TWI795872B - 抗gm2ap抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本文揭露特異性結合GM2激活蛋白 (GM2-activator protein,GM2AP)的重組抗體或其抗原結合片段。該重組抗體或其抗原結合片段包含含有3個輕鏈互補決定區(LCDR1至3)胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)及含有3個重鏈互補決定區(HCDR1至3)的重鏈可變區(HCVR),其序列如本文實施例所揭露者。本文亦提供編碼其之多核苷酸、載體、宿主細胞、偵測GM2AP的方法及套組,以及誘發該些重組抗體或其抗原結合片段的方法。
Description
本文係關於一種新穎重組抗體或其任意抗原結合片段。具體來說,本文係關於一種針對GM2活化蛋白(GM2AP)的新穎重組抗體或其任意抗原結合片段及其應用。
GM2活化蛋白(GM2AP)是一種小型單體蛋白,含有一個Asn連接糖基化的位點。其先被合成為前體,然後在32Ser處被糖基化、修飾及裂解而成為成熟的形式。成熟的GM2AP是一種糖蛋白,其脫糖形式(deglyeosylated form)的分子量為17.6kDa。作為一種輔因子,GM2AP具有至少三個功能性特徵,包括被稱為β-cup的疏水性袋狀結構(hydrophobic pocket)、寡糖結合點和與Hex A交互作用的區域。與Hex A交互作用的區域有助於溶酶體β己糖胺脢A(Hex A)將GM2神經節苷脂(GM2 ganglioside)降解為GM3。然而,只有三分之一所合成的GM2AP被分泌出來。細胞可以通過與碳水化合物無關的機制,由各種細胞如表皮角質細胞和纖維母細胞來重新抓取GM2AP。缺乏功能性的GM2AP是GM2神經節苷脂病AB變體(一種嚴重的溶酶體儲存障礙)患者組織中,GM2神經節苷脂異常積累的原因。GM2AP的遺傳性缺損也與神經節苷脂和涉及腫瘤發展的腫瘤相關神經節苷脂之量的改變有關。腫瘤相關神經節苷脂是初始致癌轉化的結果,在誘發侵襲和轉移中發揮作用。腫瘤細胞係合成並在其微環境中脫落神經節苷脂,這導致血清中腫瘤相關的神經節苷脂量有提高。此
外,已知神經節苷脂在細胞生長、粘附、細胞-細胞相互作用和訊號傳導中表現出調節作用。
有鑒於現有技術之需要,本文係提供以下實施例。
在一實施例中本文提供一種特異性結合GM2活化蛋白(GM2AP)的重組抗體或其抗原結合片段,其中該重組抗體或其抗原結合片段包含:(a)輕鏈可變區(LCVR),包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個輕鏈互補決定區(LCDR1至3)胺基酸序列:SEQ ID NO:51至53、57至59、69至71、75至77、81至83、87至89、96至98、102至104、108至110,及114至116;以及(b)重鏈可變區(HCVR),包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個重鏈互補決定區(HCDR1至3)胺基酸序列:SEQ ID NO:54至56、66至68、72至74、78至80、84至86、90至92、93至95、99至101、105至107、111至113,及117至119。
較佳地,該LCVR包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:5、7、11、13、15、17、20、22、24和26,及/或該HCVR包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、10、12、14、16、18、19、21、23、25和27。
更佳地,該LCVR/HCVR對分別包含以下之胺基酸序列對:SEQ ID NOs:5/6、11/12、13/14、15/16、17/18、17/19、20/21、22/23、24/25或26/27。
較佳地,該LCDR1/LCDR2/LCDR3分別包含SEQ ID NO:51/52/53、57/58/59、69/70/71、75/76/77、81/82/83、87/88/89、96/97/98、102/103/104、108/109/110,或114/115/116的胺基酸序列。
較佳地,該HCDR1/HCDR2/HCDR3分別包含SEQ ID NO:54/55/56、66/67/68、72/73/74、78/79/80、84/85/86、90/91/92、93/94/95、99/100/101、105/106/107、111/112/113或117/118/119的胺基酸序列。
更佳地,該LCDR1/LCDR2/LCDR3/HCDR1/HCDR2/HCDR3分別包含SEQ ID NO:51/52/53/54/55/56、69/70/71/72/73/74、75/76/77/78/79/80、81/82/83/84/85/86、87/88/89/90/91/92、87/88/89/93/94/95、96/97/98/99/100/101、102/103/104/105/106/107、108/109/110/111/112/113,或114/115/116/117/118/119的胺基酸序列。
在前述任一種實施例中,該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組:雙體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體(disulfide stabilized diabody,ds diabody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule,scfv)、scfv二聚體(scfv dimer,雙價雙體(bivalent diabody))及其任意組合。
在前述任一種實施例中,該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組:單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體及其任意組合。
在前述任一種實施例中,該重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體。
在一實施例中,本文提供編碼任一種本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。該多核苷酸包含選自由SEQ ID NO:28至30、33至50所組成之群組的核酸序列。
較佳地,編碼該LCVR的核酸序列係選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO:28、30、34、36、38、40、43、45、47和50,及/或編碼該HCVR
的核酸序列係選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO:29、33、35、37、39、41、42、44、46、48,及49。
在前述任一種實施例中,該LCVR/HCVR係分別由下列核酸序列對所編碼:SEQ ID NO:28/29、34/35、36/37、38/39、40/41、40/42、43/44、45/46、47/48或50/49。
在一實施例中,本文提供一種載體,其包含任一種本文所提及之多核苷酸。
在一實施例中,本文提供一種宿主細胞,其包含任一種本文所提及之載體。
較佳地,宿主細胞係選自下列所組成之群組:中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary(CHO)cell)、NSO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、COS細胞、239F細胞、SF9細胞、SF21細胞及其組合。
在一實施例中,本文提供一種套組,用以在生物樣品中偵測GM2活化蛋白(GM2AP),其中該套組包含本文中所提及之重組抗體或其抗原結合片段。
較佳地,該套組包含受質及二級抗體,該二級抗體接合訊號產生單元並與該重組抗體或其抗原結合片段的Fc域結合。受質係經配置為與訊號產生單元進行反應並產生一訊號。
在前述任一種實施例中,該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。
在前述任一種實施例中,該訊號產生單元包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。較佳地,標籤性酵素可包含辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)或鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
在前述任一種實施例中,當訊號產生單元為辣根過氧化酶時,受質為四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)。
在前述任一種實施例中,套組進一步包含阻斷溶液(blocking solution)。較佳地,阻斷溶液包含脫脂牛奶、牛血清白蛋白或酪蛋白。
在前述任一種實施例中,套組進一步包含清洗溶液(wash solution)。較佳地,清洗溶液包含磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline,PBS)、Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS)、含有清潔劑(detergent)的PBS或含有清潔劑(detergent)的TBS。
在一實施例中,本文提供一種在生物樣品中偵測GM2激活劑蛋白(GM2AP)的方法,包含:(a)將本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段施用至所述生物樣品;(b)將所述生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育;(c)偵測所述可偵測標籤。
在前述任一種實施例中,該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。
在前述任一種實施例中,該二級抗體係結合至該抗體或其抗原結合片段的Fc域。
在前述任一種實施例中,該可偵測標籤包含鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
在前述任一種實施例中,該步驟(c)係藉由以下所執行:將該可偵測標籤與對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)溶液共同孵育,並在OD405測量其吸收度。
在前述任一種實施例中,該步驟(c)係藉由以下所執行:將該可偵測標籤與四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)溶液共同孵育,並在OD405測量其吸收度。
在一實施例中,本文提供一種誘發任一種本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段的方法,包含(a)對個體施用一胜肽片段,該胜肽片段包含SEQ ID NO:1至4中任一者的胺基酸序列;(b)形成融合瘤細胞;以及(c)篩選分泌特異性結合至糖基化GM2AP之抗體的融合瘤細胞。
在前述任一種實施例中,所述胜肽片段包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列。
圖1顯示GM2AP單株抗體的篩選程序。
圖2顯示(A)GM2AP-His8的流出液和洗脫液的收集,以及(B)用考馬斯藍(Coomassie Blue)對流出液和洗脫液之分析。
圖3顯示以間接ELISA法對GM2AP免疫的小鼠之血清進行分析。
圖4顯示以四種抗GM2AP抗體株:GM6、GM8、GM9和GM10以及一個商用GM2AP抗體(Sigma)進行西方墨點檢測(Western Blot Assay)染色的結果。
圖5顯示GM9能識別VITAEin蛋白的各種片段。
圖6顯示GM10能識別VITAEin蛋白的各種片段。
本文之上述和其他方面係以下述其他實施例進行更詳細的描述。咸應理解,本發明可以用不同形式所表徵,不應該被理解為侷限於本文所述的實施方案。相反的,提供這些實施例是為了更徹底及完整地揭露本發明,並向本案所屬技術領域具有通常知識者充分傳達本發明的範圍。
本文所使用之術語只是為了描述特定的實施方案,並非意圖限制本發明。在本文敘述和附隨之申請專利範圍中,除非上下文有明確的相反指示,否則單數形式的「一」(「a」、「an」)和「該」也包括複數形式。
如本文所用,術語「包括(comprises、comprising)」、「包含(includcs、including)」、「含有(has、having)」、「含括(contains、containing)」、「其特徵在於」或其任何其他變體,旨在涵蓋非排他性的包含,但須遵守明確指出的任何限制。舉例來說,由所列單元組成的組成物、混合物、方式或方法不一定只限於這些單元,還可能包括未明確列出者,或該組成物、混合物、方式或方法所固有的其他單元。
轉折性用語「由...組成」排除了任何未指明的單元、步驟或組成分。如果在請求項中,這將使請求項中僅限於包含所述的那些材料,但通常與之相關的雜質除外。當「由...組成」這一短語出現在請求項的某一子句中,而非緊跟在其標的之後時,它只限制該子句中規定的要素;其他要素並不被排除在整個請求項之外。
若使用例如「包括」這樣的開放性用語來定義一項發明或其一部分,那麼咸應理解,除非另有說明,否則該描述應該被解釋為也以「由...組成」一詞來描述這樣的發明。
如本文所使用的,術語「約」係用於表示一個數值包括例如測量設備的固有誤差變化、用於確定該數值的方法、或研究對象之間存在的變化。通常情況下,該術語是指包括約為或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的變化比率,其取決於具體情況。
請求項中使用的術語「或」是指「及/或」,除非有明確指出僅限替代物或替代物是互斥的,即便本文支持僅限替代物和「及/或」的定義。
本文所用術語「個體」是指人類或動物。示例性的個體可以是人類、猿類、狗、豬、牛、貓、馬、山羊、綿羊、嚙齒動物和其他患有可從治療中獲益的哺乳動物。
術語「施用(administering、administration)」係指向個體提供本文的抗體。用於舉例而非限制的方式,其可以通過腸外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹腔內、囊內、腹腔內、軟骨內(intracartilaginous)、腔內(intracavitary)、體腔內(intracelial)、小腦內(intracerebellar)、腦室內、結腸內(intracolic)、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內(intraosteal)、骨盆內、心包內(intrapericardiac)、腹膜內、胸膜內(intrapleural)、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊髓內、滑膜內(intrasynovial)、胸腔內(intrathoracic)、子宮內(intrauterine)、膀胱內(intravesical)、推注(bolus)、陰道、直腸、口腔(buccal)、舌下、鼻內和經皮方式來施用。例如,可以通過靜脈注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)、真皮內注射(i.d.)、腹膜內注射(i.p.)或肌肉注射(i.m.)進行注射。可以採用一種或多種此類途徑。
本文所提術語「抗體」包括完整的抗體和任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」是指由至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過雙硫鍵相互連接的糖蛋白,或其抗原結合部分。每條重鏈由一個重鏈可變區(此處縮寫為VH)和一個重鏈恆定區(此處縮寫為CH)組成。重鏈恆定區由三個結構域組成,CH1、CH2和CH3。每條輕鏈由一個輕鏈可變區(在此縮寫為VL)和一個輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH
和VL區可以進一步細分為高度變異區域,稱為互補決定區(CDR),穿插有較保守的區(稱為框架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成,從胺基端到羧基端按以下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含一個與抗原交互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合,包括免疫系統的各種細胞(如效應子細胞)和古典補體系統的第一組份(C1q)。
「表位」或「抗原決定簇(antigenic determinant)」是抗原分子的一部分,負責與抗體的抗原結合結構域進行特定的相互作用。抗原結合結構域可以由一或多個抗體可變結構域提供。一個抗原結合結構域可以包括至少一個抗體輕鏈可變區(VL)和至少一個抗體重鏈可變區(VH)。一個抗原結合結構域也可以只包括VH或只包括VL區。特言之,在本文中,表位可以是人類GM2AP的一個特定結構域或結構域組合。在本文的一些實施例中,特定結構域或結構域組合是包括SEQ ID NO:1的胺基酸序列的人類GM2AP。
術語「互補決定區(CDR)」被定義為抗體中可變鏈的一部分,這些分子在此與它們的特定抗原結合。在本文中,重鏈中的CDR區通常被稱為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,而在輕鏈中則為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。它們是從胺基末端到羧基末端的方向依次編號。
框架區和CDR的範圍是根據Kabat等人(參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991)和ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(參見Lefranc,Nucleic Acids Res 29:207-9,2001;以及線上imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=O&Option=humanlg)來定義。
在本文中「Kabat系統」是指根據Kabat(1991;Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit.,NIH publication No.91-3242U.S.Department of Health and Human Services)和Chothia(1987;J.Mol.Biol.196,901-917)以一致的方式對殘基進行編號的標準。這個編號系統被所屬技術領域具有通常知識者廣泛使用,並且是基於序列的變異性和可變結構域區域的三維環狀結構,這對抗原結合活性很重要。輕鏈或重鏈的所有殘基在Kabat系統中有不同的位置;即Kabat系統適用於CDR以及框架區。任何抗體的特定殘基的位置可以根據Kabat系統進行編號。根據Kabat系統識別VH和VL鏈的CDR區的規則顯示在www.bioinf.org.uk/abs。
IMGT獨特編號系統是Kabat系統的替代品,其允許比較可變域,無論抗原受體、鏈的類型或物種為何(Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pomrnie,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.and Lefranc,Dev.Comp.lmmunol.,27,55-77(2003))。在IMGT獨特編號系統中,保守的胺基酸總是有相同的位置,例如半胱胺酸23(1st-CYS),色胺酸41(CONSERVED-TRP),疏水性胺基酸89,半胱胺酸104(2nd-CYS),苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特編號系統提供了框架區(FR1 IMGT:位置1至26,FR2-IMGT:位置39至55,FR3-IMGT:位置66至104,FR4-IMGT:位置118至128)和互補決定區(CDR1-IMGT:27至38,CDR2-IMGT:56至65和CDR3-IMGT:105至117)的標準化劃定。由於空隙代表未被佔用的位置,CDR IMGT的長度(顯示在括號內,用點分隔,例如[8.8.13])成為關鍵資訊。IMGT獨特編號系統用於20個圖形表示,指定為IMGT Colliers de Perles
[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.and Lefranc,M.-P.P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)],以及IMGT/3Dstructure-DB中的三維結構[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Tcell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。
本文所用的術語「抗原結合片段」是指一種抗體片段,例如雙體(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體(disulfide stabilized diabody,ds diabody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule,scfv)、scfv二聚體(scfv dimer,雙價雙體(bivalent diabody)),由包括一或多個CDR的抗體的一部分形成的多特異性抗體,或任何其他與抗原結合但不包括完整的抗體結構的抗體片段。抗原結合片段能夠與其母體抗體或母體抗體片段(例如,母體scFv)所結合的相同抗原進行結合。在某些情況下,一個抗原結合片段可以包括一或多個來自特定人類抗體的CDR,嫁接到來自於一或多個不同人類抗體的框架區。
在上述抗原結合片段中,Fab係指一個具有輕鏈和重鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈第一恆定區(CH1)的結構,並且具有一個抗原結合位點。Fab'與Fab不同,Fab'有一個鉸鏈區,包括重鏈CH1結構域C端的至少一個半胱胺酸殘基。當Fab'的鉸鏈區的半胱胺酸殘基通過雙硫鍵連接時,就會產生F(ab')2。
Fv是一個最小的抗體片段,只具有重鏈可變區和輕鏈可變區。生產Fv片段的重組技術是本技術領域內所周知的。「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由一個輕鏈可變區和一個重鏈可變區直接或通過肽連接子序列相互連接組成的工程化抗體。雙鏈Fv可以有一個結構,其中重鏈可變區通過非共價鍵與輕鏈
可變區相連。單鏈Fv一般可形成二聚體結構,如雙鏈Fv,其中重鏈可變區通過肽連接子與輕鏈可變區共價連接,或者重鏈和輕鏈可變區在其C端直接連接。該連接子可以是包括任何1至100個或2至50個胺基酸的肽連接子,而對其有用的適當序列是本技術領域內所周知的。
抗原結合片段可以用蛋白酶獲得(例如,整個抗體可以用木瓜蛋白酶消化以獲得Fab片段,或者可以用胃蛋白酶消化以獲得F(ab')2片段),或者可以通過基因重組技術來製備。
本文所使用的術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」是指具有均一分子組成的抗體分子的製備物。一個單株抗體組成物對一個特定的表位顯示出單一的結合特異性和親和力。
本文所用的術語「人類抗體」旨在包括具有可變區的抗體,其中框架和CDR區都來自人類種系免疫球蛋白序列。此外,如果該抗體包含一個恆定區,該恆定區也來自人類種系免疫球蛋白序列。本發明的人類抗體可以包括人類種系免疫球蛋白序列沒有編碼的胺基酸殘基(例如,通過體外或體內體細胞突變以隨機或定點誘變所引入的突變)。然而,本文所使用的術語「人類抗體」並不包括CDR序列來自另一哺乳動物物種,如小鼠的種系,被嫁接到人類框架序列的抗體。
術語「人類單株抗體」是指顯示單一結合特異性的抗體,其可變區中的框架和CDR區均來自人類種系免疫球蛋白序列。
本文使用的術語「重組」旨在包括通過重組技術來製備、表現、建立或分離的所有分子,例如使用轉染到宿主細胞的重組表現載體所表現的多特異性分子(例如雙特異性分子)、從轉基因為人類免疫球蛋白基因的動物(例如
小鼠)中分離的多特異性分子(例如。雙特異性分子)(例如,參見Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通過任何其他涉及將人類免疫球蛋白和/或MHC基因序列拼接(splicing)到其他DNA序列的方法所製備、表現、建立或分離的多特異性分子。這種重組的多特異性分子可以包括具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗原結合域。
本文所使用的術語「重組人類抗體」包括所有通過重組技術所製備、表現、建立或分離的人類抗體,例如:(a)從轉基因或轉染色體為人類免疫球蛋白基因的動物(如小鼠)或由其製備的融合瘤(下文進一步描述)中分離的抗體,(b)從轉型為表現人類抗體的宿主細胞中分離的抗體,例如從轉染瘤(transfectoma),(c)從重組的、組合的人類抗體庫中分離出來的抗體,以及(d)通過任何其他涉及人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接的方法製備、表現、建立或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有可變區,其中框架和CDR區來自人類種系免疫球蛋白序列。然而,在某些實施例中,這樣的重組人抗體可以進行體外誘變(in vitro mutagenesis)(或者,當使用人類Ig序列的轉基因動物時,係進行體內體細胞誘變),因此,重組人類抗體的VH和VL區域的胺基酸序列雖然衍生自於人類種系VH和VL序列並與之相關,但可能不會天然存在在體內的人類抗體種系庫(human antibody germline repertoire)中。
術語「人源化抗體」指的是由非人類物種產生的抗體,包括經過修飾的蛋白質序列,以增加其與人類天然產生抗體之變體的相似性。人源化過程可能是必要的,以避免在人類中施用非人類來源的抗體時產生不希望的免疫原性效應。相較之下,這裡提到的術語「嵌合抗體」是指將一個物種的抗原結合區(即VH和VL)與另一物種的恆定結構域融合而製成的抗體。
本文所用的術語「Kassoc」或「Ka」是指特定抗體-抗原相互作用的結合速率,而本文所用的術語「Kdis」或「Kd」則是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術語「KD」是指解離常數,它由Kd與Ka的比率(即Kd/Ka)得到,並以莫耳濃度(M)表示。抗體的KD值可以用所屬技術領域內公認的方法來確定。
術語「序列同一性百分比(%)」或「同源性(homology)」被定義為候選序列中與參考序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的百分比,其係在校準排列(alignment)序列之後,並於必要時引入間隙以達到最大的序列同一性百分比,並排除保守的核酸替換。用以比較序列的最佳排列(alignment)除了手工操作外,還可以通過本技術領域已知的局部同源算法或使用這些算法的電腦程式(如BLAST P)來產生。
下述實施例所提及之核苷酸及胺基酸序列係綜整於表1至3中。
以下描述根據本文的某些示例性實施例。
根據本文的一個實施例,本文提供了一種重組抗體,其能特異性地結合GM2活化蛋白(GM2AP)(「抗GM2AP抗體」)或其抗原結合片段。本實施例的GM2AP可包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的胺基酸序列。本實施例的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可與SEQ ID NO:1的胺基酸1至14,或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸57至70的
一或多個胺基酸殘基進行特異性結合。較佳地,抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可於SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的胺基酸57至70與GM2AP特異性結合。換句話說,SEQ ID NO:1的所述胺基酸1至14和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的胺基酸57至70形成本實施例中抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的表位。
如本文所用,「與GM2AP特異性結合」的抗體是指與GM2AP結合的抗體,其結合值KD小於1x 10-8M,小於1x 10-9M,小於1x 10-10M,小於1x 10-11,或甚至更小。
抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可包括一個輕鏈可變區(LCVR)和一個重鏈可變區(HCVR)。在一些實施方案中,LCVR可包括與SEQ ID NO:5、7、11、13、15、17、20、22、24或26具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。同時,HCVR較佳係包括與SEQ ID NO:6、10、12、14、16、18、19、21、23、25或27具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。更佳地,該LCVR和HCVR對可以分別包括與SEQ ID NO:5/6、11/12、13/14、15/16、17/18、17/19、20/21、22/23、24/25或26/27具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列對。
此外,LCVR可包括三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。LCDR1、LCDR2和LCDR3中的每一個都可以包括與SEQ ID NO:51、52、53、57、58、59、69、70、71、75、76、77、81、82、83、87、88、89、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115或116至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。同時,HCVR可包括三個重鏈互補決
定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。HCDR1、HCDR2和HCDR3中的每一個可以包括與SEQ ID NO:54、55、56、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、93、94、95、99、100、101、105、106、107、111、112、113、117、118或119至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。
更佳地,LCDR1/LCDR2/LCDR3可分別具有與SEQ ID NO:51/52/53、57/58/59、69/70/71、75/76/77、81/82/83、87/88/89、96/97/98、102/103/104、108/109/110或114/115/116為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的的胺基酸序列。此外,HCDR1/HCDR2/HCDR3可以分別具有與SEQ ID NO:54/55/56、66/67/68、72/73/74、78/79/80、84/85/86、90/91/92、93/94/95、99/100/101、105/106/107、111/112/113或117/118/119為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。再更佳的是,LCDR1/LCDR2/LCDR3/HCDR1/HCDR2/HCDR3可以分別具有與SEQ ID NO:51/52/53/54/55/56,69/70/71/72/73/74,75/76/77/78/79/80,81/82/83/84/85/86,87/88/89/90/91/92,87/88/89/93/94/95,96/97/98/99/100/101,102/103/104/105/106/107,108/109/110/111/112/113,或114/115/116/117/119為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的胺基酸序列。
此處所用之重組抗體或其抗原結合片段可為雙體(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體(disulfide stabilized diabody,ds diabody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody
molecule,scfv)、scfv二聚體(scfv dimer,雙價雙體(bivalent diabody))或其任意組合。此外,重組抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體或其任意組合。較佳地,重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體。
根據本文的一個實施例,還提供了一種多核苷酸,其編碼本文中提到的任何一種抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。該多核苷酸可包括與SEQ ID NO:28至30、33至50具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)同一性的核酸序列。在一些實施方案中,編碼前述實施例之重組抗體或其抗原結合片段的LCVR的核酸序列可與SEQ ID NO:28、30、34、36、38、40、43、45、47或50具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)的同一性。同時,編碼前述實施例之重組抗體或其抗原結合片段的HCVR的核酸序列可以與SEQ ID NO:29、33、35、37、39、41、42、44、46、48或49有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)的同一性。
此外,前述實施例的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的LCVR/HCVR對,可分別由與SEQ ID NO:28/29、34/35、36/37、38/39、40/41、40/42、43/44、45/46、47/48或50/49為至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%(或兩者之間的任何百分比)的核酸序列對所編碼。
在一些實施方案中,多核苷酸與編碼前述胺基酸序列者實質上相同。實質上相同的序列可以是多形態序列(polymorphic sequences),即族群中的替代序列或等位基因。實質上相同的序列也可以包括誘變的序列,包括包含沈默突變的序列。突變可以包括一或多個核苷酸殘基的變化,一或多個核苷酸殘基的缺失,或一或多個額外核苷酸殘基的插入。基於核酸編碼的退行性,實質上相同的序列也可以包括在本文所公開的胺基酸序列中任何指定胺基酸位置上編碼相同胺基酸的各種核苷酸序列。
基於本文的目的,還提供了一種包含上述多核苷酸的載體。此外,還提供了包含如上所述載體的宿主細胞。在一些實施方案中,宿主細胞可以是真核細胞,較佳是人工選擇或基因工程化的。真核細胞可包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、COS細胞、239F細胞、SF9細胞、SF21細胞及其組合。
一般來說,多核苷酸、載體和包含其之宿主細胞可用於產生前述實施例所提供的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。特言之,本實施例的多核苷酸可以是,例如,DNA或RNA,可以包含或不包含內含子序列。較佳地,多核苷酸可以是cDNA分子。
本實施例的多核苷酸可以藉由所屬技術領域已知的任何方法分離和獲得。例如,若抗體的核苷酸序列是已知的,編碼抗體的多核苷酸可以由化學合成的寡核苷酸組裝而成。舉例來說,這將涉及合成重疊之寡核苷酸(其含有編碼抗體的部分的序列),黏合(annealing)並連接這些寡核苷酸,然後通過PCR來擴增所連接的寡核苷酸。本文所揭露的多核苷酸也可以從任何其他合適的核酸來源產生,如抗體cDNA文庫,或從任何表現抗體的組織或細胞(如從選擇表現抗體的融合瘤細胞)所分離的cDNA文庫。編碼由宿主細胞(如融合瘤)
製造的抗GM2AP抗體的輕鏈和重鏈的cDNA,可以藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於使用噬菌體展示技術(phage display techniques)所獲得的抗體,編碼前述實施例所提供的抗GM2AP抗體的多核苷酸,可以從庫的各種噬菌體殖株中回收。在一些實施方案中,任何揭露的多核苷酸或分離的核酸可被納入表現載體中。用於在各種人類和動物細胞類型中表現的適當載體是本技術領域已知的。在一些實施方案中,係提供包括載體的宿主細胞。適當的宿主細胞例如包括,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、COS細胞、239F細胞、SF9細胞、SF21細胞及/或其他人類或非人類細胞品系。在一些實施方案中,當在培養基中培養時,宿主細胞可以瞬時或穩定地表現載體上的多核苷酸或分離的核酸,從而提供一種產生本文所揭露的抗體或片段的方法。
當獲得編碼VH和VL片段的DNA片段時,這些DNA片段可以藉由標準的重組DNA技術來進一步操作,例如將可變區基因轉換為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中,編碼VL或VH的DNA片段與另一個DNA分子,或編碼另一種蛋白質的片段,如抗體恆定區或可撓性連接子,係進行可操作性連接。術語「可操作性連接」在此係指兩個DNA片段以功能性的方式連接,例如使兩個DNA片段編碼的胺基酸序列保持在讀取框內(in-frame),或使蛋白質在所需啟動子的控制下進行表現。
藉由將編碼VH區的DNA與另一個編碼重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)的DNA分子進行可操作性連接,可以將分離出來的編碼VH區的DNA轉換成全長的重鏈基因。小鼠和人類(或其他哺乳動物)重鏈恆定區基因的序列在本技術領域是已知的(例如,參見Kabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),包含這些區域的DNA片段可以通過標準
PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施方案中,重鏈恆定區是選自於在IgG1同型。對於Fab片段重鏈基因,編碼VH的DNA可以與另一個只編碼重鏈CH1恆定區的DNA分子進行可操作性連接。
編碼VL區的經分離DNA可以藉由編碼VL的DNA與另一個編碼輕鏈恆定區CL的DNA分子進行可操作性連接,而轉換為全長的輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。小鼠和人類(或其他哺乳動物)輕鏈恆定區基因的序列在本技術領域是已知的(例如,參見Kabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),包含這些區域的DNA片段可以通過標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可以是kappa或lambda恆定區。
為了建立scFv基因,編碼VH和VL的DNA片段係可操作性地連接另一個編碼可撓性連接子的片段,例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3,致使VH和VL序列可以作為一個連續的單鏈蛋白來表現,而VL和VH區由可撓性連接子連接(例如,參見Bird et al.,1988 Science 242:423-426;Huston et at.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-554)。
根據本文的一個實施例,還提供了一種用於檢測生物樣品中GM2活化蛋白(GM2AP)的套組。該套組可包括本文中提到的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。較佳地,該實施例的套組可進一步包括受質(substrate)和二級抗體,該抗體與訊號產生單元接合(conjugate),並結合至抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的Fc結構域。受質被配置為與訊號產生單元進行反應以產生訊
號。此外,套組還可進一步包括阻斷溶液及/或清洗溶液。較佳地,阻斷溶液可包括脫脂牛奶、牛血清白蛋白或酪蛋白,清洗溶液可包括磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline,PBS)、Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS)、含有清潔劑(detergent)的PBS或含有清潔劑(detergent)的TBS。
在某些實施方案中,生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。此外,訊號產生單元可包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。較佳地,標籤性酵素可包含辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)或鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
更佳地,若訊號產生單元為辣根過氧化酶,則受質為四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)。
本文還提供了一種藉由前述抗GM2AP抗體或其抗原結合片段,或更具體地說,藉由前述實施例的套組來檢測生物樣品中的GM2活化蛋白(GM2AP)的方法。本實施例的方法可包括以下步驟:(a)將本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段施用至所述生物樣品;(b)將所述生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育;(c)偵測所述可偵測標籤。
為了本文之目的,生物樣品可包含全血、血清、血漿、尿液或其組合,且二級抗體係結合至該抗體或其抗原結合片段的Fc域。此外,可偵測標籤可包含鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。同時,步驟(c)可藉由以下方式來執行:將可偵測標籤與對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)溶液共同孵育,並在OD405測量其吸收度。
或者,可偵測標籤可包含辣根過氧化酶,而步驟(c)可藉由以下方式來執行:將可偵測標籤與四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)溶液共同孵育,並在OD450測量其吸收度。
本文亦提供一種誘發任一種本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段的方法。本實施例的方法包含以下步驟:(a)對個體施用一胜肽片段,該胜肽片段包含SEQ ID NO:1至4中任一者的胺基酸序列;(b)形成融合瘤(hybridoma)細胞;以及(c)篩選分泌特異性結合至糖基化GM2AP之抗體的融合瘤細胞。
較佳地,步驟(a)的胜肽片段可包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列。
對於本技術領域具有通常知識者來說,顯然可以對所揭露之實施例進行各種修飾和變化。以下實驗例係旨在示例性說明。
以下個實驗例所用之材料可商購獲得,或是由所屬技術領域具有通常知識者從與相關之可商購獲得材料所簡單獲得而無須過度實驗。
在本文中,GM2AP或GM2AP的胜肽片段被靜脈注射到BALB/C小鼠體內以產生單株抗體。具體來說,在一個實施方案中,與(GlcNAc)2Fuc(Man)3
連接GM2AP(SEQ ID NO:1,PIIVPGNVTLSVG)的胜肽片段被用來在待測個體(如小鼠)中誘發抗體。在另一個實施方案中,與(GlcNAc)2Fuc(Man)3連接的GM2AP(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)被用來在待測個體中誘發抗體。在另一個實施方案中,為方便純化,用聚His標記(如8個組氨酸)的GM2AP(SEQ ID NO:4)被用於誘發個體的抗體。也可以應用其他標籤,如FLAG、Myc、HA等。
為了產生特異性識別GM2AP的單株抗體,簡言之,重組GM2AP(SEQ ID NO:4)在SF9細胞和/或SF21細胞中進行表現(圖1)。所表現的重組GM2AP通過Ni Excell管柱加以純化(緩衝液A:0.3M氯化鈉,25mM磷酸鈉,20mM咪唑,pH8.0;緩衝液B:0.3M氯化鈉,25mM磷酸鈉,500mM咪唑,pH8.0;透析緩衝液:0.3M氯化鈉,25mM磷酸鈉,pH8.0)。SF21細胞裂解液首先通過0.22uM膜來過濾。用緩衝液A對Ni Excell柱進行預平衡,然後將過濾的細胞裂解液裝載至管柱中。用緩衝液A清洗管柱,用4%、8%、16%、50%和100%的緩衝液B從管柱子上洗脫重組GM2AP。收取16%和8%的組分並在透析緩衝液中進行透析(圖2)。
經純化的GM2AP被靜脈注射到BALB/C小鼠體內以產生單株抗體。通過間接ELISA測試所生成的抗GM2AP血清的滴度。簡言之,GM2A蛋白(經His標記)和CD40(21-193)蛋白(陰性對照)被塗覆在ELISA板上。小鼠抗組胺酸標籤單株抗體(1000X)係作為陽性對照,正常血清作為陰性對照。對D56和D31出血前血清進行連續稀釋並加入到經塗覆的孔中。使用山羊抗小鼠IgG-HRP(1500X)作為二級抗體。測量樣品混合物的吸光度OD450。結果顯示在表4和表5以及圖3中。
之後,犧牲小鼠,將活化的脾臟細胞與黑色素瘤細胞融合,以產生融合瘤。將所有融合瘤殖株中對GM2AP顯示出最高的親和力的殖株,靜脈注射到小鼠體內以產生腹水,用以擴增抗體。在所有殖株中顯示出對GM2AP的最
高親和力的抗體株被進一步選擇用於進一步研究,例如殖株編號21-2B5-F7、21-2H9-G2、21-4E3-C8、21-4B10-E1、21-G4-B11、22-5B1-B2、22-5F2-E10、22-4B11-B9、22-3E6-B11、22-2E9-G12等。
所有數據均以平均值±標準差(STDEV)來表示。數據比較係藉由非配對學生t檢驗(Student t test)或單因子變異數分析(ANOVA)來確定。P值小於0.05被認為是統計學上顯著的。
如表4和表5以及圖3所示,D56和D31的出血前血清都包含有特異性結合GM2AP的抗體,而不結合CD40(21-193)蛋白。抗GM2AP抗體的存在通過西方墨點法進一步證實(數據未顯示)。
此外,在所有的抗體株中,進一步選擇了對GM2AP親和力最高的抗體株進行進一步研究。即對殖株編號21-2B5-F7、21-2H9-G2、21-4E3-C8、21-4B10-E1、21-4G4-B11、22-5B1-B2、22-5F2-E10、22-4B11-B9、22-3E6-B11和22-2E9-G12的抗體進行了序列分析。LCVR/HCVR的胺基酸序列和對應的CDRs(LCDR1至3和HCDR1至3)顯示在表2。編碼這些單株抗體的LCVR/HCVR的核酸序列顯示在表3中。此外,所述單株抗體的濃度表列如下。
藉由西方墨點檢測法,將前述實例所提供的四個抗體株(21-4B10-E1,21-4E3-C8,21-2H9-G2和21-2B5-F7)與一個商用抗GM2AP抗體(Sigma)進行比較。該檢測是通過以下步驟進行的。
12mL的尿液樣品以50kDa切分(50kDa cut-off)的Centricon離心過濾裝置(Millipore)加以離心,直到上部的樣品體積小於500μL。將去離子水加入上部,使最終體積為12mL,然後進行離心,直到上部的樣品體積小於500μL。第二次向上部加入去離子水,使最終體積為12mL,然後進行離心,直到上部的樣品體積小於500μL。對所收集的樣品進行脫鹽和濃縮,然後進行SDS-PAGE分析,在樣品緩衝液中不添加無還原劑。對於SDS-PAGE分析,每個孔裝載25μL收集的樣品(大約10μg的蛋白質量)。運行後的凝膠被轉移到硝化纖維素(NC)膜上,然後用前述實例所提供的四個殖株抗GM2AP抗體(21-4B10-E1,21-4E3-C8,21-2H9-G2和21-2B5-F7)和商用抗GM2AP抗體(Sigma)作為初級抗體,藉由實驗室的標準步驟用適當的二級抗Fc抗體進行西方墨點分析來染色。商用抗GM2AP抗體(Sigma)在使用前以1:1000稀釋。四株抗GM2AP抗體的濃度綜整於表7。
其結果顯示於圖4中。如圖4所示,尿液樣品中的GM2AP蛋白明顯地被前述實例所提供的四個抗GM2AP抗體株全部檢測到,而用商用抗GM2AP抗體(Sigma)染色的泳道上沒有這種訊號。
在鏈霉菌素(streptavidin)板的孔中加入各種帶有N端或C端生物素修飾的GM2AP蛋白片段(50ng/孔,表8)(C端生物素修飾片段用「(C)」表示)。在37℃下孵育一小時後,每孔加入500ng/孔的初級抗體(GM9=檢測抗體;GM10=捕獲抗體),隨後在37℃下再孵育一小時。在每個孔中加入二級抗體(抗小鼠(HRP),1:10000稀釋),在37℃下再孵育一小時。加入TMB作為受質和呈色劑,在黑暗中反應5分鐘。然後加入終止液來淬熄反應,測定每孔的OD450吸光度。
如圖5和6所示,GM9和GM10對VITAEin 1至30的部分有顯著的識別,對GM2AP 170至193的部分有輕微的識別。經過結構分析(數據未顯示),VITAEin 1至30和VITAEin 170至193在結構上定位緊密。因此,可以推斷,抗體可以識別VITAEin 1至30的部分,也可以在空間上識別VITAE1至30和VITAEin 170至193的兩個部分。VITAEin 1至30和VITAE 170至193在NCBI上進行了蛋白質BLAST。非VITAEin的蛋白質沒有出現在結果的前100個點擊(hits)中。因此,這些抗體被證明對識別區域具有高度的特異性。
此外,藉由GE BIAcore 3000儀器的表面電漿共振(SPR)來分析GM9和GM10抗體對(GM10=捕獲;GM9=檢測)的ka(M-1s-1)、kd(s-1)和KD(M)值,綜整如表9。
從表9中可以看出,藉由SPR試驗顯示GM9和GM10的KD值分別為1.25E-10M和8.8E-10M。因此,抗體GM9和GM10顯示對抗原有很高的親和力,並且很難與抗原分離。
無需進一步闡述,咸信本技術領域具有通常知識者可以根據上述描述,最大限度地利用本發明。因此,所述具體實例應被理解為僅僅是說明性的,而非以以任何方式限制本文的其餘部分。
本文引用的所有參考文獻(例如出版物或專利或專利申請案)均通過引用將其整體併入本文,其程度與每個單獨的參考文獻(例如出版物或專
利或專利申請案)具體和單獨地指出藉由引用將其整體併入本文的程度相同,以用於所有目的。其他實施例係涵括在後附之申請專利範圍中。
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<223> 22-5F2-E10 HCDR3
Claims (15)
- 一種特異性結合GM2活化蛋白(GM2-activator protein,GM2AP)的重組抗體或其抗原結合片段,其中該重組抗體或其抗原結合片段包含:一輕鏈可變區(LCVR),包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個輕鏈互補決定區(LCDR1至3)胺基酸序列:SEQ ID NO:57至59;以及一重鏈可變區(HCVR),包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個重鏈互補決定區(HCDR1至3)胺基酸序列:SEQ ID NO:66至68。
- 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR係由SEQ ID NO:7的胺基酸序列所組成。
- 根據請求項2之重組抗體或其抗原結合片段,其中該HCVR係由SEQ ID NO:10的胺基酸序列所組成。
- 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段,其中該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組:雙體(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體(disulfide stabilized diabody,ds diabody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule,scfv)、scfv二聚體(scfv dimer,雙價雙體(bivalent diabody))及其任意組合。
- 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段,其中該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組:單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體及其任意組合。
- 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段,其中該重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體。
- 一種編碼根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段的多核苷酸,包含選自由SEQ ID NO:30及33所組成之群組的核酸序列。
- 根據請求項7之多核苷酸,其中編碼該LCVR的核酸序列係SEQ ID NO:30。
- 根據請求項8之多核苷酸,其中編碼該HCVR的核酸序列係SEQ ID NO:33。
- 一種在生物樣品中偵測GM2激活劑蛋白(GM2AP)的方法,包含:(a)將根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段施用至所述生物樣品;(b)將所述生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育;(c)偵測所述可偵測標籤。
- 根據請求項10之方法,其中該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。
- 根據請求項10之方法,其中該二級抗體係結合至該抗體或其抗原結合片段的Fc域。
- 根據請求項10之方法,其中該可偵測標籤包含鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
- 根據請求項10之方法,其中該步驟(c)係藉由以下所執行:將該可偵測標籤與對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)溶液共同孵育,並在OD405測量其吸收度。
- 根據請求項10之方法,其中該步驟(c)係藉由以下所執行:將該可偵測標籤與四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)溶液共同孵育,並在OD405測量其吸收度。
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