TW202413405A - 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途 - Google Patents
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Abstract
提供了抗體及其抗原結合片段,特別是具有親和力和刺激T細胞活化的活性的此類抗體和抗原結合片段。介紹了此類抗體和抗原結合片段在治療癌症、免疫和傳染病和其他病狀中的用途。
Description
本發明關於特異於T細胞上表達的人CD3的新型抗體或抗原結合片段。
身體的免疫系統可以抵禦感染、損傷和癌症。體液免疫系統和細胞免疫系統這兩個獨立但相互關聯的系統共同作用來保護身體。體液系統由可溶性因子(稱為抗體)介導,其中和被身體識別為異物的產物。相比之下,細胞系統涉及T細胞和巨噬細胞等細胞,其清除和中和外來入侵者。
分化簇3(CD3)是T細胞上表達的同二聚體或異二聚體抗原,與T細胞受體複合物(TCR)相關,是T細胞活化所必需的。抗CD3的抗體已被證明可將CD3聚集在T細胞上,從而以類似於TCR與肽負載的MHC分子結合的方式引起T細胞活化。抗CD3抗體已被提議用於涉及T細胞活化的治療。抗CD3抗體已用於治療增殖性疾病(如癌症)以及用於治療自身免疫性疾病。
結合人CD3 ε的幾種抗體是本領域已知的:抗體OKT3、抗體UCHT1、抗體SP34、抗體F2B(WO 2017/223111 A1)或抗體20G6(WP2016/116626 A1)。OKT3與黑猩猩CD3發生反應,但不與其他靈長類動物(如恆河猴)的CD3
同源物發生反應。CD3單株抗體的物種特異性是將其研發為治療人類疾病的抗體藥物的一大阻礙。任何新的候選藥物都必須經過嚴格的臨床前驗證,然後才能用於人類患者進行臨床試驗。臨床前安全性測試是將候選藥物施用至相關物種,較佳非人靈長類。但黑猩猩被認為是瀕危物種,利用此類動物進行藥物安全測試是受到嚴格限制的。本領域所述的適合安全性評價測試的物種可以是恆河猴,特別是食蟹猴。然而,缺乏靈長類物種特異性交叉反應性的CD3抗體難以提供有效的臨床前安全評估數據。在已知的與人CD3結合的抗體中,SP34是極少數能夠與多種靈長類CD3(如人和食蟹猴CD3)結合的抗體之一。然而,SP-34識別僅存在於CD3的ε鏈上的表位,而抗體UCHT1識別由ε和γ鏈形成的表位。在體內,ε鏈還可以形成CD3 δ/ε異二聚體。過去已經開發了幾種針對人CD3 δ/ε的抗體,但迄今為止這些嘗試的成功有限。
因此,開發出新型CD3結合分子的需求仍未得到滿足,特別是新型抗CD3抗體,無論是在體外還是在細胞環境中,其不但表現出期望的親和力和效力特徵,還有與其他物種的交叉反應性,特別是與非人靈長類(如食蟹猴)。
本發明的目的在於提供與人CD3及食蟹猴CD3結合的新型抗體或該抗體的抗原結合片段(以下也稱為抗體等)、包含該抗體的分子、以及含有該抗體等或該分子作為有效成分的具有細胞毒性活性等的醫藥組成物。
本發明人為了實現該目的進行了廣泛的研究,藉由開發新型抗CD3抗體和包含該抗體的分子而實現了本發明。
具體地,本發明包括以下幾個方面:
本揭露提供了一種抗CD3抗體或其抗原結合片段,其包含一個或多個選自以下的CDR區序列或其突變序列:
抗體重鏈可變區,其包含如選自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06的序列所示的一個或多個HCDR;和抗體輕鏈可變區,其包含如選自SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09(X1QX2TX3FPYT)、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列所示的一個或多個LCDR;其中X1是M、Q、T或A,X2是L或A,X3是H或Q。
在一些實施方案中,該抗體重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3區,該抗體輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3區,其中:a)HCDR1如SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:04所示;b)HCDR2如SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:05所示;c)HCDR3如SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:06所示;d)LCDR1如SEQ ID NO:07或SEQ ID NO:10所示;e)LCDR2如SEQ ID NO:08或SEQ ID NO:11所示;f)LCDR3如SEQ ID NO:09或SEQ ID NO:12所示。
在一些實施方案中,本揭露提供了抗CD3抗體或抗原結合片段,其分別包含如SEQ ID NO:01所示的HCDR1、如SEQ ID NO:02所示的HCDR2和如SEQ ID NO:03所示的HCDR3;或分別如SEQ ID NO:04所示的HCDR1、如SEQ ID NO:05所示的HCDR2和如SEQ ID NO:06所示的HCDR3。
在一些實施方案中,本揭露提供了抗CD3抗體或抗原結合片段,其分別包含如SEQ ID NO:07所示的LCDR1、如SEQ ID NO:08所示的LCDR2
和如SEQ ID NO:09所示的LCDR3;或分別如SEQ ID NO:10所示的LCDR1、如SEQ ID NO:11所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3。
在一個較佳的實施方案中,抗CD3抗體或其抗原結合片段包含:a)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:03所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;和輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或b)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;和輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一個較佳的實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段選自鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段包含:a)如SEQ ID NO:13所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:18所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的輕鏈可變區;或b)如SEQ ID NO:17所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:31所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段包含:a)具有選自SEQ ID NO:13、14、15和16中任一序列的重鏈可變區;和/或具有選自SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中任一序列
的輕鏈可變區;或b)如SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:31所示的輕鏈可變區。
在一個較佳的實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段包含:a)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或b)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:31的輕鏈可變區;或c)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:19的輕鏈可變區;或d)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:20的輕鏈可變區;或e)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:21的輕鏈可變區;或f)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:22的輕鏈可變區;或g)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:23的輕鏈可變區;或h)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區;或i)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區;或j)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區;或k)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區;或l)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:28的輕鏈可變區;或m)SEQ ID NO:14的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或n)SEQ ID NO:15的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或o)SEQ ID NO:16的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或p)SEQ ID NO:16的重鏈可變區和SEQ ID NO:29的輕鏈可變區;或q)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:30的輕鏈可變區。
在一個較佳的實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段包含:a)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或b)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:51的輕鏈;或c)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:39的輕鏈;或d)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:40的輕鏈;或e)SEQ ID NO:
34的重鏈和SEQ ID NO:41的輕鏈;或f)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:42的輕鏈;或g)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:43的輕鏈;或h)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:44的輕鏈;或i)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:45的輕鏈;或j)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:46的輕鏈;或k)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:47的輕鏈;或l)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:48的輕鏈;或m)SEQ ID NO:35的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或n)SEQ ID NO:36的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或o)SEQ ID NO:37的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或p)SEQ ID NO:37的重鏈和SEQ ID NO:49的輕鏈;或q)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:50的輕鏈。
在一些實施方案中,抗CD3抗體是全長抗體,其進一步包含人抗體恆定區;較佳地,人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體,該人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體的κ鏈和λ鏈恆定區及其常規變體;更佳地,全長抗體包含SEQ ID NO:32的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:33的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中,CD3抗原結合片段選自:Fab、Fab'、F(ab')2、可變片段(Fv)、單鏈可變片段(scFv)、二聚結構域V(雙體抗體)、二硫穩定化的Fv(dsFv)和任何含有CDR的肽。
在一個較佳的實施方案中,抗CD3抗體或抗原結合片段以1×10-5M至1×10-12M的KD值的親和力與人CD3結合。
一方面,本揭露提供了一種分離的抗體或其抗原結合片段,其與上述抗體或其抗原結合片段競爭性結合人CD3。
在另一個方面,上述抗體或其抗原結合片段具有至少一個以下特徵:a)以1×10-7M至1×10-12M的KD值的親和力與人CD3結合;b)與食蟹猴或恆河猴的CD3發生交叉反應;c)T細胞的活化增加。
在一些實施方案中,本揭露提供了一種分離的核酸分子,其編碼任何抗體或抗原結合片段。
在一方面,本揭露還提供了一種重組載體,其包含上述分離的核酸分子。
在另一方面,本揭露還提供了一種用上述重組載體轉化的宿主細胞,其中該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,較佳真核細胞,更佳哺乳動物細胞。
在一方面,本揭露還提供了一種用於在介質中產生上述抗體或抗原結合片段的方法,以產生並積累該抗體或其抗原結合片段,並從培養物中收穫該抗體或其抗原結合片段。
在一方面,本揭露還提供了一種用於免疫檢測或測量CD3的方法,其中該方法包括藉由與上述抗體或抗原結合片段接觸來檢測CD3。
在一方面,本揭露還提供了一種用於診斷與人CD3陽性細胞相關的疾病的方法,其中該方法包括藉由與上述抗體或抗原結合片段接觸來檢測或測量CD3或CD3陽性細胞。
在一些實施方案中,本揭露提供了一種醫藥組成物,其包含治療有效量的上述抗體或抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施方案中,本揭露還提供了在需要其的受試者中治療CD3介導的疾病或病症的方法,包括向受試者施用上述抗體或抗原結合片段、或上述醫藥組成物,其中該疾病或病症選自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。
本發明的主要優點是:
(1)本發明利用帶有人抗體可變基因的轉基因小鼠獲得了全人抗體可變區,所獲得的抗體具有一系列期望的特徵:
i)可變區序列與現有抗體不同;
ii)獲得的抗體具有結合人CD3的能力
iii)獲得的抗體與細胞表面的CD3結合;
iv)獲得的抗體刺激T細胞活化;
(2)本發明獲得了具有不同序列的抗體,其可以特異性結合CD3,包括與其他物種,特別是與非人靈長類動物(如食蟹猴)發生交叉反應。
圖1.使用RIMMS操作方案免疫的小鼠進行尾部放血,藉由流式細胞術(BD Fortessa X20)以1/50稀釋度測量針對Jurkat E6.1細胞的血清滴度。細胞結合顯示為不同螢光強度下歸一化計數的直方圖。UCHT1用作陽性對照。來自未免疫小鼠的血清用作陰性對照。
圖2.來自13A1融合瘤株的流式細胞術分析的代表性結合直方圖。實線代表與Jurkat E6.1細胞結合,虛線代表與J.RT-T3.5細胞結合。F2B用作CD3結合的陽性對照,僅二抗用作陰性對照。
圖3.藉由流式細胞術分析選擇的CD3融合瘤上清液與食蟹猴T細胞的結合,顯示為直方圖。SP34用作陽性對照,株27A5用作陰性對照。
圖4.該圖顯示了使用NFAT報告子測定的選擇的融合瘤株上清液的T細胞活化活性。F2B和OKT3是抗CD3 mAb,用作陽性對照。
圖5.藉由ELISA測定13A1重組抗體與人CD3 δε(圖5A)和食蟹猴CD3 δε(圖5B)的結合曲線,如圖所示。
圖6.藉由流式細胞術測定重組13A1與CD3+ Jurkat E6.1(圖6A)和人原代T細胞(圖6B)以及陽性對照(F2B)的結合,顯示為劑量反應曲線,如圖所示。
圖7. 13A1 VH1-VL1突變體1-10(圖7A)、突變體32-34(圖7B)和突變體36(圖7C)與Jurkat E6.1細胞的結合曲線,如圖所示。
圖8.該圖顯示了使用NFAT報告子測定的指定重組抗體的T細胞活化活性。13A1 VH1-VL1和13A1 VH1-VL2活性顯示在圖8A中。13A1 VH1-VL1及其輕鏈突變體或重鏈突變體的活性顯示在(圖8B)、(圖8C)和(圖8D)中。
圖9.藉由流式細胞術分析測量細胞表面CD69的量,以此來測量抗CD3抗體對人PBMC的活化。
圖10.分別藉由CD4(圖10A)或CD8 T細胞(圖10C)上的活化標記物CD25的上調、以及CD4(圖10B)或CD8 T細胞(圖10D)上活化標記物CD69的上調,來測量與13A1 VH1-VL1及其突變體結合後的T細胞活化。
圖11.藉由與不同濃度的抗原(人CD3 δε)結合來測定13A1 VH1_VL1的動力學。藉由測定解離速率常數Koff和締合速率常數Kon來計算平衡速率常數KD。
定義
在下面詳述本發明之前,將理解的是,本發明不限於本文中描述的特定方法、操作方案和試劑,因為它們可以有變化。還將理解的是,本文所用的術語僅用於描述特定實施方案的目的,而不旨在限制本發明的範圍,本發明的範圍將僅由所附申請專利範圍限制。除非另有定義,否則本文所用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的相同含義。
對於說明書的解釋,將應用以下定義,並且在任何適當的情況下,單數形式使用的術語也可以包括複數形式,反之亦然。將理解的是,本文所用的術語僅用於描述具體實施方案的目的,而不旨在限制。
術語“CD3”和“CD3抗原”在本文中可互換使用,包括由細胞天然表達或在用CD3基因轉染的細胞上表達的人CD3的任何變體、同種型和物種同源物。
“抗體”是指包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白,或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。VH和VL區可進一步細分為高變區,稱為互補決定區(CDR),其間散佈有更保守的區,稱為框架區(FR)。每個VH和VL由3個CDR和4個FR組成,按以下順序從胺基末端到羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子,包括免疫系統的各種細胞(例如,效應子細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)。
如本文所用,抗體的術語“抗原結合片段”是指抗體的一個或多個片段,其保留與抗原(例如,CD3)特異性結合的能力。已表明可以藉由全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。涵蓋在抗體的術語“抗原結合片段”中的結合片段的示例包括:(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CHI結構域組成的單價片段;(ii)F(ab')2片段,包含由鉸鏈區二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段;(iii)Fd片段,其由VH和CHI結構域組成;(iv)Fv片段,其由抗體單個臂的VL和VH結構域組成;(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546),其由VH結構域組成;(vi)分離的互補決定區(CDR);和(vii)兩個或更多個分離的CDR的組合,該CDR可以視需要地由合成接頭連接。此外,儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼,但可以使用重組方法藉由合成接頭連接它們,使得能夠將其製成單個蛋白鏈,其中VL和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Sci.USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體也旨在涵蓋於抗體的術語“抗原結合部分”中。
如本文所用,術語“人抗體”旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明的人抗體可以包括未由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變而引入的突變)。然而,如本文所用,術語“人抗體”不旨在包括其中源自另一種哺乳動物物種(如小鼠)種系的CDR序列已被移植至人框架序列上的抗體。
如本文所用,術語“重組人抗體”包括藉由重組手段製備、表達、產生或分離的所有人抗體,如(a)從人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體的動
物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體(進一步描述於以下第一節中),(b)從經轉化以表達抗體的宿主細胞(例如從轉染瘤)分離的抗體,(c)從重組組合人抗體文庫分離的抗體,和(d)藉由涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。此類重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而,在某些實施方案中,可以對此類重組人抗體進行體外誘變(或者,當使用人Ig序列轉基因的動物時,進行體內體細胞誘變),因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是這樣的序列:雖然源自人種系VH和VL序列並與之相關,但可以非天然存在於體內人抗體種系貯庫中。
術語“CDR”是指抗體可變結構域內的六個高變區之一,其主要有助於抗原結合。六個CDR最常用的定義之一由Kabat E.A.等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242提供。如本文所用,CDR的Kabat定義僅適用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3或L1、L2、L3),以及重鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3或H1、H2、H3)。
用於識別HCVR和LCVR胺基酸序列內的CDR的方法和技術是本領域公知的,可以用於識別本文揭露的具體說明的HCVR和/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可以用於鑑定CDR邊界的示例性慣例包括,例如,基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲結構的Chothia(Chothia等人(1989)Nature 342:877-883)、基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,US Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))、AbM(University of Bath)、Contact(University
College London)、國際ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(萬維網上imgt.cines.fr/)和基於使用大量晶體結構的親和傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。所屬技術領域具有通常知識者可以容易地識別出由每種編號系統定義的CDR。
CDR編號的有用比較如下:
註釋1:這些定義中的一些(特別是對於Chothia環)因所檢查的個體出版物而異;註釋2:任何編號方案都可以用於這些CDR定義,但contact定義除外,其使用Chothia或Martin(增強Chothia)定義;註釋3:使用Kabat編號慣例進行編號時,Chothia HCDR1環的末端在H32和H34之間變化,取決於環的長度。這是因為Kabat編號方案將插入放置於H35A和H35B處。
“保守修飾”或“保守替換或取代”是指用具有相似特性(例如,電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其他胺基酸來取代蛋白中的胺基酸,如可以頻繁地進行改變而不改變蛋白的生物活性。所屬技術領域具有通常知識者應當理解,一般來說,多肽的非必需區域中的單個胺基酸取代基本上不會改變生物活性(參見,例如,Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,
The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁,(第4版))。此外,結構或功能相似的胺基酸的取代不太可能破壞生物活性。
如本文所用,術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈,但較佳為雙鏈DNA。當核酸被置於與另一個核酸序列的功能關係中時,它是“有效連接”的。例如,如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄,則該啟動子或增強子與編碼序列有效連接。
核酸的製備方法是本領域的常規製備方法。較佳地,其包括以下步驟:藉由基因選殖技術獲得編碼上述蛋白的核酸分子,或藉由人工全長序列合成的方法獲得編碼上述蛋白的核酸分子。
所屬技術領域具有通常知識者知曉,編碼蛋白胺基酸序列的鹼基序列可以被適當地替換、缺失、改變、插入或添加,以提供多核苷酸同系物。可以藉由在維持抗體活性的範圍內替換、缺失或添加編碼蛋白序列的基因的一個或多個鹼基來製備本發明的多核苷酸的同系物。
術語“載體”是指能夠轉運已與其連接的另一核酸的核酸分子。在一個實施方案中,載體是“質粒”,其是指可以將另外的DNA片段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中,載體是病毒載體,其中另外的DNA片段可以連接至病毒基因組中。本文揭露的載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自我複製(例如,具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體),或者可以在引入宿主細胞時摻入宿主細胞的基因組中,從而與宿主基因組一起複製(例如,非附加體哺乳動物載體)。
重組表達載體可以藉由本領域的常規方法獲得,即藉由將本發明的核酸分子連接至各種表達載體而被構建。該表達載體是本領域多種常規載體
中的一種,只要其可以攜帶上述核酸分子即可。載體較佳包括:各種質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體等。
如本文所用,術語“轉染瘤(transfectoma)”包括表達抗體的重組真核宿主細胞,如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、植物細胞或真菌(包括酵母細胞)。
可以藉由常規技術(例如,如PCR擴增或基因組文庫篩選的方法)獲得根據本發明的抗體或其片段的DNA分子的序列。此外,編碼輕鏈和重鏈的序列可以融合在一起,以形成單鏈抗體。
一旦獲得相關序列,就可以使用重組方法批量獲得該相關序列。這通常藉由以下進行:藉由常規方法,將序列選殖至載體中,用載體轉化細胞,然後將相關序列與增殖的宿主細胞分離。
此外,可以人工合成相關序列,尤其是當片段長度短時。通常,首先合成數個小片段,然後將其連接在一起以獲得長序列的片段。
目前,可以完全藉由化學合成獲得編碼本發明的抗體(或其片段或其衍生物)的DNA序列。然後可以將DNA序列引入本領域已知的各種現存DNA分子(或例如載體)和細胞中。此外,還可以藉由化學合成將突變引入本發明的蛋白序列中。
一般地,在適合表達根據本發明的抗體的條件下培養獲得的宿主細胞。然後,藉由使用常規的免疫球蛋白純化步驟純化本發明的抗體,例如所屬技術領域具有通常知識者所屬技術領域具有通常知識者公知的常規分離純化手段,如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析、離子交換色譜、疏水色譜、分子篩色譜或親和色譜。
可以藉由常規手段鑑定獲得的單株抗體。例如,可以藉由免疫沉澱或體外結合測定(如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來確定單株抗體的結合特異性。可以藉由例如Scatchard分析來確定單株抗體的結合親和力(Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980))。
根據本發明的抗體可以在細胞中或細胞膜上表達,或者胞外分泌。如有必要,可以根據重組蛋白的物理、化學和其他特性,藉由各種分離方法來分離並純化重組蛋白。這些方法是所屬技術領域具有通常知識者公知的。這些方法的示例包括但不限於:常規複性處理、藉由蛋白沉澱劑處理(如鹽沉澱)、離心、藉由滲透進行細胞裂解、超聲處理、超離心、分子篩色譜(凝膠色譜)、吸附色譜、離子交換色譜、高效液相色譜(HPLC)和任何其他液相色譜,及其組合。
如本文所用,術語“kd”(sec-1)在本文中用於旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數。該值也稱為koff值。
如本文所用,術語“ka”(M-1×sec-1)旨在指特定抗體-抗原相互作用的締合速率常數。
如本文所用,術語“KD”(M)旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體與預定抗原上的表位結合。
如本文所用,術語“醫藥組成物”旨在指含有本文所述的一種或多種化合物或其生理/藥學上可接受的鹽或其前藥與其他化學成分(如生理/藥學上可接受的載體和賦形劑)的混合物。醫藥組成物的目的是促進對生物體的施用,這有利於活性成分的吸收並發揮生物活性。
當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物液體時,“施用”和“處理”是指使該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物液體與外源性藥物試劑、治療試劑、診斷試劑或組成物接觸。“施用”和“處理”可以例如指治療方法、藥物代謝動力學方法、診斷方法、研究方法和實驗方法。細胞的處理涵蓋使細胞與試劑接觸,以及使液體與試劑接觸,其中該液體與細胞接觸。“施用”和“處理”也指體外處理和離體處理,例如藉由試劑、診斷劑、結合組成物或藉由另一細胞對細胞進行體外處理和離體處理。當應用於人、獸醫或研究受試者時,“治療”是指治療性治療、預防性或預防措施、研究和診斷應用。
此外,本揭露包括用於治療與CD3相關的疾病的藥物,其包含本揭露的抗體或其抗原結合片段作為活性成分。
對與CD3相關的疾病沒有限制,只要其是與CD3相關聯的疾病,例如,由本揭露中揭露的分子誘導的治療反應可以藉由結合人CD3來減少。因此,當在適合於治療應用的製劑和配方中時,本揭露的分子對於那些患有腫瘤、癌症或傳染病的人非常有用。
此外,本揭露涉及用於免疫檢測或測量CD3的方法,用於免疫檢測或測量CD3的試劑,用於免疫檢測或測量表達CD3的細胞的方法,以及用於診斷與CD3陽性細胞相關的疾病的診斷試劑,其包含本揭露的特異性識別人CD3的抗體或抗原結合片段作為活性成分。
在本揭露中,用於檢測或確定CD3的量的方法可以是任何已知的方法。例如,它包括免疫檢測或測定。
免疫檢測或測定是一種藉由使用標記的抗原或抗體來檢測或確定抗體或抗原的量的方法。免疫檢測或測定的示例包括放射性物質標記的免疫抗
體方法(RIA)、酶免疫測定(EIA或ELISA)、螢光免疫測定(FIA)、發光免疫測定、蛋白印跡方法、物理化學方法等。
可以藉由使用本發明的抗體或其抗體片段檢測或測量表達CD3的細胞來診斷上述與CD3陽性細胞相關的疾病。
為了檢測表達多肽的細胞,可以使用已知的免疫檢測,較佳可以使用免疫沉澱、螢光細胞染色或免疫組織化學染色等。此外,可以使用螢光抗體染色方法等,使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)。
實施例
本發明藉由以下具體實施例進一步說明。將理解的是,這些實施例僅用於說明目的,並不旨在限制本發明的範圍。以下實施例中沒有詳細條件的實驗方法一般按照常規條件中描述的條件,如Sambrook.J等人《分子選殖實驗指南》(黃培堂等譯,北京:科學出版社,2002),或按照製造商建議的條件(例如,產品說明書)。除非另有說明,否則百分比和份數均以重量計。除非另有說明,否則以下實施例中使用的實驗材料和試劑均為市售。
實施例中描述的室溫是本領域的常規室溫,並且通常為10-30℃。
實施例1:免疫和抗體篩選
免疫原的製備
CD3抗原的設計:Jurkat E6.1、DNA和重組蛋白抗原的組合用於免疫小鼠。人CD3E和CD3D的重組胞外域以異二聚體的形式表達和純化,購買自AcroBiosystems(目錄號CDD-H52Wa、CDD-H52W1、CDD-C52W4、CDD-C52W9)。使用Fc、His Tag&Fc、Flag Tag或His Tag&Tag Free。
免疫
免疫操作方案:
藉由使用人CD3抗原、食蟹猴CD3抗原、人CD3 DNA和/或天然表達人CD3的Jurkat E6.1細胞(Sigma-Aldrich,目錄號88042803)的組合免疫經遺傳修飾以編碼人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區的小鼠,獲得抗CD3抗體。藉由CD3特異性免疫測定監測抗體免疫反應。當達到期望的免疫反應時,從每隻小鼠中收穫脾細胞,以及(1)與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞,用於CD3特異性的篩選,或(2)使用具有C末端6-His標簽的人CD3作為結合並識別反應性抗體的分選試劑,用於分選B細胞(抗原陽性B細胞)。圖1顯示了使用CD3蛋白進行免疫後,藉由流式細胞術檢測血清中抗體滴度的結果。
結果表明:使用免疫原進行3次免疫後,所選小鼠的抗原選擇性細胞結合滴度超過1:50,表明小鼠對該免疫原具有較好的體液免疫反應,其脾細胞可以用於融合瘤細胞的製備。
脾細胞融合
藉由電融合或PEG融合使脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCC® CRL-158)融合以獲得融合瘤細胞。按照製造商的說明,使用ClonacellTM HY技術(STEMCELL technologies)進行PEG融合。用於電融合時,原代細胞:小鼠骨髓瘤細胞系比率為1:1,用於PEG融合時為10:1。
藉由ELISA篩選融合瘤細胞
使用DuoSet ELISA輔助試劑盒(R&D System,DY008)進行ELISA。將ELISA板用5ug/ml的人CD3DE(AcroBio CDD-H52W1)和食蟹猴CD3DE(AcroBio,CDD-C52W4)包被過夜。藉由用洗滌緩衝液洗滌板三次,洗去過量未結合的蛋白,然後在室溫封閉1小時。將50μl的CD3融合瘤上清液加
入雙複孔中並孵育1小時。洗去過量未結合的抗體,再將50μl的1:1000稀釋的二抗山羊抗小鼠IgG Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch 115-035-071)加入每個孔中1小時。根據製造商的操作方案,洗滌板,然後加入化學發光劑(顏色A和顏色B)。藉由酶標儀(PerkinElmer)測量樣品在450nm處的光密度。
結果表明,本揭露的融合瘤株13A1抗體的上清液對人和食蟹猴CD3具有高親和力。
Jurkat結合篩選
對融合瘤上清液使用流式細胞術分析進行對人T細胞系(CD3+ Jurkat細胞系株E6.1和CD3-株J.RT-T3.5(ATCC))的結合測試。使用未稀釋的融合瘤上清液進行初次染色,然後使用螢光標記的二抗(PE山羊抗小鼠IgG,Biolegend目錄號405307)進行染色。圖2顯示了選擇的流式細胞術直方圖的示例。與J.RT-T3.5細胞相比,株13A1與Jurkat E6.1的結合譜增強。
食蟹猴T細胞(HSC-F)結合
使用流式細胞術分析進一步測試來自Jurkat細胞結合篩選中選擇的株與食蟹猴T細胞的結合(HSC-F)。食蟹猴T細胞系(HSC-F)獲自非人靈長類動物試劑資源(NHPRR)。以與上述類似的方式進行染色。代表性結果如圖3所示。
T細胞活化(NFAT報告子測定)
使用Jurkat-LuciaTM NFAT細胞(InvivoGen jktl-nfat),使用NFAT報告子測定法測量融合瘤上清液或重組抗CD3抗體的T細胞活化活性。用捕獲抗體(山羊抗小鼠IgG Fcγ片段特異性的,JacksonImmunoResearch 115-005-071)以4μg/ml PBS溶液、50μl/孔,對U型底96孔板進行乾法包被。將用培養介質稀釋的融合瘤上清液或重組抗CD3抗體以50μl/孔添加至預包被的板中過夜。將Jurkat-LuciaTM NFAT細胞以每孔400,000個細胞(在200ul培養介質中)添加到每個孔中。將細胞在37℃、5%CO2下維持24小時,然後收集培養物上清液。根據製造商的說明,使用QUANTI-Luc測定溶液(InvivoGen)測量培養物上清液中的螢光素酶活性。發光信號由VICTOR Nivo多模式酶標儀(PerkinElmer)記錄。純化的抗CD3抗體F2B和OKT3用作陽性對照。來自另一個融合瘤株的上清液用作陰性對照。如圖4所示,如體外報告子測定所示,選擇株13A1是因為其具有活化人T細胞的能力。
實施例2:陽性融合瘤株的測序
從陽性融合瘤株測序的過程如下。收集對數生長期的融合瘤細胞,提取RNA,進行逆轉錄,然後進行VDJ區域擴增。對從每個株擴增的cDNA文庫進行下一代測序。獲得了與抗體13A1對應的重鏈和輕鏈可變區DNA序列的胺基酸序列(根據Kabat&Wu註釋,VH/VL中CDR的胺基酸殘基加下劃線:
>13A1_VL1(SEQ ID NO:18)
DIVMTQTPLSSPVIFGQPASISC
RSSQSLVHSDGNTYLS
WLQKRPGQPPRLLIY
KISNRFS
GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVETEDVGIYYC
MQLTHFPYT
FGQGTKLEIK
>13A1_VH1(SEQ ID NO:13)
EVQLVESGGGLVKSGGSLRLSCAASGFIFS
SYSMN
WVRQAPGKGLEWVS
SISSSRSYIYYADSVKG
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTGFYYCAR
GGWGGLYFDY
WGQGTLVTVSS
>13A1_VL2(SEQ ID NO:31)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQGISNYLA
WYQQKPGKFPKLLIY
AASTLQS
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC
QKYNSAPLT
FGGGTKVEIK
>13A1_VH2(SEQ ID NO:17)
LVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
GYYMH
WVRQAPGQGLEWMG
WINPNSGGTNYAQKFQG
RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
LELLDY
WGQGTLVTVSS
註釋:順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,斜體部分代表FR序列,下劃線部分代表CDR序列。
實施例3 重組抗體13A1的構建及表達
1.重組抗體的分子株
編碼選擇的株的VH和VL區的cDNA序列直接合成為具有5’末端框內前導序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)的DNA片段。使用NEBuilder DNA組裝選殖試劑盒(New England Biolabs)將這些DNA片段選殖到選定的載體中。VH區被選殖到pFUSE-CHIg_hG1載體(InvivoGen #pfuse-hchg1)中,與載體中hIgG1重鏈恆定區同框。VL區被選殖到pFUSE2-CLIg_hk載體(InvivoGen,#pfuse2-hclk)中,與載體中hIg κ輕鏈恆定區同框。
2.重組抗體的表達和純化
重鏈表達質粒和輕鏈質粒使用ExpiFectamine 293轉染試劑盒(ThermoFisher,A14524)共轉染至Expi293F細胞(ThermoFisher,#A14527)中,或使用ExpiFectamine CHO轉染試劑盒(ThermoFisher,A29129)共轉染至ExpiCHO-S細胞(ThermoFisher,#A29127)中。基於製造商的說明,質粒DNA濃度達到每
ml懸浮細胞1.0μg,LC:HC載體比率為1:1。在37℃,8% CO2的軌道振盪器上培養轉染的細胞5至7天。收集條件介質,並在AKTA Pure 25機器(Cytiva)上使用HiTrap MabSelect SuRe管柱(Cytiva,#17549112)純化抗體。沖提的抗體用Tris緩衝液(pH 9.0)中和,進行PBS緩衝液交換。藉由UV吸收測量產物濃度,藉由SDS-PAGE和HPLC測定質量。
實施例4 株13A1的突變和種系化
突變的目的是藉由將某些殘基轉化為種系序列來獲得一組具有不同親和力和潛在較低免疫原性的抗CD3抗體。
融合瘤株13A1的模板選擇和反向突變設計(表2和表3)。
本揭露的性能和效果藉由以下生化測試或體內藥理測試驗證:
測試例1.抗體與hCD3 δε和食蟹猴CD3 δε結合的酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測
1.重組抗體
將ELISA板用5ug/ml人或食蟹猴CD3 δε-His(AcroBiosystems)包被過夜。對重組抗CD3抗體13A1進行從100nM開始的連續稀釋,添加到CD3包被的板中。洗掉多餘的未結合抗體,然後添加小鼠抗人IgG Fc-HRP(Abcam 99774)。藉由在酶標儀上於450nm處以O.D.測量結果。使用GraphPad Prism 9分析數據(圖5)。計算CD3抗體與人和食蟹猴CD3 δε蛋白結合的EC50值(表5)。
測試例2.藉由流式細胞術(FACS)檢測抗體與CD3+ Jurkat細胞和人原代T細胞的結合
1.重組抗體
藉由流式細胞術分析確定13A1_VH1_VL1、13A1_VH1_VL2(圖6)重組抗體與細胞表面CD3的結合曲線。將Jurkat E6.1細胞等分為30萬個/孔,向每個孔中添加60ul連續稀釋的抗體。於4℃避光染色1小時。將PE山羊抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch)以1:200稀釋用作二抗。
藉由使用來自一名健康供體的新鮮分離的PBMC來測定13A1_VH1_VL1與原代T細胞的結合。將30萬個PBMC等分到每個孔中,用
抗人TCRα/β-FITC(Biolegend,目錄號306706)染色。13A1抗體連續稀釋,每孔加入60ul進行初次染色。PE山羊抗人IgG用作二抗,如圖7A所示。
藉由流式細胞儀(BD LSRFortessa)分析染色的樣品。藉由JurkatE6.1(圖6A)或原代T細胞(TCRα/β+)(圖6B)上的PE螢光強度測量CD3結合,藉由FlowJo軟體進行分析。使用GraphPad Prism 9分析數據。計算結合親和力,顯示為EC50(nM)值(表6)。
2. 13A1突變
將一系列單胺基酸或多胺基酸突變引入13A1_VH1_VL1,以調節與CD3的結合親和力。將13A1_VH1_VL1的序列與種系序列進行比較,在各個CDR和框架區上將突變反向引入種系序列(實施例3)。含有突變的重組抗體以人IgG1形式生成。從1000nM開始進行連續稀釋,如上所述藉由流式細胞術分析確定每種突變體與Jurkat E6.1細胞的結合曲線。其結果如圖7A至圖7C所示,結合的EC50如表7A至表7C所示。
測試例3.藉由NFAT報告子測定或人PBMC活化檢測CD3抗體對T細胞活化的影響。
1.NFAT報告子測定
為了評估CD3抗體觸發T細胞活化的潛力,將96孔U型底的板用10ug/ml捕獲抗體(來自Jackson ImmunoResearch的AffiniPure山羊抗人IgG,Fcγ特異性的,#109-005-170)進行乾法包被,然後在PBS洗滌後,用10ug/ml的抗CD3抗體濕法包被。在PBS洗滌後,將NFAT報告細胞(InvivoGen #jktl-nfat)以40萬/孔(在RPMI 1640溶液中,含10% FBS)添加到每孔中。在37℃、5% CO2下孵育24小時後。按照製造商的說明,使用QUANTI-Luc測定(InvivoGen)測量報告子活性。使用Victor Nivo多模式酶標儀(PerkinElmer)測量發光,藉由
GraphPad Prism 9軟體分析結果。重組13A1對T細胞活化的影響如圖8A所示,EC50值如表8所示。如圖8B至圖8D所示,相較於親本13A1,13A1_VH1_VL1的不同輕鏈和/或重鏈突變表現出在其T細胞活化能力上的差異,EC50值顯示在表9A至表9C中。
2.人PBMC的活化
將來自單個健康供體的新鮮PBMC以1×106個細胞/ml的密度放置入含有GlutaMax 10% FBS的RPMI1640介質中,在37℃孵育過夜。抗CD3抗體OKT3、13A1和F2B以及對照人IgG連續稀釋。然後,將PBMC以50,000個細胞每孔添加到抗體溶液中,每孔終體積為200μl。將細胞在37℃、5% CO2下孵育2天,然後用抗人CD69抗體(Biolegend,目錄號310938)染色,藉由BD Fortessa X20進行分析。藉由FlowJo和GraphPad Prism 9軟體分析數據。抗CD3抗體對PBMC的活化表示為CD69相對於對照的△MFI,如圖9所示,EC50值如表10所示。
進行了類似的實驗來評價13A1_Mut36對原代人T細胞活化的活性,表示為T細胞活化標記物(CD25和CD69)的誘導表達。簡而言之,將新鮮分離的PBMC與連續稀釋的13A1、13A1-Mut36、OKT3和對照IgG一起孵育,然後用以下抗體進行染色:抗hCD8(Biolegend 300906)、抗hCD69(Biolegend 310938)、抗hCD4(Biolegend 300537)和抗hCD25(Biolegend 302606)。然後,如上所述藉由流式細胞術分析染色的細胞。
結果如圖10A至圖10D所示。13A1和13A1-Mut36均具有出色的T細胞活化作用。CD4+CD25+(%CD4+)代表在給定組中CD25陽性的CD4細
胞的百分比,T細胞活化分別測定為表達CD25(圖10A)或CD69(圖10B)的CD4 T細胞的百分比,表達CD25(圖10C)和CD69(圖10D)的CD 8 T細胞的百分比。
測試例4.抗體親和力測試
藉由Octet(Octet Red 384)儀器測定13A1_VH1_VL1和人CD3 δε之間的親和力。選擇抗hIgG Fc捕獲(AHC)生物傳感器,用緩衝溶液平衡傳感器10分鐘。隨後,將傳感器浸入含有2ug/ml 13A1_VH1_VL1的孔中,以將抗體上樣到探針上。洗掉多餘的未結合抗體。在含有連續稀釋的人CD3 δε-His的孔中進行抗原結合,濃度範圍為300nM至0.4nM,持續10分鐘。然後將探針浸入新的緩衝液孔中,以啟動另外30分鐘的解離。將減去緩衝液的數據輸入Prism以繪製締合和解離曲線(圖11)。平衡速率常數KD經計算為約24nM。
TW202413405A_112126218_SEQL.xml
Claims (23)
- 一種抗CD3抗體或其抗原結合片段,其包含:抗體重鏈可變區,其包含如選自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06的序列所示的一個或多個HCDR;和抗體輕鏈可變區,其包含如選自SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09(X1QX2TX3FPYT)、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12的序列所示的一個或多個LCDR;其中X1是M、Q、T或A,X2是L或A,X3是H或Q。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述抗體輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3區,其中,a)如SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:04所示的HCDR1;b)如SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:05所示的HCDR2;c)如SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:06所示的HCDR3;d)如SEQ ID NO:07或SEQ ID NO:10所示的LCDR1;e)如SEQ ID NO:08或SEQ ID NO:11所示的LCDR2;f)如SEQ ID NO:09或SEQ ID NO:12所示的LCDR3。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈可變區序列分別包含如SEQ ID NO:01所示的HCDR1,如SEQ ID NO:02所示的HCDR2,和如SEQ ID NO:03所示的HCDR3;或者如SEQ ID NO:04所示的HCDR1,如SEQ ID NO:05所示的HCDR2,和如SEQ ID NO:06所示的HCDR3。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該輕鏈可變區序列分別包含如SEQ ID NO:07所示的LCDR1,如SEQ ID NO:08所示的LCDR2,和如SEQ ID NO:09所示的LCDR3;或者如SEQ ID NO:10所示的LCDR1,如SEQ ID NO:11所示的LCDR2,和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中,a)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:03所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者b)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1至5中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段選自鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項6所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含:a)如SEQ ID NO:13所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:18所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的輕鏈可變區;或者b)如SEQ ID NO:17所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:31所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的輕鏈可變區。
- 如請求項7所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含:a)具有選自SEQ ID NO:13、14、15和16中任一序列的重鏈可變區;和/或具有選自SEQ ID NO:30、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29中任一序列的輕鏈可變區;或者b)如SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區;和/或如SEQ ID NO:31所示的輕鏈可變區。
- 如請求項8所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含:a)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:30的輕鏈可變區;或b)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:31的輕鏈可變區;或c)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:19的輕鏈可變區;或d)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:20的輕鏈可變區;或e)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:21的輕鏈可變區;或f)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:22的輕鏈可變區;或g)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:23的輕鏈可變區;或h)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:24的輕鏈可變區;或i)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:25的輕鏈可變區;或j)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:26的輕鏈可變區;或k)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:27的輕鏈可變區;或l)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:28的輕鏈可變區;或m)SEQ ID NO:14的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或n)SEQ ID NO:15的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或o)SEQ ID NO:16的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區;或p)SEQ ID NO:16的重鏈可變區和SEQ ID NO:29的輕鏈可變區;或q)SEQ ID NO:13的重鏈可變區和SEQ ID NO:18的輕鏈可變區。
- 如請求項9所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含:a)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:50的輕鏈;或b)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:51的輕鏈;或c)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:39的輕鏈;或d)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:40的輕鏈;或e)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:41的輕鏈;或f)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:42的輕鏈;或g)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:43的輕鏈;或h)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:44的輕鏈;或i)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:45的輕鏈;或j)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:46的輕鏈;或k)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:47的輕鏈;或l)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:48的輕鏈;或m)SEQ ID NO:35的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或n)SEQ ID NO:36的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或o)SEQ ID NO:37的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈;或p)SEQ ID NO:37的重鏈和SEQ ID NO:49的輕鏈;或q)SEQ ID NO:34的重鏈和SEQ ID NO:38的輕鏈。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體還包含人抗體恆定區;較佳地,該人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體,以及該人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體的κ鏈和λ鏈恆定區及其常規變體;更佳地,該抗體包含SEQ ID NO:32的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:33的人輕鏈恆定區。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、可變片段(Fv)、單鏈可變片段(scFv)、二聚結構域V(雙體抗體)、二硫穩定化的Fv(dsFv)和含有CDR的肽。
- 如請求項8所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段以1×10-5M至1×10-12M的KD值的親和力與人CD3結合。
- 一種分離的抗體或其抗原結合片段,其與如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段競爭結合人CD3。
- 如請求項9所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,其具有以下特徵中的至少一項:a)以1×10-5M至1×10-12M的KD值的親和力與人CD3結合;b)與食蟹猴或恆河猴的CD3發生交叉反應;c)T細胞的活化增加。
- 一種分離的核酸分子,其編碼如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組載體,其包含如請求項16所述的分離的核酸分子。
- 一種宿主細胞,其轉化有如請求項17所述的重組載體,其中該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,較佳真核細胞,更佳哺乳動物細胞。
- 一種產生如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法,其中該方法包括在介質中培養如請求項18所述的宿主細胞以產生 並積累如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,從該培養物中收穫該抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於免疫學檢測或測量CD3的方法,其中該方法包括藉由與如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段接觸來檢測CD3。
- 一種用於診斷與人CD3陽性細胞相關疾病的方法,其中該方法包括藉由與如請求項1所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段接觸來檢測或測量CD3或CD3陽性細胞。
- 一種醫藥組成物,其包含治療有效量的如請求項1至15中任一項所述的抗CD3抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種在需要其的受試者中治療CD3介導的疾病或病症的方法,包括向受試者施用如請求項1至15中任一項所述的抗CD3抗體或抗原結合片段、或如請求項22所述的醫藥組成物,其中該疾病或病症選自癌症、自身免疫性疾病和/或炎性疾病。
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US63/388,825 | 2022-07-13 |
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