被液，50μL/孔，分别包被酶标板各1块，2～8℃包被12小时以上；弃去包板残液，加入3％牛奶-PBST，200μL/孔，室温封闭1小时；PBST洗涤1次，200μL/孔；B5D1稀释至100μg/ml，再5倍稀释10个梯度，100μL/孔加入酶标板，室温孵育1小时；PBST洗涤4次，200μL/孔；然后加入3％牛奶-PBST稀释25000倍的GOXHU Fc HRP AFFINITY，100μL/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤6次，200μL/孔，拍干；100μL/孔TMB显色液，室温反应5分钟，再加2M H2SO4，50μL/孔，终止反应；酶标仪上读取450nm波长下吸光度OD450值；根据OD450值与B5D1浓度关系计算EC50和EC90值。
结果：
表5.人源化LAG-3单克隆抗体B5D1与重组人LAG3结合结果
抗体 EC50(ng/ml) EC90(ng/ml)
B5D1 63.3 1140
表6.人源化LAG-3单克隆抗体B5D1与重组食蟹猕猴LAG3结合结果
抗体 EC50(ng/ml) EC90(ng/ml)
B5D1 65.1 896.2
从表5-6观察到，本发明的人源化LAG-3单克隆抗体B5D1除与重组人LAG3有结合外，与重组食蟹猕猴LAG3也有结合，为临床动物试验提供便利。
实施例7人源化LAG-3单克隆抗体与人LAG3的亲和力检测
本实施例使用SPR方法测定抗体-抗原结合动力学及亲和力。
方法：按照人抗体捕获试剂盒(Human Antibody Captrue Kit)氨基偶联法准备抗人捕获-CM5(Anti-Human Capture-CM5)芯片。将芯片置室温平衡20～30min，装入Biacore8K仪器；用平衡缓冲液将B5D1稀释至实验工作浓度；抗原用平衡缓冲液稀释至50nM，再3倍稀释度6个浓度梯度，并设置2个零浓度(即平衡缓冲液)和一个重复浓度(一般为最低浓度重复)；按照抗体，抗原，再生的次序，循环往复对10个抗原浓度(2个零浓度，7个梯度浓度及1个重复浓度)进行实验分析，抗原进样流速30μL/分钟，结合时间120秒，解离时间600秒；分析完成后，选用对应的分析程序分析数据，确认无明显参照结合(reference binding)，选用动力学，1:1结合模型(Kinetics，1:1binding modle)，拟合数据，获得B5D1的动力学相关参数Ka，Kd和KD值。
结果：
表7.人源化抗体B5D1与重组人LAG3亲和力检测结果
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
B5D1 1.26E+06 7.65E-04 6.10E-10
与人LAG3的亲和力常数(KD(M))结果(表7)显示，本发明B5D1抗体的亲和力具有很强的亲和力。
实施例8人源化LAG-3单克隆抗体细胞水平结合活性测定
为了检测人源化LAG-3单克隆抗体B5D1与细胞表面的LAG-3蛋白的结合能力，将抗体与细胞膜上过表达人LAG-3的CHO细胞共孵育，用流式细胞仪进行检测。将待检测抗体用流式缓冲液(1×PBS+1％BSA)进行梯度稀释。96孔板中每孔铺2×104个表达人LAG-3的CHO细胞的20μL细胞悬液，加入20μL抗体稀释液，混匀，室温孵育30分钟。用流式缓冲液清洗细胞2次。将二抗R-藻红蛋白亲和纯化山羊抗人(R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human)IgG Fc(Jackson，Cat.#109-115-098)1:200稀释后加入，混匀，室温避光孵育15min。用流式缓冲液清洗细胞3次。加入100μl流式缓冲液混匀，流式检测。
结果如表8和图1所示。结果显示，本发明B5D1抗体具有良好的生物活性，与细胞表面的LAG-3蛋白的结合能力强，其EC50为2.059μg/ml。
表8.B5D1抗体生物活性测定结果
抗体 EC50(μg/ml)
B5D1 2.059
实施例9人源化LAG-3单克隆抗体阻断LAG-3抗原和MHC-II分子结合的实验
将重组人LAG-3-Fc(北京义翘神州，货号16498-H05H-200)用双蒸水复溶备用。用含1％BSA的PBS溶液(1％BSA/PBS)将重组人LAG-3-Fc稀释至6μg/ml，每孔20μL加入96孔U型板，与3倍比系列稀释的抗LAG-3人源化抗体B5D1按体积比1:1在96孔U型板中室温反应20min。取对数生长期Daudi细胞(购自ATCC)离心(800rpm×5min)弃培养液，用1％BSA/PBS重悬至活细胞密度为1×106/mL，每孔20μL(2×104个细胞)加入重组人LAG-3-Fc与LAG-3抗体预孵育的96孔U型板中2-8℃反应30min。其中，BMS人源化LAG-3抗体(BMS mAb)作为阳性对照。将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤2遍，加入1:300稀释的Alexa488-山羊抗鼠(Goat anti mouse)-Fc(JacksonImmunoResearch，货号115-545-071)，室温反应15min，将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤3遍，最终用每孔100μL 1％BSA/PBS重悬，用流式细胞仪(BD，Accuri C6)检测第一通道的荧光强度。
结果如表9和图2所示。结果表明，相比阳性对照BMS mAb，本发明提供的LAG-3抗体可以更有效阻断LAG-3和MHC-II分子的结合。
表9B5D1抗体阻断LAG-3抗原和MHC-II分子结合
抗体 IC50(μg/ml)
B5D1 0.152
BMS mAb 0.227
实施例10人源化LAG-3单克隆抗体对抗原特异性的T细胞响应的刺激—体外活性实验
为了检测人源化LAG-3单克隆抗体是否能够刺激抗原特异性的T细胞响应，使用了3A9-T细胞多肽刺激实验。在本实施例中，效应细胞为一种鼠的杂交瘤T细胞3A9细胞(购自ATCC)，它的特异性抗原为多肽HEL48-62。在3A9细胞中过表达人的LAG-3蛋白，构建3A9-huLAG-3的稳转细胞株。细胞表面表达有MHC-II分子的LK35.2细胞作为抗原呈递细胞把多肽HEL48-62呈递给3A9细胞或3A9-huLAG-3细胞。通过检测3A9-huLAG-3细胞分泌IL-2的情况来显示抗体对T细胞的活性的刺激。
首先，把LK35.2细胞(96孔板2.5x104细胞/孔)与200nM多肽HEL48-62在37℃条件下共孵育30分钟，把3A9-huLAG-3细胞(96孔板5.0x104细胞/孔)与梯度稀释的待测抗LAG-3抗体在37℃条件下共孵育15分钟。然后把两个细胞体系混合，置于37℃培养箱中培养24小时。收集上清，用ELISA检测试剂盒(mouse IL-2OptEIA试剂盒,BD Bioscience,#555148)检测IL-2的表达情况。其中，BMS人源化LAG-3抗体(BMS mAb)作为阳性对照。
结果如表10和图3所示。结果表明，本发明提供的LAG-3抗体可以有效激活抗原特异性的T细胞的活性，作用效果优于阳性对照BMS mAb。
表10B5D1抗体的体外活性测定结果
抗体 EC50(μg/ml)
B5D1 1.25
BMS mAb 1.80
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华博生物医药技术（上海）有限公司
<120> 一种高亲和力高生物活性的LAG-3抗体及其应用
<130> P2018-0874
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Ala Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Pro Ser Val Val Glu Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Gly His Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Ala Gly Gly Gly Pro Ser Val Val Glu Gly Asp Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Leu Gln Ser Thr His Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Ala Glu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Pro Ser Val Val Glu Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (16)

1.一种抗LAG-3的抗体，其特征在于，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；并且
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6所示的CDR1’，
氨基酸序列为LVS的CDR2’，和
SEQ ID NO:7所示的CDR3’。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，且所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:2所示；或
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:8所示，且所述抗体的轻链可变区序列如SEQID NO:9所示。
4.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于LAG-3的结合区，并且所述scFv具有如权利要求1所述抗体的重链可变区和轻链可变区。
6.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求5所述的CAR构建物。
7.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
8.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗高表达LAG-3的霍奇金淋巴瘤的药物或制剂。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求5所述的CAR构建物、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
10.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；或
(2)如权利要求4所述的重组蛋白；
(3)如权利要求5所述的CAR构建物。
11.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求10所述的多核苷酸。
12.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求11所述的载体或基因组中整合有如权利要求10所述的多核苷酸。
13.一种体外非诊断地检测样品中LAG-3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在LAG-3蛋白。
14.一种检测板，所述的检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有如权利要求1所述的抗体或如权利要求7所述的抗体药物偶联物。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如权利要求1所述的抗体；和
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如权利要求1所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如权利要求14所述的检测板。
16.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求12所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的重组蛋白。
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