JP2023027019A - 抗ｇｍ２ａｐ抗体及びその応用 - Google Patents
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Abstract
【課題】本開示は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＭ２ＡＰ）と特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合断片を提供する。【解決手段】前記組換え抗体又はその抗原結合断片は、本開示の実施例に開示された配列に規定される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１～３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１～３）を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含む。本開示には、これをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ＧＭ２ＡＰを検出するための方法及びキット、並びにそれらの組換え抗体又はその抗原結合断片を誘導する方法も提供されている。【選択図】図１
Description
本開示は、新規な組換え抗体又はその任意の抗原結合断片に関するものである。具体的に、本開示は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）に対する新規な組換え抗体又はその任意の抗原結合断片及びその応用に関するものである。
ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）は、Ａｓｎ結合グリコシル化部位を持つ小さな単量体タンパク質である。最初に前駆体として合成され、次に３２Ｓｅｒでのグリコシル化、修飾、切断を経て成熟型となる。成熟したＧＭ２ＡＰは、脱糖した状態（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｆｏｒｍ）で分子量が１７．６ｋＤａである糖タンパク質である。補因子として、ＧＭ２ＡＰは、β－ｃｕｐと呼ばれる疎水性ポケット構造（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｃｋｅｔ）、オリゴ糖結合部位、Ｈｅｘ Ａと相互作用する領域を含む少なくとも３つの機能的特徴を持つ。Ｈｅｘ Ａと相互作用する領域は、リソソームβ－ヘキソサミンＡ（Ｈｅｘ Ａ）によるＧＭ２ガングリオシド（ＧＭ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）のＧＭ３への分解に寄与している。しかし、合成されたＧＭ２ＡＰの３分の１しか分泌されなかった。細胞は、炭水化物に依存しないメカニズムを介して、表皮角化細胞や線維芽細胞等の様々な細胞によってＧＭ２ＡＰを再捕捉することが可能である。機能的なＧＭ２ＡＰの欠如は、重度のリソソーム貯蔵障害であるＧＭ２ガングリオシドーシスＡＢバリアントの患者の組織におけるＧＭ２ガングリオシドの異常な蓄積の原因である。ＧＭ２ＡＰの遺伝的欠損は、ガングリオシド及び腫瘍の発生に関与する腫瘍関連ガングリオシドの量の変化にも関連している。腫瘍関連ガングリオシドは、最初の発癌性形質転換の結果であり、浸潤と転移を誘発する役割を果す。腫瘍細胞は、その微小環境でガングリオシドを合成して放出し、その結果、血清中の腫瘍関連ガングリオシドの量が増加する。さらに、ガングリオシドは、細胞増殖、接着、細胞間相互作用、及びシグナル伝達において調節的役割を示すことが知られている。
既存技術のニーズに応じて、本開示は、以下の実施例を提供する。
一つの実施例において、本開示は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）と特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１～５３、５７～５９、６３～６５、６９～７１、７５～７７、８１～８３、８７～８９、９６～９８、１０２～１０４、１０８～１１０、１１４～１１６からなる群よりそれぞれ独立して選ばれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１～３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４～５６、６０～６２、６６～６８、７２～７４、７８～８０、８４～８６、９０～９２、９３～９５、９９～１０１、１０５～１０７、１１１～１１３、１１７～１１９からなる群よりそれぞれ独立して選ばれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１～３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、を含む、組換え抗体又はその抗原結合断片を提供する。
好ましくは、前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、及び/又は、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む。
より好ましくは、前記ＬＣＶＲ／ＨＣＶＲ対は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１７／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５又は２６／２７のアミノ酸配列対を含む。
好ましくは、前記ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３、５７／５８／５９、６３／６４／６５、６９／７０／７１、７５／７６／７７、８１／８２／８３、８７／８８／８９、９６／９７／９８、１０２／１０３／１０４、１０８／１０９／１１０、又は１１４／１１５／１１６のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４／５５／５６、６０／６１／６２、６６／６７／６８、７２／７３／７４、７８／７９／８０、８４／８５／８６、９０／９１／９２、９３／９４／９５、９９／１００／１０１、１０５／１０６／１０７、１１１／１１２／１１３又は１１７／１１８／１１９のアミノ酸配列を含む。
より好ましくは、前記ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３／ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３／５４／５５／５６、５７／５８／５９／６０／６１／６２、６３／６４／６５／６６／６７／６８、６９／７０／７１／７２／７３／７４、７５／７６／７７／７８／７９／８０、８１／８２／８３／８４／８５／８６、８７／８８／８９／９０／９１／９２、８７／８８／８９／９３／９４／９５、９６／９７／９８／９９／１００／１０１、１０２／１０３／１０４／１０５／１０６／１０７、１０８／１０９／１１０／１１１／１１２／１１３、又は１１４／１１５／１１６／１１７／１１８／１１９のアミノ酸配列を含む。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記組換え抗体又はその抗原結合断片は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓｆｖ－ｄｓｆｖ’）、ジスルフィド結合によって安定化されたダイアボディ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ｓｃｆｖ）、ｓｃｆｖ二量体（ｓｃｆｖ ｄｉｍｅｒ、二価のダイアボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｄｉａｂｏｄｙ））及びそれらの組合せからなる群より選ばれるものである。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記組換え抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びそれらの組合せからなる群より選ばれるものである。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記組換え抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体である。
一つの実施例において、本開示は、本開示に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～５０からなる群より選ばれる核酸配列を含む。
好ましくは、前記ＬＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４３、４５、４７、５０からなる群より選ばれるものであり、及び／又は、前記ＨＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４４、４６、４８、４９からなる群より選ばれるものである。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記ＬＣＶＲ／ＨＣＶＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４０／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、又は５０／４９の核酸配列対によってコードされている。
一つの実施例において、本開示は、本開示に記載のポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクターを提供する。
一つの実施例において、本開示は、本開示に記載のベクターのいずれか一つを含む宿主細胞を提供する。
好ましくは、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）ｃｅｌｌ）、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＣＯＳ細胞、２３９Ｆ細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞及びその組み合わせからなる群より選ばれるものである。
一つの実施例において、本開示は、本開示に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片を含み、生体試料においてＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出するためのキットを提供する。
好ましくは、前記キットは、基質と、シグナル生成ユニットとコンジュゲートし、前記組換え抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合する二次抗体と、を含む。前記基質は、シグナル生成ユニットと反応してシグナルを発生するように構成されている。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記生体試料は、全血、血清、血漿、尿又はそれらの組合せを含む。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記シグナル生成ユニットは、放射性マーカー、蛍光マーカー、燐光マーカー、化学発光マーカー、又は標識酵素を含む。好ましくは、標識酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）又はアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含んでも良い。
上記の実施例のいずれかにおいて、シグナル生成ユニットが西洋ワサビペルオキシダーゼである場合、基質はテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）である。
好ましくは、上記の実施例のいずれかにおいて、キットは、ブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに含む。ブロッキング溶液は、脱脂乳、ウシ血清アルブミン又はカゼインを含む。
上記の実施例のいずれかにおいて、キットは、洗浄液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに含む。好ましくは、洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＴＢＳ）、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＰＢＳ、又は洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＴＢＳを含む。
一つの実施例において、本開示は、生体試料においてＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出する方法であって、（ａ）本開示に記載の生組換え抗体又はその抗原結合断片を前記生体試料に投与するステップと、（ｂ）前記生体試料を検出可能なラベルが接合される二次抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記検出可能なラベルを検出するステップと、を含む方法を提供する。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記生体試料は、全血、血清、血漿、尿又はそれらの組合せを含む。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記二次抗体は、前記抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合されている。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記検出可能なラベルは、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含む。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記ステップ（ｃ）は、前記検出可能なラベルをｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４０５での吸光度を測定することにより行われる。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記ステップ（ｃ）は、前記検出可能なラベルをテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４０５での吸光度を測定することにより行われる。
１つの実施形態において、本開示は、本開示に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つを誘導する方法であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４のアミノ酸配列のいずれか１つを含むペプチド断片を個体に投与するステップと、（ｂ）ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、（ｃ）グリコシル化ＧＭ２ＡＰと特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をスクリーニングするステップと、を含む、方法を提供する。
上記の実施例のいずれかにおいて、前記ペプチド断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む。
本開示における上記及び他の点は、以下の他の実施例においてより詳しく説明される。本発明について、異なる形態で表すことができ、本開示に記載された実施形態に限定されると解釈すべきではないことを理解されたい。むしろ、これらの実施例は、単に本発明をより徹底的かつ完全に開示するためのものであって、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるために提供されるものである。
本開示で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明を限定することを意図するものではない。本開示及び添付の特許請求の範囲において、「一つ」（「ａ」、「ａｎ」）及び「当該」の単数形は、文脈から明らかに反対のことが示されていない限り、複数形も含む。
本開示のように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ、ｈａｖｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｎｔａｉｎｓ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「…を特徴とする」との用語、又はその他の変形は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているが、明示的に記載された制限に従う必要がある。例えば、列挙された単位からなる組成物、混合物、手段又は方法は、必ずしもそれらの単位のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されなく、或は前記組成物、混合物、手段又は方法に固有の他の単位を含んでも良い。
移行句「…からなる」は、特定されていないユニット、ステップ、又はコンポーネントを除外する。請求項の場合、当該請求項は、通常、それに関連する不純物を除いて、記載された材料のみを含めると制限されることになる。「…からなる」という用語が、標的の名称の直後ではなく、ある節に現れる場合、それはその節で指定された要素のみを制限し、他の要素は請求項の全体から除外されるわけではない。
ある発明又はその一部を定義するために、例えば、「含む」とのような開放的な用語が使用される場合、特に断らない限り、その記載も「…からなる」という用語によってそのような発明を記述していると解釈されるべきであると理解される。
本開示で使用される「約」という用語は、ある数値が、例えば、測定器固有の誤差のばらつき、その数値を確定するために使用される方法、或は、被験者の間に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。通常の場合、この用語とは、具体的な状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％の変動率、或はそれよりも小さい変動率を含むことを指す。
特許請求の範囲で使用される「又は」という用語は、本開示に代替物のみと「及び／又は」との定義が裏付けられているとしても、代替物のみ、或は、代替物が相互に排他的であることが明示されていない限り、「及び／又は」を意味する。
本開示で使用する「個体」という用語は、ヒト又は動物を指す。例示的な個体は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、及び治療から利益を得る可能性のある病気を有する他の哺乳動物であり得る。
「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、本開示の抗体を個体に提供することを指す。例として、限定するものではないが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内（ｉｎｔｒａｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ）、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、体腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内（ｉｎｔｒａｃｏｌｉｃ）、子宮頸内、胃内、肝内、心筋内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｔｅａｌ）、骨盤内、心膜内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｃａｒｄｉａｃ）、腹膜内、胸膜内（ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ）、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、胸腔内（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ）、子宮内（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ）、膀胱内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）、膣、直腸、頬（ｂｕｃｃａｌ）、舌下、鼻腔内及び経皮により投与することができる。例えば、注射は、静脈注射（ｉ．ｖ．）、皮下注射（ｓ．ｃ．）、皮内注射（ｉ．ｄ．）、腹腔注射（ｉ．ｐ．）、又は筋肉注射（ｉ．ｍ．）によって行うことができる。これらの経路のうち、１つ又は複数を採用することができる。
本開示で言及される「抗体」という用語は、無傷の抗体及び任意の抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又はその単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）が互に接続された糖タンパク質又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、一つの重鎖可変領域（ここではＶＨと略す）及び一つの重鎖定常領域（ここではＣＨと略す）から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、一つの軽鎖可変領域（ここではＶＬと略される）及び一つの軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲＩ、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する一つの結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
「エピトープ」又は「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、抗体の抗原結合ドメインとの特定の相互作用を担う抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは、１つ又は複数の抗体可変ドメインによって提供され得る。一つの抗原結合ドメインは、少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び少なくとも１つの抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。１つの抗原結合ドメインは、ＶＨ領域のみ又はＶＬ領域のみを含み得る。具体的に、本開示において、エピトープは、ヒトＧＭ２ＡＰの一つの特定のドメイン又はドメインの組み合わせであり得る。本開示のいくつかの実施例では、特定のドメイン又はドメインの組み合わせは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むヒトＧＭ２ＡＰである。
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、抗体中の可変鎖の一部として定義され、ここで、これらの分子はそれらの特定の抗原に結合する。本開示において、重鎖中のＣＤＲ領域は、一般的にＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖ではＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に順番に番号が付けられている。
フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、Ｋａｂａｔ等（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９１参照）、及び、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデーターベース（ＩＭＧＴ）（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：２０７－９， ２００１；及びネットｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝Ｏ＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎｌｇ参照）に基づいて定義される。
本開示における「Ｋａｂａｔシステム」とは、Ｋａｂａｔ（１９９１；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７）に基づいて、一貫した方法で残基に番号を付ける基準を指す。この番号付けシステムは、当業者に広く使用されており、抗原結合活性にとって重要な配列の多様性及び可変ドメイン領域の三次元ループ構造に基づくものである。軽鎖又は重鎖のすべての残基は、Ｋａｂａｔシステムにおいて異なる位置を持つ。つまり、Ｋａｂａｔシステムは、ＣＤＲ及びフレームワーク領域に適用される。任意の抗体における特定の残基の位置は、Ｋａｂａｔシステムに従って番号付けすることができる。Ｋａｂａｔシステムに従ってＶＨ及びＶＬ鎖のＣＤＲ領域を識別するための規則は、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓに示されている。
ＩＭＧＴ独自の番号付けシステムは、Ｋａｂａｔシステムに代わるものであり、抗原受容体、鎖のタイプ、又は種に関係なく可変ドメインを比較することを可能にする（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．－Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８， ５０９ （１９９７）／Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．－Ｐ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６ （１９９９）／Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， Ｐｏｍｒｎｉｅ， Ｃ．， Ｒｕｉｚ， Ｍ．， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｖ．， Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ， Ｅ．， Ｔｒｕｏｎｇ， Ｌ．， Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ－Ｃｏｎｔｅｔ， Ｖ． ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ．ｌｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３））。ＩＭＧＴ独自の番号付けシステムでは、保存されたアミノ酸は常に同じ位置、例えばシステイン２３（１ｓｔ－ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ－ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ－ＣＹＳ）、フェニルアラニン又はトリプトファン１１８（Ｊ－ＰＨＥ又はＪ－ＴＲＰ）にある。ＩＭＧＴ独自の番号付けシステムは、フレームワーク領域（ＦＲ１－ＩＭＧＴ：位置１～２６、ＦＲ２－ＩＭＧＴ：位置３９～５５、ＦＲ３－ＩＭＧＴ：位置６６～１０４、ＦＲ４－ＩＭＧＴ：位置１１８～１２８）と相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ：２７～３８、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ：５６～６５、ＣＤＲ３－ＩＭＧＴ：１０５～１１７）の標準的な区切りを提供している。ボイドは占有されていない場所を表すため、ＣＤＲ ＩＭＧＴの長さ（例えば、［８．８．１３］のように、ドットで区切られた括弧内に表示される）が重要な情報になる。ＩＭＧＴ独自の番号付けシステムは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓ［Ｒｕｉｚ， Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５３， ８５７－８８３ （２００２）／Ｋａａｓ， Ｑ． ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． Ｐ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２， ２１－３０ （２００７）］、及び、ＩＭＧＴ／３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢにおける三次元元構造と指定される、２０のグラフィック表示で使用されている。
本開示で使用される「抗原結合断片」という用語は、例えば、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓｆｖ－ｄｓｆｖ’）、ジスルフィド結合によって安定化されたダイアボディ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ｓｃｆｖ）、ｓｃｆｖ二量体（ｓｃｆｖ ｄｉｍｅｒ、二価のダイアボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｄｉａｂｏｄｙ））、１つ又は複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、又は抗原に結合するが無傷の抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合断片は、その親抗体又は親抗体断片（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合する抗原と同様のものに結合することができる。ある場合、一つの抗原結合断片は、１つまたな複数の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域に移植された、特定のヒト抗体由来の１つまたな複数のＣＤＲを含み得る。
上記の抗原結合断片のうち、Ｆａｂとは、軽鎖と重鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖第１定常領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１つの抗原結合部位を有するものを指す。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点でＦａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合によって連結されたときに生成される。
Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片である。Ｆｖ断片を作製するための組換技術は、当技術分野で周知のものである。「一本鎖Ｆｖ抗体」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が直接又はペプチドリンカー配列を介して互いに連結された工学的抗体を指す。二重鎖Ｆｖは、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結された構造を有することができる。一本鎖Ｆｖは一般的に、重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有連結され、或は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそのＣ末端において直接連結される二量体構造（例えば、二重鎖Ｆｖ）を形成することができる。このリンカーは、任意の１から１００又は２から５０のアミノ酸を含むペプチドリンカーであっても良く、それに有用な適切な配列は当技術分野で周知のものである。
抗原結合断片は、プロテアーゼを使用することによって得ることができ（例えば、抗体全体をパパインで消化してＦａｂ断片を得ても良く、ペプシンで消化してＦ（ａｂ’）２断片を得ても良い）、又は遺伝子組み換え技術によって調製できる。
本開示で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、均一な分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
本開示で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する抗体を含むものを指す。さらに、当該抗体が一つの定常領域を含む場合、当該定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明におけるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロ又はインビボでの体細胞突然変異によるランダム又は標的変異誘発によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本開示で使用される「ヒト抗体」という用語は、ＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されたマウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来する抗体を含まない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、可変領域におけるフレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。
本開示で使用される「組換え」という用語は、組換え技術によって調製、発現、確立、又は単離したすべての分子、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される多重特異性分子（例えば、二重特異性分子）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された多重特異性分子（例えば、二重特異性分子）（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：６２８７－６２９５参照）、又はヒト免疫グロブリン及び／又はＭＨＣ遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）する他の方法によって調製、発現、確立又は単離した多重特定分子を含むことを指す。このような組換え多重特異性分子は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗原結合ドメインを含み得る。
本開示で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え技術によって調製、発現、確立、又は単離されたすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック又はトランス染色体である動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明する）から単離された抗体と、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体と、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体と、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列とのスプライシングに係わる他の方法によって調製、発現、確立、又は単離された抗体と、を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（又は、ヒトＩｇ配列を有するトランスジェニック動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発が行われる）を受けることができる。したがって、組換えヒト抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連するものの、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）内に天然に存在しない可能性がある。
「ヒト化抗体」という用語は、ヒトの自然発生抗体の変異体との類似性を高めるために改変されたタンパク質配列を含む、非ヒト種によって産生される抗体を指す。ヒト以外の由来の抗体をヒトに投与する際に、望ましくない免疫原性作用を回避するために、ヒト化のプロセスが必要な場合がある。これに対し、ここで言及される「キメラ抗体」という用語は、ある種の抗原結合領域（即ち、ＶＨ及びＶＬ）を別の種の定常ドメインと融合させることによって作製される抗体を指す。
本開示で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を指し、本開示で使用される「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原の解離速度を指す。本開示で使用される「ＫＤ」という用語は解離定数を指し、これはＫｄとＫａの比率（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で公認されている方法を使用して決定することができる。
「配列同一性パーセント（％）」又は「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、参照配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセントとして定義され、配列を整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）させた後、必要に応じてギャップを導入することで最大の配列同一性パーセントを達成するとともに、保存的核酸置換を排除することを指す。配列を比較するための最適なアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、手動操作の他に、当該技術分野で知られている局所的な相同性アルゴリズムや、これらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ Ｐ）によって生成することもできる。
以下の実施形態で言及するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表１～表３にまとめて示す。
表1.GM2APのアミノ酸配列
表1.GM2APのアミノ酸配列
表2.本開示で例示される組換え抗体のアミノ酸断片
表3.本開示で例示される抗体のLCVR/HCVRをコードするヌクレオチド配列
以下、本開示に係わるいくつかの例示的な実施例について説明する。
〔組換え抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片〕
本開示における一つの実施例によれば、本開示は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）と特異的に結合する組換え抗体（「抗ＧＭ２ＡＰ抗体」）又はその抗原結合断片を提供する。本実施例のＧＭ２ＡＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含んでも良い。本実施例の抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１～１４、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０の一つ又は複数のアミノ酸残基と特異的に結合し得る。好ましくは、抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０でＧＭ２ＡＰと特異的に結合し得る。言い換えると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１～１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０が本実施例における抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のエピトープを形成するものである。
本開示における一つの実施例によれば、本開示は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）と特異的に結合する組換え抗体（「抗ＧＭ２ＡＰ抗体」）又はその抗原結合断片を提供する。本実施例のＧＭ２ＡＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含んでも良い。本実施例の抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１～１４、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０の一つ又は複数のアミノ酸残基と特異的に結合し得る。好ましくは、抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０でＧＭ２ＡＰと特異的に結合し得る。言い換えると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１～１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸５７～７０が本実施例における抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のエピトープを形成するものである。
本開示で記載される「ＧＭ２ＡＰと特異的に結合する」抗体とは、１ｘ１０－８Ｍ未満、１ｘ１０－９Ｍ未満、１ｘ１０－１０Ｍ未満、１ｘ１０－１１未満、又はそれ以下の結合値ＫＤでＧＭ２ＡＰと結合する抗体を指す。
抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片は、一つの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び一つの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含んでも良い。いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４又は２６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を含んでも良い。一方、ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５又は２７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。より好ましくは、前記ＬＣＶＲ／ＨＣＶＲ対のそれぞれは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１７／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５又は２６／２７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列対を含んでも良い。
なお、ＬＣＶＲは、三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含んでも良い。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の各々は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５７、５８、５９、６３、６４、６５、６９、７０、７１、７５、７６、７７、８１、８２、８３、８７、８８、８９、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５又は１１６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を含んでも良い。一方、ＨＣＶＲは、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）を含んでも良い。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の各々は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９９、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１１１、１１２、１１３、１１７、１１８又は１１９との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を含んでも良い。
より好ましくは、ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３のそれぞれは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３、５７／５８／５９、６３／６４／６５、６９／７０／７１、７５／７６／７７、８１／８２／８３、８７／８８／８９、９６／９７／９８、１０２／１０３／１０４、１０８／１０９／１１０又は１１４／１１５／１１６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を有しても良い。なお、ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３のそれぞれは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４／５５／５６、６０／６１／６２、６６／６７／６８、７２／７３／７４、７８／７９／８０、８４／８５／８６、９０／９１／９２、９３／９４／９５、９９／１００／１０１、１０５／１０６／１０７、１１１／１１２／１１３又は１１７／１１８／１１９との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を有しても良い。さらに好ましくは、ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３／ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３のそれぞれは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３／５４／５５／５６、５７／５８／５９／６０／６１／６２、６３／６４／６５／６６／６７／６８、６９／７０／７１／７２／７３／７４、７５／７６／７７／７８／７９／８０、８１／８２／８３／８４／８５／８６、８７／８８／８９／９０／９１／９２、８７／８８／８９／９３／９４／９５、９６／９７／９８／９９／１００／１０１、１０２／１０３／１０４／１０５／１０６／１０７、１０８／１０９／１１０／１１１／１１２／１１３、又は１１４／１１５／１１６／１１７／１１９との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）であるアミノ酸配列を有しても良い。
ここで使用される組換え抗体又はその抗原結合断片は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓｆｖ－ｄｓｆｖ’）、ジスルフィド結合によって安定化されたダイアボディ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ｓｃｆｖ）、ｓｃｆｖ二量体（ｓｃｆｖ ｄｉｍｅｒ、二価のダイアボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｄｉａｂｏｄｙ））、又はそれらの組合せであっても良い。なお、組換え抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はそれらの組合せであっても良い。好ましくは、組換え抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体である。
〔組換え抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターと宿主細胞〕
本開示における一つの実施例によれば、さらに、本開示に記載される抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～５０との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）である核酸配列を含んでも良い。いくつかの実施形態では、上記の実施例の組換え抗体又はその抗原結合断片のＬＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４３、４５、４７又は５０とは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）の同一性を有しても良い。一方、上記の実施例の組換え抗体又はその抗原結合断片のＨＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４４、４６、４８又は４９とは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）の同一性を有しても良い。
本開示における一つの実施例によれば、さらに、本開示に記載される抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～５０との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）である核酸配列を含んでも良い。いくつかの実施形態では、上記の実施例の組換え抗体又はその抗原結合断片のＬＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４３、４５、４７又は５０とは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）の同一性を有しても良い。一方、上記の実施例の組換え抗体又はその抗原結合断片のＨＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４４、４６、４８又は４９とは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）の同一性を有しても良い。
なお、上記の実施例の抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のＬＣＶＲ／ＨＣＶＲ対のそれぞれは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４０／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８又は５０／４９との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（或は、その間の任意の割合）である核酸配列対によってコードされても良い。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前記アミノ酸配列をコードするものと実質的に同一である。実質的に同一の配列は、多型配列（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、即ち集団中の代替配列又は対立遺伝子であり得る。実質的に同一の配列はまた、サイレント変異を含む配列を含む、変異誘発された配列を含み得る。変異には、１つ又は複数のヌクレオチド残基の変化、１つ又は複数のヌクレオチド残基の欠失、又は１つ又は複数の追加のヌクレオチド残基の挿入が含まれ得る。実質的に同一の配列はまた、核酸コードの縮退に基づいて、本開示に記載されるアミノ酸配列中の任意のアミノ酸位置で同一のアミノ酸をコードする様々なヌクレオチド配列を含み得る。
本開示の目的に基づいて、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。さらに、前記ベクターを含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であっても良く、好ましくは、人工的に選択された、又は遺伝子工学的に操作されたものである。真核細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＯＳ細胞、２３９Ｆ細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞及びれらの組み合せが含まれるが、これらに限定されない。
一般的に、ポリヌクレオチド、ベクター及びそれを含む宿主細胞は、上記の実施例が提供する抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合性断片の製造に使用されることができる。特に、本実施例のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであっても良く、イントロン配列を含んでも含まなくても良い。好ましくは、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡ分子であり得る。
本実施例のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の方法によって単離・取得することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。例えば、抗体をコードする配列の一部を含むオーバーラップしたオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、ならびにライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が含まれる。本開示に記載されるポリヌクレオチドはまた、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から単離されたｃＤＮＡライブラリー等の任意の他の適切な核酸源から生成することもできる。宿主細胞（例えば、ハイブリドーマ）によって作製された抗ＧＭ２ＡＰ抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。ファージディスプレイ技術（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して得られる抗体については、前述の実施形態によって提供される抗ＧＭ２ＡＰ抗体をコードするポリヌクレオチドは、ライブラリーの様々なファージクローンから回収することができる。いくつかの実施形態では、開示されたポリヌクレオチド又は単離された核酸のいずれかが発現ベクターに組み込まれでも良い。様々なヒト及び動物細胞型における発現に適したベクターは、当技術分野で知られているものである。いくつかの実施形態では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。好適な宿主細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＯＳ細胞、２３９Ｆ細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、及び／又はその他のヒト又は非ヒト細胞株が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養培地で培養されると、ベクター上のポリヌクレオチド又は単離された核酸を一過性又は安定的に発現し、それによって、本開示に記載される抗体又は断片を産生する方法を提供し得る。
ＶＨ及びＶＬ断片をコードするＤＮＡ断片が得られた場合、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換する等の標準的な組み換えＤＮＡ技術によってさらに操作されることができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子、又は抗体定常領域やフレキシブルリンカー等の別のタンパク質をコードする断片に操作可能に連結される。ここで、「操作可能に連結される」という用語は、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミン酸配列がインフレームのままであるように、あるいはンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、２つのＤＮＡ断片が機能的に連結されることを意味する。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。マウス及びヒト（又は他の哺乳動物）の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得ることが可能である。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプの中から選択される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結することができる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。マウス及びヒト（又は他の哺乳動物）の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得ることが可能である。軽鎖定常領域は、ｋａｐｐａ又はｌａｍｂｄａ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を確立するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、ＶＨ及びＶＬ配列が連続した一本鎖タンパク質として発現できるように、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードするようなフレキシブルリンカーをコードする別の断片に操作可能に連結され、ＶＬ及びＶＨ領域はフレキシブルリンカーで連結されている（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｔ．， （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４参照）。
〔ＧＭ２ＡＰを検出するキット〕
本開示の一つの実施例によれば、生体試料中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出するためのキットも提供される。このキットは、本開示に記載される抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片を含んでも良い。好ましくは、本実施形態のキットは、基質と、シグナル生成ユニットとコンジュゲートし、抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合する二次抗体とをさらに含んでも良い。基質は、シグナル生成ユニットと反応してシグナルを発生するように構成されている。なお、キットは、ブロッキング溶液及び／又は洗浄液をさらに含んでも良い。好ましくは、ブロッキング溶液は、脱脂乳、ウシ血清アルブミン、又はカゼインを含んでも良く、洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＴＢＳ）、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＰＢＳ、又は洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＴＢＳを含んでも良い。
本開示の一つの実施例によれば、生体試料中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出するためのキットも提供される。このキットは、本開示に記載される抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片を含んでも良い。好ましくは、本実施形態のキットは、基質と、シグナル生成ユニットとコンジュゲートし、抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合する二次抗体とをさらに含んでも良い。基質は、シグナル生成ユニットと反応してシグナルを発生するように構成されている。なお、キットは、ブロッキング溶液及び／又は洗浄液をさらに含んでも良い。好ましくは、ブロッキング溶液は、脱脂乳、ウシ血清アルブミン、又はカゼインを含んでも良く、洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＴＢＳ）、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＰＢＳ、又は洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むＴＢＳを含んでも良い。
いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿又はそれらの組合せを含む。なお、シグナル生成ユニットは、放射性マーカー、蛍光マーカー、燐光マーカー、化学発光マーカー、又は標識酵素を含んでも良い。好ましくは、標識酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）又はアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含んでも良い。
好ましくは、シグナル生成ユニットが西洋ワサビペルオキシダーゼである場合、基質はテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）である。
〔ＧＭ２ＡＰを検出する方法〕
本開示には、上記の抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片によって、又はより具体的には上記の実施例のキットによって、生体試料中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出する方法も提供されている。本実施例の方法は、（ａ）本開示に記載される組換え抗体又はその抗原結合断片を生体試料に投与するステップと、（ｂ）前記生体試料を検出可能なラベルが接合される二次抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）検出可能なラベルを検出するステップと、を含んでも良い。
本開示には、上記の抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片によって、又はより具体的には上記の実施例のキットによって、生体試料中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出する方法も提供されている。本実施例の方法は、（ａ）本開示に記載される組換え抗体又はその抗原結合断片を生体試料に投与するステップと、（ｂ）前記生体試料を検出可能なラベルが接合される二次抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）検出可能なラベルを検出するステップと、を含んでも良い。
本開示の目的に基づいて、生体試料は、全血、血清、血漿、尿又はそれらの組合せを含んでも良く、二次抗体は、抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合されている。さらに、検出可能なラベルは、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含んでも良い。また、ステップ（ｃ）は、検出可能なラベルをｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４０５での吸光度を測定することにより行われることが可能である。
また、検出可能なラベルは、西洋ワサビペルオキシダーゼを含んでも良く、 ステップ（ｃ）は、検出可能なラベルをテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４５０での吸光度を測定することにより行われることが可能である。
〔抗ＧＭ２ＡＰ抗体又はその抗原結合断片を誘導する方法〕
本開示では、本開示に記載される組換え抗体又はその抗原結合断片のいずれか一つを誘導する方法も提供されている。本実施例の方法は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４のアミノ酸配列のいずれか１つを含むペプチド断片を個体に投与するステップと、（ｂ）ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞を形成するステップと、（ｃ）グリコシル化ＧＭ２ＡＰと特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をスクリーニングするステップと、を含む。
好ましくは、ステップ（ａ）のペプチド断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含んでも良い。
当業者にとって、開示された実施例に対して様々な修正及び変形を行うことができることは明らかである。以下の実験例は、例示的な説明を意図したものである。
〔実験例〕
以下の実験例で使用される材料は、市販されるものから入手するか、又は当業者であれば、過度の実験をすることなく、関連する市販の材料から容易に入手することが可能である。
以下の実験例で使用される材料は、市販されるものから入手するか、又は当業者であれば、過度の実験をすることなく、関連する市販の材料から容易に入手することが可能である。
〔ＧＭ２ＡＰの作製と精製〕
ここで、ＧＭ２ＡＰ又はＧＭ２ＡＰのペプチド断片をＢＡＬＢ／Ｃマウスに静脈内注射し、モノクローナル抗体を作製する。具体的に、一つの実施形態では、（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｆｕｃ（Ｍａｎ）３に連結されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＰＩＩＶＰＧＮＶＴＬＳＶＧ）のペプチド断片は、試験対象（例えば、マウス）における抗体の誘導に用いられる。別の実施形態では、（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｆｕｃ（Ｍａｎ）３に連結されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、試験対象における抗体の誘導に用いられる。別の実施形態では、精製を容易にするために、ポリＨｉｓ（例えば、八つのヒスチジン）で標識されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、個体内での抗体の誘導に用いられる。例えば、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＨＡ等、他のラベルも適用することが可能である。
ここで、ＧＭ２ＡＰ又はＧＭ２ＡＰのペプチド断片をＢＡＬＢ／Ｃマウスに静脈内注射し、モノクローナル抗体を作製する。具体的に、一つの実施形態では、（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｆｕｃ（Ｍａｎ）３に連結されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＰＩＩＶＰＧＮＶＴＬＳＶＧ）のペプチド断片は、試験対象（例えば、マウス）における抗体の誘導に用いられる。別の実施形態では、（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｆｕｃ（Ｍａｎ）３に連結されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、試験対象における抗体の誘導に用いられる。別の実施形態では、精製を容易にするために、ポリＨｉｓ（例えば、八つのヒスチジン）で標識されたＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、個体内での抗体の誘導に用いられる。例えば、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＨＡ等、他のラベルも適用することが可能である。
ＧＭ２ＡＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を作製するために、簡単に言うと、組換えＧＭ２ＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をＳＦ９細胞及び／又はＳＦ２１細胞で発現させた（図１）。発現した組換えＧＭ２ＡＰをＮｉ Ｅｘｃｅｌｌカラムで精製した（緩衝液Ａ：０．３Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；緩衝液Ｂ：０．３Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；透析緩衝液：０．３Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）。ＳＦ２１細胞溶解液は、最初に０．２２ｕＭ膜を通して濾過された。Ｎｉ Ｅｘｃｅｌｌカラムを緩衝液Ａで予め平衡化し、濾過した細胞溶解液をカラムにロードした。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、組換えＧＭ２ＡＰを４％、８％、１６％、５０％及び１００％の緩衝液Ｂでカラムから溶出した。１６％と８％の画分を収集し、透析緩衝液で透析した（図２）。
精製したＧＭ２ＡＰをＢＡＬＢ／Ｃマウスに静脈内注射し、モノクローナル抗体を作製した。作製された抗ＧＭ２ＡＰ血清の力価は間接ＥＬＩＳＡにより測定された。簡単に説明すると、ＧＭ２Ａタンパク質（Ｈｉｓで標識）とＣＤ４０（２１－１９３）タンパク質（陰性対照）をＥＬＩＳＡプレートにコートした。陽性対照としてマウス抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体（１０００Ｘ）を使用し、陰性対照として正常血清を使用した。Ｄ５６及びＤ３１の出血前血清を連続的に希釈し、コーティングされたウェルに加えた。二次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１５００Ｘ）を使用した。検体混合物のＯＤ４５０での吸光度を測定した。結果を表４、５及び図３に示す。
その後、マウスを犠牲にし、活性化された脾臓細胞をメラノーマ細胞と融合させ、融合腫瘍を作製した。すべての融合腫瘍クローンの中で、ＧＭ２ＡＰに対して最も高い親和性を示すクローンをマウスに静脈注射して腹水を生成し、抗体を増幅させた。すべてのクローンの中で、ＧＭ２ＡＰに対して最も高い親和性を示す抗体クローン、例えば、クローンＮＯ．２１－２Ｂ５－Ｆ７、２１－２Ｈ９－Ｇ２、２１－４Ｅ３－Ｃ８、２１－４Ｂ１０－Ｅ１、２１－Ｇ４－Ｂ１１、２２－５Ｂ６－Ｂ２、２２－５Ｆ２－Ｅ１０、２２－４Ｂ１１－Ｂ９、２２－３Ｅ６－Ｂ１１、２２－２Ｅ９－Ｇ１２等を研究のためにさらに選択した。
［統計分析］
すべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＴＤＥＶ）として示された。データの比較は、対応のないスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。
［結果］
表４、５及び図３に示すように、Ｄ５６及びＤ３１の両方の出血前血清には、ＧＭ２ＡＰと特異的に結合する抗体が含まれていたが、ＣＤ４０（２１－１９３）タンパク質には結合しなかった。抗ＧＭ２ＡＰ抗体の存在は、さらにウェスタンブロットアッセイにより確認された（データは示していない）。
すべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＴＤＥＶ）として示された。データの比較は、対応のないスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。
［結果］
表４、５及び図３に示すように、Ｄ５６及びＤ３１の両方の出血前血清には、ＧＭ２ＡＰと特異的に結合する抗体が含まれていたが、ＣＤ４０（２１－１９３）タンパク質には結合しなかった。抗ＧＭ２ＡＰ抗体の存在は、さらにウェスタンブロットアッセイにより確認された（データは示していない）。
表4.抗GM2AP血清_D56の力価
表 5.抗GM2AP血清_D31の力価
さらに、すべての抗体クローンのうち、ＧＭ２ＡＰに対する親和性が最も高い抗体クローンを、さらなる研究のためにさらに選択した。即ち、クローンＮＯ．２１－２Ｂ５－Ｆ７、２１－２Ｈ９－Ｇ２、２１－４Ｅ３－Ｃ８、２１－４Ｂ１０－Ｅ１、２１－４Ｇ４－Ｂ１１、２２－５Ｂ６－Ｂ２、２２－５Ｆ２－Ｅ１０、２２－４Ｂ１１－Ｂ９、２２－３Ｅ６－Ｂ１１及び２２－２Ｅ９－Ｇ１２の抗体に対して配列分析を行った。ＬＣＶＲ／ＨＣＶＲのアミノ酸配列及び対応するＣＤＲｓ（ＬＣＤＲ１～３及び ＨＣＤＲ１～３）を表２に示す。これらのモノクローナル抗体のＬＣＶＲ／ＨＣＶＲをコードする核酸配列を表３に示す。なお、モノクローナル抗体の濃度は以下の通りである。
表6. モノクローナル抗GM2AP抗体の濃度
〔ウェスタンブロットアッセイによる本開示の抗ＧＭ２ＡＰ抗体と他の市販のＥＬＩＳＡキットとの比較〕
上記の実施例で提供した４つの抗体クローン（２１－４Ｂ１０－Ｅ１、２１－４Ｅ３－Ｃ８、２１－２Ｈ９－Ｇ２及び２１－２Ｂ５－Ｆ７）と市販の抗ＧＭ２ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）とを、ウェスタンブロットアッセイにより比較した。このアッセイは、以下の手順で行った。
上記の実施例で提供した４つの抗体クローン（２１－４Ｂ１０－Ｅ１、２１－４Ｅ３－Ｃ８、２１－２Ｈ９－Ｇ２及び２１－２Ｂ５－Ｆ７）と市販の抗ＧＭ２ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）とを、ウェスタンブロットアッセイにより比較した。このアッセイは、以下の手順で行った。
１２ｍＬの尿検体を、５０ｋＤａカットオフ（５０ｋＤａ ｃｕｔ－ｏｆｆ）のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、上部の検体体積が５００μＬ未満になるまで遠心分離した。上部に脱イオン水を加えて最終体積を１２ｍＬとし、上部の検体体積が５００μＬ未満になるまで遠心分離を行った。２回目に脱イオン水を加えて最終体積を１２ｍＬとし、上部の検体体積が５００μＬ未満になるまで遠心分離した。収集した検体に対して脱塩、濃縮を行った後、検体緩衝液に還元剤を添加せずにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析では、各ウェルに収集した検体（タンパク質量にして約１０μｇ）を２５μＬずつロードした。泳動後のゲルをニトロセルロース（ＮＣ）膜に移し、上記の実施例で提供した４つのクローン化抗ＧＭ２ＡＰ抗体（２１－４Ｂ１０－Ｅ１、２１－４Ｅ３－Ｃ８、２１－２Ｈ９－Ｇ２及び２１－２Ｂ５－Ｆ７）と市販の抗ＧＭ２ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）とを一次抗体として、ラボでの標準手順で適当な二次抗Ｆｃ抗体を用いてウェスタンブロットアッセイを行うことによって、染色した。市販の抗ＧＭ２ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）は、使用前に１：１０００に希釈した。４つの抗ＧＭ２ＡＰ抗体の濃度を表７にまとめた。
表7.ウェスタンブロットアッセイの抗GM2AP抗体の濃度
その結果を図４に示す。図４に示すように、尿検体中のＧＭ２ＡＰタンパク質は、上記の実施例で提供した４つの抗ＧＭ２ＡＰ抗体クローンのすべてで検出されたが、市販の抗ＧＭ２ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）で染色したレーンではそのようなシグナルは見られなかったことが明らかであった。
〔ＥＬＩＳＡとＳＰＲで分析した抗ＧＭ２ＡＰ抗体の感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ〕
ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）プレートのウェルに、Ｎ末端又はＣ末端のビオチン修飾を施した種々のＧＭ２ＡＰタンパク質断片（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ、表８）を添加した（Ｃ末端のビオチン修飾断片は「（Ｃ）」で示した）。３７℃で１時間インキュベートした後、５００ｎｇ／ｗｅｌｌの一次抗体（ＧＭ９＝検出抗体；ＧＭ１０＝捕捉抗体）を各ウェルに添加し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体（抗マウス（ＨＲＰ）、１：１００００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。基質及び発色剤としてＴＭＢを添加し、暗所で５分間反応させた。その後、終止液を加えて反応をクエンチし、各ウェルのＯＤ４５０での吸光度を測定した。
ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）プレートのウェルに、Ｎ末端又はＣ末端のビオチン修飾を施した種々のＧＭ２ＡＰタンパク質断片（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ、表８）を添加した（Ｃ末端のビオチン修飾断片は「（Ｃ）」で示した）。３７℃で１時間インキュベートした後、５００ｎｇ／ｗｅｌｌの一次抗体（ＧＭ９＝検出抗体；ＧＭ１０＝捕捉抗体）を各ウェルに添加し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体（抗マウス（ＨＲＰ）、１：１００００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。基質及び発色剤としてＴＭＢを添加し、暗所で５分間反応させた。その後、終止液を加えて反応をクエンチし、各ウェルのＯＤ４５０での吸光度を測定した。
表8.VITAEin断片
図５及び６に示すように、ＧＭ９及びＧＭ１０は、ＶＩＴＡＥｉｎ １～３０の部分を有意に識別し、ＧＭ２ＡＰの１７０～１９３の部分をわずかに識別している。構造解析後（データは示していない）、ＶＩＴＡＥｉｎ １～３０とＶＩＴＡＥｉｎ １７０～１９３は構造上密接に位置していることがわかった。したがって、この抗体は、ＶＩＴＡＥｉｎ １～３０の部分を識別できるとともに、ＶＩＴＡＥｉｎ １～３０とＶＩＴＡＥｉｎ １７０～１９３の２つの部分を空間的に識別できると推測される。ＶＩＴＡＥｉｎ １～３０及びＶＩＴＡＥｉｎ １７０～１９３は、ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴされたタンパク質であった。ＶＩＴＡＥｉｎ以外のタンパク質は、結果の最初の１００ヒット（ｈｉｔｓ）に現れなかった。したがって、これらの抗体は、識別領域に対して高度に特異的であることが証明された。
さらに、ＧＭ９及びＧＭ１０抗体対（ＧＭ１０＝捕捉；ＧＭ９＝検出）のｋａ（Ｍ－１ｓ－１）、ｋｄ（ｓ－１）及びＫＤ（Ｍ）値を、ＧＥ ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置による表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって分析し、表９にまとめた。
表9.抗GM2AP抗体のKD値
表９から分かるように、ＳＰＲ試験により、ＧＭ９及びＧＭ１０のＫＤ値は、それぞれ１．２５Ｅ－１０Ｍ及び８．８Ｅ－１０Ｍであることが示された。したがって、抗体ＧＭ９及びＧＭ１０は、抗原に対して高い親和性を有し、抗原からの解離が困難であることが示された。
さらに詳しく述べることなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、上記の具体例は、単に例示であって、本開示の残りの部分を何ら限定するものではないと理解されるべきである。
本開示で引用されるすべての参考文献（例えば、刊行物又は特許又は特許出願）は、個々の参考文献（例えば、刊行物又は特許又は特許出願）が、全ての目的のためにその全体を参照により組み込むことが具体的かつ個別に示されているかのと同じ程度に、その全体が参考として本開示に組み込まれている。その他の実施例については、添付の特許請求の範囲に含まれている。
Claims (20)
- ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＭ２ＡＰ）と特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合断片であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１～５３、５７～５９、６３～６５、６９～７１、７５～７７、８１～８３、８７～８９、９６～９８、１０２～１０４、１０８～１１０、１１４～１１６からなる群よりそれぞれ独立して選ばれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１～３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４～５６、６０～６２、６６～６８、７２～７４、７８～８０、８４～８６、９０～９２、９３～９５、９９～１０１、１０５～１０７、１１１～１１３、１１７～１１９からなる群よりそれぞれ独立して選ばれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１～３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、
を含むことを特徴とする組換え抗体又はその抗原結合断片。 - 前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- 前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む請求項２に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
を含む請求項３に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。 - ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３、５７／５８／５９、６３／６４／６５、６９／７０／７１、７５／７６／７７、８１／８２／８３、８７／８８／８９、９６／９７／９８、１０２／１０３／１０４、１０８／１０９／１１０、又は１１４／１１５／１１６のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４／５５／５６、６０／６１／６２、６６／６７／６８、７２／７３／７４、７８／７９／８０、８４／８５／８６、９０／９１／９２、９３／９４／９５、９９／１００／１０１、１０５／１０６／１０７、１１１／１１２／１１３、又は１１７／１１８／１１９のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む請求項２に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１／５２／５３／５４／５５／５６、５７／５８／５９／６０／６１／６２、６３／６４／６５／６６／６７／６８、６９／７０／７１／７２／７３／７４、７５／７６／７７／７８／７９／８０、８１／８２／８３／８４／８５／８６、８７／８８／８９／９０／９１／９２、８７／８８／８９／９３／９４／９５、９６／９７／９８／９９／１００／１０１、１０２／１０３／１０４／１０５／１０６／１０７、１０８／１０９／１１０／１１１／１１２／１１３、又は１１４／１１５／１１６／１１７／１１８／１１９のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３／ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む請求項３に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓｆｖ－ｄｓｆｖ’）、ジスルフィド結合によって安定化されたダイアボディ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ｓｃｆｖ）、ｓｃｆｖ二量体（ｓｃｆｖ ｄｉｍｅｒ、二価のダイアボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｄｉａｂｏｄｙ））及びそれらの組合せからなる群より選ばれるものである請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びそれらの組合せからなる群より選ばれるものである請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ヒト抗体である請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～５０からなる群より選ばれる核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記ＬＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４３、４５、４７、５０からなる群より選ばれるものである請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ＨＣＶＲをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４４、４６、４８、４９からなる群より選ばれるものである請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の核酸配列によってコードされ、
前記ＬＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０の核酸配列によってコードされ、前記ＨＣＶＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９によってコードされている請求項１３に記載のポリヌクレオチド。 - 生体試料においてＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片を前記生体試料に投与するステップと、
（ｂ）前記生体試料を検出可能なラベルが接合される二次抗体とともにインキュベートするステップと、
（ｃ）前記検出可能なラベルを検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記生体試料は、全血、血清、血漿、尿又はそれらの組合せを含む請求項１５に記載の方法。
- 前記二次抗体は、前記抗体又はその抗原結合断片のＦｃドメインに結合されている請求項１５に記載の方法。
- 前記検出可能なラベルは、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含む請求項１５に記載の方法。
- 前記ステップ（ｃ）は、前記検出可能なラベルをｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４０５での吸光度を測定することにより行われる請求項１５に記載の方法。
- 前記ステップ（ｃ）は、前記検出可能なラベルをテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）溶液とともにインキュベートし、ＯＤ４５０での吸光度を測定することにより行われる請求項１５に記載の方法。
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