KR101780877B1 - 인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (pd-l1)과 결합하는 항체 - Google Patents

인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (pd-l1)과 결합하는 항체 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 항원 결합 단편, 및 항-PD-L1 항체 또는 결합 단편; 및 인간 PD-L1과 결합된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용의 항체 및 항원 결합 단편은 조직 샘플에서의 인간 PD-L1 발현을 면역조직화학적으로 검출하는 데 유용하다. 본 개시내용의 항체 및 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라 그의 발현을 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 또한 제공된다.
[대표도]
도 11b

Description

인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (PD-L1)과 결합하는 항체 {ANTIBODIES THAT BIND TO HUMAN PROGRAMMED DEATH LIGAND 1 (PD-L1)}
본 발명은 인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (PD-L1)과 결합하고 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 인간 조직 샘플 중에서 PD-L1 발현을 검출하는 데 유용한 특이적 서열을 갖는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 항-인간-PD-L1 항체를 이용하는 특이적 IHC 검정에 관한 것이다.
PD-L1은 면역 조절과 말초성 면역내성의 유지에 있어서 중요한 수행자로서 인식되는, 프로그램된 사멸 1 (PD-1)에 대한 2개의 공지된 리간드 중 하나인 세포 표면 당단백질이다. PD-L1의 발현은 타고난 본래의 림프구 및 활성화 B 및 T 세포, 단구 및 수지상 세포를 포함한 각종 면역 세포의 표면 상에서 관찰되어 왔다 (상기 문헌). 더욱이, PD-L1 mRNA는 혈관 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포를 포함한 비-림프계 조직에 의해 발현되고, 편도 및 태반 조직에서 발현된다 (예를 들어, 문헌 [Keir, M.E. et al., Annu Rev Immunol . 26:677-704 (2008)]; [Sharp A.H. et al., Nature Immunol . 8:239-245 (2007)]; [Okazaki T and Honjo T, Internat. immunol. 19:813-824 (2007)] 참조).
PD-L1 발현은 또한, 각종 인간 암에서 관찰되어 왔고, 종양 세포 발현된 PD-L1과 PD-1 간의 상호 작용은 종양-특이적 T 세포의 억제 또는 아폽토시스를 유도시킬 수 있다. 예를 들어, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암 및 흑색종의 다수 샘플 세트에서, PD-L1 발현이 좋지 않은 예후와 상관이 있고 후속 치료와 무관하게 전반적인 생존율을 저하시키는 것으로 밝혀졌다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항-PD-1 모노클로날 항체가 각종 종양 유형에 대항하여 항-종양 활성을 지니는 것으로 밝혀졌는데, 초기 인간 임상 데이터는 PD-L1을 발현하는 종양 환자가 항-PD-1 요법에 더 잘 반응하는 것으로 예상된다고 제안하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Iwai et al., PNAS 99:12293-12297 (2002)]; [Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-2953 (2005)]; [Ghebeh et al., Neoplasia 8:190-198 (2006)]; [Hamanishi, J et al., PNAS 104:3360-3365 (2007)]; [Yang et al., Invest Ophthalmol Vis Sci . 49(6):2518-2525 (2008)]; [Gao et al., Clin Cancer Res 15:971-979 (2009)]; [Brahmer J.R. et al., J Clin Oncol. 28:3167-3175 (2010)] 참조).
최근 보고서에는 포르말린-고정되고 파라핀-봉매된 (FFPE) 인간 흑색종 샘플에서 hPD-L1의 발현을 검출하는 데 있어서의 유용성을 알아보기 위하여 15개의 항-인간 PD-L1 항체를 비교한 내용이 기재되어 있다 (Gadiot, J., et al., Cancer 117(10):2192-2201 (2011)). 이러한 비교에서 평가된 유용성 기준은 다음과 같다: (1) 파라핀-봉매된 조직을 염색할 수 있는 능력, (2) 저 배경 염색을 생성시킬 수 있는 능력, 및 (3) PD-L1 융합 단백질과의 예비-인큐베이션에 의해 PD-L1에 대한 결합을 차단하였는지의 여부. 상기 저자들은 시험된 15개 항체 중에서 토끼 항-인간 폴리클로날 항체인 Ab #4059 [프로사이(ProSci; 미국 캘리포니아주 포웨이)로부터 수득됨]가 이들 기준 모두를 허용 가능하게 충족시키는 유일한 항-인간 PD-L1 항체였다고 결론지었다 (상기 문헌, 2195, 두번째 칼럼).
본 발명은 본 발명자들이 본원에서, 프로사이 Ab #4059에 의해 생성된 것 보다 더 면역학적으로 관련된 것으로 여겨지는 FFPE 편도 조직에서 IHC 염색 패턴을 생성시키는 항-인간 PD-L1 모노클로날 항체에 관한 것이다. 다음 실시예에 기재되는 바와 같이, 본 발명자들은 상기 프로사이 항체 [PRS4059, 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich) 로트 40590604]가 편도 내의 모든 조혈 계통을 동등한 세기로 염색하는 반면, 본 발명의 2개 항체, 즉 22C3 및 20C3은 편도 음와 상피 세포와 난포 CD68+ 골수 세포 (이는 대식세포와 형태학적으로 일치한다)를 선택적으로 염색하였다는 사실을 밝혀내었다. 더욱이, 22C3 및 20C3은 이들 2가지 별개 세포 집단 간의 일관된 세기 차이를 명확히 보여주었는데, 음와 상피 세포에서의 염색 세기가 난포 대식세포에서 보다 훨씬 더 큰 것으로 나타났다. 3개 항체 (PRS4059, 22C3 및 20C3) 모두를 PD-L1 항원과의 예비-인큐베이션으로 중화시켰는데, 이는 그 반응성이 항원-결합 도메인 (CDR)에 의해 매개된다는 것을 표시해준다. 따라서, 본 발명은 또한, FFPE 조직 박편에서 PD-L1을 검출하기 위한 IHC 검정에서 수행하는 것 포함하여, 인간 세포의 표면 상에서 PD-L1 발현을 검출하는 데 있어서의, 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 이러한 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 3개 경쇄 CDR, 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 3개 중쇄 CDR을 포함한다.
CDRL1은 서열 1, 서열 9, 서열 21, 서열 9의 변이체, 및 서열 21의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. CDRL2는 서열 2 및 서열 2의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. CDRL3은 서열 3, 서열 10, 서열 22, 서열 10의 변이체, 및 서열 22의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
CDRH1은 서열 5, 서열 14, 서열 15, 서열 26, 서열 27, 서열 14의 변이체, 서열 15의 변이체, 서열 26의 변이체, 및 서열 27의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. CDRH2는 서열 6, 서열 16, 서열 28, 서열 16의 변이체, 및 서열 28의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. CDRH3은 서열 7, 서열 17, 서열 29, 서열 17의 변이체, 및 서열 29의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편에서, 변이체 CDR 서열 (경쇄 또는 중쇄)은 참조 서열 내의 1개 또는 2개의 보존적 아미노산 치환, 바람직하게 참조 서열 내의 단지 1개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 참조 서열과 동일하다. 바람직한 실시양태에서, 3개 경쇄 CDR 중 최대 2개는 변이체 서열이고, 3개 중쇄 CDR 중 최대 2개는 변이체 서열이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 6개 CDR 중 단지 3개, 2개 또는 1개가 변이체 서열이다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 3개 경쇄 CDR은 서열 1, 서열 2, 및 서열 3이고, 3개 중쇄 CDR은 서열 5, 서열 6 및 서열 7이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 3개 경쇄 CDR은 서열 9, 서열 2, 및 서열 10이고, 3개 중쇄 CDR은 서열 14, 서열 16 및 서열 17이다.
또한 또 다른 바람직한 실시양태에서, 3개 경쇄 CDR은 서열 21, 서열 2 및 서열 22이고, 3개 중쇄 CDR은 서열 26, 서열 28 및 서열 29이다.
본 발명의 일부 항체 및 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 경쇄 가변 영역은 서열 4, 서열 13, 서열 13의 변이체, 서열 25 및 서열 25의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 중쇄 가변 영역은 서열 8, 서열 20, 서열 20의 변이체, 서열 32 및 서열 32의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 실시양태에서, 변이체 경쇄 가변 영역 서열 프레임워크 영역 내에 (즉, CDR의 외부에) 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것, 및 바람직하게는 프레임워크 영역 내에 4개, 3개 또는 2개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다. 유사하게, 변이체 중쇄 가변 영역 서열은 프레임워크 영역 내에 (즉, CDR의 외부에) 17개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것, 및 바람직하게는 프레임워크 영역 내에 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다.
본 발명의 하나의 바람직한 항체 또는 항원 결합 단편에서, 경쇄 가변 영역은 서열 13이고 중쇄 가변 영역은 서열 20이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 25의 경쇄 가변 영역 및 서열 32의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 서열 25의 경쇄 가변 영역 및 서열 32의 중쇄 가변 영역 (여기서, 서열 32 중의 X는 pE임)을 포함한다.
또한 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 서열 25의 경쇄 가변 영역 및 서열 32의 중쇄 가변 영역 (여기서, 서열 32 중의 X는 Q임)을 포함한다.
상기 항체 실시양태 모두에서, 단리된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE를 포함한 모든 부류의 면역글로불린의 완전한 길이의 항체일 수 있다. 바람직하게, 항체는 IgG 항체, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 한 실시양태에서, 항체는 마우스 IgG1 불변 영역을 포함한다.
특히 바람직한 항체는 모노클로날 항체 20C3 및 22C3인데, 이들은 각각 하이브리도마 MEB037.20C3 및 MEB037.22C3에 의해 발현된 IgG1 항체이다.
본 발명은 또한, 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하고; 20C3 또는 22C3, 또는 서열 25 및 서열 32를 포함하는 참조 항체의 인간 PD-L1과의 결합을 차단하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 20C3 및 22C3 각각, 또는 (a) 서열 13 및 서열 20을 포함하는 참조 항체 및 (b) 서열 25 및 서열 32를 포함하는 참조 항체 각각의 인간 PD-L1과의 결합을 차단한다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 항체 또는 항체 단편 중 어느 것을 제제 중에 포함하는 항체 조성물을 제공한다. 하나의 적합한 제제는 20 mM 아세트산나트륨 및 9% 수크로스, pH 5.0을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 항체 분자의 혼합물을 포함하는데, 여기서 이 혼합물 중의 항체 분자의 대다수 (즉, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 어느 것 초과)는 서열 25 및 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 pE임)를 포함하고, 혼합물 중의 나머지 항체 분자는 서열 25 및 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 Q임)를 포함한다.
상기 실시양태 중 어느 것에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편이다.
상기 실시양태 중 어느 것에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 개시된 항체 가변 영역 중 어느 것을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 이러한 핵산은 서열 33 및 서열 34 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 핵산은 서열 35 및 서열 36 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 이들 실시양태 중 어느 것에서, 단리된 핵산은 바람직하게 발현 벡터이다.
본 발명은 또한, 상기 개시된 항체 가변 영역 중 어느 것을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게, 발현 벡터는 서열 33 및 서열 34를 포함하거나 또는 서열 35 및 서열 36을 포함한다.
본 발명은 또한, 인간으로부터 분리된 인간 조직 샘플을 PD-L1 발현에 대해 검정하는 방법을 제공한다. 이러한 검정 방법은 상기 조직 샘플을, 인간 PD-L1에 대한 PD-L1 결합 시약의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에 PD-L1 결합 시약과 접촉시키는 단계, 결합되지 않은 PD-L1 결합 시약을 제거하는 단계, 및 결합된 PD-L1 결합 시약의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 결합된 결합 시약의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다. 결합 시약은 상기 언급된 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 것이다. 바람직하게, 결합 시약은 서열 13 및 서열 20을 포함하거나 또는 서열 25 및 서열 32를 포함하는 항체이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 결합 단편은 서열 25 및 서열 32를 포함하는 항체 분자의 혼합물을 포함하는 항체 조성물인데, 여기서 이러한 분자의 대다수 (즉, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 어느 것 초과)는 서열 32 중의 위치 X에 pE를 갖고, 나머지 분자는 서열 32 중의 위치 X에 Q를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 조직 샘플을 PD-L1 발현에 대해 검정하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 PD-L1 결합 제제; 및 인간 PD-L1과 결합된 결합 제제를 포함하는 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 포함한다. PD-L1 결합 제제는 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하는 상기 언급된 모든 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이다. 바람직하게, 이러한 항체 또는 결합 단편은 서열 13 및 서열 20을 포함하거나 또는 서열 25 및 서열 32를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 결합 시약은 서열 25 및 서열 32를 포함하는 항체 분자의 혼합물을 포함하는 항체 조성물인데, 여기서 이러한 분자의 대다수 (즉, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 어느 것 초과)는 서열 32 중의 위치 X에 pE를 갖고, 나머지 분자는 서열 32 중의 위치 X에 Q를 갖는다.
도 1은 하이브리도마 MEB037.20C3으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 항체 가변 경쇄 및 중쇄 cDNA에 대한 뉴클레오티드 서열, 및 이에 의해 코딩된 예상되는 아미노산 서열 (볼드체)을 도시한 것인데, 각 괄호는 리더 펩티드에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표시하고 밑줄친 것은 CDR 서열을 표시한다.
도 2는 하이브리도마 MEB037.22C3으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 항체 가변 경쇄 및 중쇄 cDNA에 대한 뉴클레오티드 서열, 및 이에 의해 코딩된 예상되는 아미노산 서열 (볼드체)을 도시한 것인데, 각 괄호는 리더 펩티드에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표시하고 밑줄친 것은 CDR 서열을 표시한다.
도 3은 항체 20C3 및 22C3의 경쇄 및 중쇄의 성숙한 가변 영역에 대한 정렬된 아미노산 서열을 도시한 것인데, 볼드체는 그 서열들이 서로 다른 위치를 표시하고, 밑줄친 것은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 CDR 서열을 표시하며, 각 괄호는 코티아(Chothia) 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 CDR1을 표시한다.
도 4는 시판용 항체 PRS4059 (도 4a) 또는 본 발명의 22C3 항체 (도 4b)를 이용하여 면역조직화학 검정에 의해 생성된 편도 박편의 염색을 도시한 것인데, 도 4a 및 4b의 우측 상의 박편은 인간 PD-L1과의 결합을 놓고 항-인간 PD-L1 항체와 경쟁하는 PD-L1-IgG1 융합 단백질 [알앤디 시스템즈(R&D Systems)]과의 예비-인큐베이션 후의 결과를 도시한 것이다.
도 5는 인간 PD-L1 단백질 및 계내 혼성화 (ISH) mRNA 발현을 각각, 항체 22C3을 이용한 IHC 검정 (도 5a) 및 계내 혼성화 (ISH) (도 5b)에 의해 검정하였고, 2가지 독특한 세포 집단, 즉 음와 상피 세포 (도 5a, 좌측 확대도 및 도 5b, 상면도)와 난포 대식세포 (도 5a, 우측 확대도 및 도 5b, 저면도) 간의 차별적 염색을 명확하게 보여주는, 인접한 정상 FFPE 편도 조직 박편의 사진을 도시한 것이다.
도 6은 mRNA 분석 (qPCR)에 의해 hPD-L1의 발현에 대해 음성인 것으로 공지된 HT144 세포 (도 6a), 및 고 수준의 hPD-L1 mRNA (qPCR)를 발현시키는 것으로 공지된 LOX 흑색종 세포 (도 6b)에 대한 각종 항-인간 PD-L1 항체 및 동위원소 대조군 항체의 결합을 유동 세포계수법으로 평가한 결과를 예시한 것이다.
도 7은 조작된 CHO 세포주 (도 7a) 및 인간 세포주 (도 7b, 상부 패널)의 FFPE 세포 펠릿 상에서 항체 22C3에 의해 생성된 IHC 염색을 도시한 것인데, 이는 염색 세기가 동일한 인간 세포주에서 측정된 hPD-L1 mRNA 발현 수준과 상당히 상관이 있다는 것을 입증해 준다 (도 7b, 하부 패널).
도 8은 hPD-L1에 대한 항체 22C3 및 20C3의 선택적 결합 및 상대적 친화도를 예시한 것인데, 이들 그래프는 hPD-L1을 발현하지 않는 세포 (도 8a), hPD-L1을 발현하는 세포 (도 8b 및 8c), 또는 인간 PD-L2를 발현하는 세포 (도 8d)를, 표시된 농도 하에 표시된 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 본 실시예에 기재된 바와 같은 2차 염소, 항-인간 IgG 항체를 이용하여 상기 1차 항체의 결합을 검출하는, 세포-기반 ELISA 실험의 결과를 나타낸다.
도 9는 항체 22C3 및 20C3이 동일하지 않지만 중복되는 에피토프와 결합한다는 것을 입증해 주는 항체 결합 경쟁 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 10은 표시된 종양 유형으로부터의 FFPE 샘플의 22C3 IHC 염색의 세기를 반-정량적 게슈탈트(gestalt) 스코어링한 결과를 예시한 것인데, 염색 정도는 스코어 수가 증가함에 따라 증가한다.
도 11은 IHC 검정에서 항체 22C3을 이용하여 검출된 인간 PD-L1 발현이, 항-인간 PD-1 항체 (MK-3475)를 이용한 요법에 대한 흑색종 환자의 반응과 상관이 있다는 것을 예시하고 있는데, 도 11a는 hPD-L1 발현에 대한 양성, 음성 또는 불분명한 것으로서 해석된 22C3-IHC 염색의 대표적 영상을 도시한 것이고, 도 11b는 IHC 검정에 의해 hPD-L1 발현에 대해 양성 또는 음성으로서 스코어링되었던 (불분명한 것으로서 스코어링된 환자가 포함된다), 양성 또는 음성 반응을 나타낸 환자의 수를 도시한 것이다.
약어. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐 다음 약어가 사용될 것이다:
ADCC 항체-의존성 세포성 세포독성
CDC 보체-의존성 세포독성
CDR 달리 표시되지 않는 한, 카바트 넘버링 시스템을 이용하여 정의된, 면역글로불린 가변 영역 내의 상보성 결정 영역
CHO 중국산 햄스터 난소
코티아 문헌 [Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997)]에 기재된 항체 넘버링 시스템
EC50 50% 효능 또는 결합을 가져다 주는 농도
ELISA 효소-결합 면역흡착 검정
FFPE 포르말린-고정되고 파라핀-봉매된
FR 항체 프레임워크 영역: CDR 영역을 배제한 면역글로불린 가변 영역
HRP 서양고추냉이 퍼옥시다제
IFN 인터페론
IC50 50% 억제를 가져다 주는 농도
IgG 면역글로불린 G
카바트 문헌 [Elvin A. Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]에 최초로 보고된 면역글로불린 정렬 및 넘버링 시스템
mAb 또는 Mab 또는 MAb 모노클로날 항체
MES 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산
MOA 작용 기전
NHS 정상 인간 혈청
PCR 중합효소 연쇄 반응
pE 피로-글루타메이트
PK 약동학
SEB 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 장내독소 B
TT 파상풍 톡소이드
V 영역 상이한 항체들 간의 서열에 있어서 가변적인 IgG 쇄의 절편. 이는 경쇄 내의 카바트 잔기 109 및 중쇄 내의 잔기 113까지 연장된다.
VH 면역글로불린 중쇄 가변 영역
VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역.
정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정의 기술적 및 과학적 용어가 다음에 구체적으로 정의된다. 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 그의 상응하는 복수의 언급 대상을 포함한다.
세포 또는 수용체에 적용되는 바와 같은 "활성화"는 문맥상 달리 표시되지 않거나 명쾌하게 표시되지 않는 한, 세포 또는 수용체를 리간드로 활성화 또는 처리하는 것을 지칭한다. "리간드"는 자연 및 합성 리간드, 예를 들어 사이토킨, 사이토킨 변이체, 유사체, 돌연변이 단백질, 및 항체로부터 유래된 결합 화합물을 포괄한다. "리간드"는 또한, 소분자, 예를 들어 사이토킨의 펩티드 모방체 및 항체의 펩티드 모방체를 포괄한다. "활성화"는 내부 기전에 의해서 뿐만 아니라 외부 또는 환경적 요인에 의해 조절된 바와 같은 세포 활성화를 지칭할 수 있다.
분자의 "활성"은 리간드 또는 수용체에 대한 이러한 분자의 결합, 또는 촉매적 활성; 유전자 발현 또는 세포 신호 전달, 분화 또는 성숙화를 자극할 수 있는 능력; 항원성 활성, 다른 분자의 활성의 조정 등을 기재하거나 지칭할 수 있다. 분자의 "활성"은 또한, 세포 대 세포 상호 작용, 예를 들어 유착을 조정 또는 유지하는 데 있어서의 활성, 또는 세포의 구조, 예를 들어 세포 막 또는 세포골격을 유지하는 데 있어서의 활성을 지칭할 수 있다. "활성"은 또한, 평균 특이 활성, 예를 들어 [촉매적 활성]/[mg 단백질] 또는 [면역학적 활성]/[mg 단백질], 생물학적 구획 내에서의 농도 등일 수 있다. "활성"은 선천 면역계 또는 적응 면역계의 성분의 조정을 지칭할 수 있다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 적용되는 바와 같은 "투여" 및 "치료"는 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 제약 조성물, 치료 조성물 또는 진단 조성물을 상기 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 지칭한다. 세포의 치료는 시약을 상기 세포와 접촉시키는 것 뿐만 아니라 시약을 유체 (이러한 유체는 세포와 접촉되어 있다)와 접촉시키는 것을 포괄한다. "투여" 및 "치료"는 또한, 시약, 진단제, 결합 화합물 또는 또 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의 시험관내 및 생체외 치료를 의미한다. 용어 "대상체"는 모든 유기체, 바람직하게 동물, 보다 바람직하게 포유류 (예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 및 가장 바람직하게 인간을 포함한다.
"치료" 또는 "치료하는"은 치료제, 예컨대 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 것을 함유하는 조성물을 내적으로 또는 외적으로, 한 가지 이상의 질환 증상을 갖거나 또는 질환 (이에 대해 상기 치료제는 치료 활성을 지닌다)이 있는 것으로 의심되는 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 상기 제제는 임상적으로 측정 가능한 어떠한 정도로써 한 가지 이상의 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 또는 이러한 증상의 진행을 억제함으로써, 치료받은 대상체 또는 집단에게서 이러한 한 가지 이상의 질환 증상을 경감시키는 데 유효한 양으로 투여된다. 특정한 어느 질환 증상을 경감시키는 데 유효한 치료제의 양 ("치료 유효량"으로서 지칭되기도 함)은 질환 상태, 환자의 연령 및 체중, 및 대상체에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 약물의 능력과 같은 요인에 따라서 다양할 수 있다. 질환 증상이 경감되었는지의 여부는 이러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 전문 의료 공급자에 의해 전형적으로 사용되고 있는 모든 임상 측정에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 실시양태 (예를 들어, 치료 방법 또는 제조품)가 모든 대상체에게서 표적 질환 증상(들)을 경감시키는 데 유효하지 않을 수 있지만, 관련 기술분야에 공지된 모든 통계 시험, 예컨대 스튜던츠(Student's) t-시험, 카이(chi)2-시험, 만 앤드 휘트니(Mann and Whitney)에 따르는 U-시험, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험 (H-시험), 존키어-테릅스트라(Jonckheere-Terpstra)-시험 및 윌콕슨(Wilcoxon)-시험에 의해 결정된 바와 같이, 통계상 유의적 수의 대상체에게서 표적 질환 증상(들)을 경감시켜야 한다.
인간, 수의과 또는 연구 대상체에게 적용되는 바와 같은 "치료"는 치료적 처치 뿐만 아니라 연구 및 진단 적용을 지칭한다. 인간, 수의과 또는 연구 대상체, 또는 세포, 조직 또는 장기에 적용되는 바와 같은 "치료"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 인간 또는 동물 대상체, 세포, 조직, 생리학적 구획 또는 생리학적 유체와 접촉시키는 것을 포괄한다.
항-PD-L1 항체
항체 20C3은 하이브리도마 서브클론 MEB037.20C3.116에 의해 생성된 항체이다.
항체 22C3은 하이브리도마 서브클론 MEB037.22C3.138에 의해 생성된 항체이고, 마우스 IgG1의 동종이형 S414R에 상응한다. 22C3의 성숙한 중쇄의 N-말단 잔기는 글루타민 또는 피로-글루타메이트 (pE)인데, 이는 유전자 서열이 성숙한 중쇄 또는 경쇄 중의 N-말단 글루타민을 코딩하는 경우에 모노클로날 항체에서 자주 관찰되는 흔한 해독 후 변형물이다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 특정의 인간 세포의 표면 상에서 발현되는 성숙한 형태의 인간 PD-L1 (전 분비 리더 서열이 결여됨; 리더 펩티드로서 지칭되기도 함)과 결합된다. 용어 "PD-L1" 및 "성숙한 PD-L1"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 달리 표시되지 않거나 또는 맥락상 용이하게 명백하지 않는 한은 동일한 분자를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 성숙한 인간 PD-L1 분자는 다음 서열 (서열 37)의 아미노산 19-290으로 이루어진다:
Figure 112015068492245-pct00001
성숙한 인간 PD-L1의 세포외 도메인은 다음 서열 (서열 38)로 이루어진다:
Figure 112015068492245-pct00002
본원에 사용된 바와 같은, 항-인간 PD-L1 항체 또는 항-hPD-L1 항체는 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. "인간 PD-L1과 특이적으로 결합하는" 항체, 또는 "인간 PD-L1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원에 대한 결합과 비교해서 인간 PD-L1에 대한 우선적 결합을 나타내는 항체이지만, 이러한 특이성이 절대적 결합 특이성을 요구하지는 않는다. 항-hPD-L1 항체는 그의 결합이, 예를 들어 IHC 진단 검정에서 가성 양성과 같은 바람직하지 못한 결과를 초래하지 않으면서 샘플 중의 인간 PD-L1의 존재의 결정적인 요인인 경우에, 이러한 항체는 인간 PD-L1에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명의 항-hPD-L1 항체에 필요한 특이성 정도는 항체의 의도한 용도에 좌우될 수 있고, 어떠한 비율에서도 의도한 목적에 사용하기 위한 그의 적합성에 의해 규정된다. 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편은 어떠한 비-PD-L1 단백질과의 친화도 보다도 2배 이상 더 크고, 바람직하게 10배 이상 더 크며, 보다 바람직하게 20배 이상 더 크고, 가장 바람직하게 100배 이상 더 큰 친화도로 인간 PD-L1과 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체가 소정의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하긴 하지만 이러한 서열이 결여된 단백질과는 결합하지 않는 경우에, 이러한 항체는 상기 소정의 서열, 예를 들어 성숙한 인간 PD-L1 (본 경우에 있어서, 서열 37의 아미노산 19-290)을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 서열 37의 아미노산 19-290을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 서열 37의 아미노산 19-290의 FLAG®-태그부착된 형태와 결합할 수 있지만, 다른 FLAG®-태그부착된 단백질과는 결합하지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 모든 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 광범위한 의미에서 사용되고 구체적으로 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체), 인간화, 완전 인간 항체, 키메라 항체 및 낙타화 단일 도메인 항체를 포괄하지만, 이에 제한되지 않는다. "모 항체"는 항체를 의도한 사용을 위해 변형시키기에 앞서, 예컨대 인간 치료 항체로서 사용하기 위하여 항체를 인간화하기에 앞서 면역계를 항원에 노출시킴으로써 수득된 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 완전한 길이의 항체에 의해 결합된 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하고 있는 단편을 지칭한다. 항체 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv; 나노바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단 생성물일 수 있다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 이러한 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호 작용에 의해 결합된다.
"Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인과 CH1 도메인을 함유하고 또한 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개 중쇄의 부분 또는 단편을 함유하므로, 쇄간 디술피드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하므로, 쇄간 디술피드 결합이 상기 2개의 중쇄 사이에 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 상기 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 결합되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')2 단편"은 항체의 펩신 절단 생성물일 수 있다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어 있다.
용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 고찰을 위해, 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,260,203을 참조할 수 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역 만을 함유하는, 면역학상 기능적 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 영역이 펩티드 링커와 공유적으로 연결되어 2가 도메인 항체를 창출한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
"2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 지닌다. 그러나, 2가 항체는 이중-특이적일 수 있다 (하기 참조).
특정의 실시양태에서, 본원의 모노클로날 항체는 또한, 카멜화 단일 도메인 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem . Sci. 26:230]; [Reichmann et al. (1999) J. Immunol . Methods 231:25]; WO 94/04678; WO 94/25591; 미국 특허 번호 6,005,079 참조). 한 실시양태에서, 본 발명은 단일 도메인 항체가 형성되도록 변형시킨 2개의 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 수반하는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이러한 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 쇄 상의 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하고 2개의 항원 결합 부위를 창출해야만 한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448]에 보다 상세히 기재되어 있다. 조작된 항체 변이체에 관한 고찰을 위해서는, 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol . 23:1126-1136]을 참조할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 인간 PD-L1 결합 활성이 몰 기준으로 표현된 경우에, (모 항체와 비교해서) 그의 인간 PD-L1 결합 활성의 10% 이상을 보유하고 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 모 항체와 비교해서 인간 PD-L1 결합 친화성의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 초과를 보유하고 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 또는 비 보존적 아미노산 치환물 (항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존된 변이체"로서 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 또한 고려된다.
"단리된 항체"는 정제 상태를 지칭하고, 이러한 맥락에서, 분자는 다른 생물학적 분자, 예컨대 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예컨대 세포성 부스러기 및 성장 배지가 실질적으로 없는 것을 의미한다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 상기 물질, 또는 물, 완충제 또는 염이 본원에 기재된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한은, 이들 물질의 완전한 부재, 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 지칭하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 항체 분자가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이물을 제외하고는 아미노산 서열에 있어서 동일한 항체 집단을 지칭한다. 이와는 달리, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로, 상이한 에피토프에 대해 종종 특이적인 그들의 가변 도메인, 특히 그들의 CDR에 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 어느 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al. (1991) J. Mol . Biol . 222: 581-597]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다 (또한, 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol . 116:731] 참조).
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하는데, 각 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식에 대해 주로 책임이 있는 약 100개 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 효과기 기능에 대해 주로 책임이 있는 불변 영역을 규정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 전형적으로, 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 각각 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되는데, 중쇄는 또한, 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조).
각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이관능성 또는 이중-특이적 항체를 제외하고는, 이러한 2개의 결합 부위는 일반적으로, 동일하다.
전형적으로, 중쇄와 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치한, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리우기도 하는 3개의 초가변 영역을 포함한다. 이러한 CDR은 통상적으로, 특이적 에피토프와 결합할 수 있게 해주는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. 일반적으로, N-말단에서부터 C-말단까지, 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 다는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 배정하는 것은 일반적으로, 다음 문헌의 정의에 따른다 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883].
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 대해 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 및 중쇄 가변 도메인 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다 (문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] (서열에 의해 항체의 CDR 영역 정의); 및 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol . 196: 901-917] (구조에 의해 항체의 CDR 영역 정의) 참조). 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR 잔기로서 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.
"상동성"은 최적으로 정렬된 경우에 두 폴리뉴클레오티드 간의 서열 유사성 또는 두 폴리펩티드 서열 간의 서열 유사성을 지칭한다. 이와 같이 비교된 두 서열 모두에게서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 소단위로 점유된 경우, 예를 들어 두 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌으로 점유된 경우에는, 이들 분자가 그 위치에서 상동성이다. 상동성 비율(%)은 두 서열에 의해 공유된 상동 위치의 수를, 비교된 위치의 총 수로 나누고 100을 곱한 것이다. 예를 들어, 두 서열을 최적으로 정렬시킨 경우에, 이러한 두 서열 내의 10개 위치 중 8개가 부합되거나 상동성이라면, 이러한 두 서열은 80% 상동성이다. 일반적으로, 이와 같은 비교는, 최대 상동률을 제공하도록 이들 두 서열을 정렬시킨 경우에 이루어진다. 예를 들어, BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행할 수 있는데, 여기서는 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸쳐 각각의 서열 간의 가장 큰 부합을 제공하는 상기 알고리즘의 파라미터를 선택한다.
"단리된 핵산 분자"는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA; 또는 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연합되지 않거나 또는 자연에서는 이와 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드와 연결되는 그의 합성 기원 또는 일부 조합물을 의미한다. 본 개시내용의 목적상, 특정한 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 온전한 염색체를 포괄하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는 명시된 서열 이외에, 10개 이하 또는 심지어 20개 이하 또는 그 초과의 다른 단백질 또는 그의 일부분 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 인용된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는, 작동적으로 연결된 조절성 서열을 포함할 수 있고/있거나 벡터 서열을 포함할 수 있다.
"제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어 프로모터, 임의로 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치되는 경우에, 이러한 핵산은 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 전구 서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구 단백질로서 발현되는 경우에는, 이러한 DNA가 상기 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 증강인자가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에는, 이러한 프로모터 또는 증강인자가 상기 서열과 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 해독을 촉진시키도록 위치된 경우에는, 이러한 리보솜 결합 부위가 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속되고, 분비성 리더의 경우에는, 연속되고 판독 단계에 있다. 그러나, 증강인자는 연속되지 않아야 한다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전이의 수와는 상관없이 그로부터 유래된 일차 대상체 세포 및 배양물을 포함한다. 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해, 모든 자손이 정확하게 동일한 DNA 내용물을 갖지 않을 것으로 또한 이해된다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 의도하는 경우, 이는 본 맥락으로부터 명백할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 특이적 핵산 서열, RNA 및/또는 DNA를, 예를 들어 미국 특허 번호 4,683,195에 기재된 바와 같이 증폭시키는 과정 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로, 관심 영역의 말단으로부터의 서열 정보 또는 이를 벗어난 서열 정보를 이용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다. 이들 프라이머는 증폭시키고자 하는 주형의 반대 가닥과 서열상 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR을 이용하여 특이적 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특이적 DNA 서열, 및 총 세포성 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등으로부터 전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 51:263]; [Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)] 참조). 본원에 사용된 바와 같은, PCR은 프라이머로서의 공지된 핵산, 및 핵산의 특이적 조각을 증폭 또는 생성시키기 위한 핵산 중합효소를 사용하는 것을 포함하는, 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 중합효소 반응 방법의 한 가지 예 (유일한 예는 아니다)인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같은, "생식세포계 서열"은 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA 서열의 서열을 지칭한다. 재배열되지 않은 면역글로불린 서열의 적합한 모든 공급원을 사용할 수 있다. 인간 생식세포계 서열은, 예를 들어 미국 국립 건강 연구소의 관절염 및 근골격계 및 피부 질환의 국립 연구소에 대한 웹사이트 상의 JOINSOLVER® 생식세포계 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 마우스 생식세포계 서열은, 예를 들어 문헌 [Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261]에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다.
예시되는 항-PD-L1 항체의 물리적 및 기능적 특성
본 발명은 단리된 항-PD-L1 항체, 및 세포의 표면 상에서 PD-L1 발현을 검출하는 데 있어서의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 항-PD-L1 항체의 예는 항체 20C3 및 22C3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (도 1 및 2 참조). 이러한 20C3 및 22C3 항체는 동일하지 않지만, 인접한 에피토프와 결합하는데 (실시예 2 및 도 9 참조), 이는 이들 두 항체의 CDR을 혼합하여, 이들 에피토프 중 하나 또는 둘 다에서 PD-L1과 특이적으로 결합하는 부가의 항체를 유도시킬 수 있다는 것을 표시한다. 따라서, 인간 PD-L1과 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음 표 1 내지 3에 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 중 3개 및 중쇄 CDR 중 3개를 포함할 수 있다.
[표 1]
Figure 112015068492245-pct00003
[표 2]
Figure 112015068492245-pct00004
[표 3]
Figure 112015068492245-pct00005
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환물"은 단백질 내의 아미노산을 유사한 특징 (예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 주쇄 입체 형태, 및 강직도 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환시켜, 이러한 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않고서도 상기 변화를 빈번하게 만들 수 있는 것을 지칭한다. 통상의 기술자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역 내의 단일 아미노산 치환물이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조상 또는 기능상 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 붕괴시킬 가능성이 적다. 예시되는 보존적 치환물은 다음 표 4에 제시되어 있다.
[표 4]
Figure 112015068492245-pct00006
본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 바와 같은, "기능-보존적 변이체"는 1개 이상의 아미노산 잔기를 목적하는 특성, 예컨대 항원 친화성 및/또는 특이성을 변경시키지 않으면서 변화시킨 항체 또는 단편을 지칭한다. 이러한 변이체는 아미노산을 유사한 특성을 지닌 것, 예를 들어 표 4의 보존적 아미노산 치환물로 대체시킨 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PD-L1과 특이적으로 결합하고 VL 도메인 및 VH 도메인을 가지며 표 1 또는 2의 경쇄 및 중쇄 CDR과 100% 서열 상동성을 공유하고 표 1 또는 2의 경쇄 및 중쇄 성숙한 가변 영역과 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 공유하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
핵산
본 발명은 또한, 본원에 개시된 항-PD-L1 항체 및 항원 결합 단편의 면역글로불린 쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1, 2 및 3에 기재된 아미노산을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 이와 혼성화되는 핵산을 포함한다.
일반적으로, 핵산은 저 수준, 중간 수준 또는 고 수준의 엄격한 조건 하에 혼성화되고, PD-L1과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 유지하고 있는 항체를 코딩한다. 제1 핵산 분자는, 이러한 제1 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적당한 조건 하에 제2 핵산 분자와 어닐링할 수 있는 경우에, 이러한 제2 핵산 분자와 "혼성화 가능"하다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook, et al.] 참조). 온도 및 이온 강도의 조건이 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 전형적인 저 수준의 엄격한 혼성화 조건은 55℃, 5X SSC, 0.1% SDS 및 포름아미드 없음; 또는 42℃ 하의 30% 포름아미드, 5X SSC, 0.5% SDS를 포함한다. 전형적인 중간 수준의 엄격한 혼성화 조건은 42℃ 하의 40% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS이다. 고도로 엄격한 혼성화 조건은 42℃ 또는 임의로 보다 고온 (예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃) 하의 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC이다. 일반적으로, SSC는 0.15 M NaC1 및 0.015 M Na-시트레이트이다. 혼성화하기 위해서는, 두 핵산이 상보성 서열을 함유해야 하지만, 혼성화의 엄격성에 따라서, 염기들 간의 부정합물이 가능하다. 핵산을 혼성화하는 데 적당한 엄격성은 관련 기술분야에 널리 공지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 핵산을 혼성화시킬 수 있는 엄격성이 더 높아진다. 길이가 100개 초과의 뉴클레오티드의 혼성체에 대해서는, 융점을 계산하기 위한 방정식이 유도되었다 (상기 문헌 [Sambrook, et al., 9.50-9.51] 참조). 보다 짧은 핵산, 예를 들어 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 경우에는, 부정합물의 위치가 더 중요해지고, 이러한 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다 (상기 문헌 [Sambrook, et al., 11.7-11.8] 참조).
다음 참고문헌은 서열 분석을 위해 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다 [BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 단리된 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편의 폴리펩티드 쇄 중 하나 이상을 코딩하는 단리된 핵산(들), 예를 들어 DNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리된 핵산은 단일 핵산 분자 상의 경쇄와 중쇄 둘 다를 코딩하고, 다른 실시양태에서 경쇄 및 중쇄는 별개의 핵산 분자 상에서 코딩된다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 신호 서열을 추가로 코딩한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하는데, 이러한 핵산은 숙주 세포가 상기 벡터로 형질감염되는 경우에, 이러한 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열과 작동적으로 연결된다. 또한, 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포; 및 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 발현 벡터를 정착시킨 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이러한 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하는 방법이 제공된다.
에피토프 결합
본 발명은 추가로, 20C3 또는 22C3 각각과 동일한 에피토프와 결합함으로써 인간 PD-L1에 대한 항체 20C3 또는 22C3의 결합을 차단시키는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 이러한 항체 및 결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 모든 교차-차단 또는 경쟁 분석 [실시예 2에 기재된 옥텟(Octet) 경쟁 분석을 포함함]을 이용하여 확인한 다음, 교차-차단 항체와 결합하는 인간 PD-L1 상의 에피토프를 확인할 수 있다. 제1 항체를 이용하여 표적을 포화될 때까지 미리 결합시키는 것이, 표적의 최대 절반 결합을 달성하는 데 필요한 제2 항체의 농도를 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배 또는 그 초과로 증가시키는 경우에는, 이러한 제1 항체가 제2 항체의 결합을 교차-차단시키는 것으로 간주된다. 교차-차단 항체에 대한 결합 에피토프는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다.
상기 에피토프 맵핑 기술 중 한 가지는 단백질 분해 및 질량 분광측정법 (HDX-MS)과 커플링된 수소/중수소 교환이다. 이 방법은 중수 (D2O)에서 그 자체로 및 각종 시간 간격 하에 그의 항체의 존재 하에 인큐베이션하는 경우에, 항원에 의한 중수소 혼입 정도를 정확하게 측정하고 비교하는 것에 좌우된다. 중수소는 노출된 부위 내의 단백질의 아미드 주쇄 상의 수소로 교환되는 반면, 항체와 결합된 항원의 영역은 보호될 것이고 단백질 분해적 단편의 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분광측정법 (LC-MS/MS)에 의한 분석 후에 보다 적은 교환을 나타내거나 전혀 교환되지 않을 것이다.
실시예 3에 기재된 HDX-MS 에피토프 맵핑에 근거하여, 항체 22C3에 대한 성숙한 인간 PD-L1 상의 제안된 에피토프는 세포외 도메인 (서열 38) 중의 2개의 불연속적인 아미노산 절편 내의 잔기를 포함한다: 156 내지 178 및 196 내지 206. 부가의 에피토프 잔기는 세포외 도메인 (서열 38) 중의 다음 절편에 존재하는 것으로 예상된다: 3 내지 9; 10 내지 13; 88 내지 93 및 135 내지 147.
따라서, 한 실시양태에서 22C3과 동일한 에피토프와 결합함으로써 인간 PD-L1에 대한 항체 22C3의 결합을 차단하는 항체는 서열 38의 아미노산 156 내지 178의 제1 절편 내의 잔기와 결합하고, 서열 38의 아미노산 196 내지 206의 제2 절편 내의 잔기와 결합하며, 일부 실시양태에서는 또한, 서열 38의 다음 절편 중 어느 1개, 2개 또는 3개, 또는 4개 모두 내의 잔기와 결합한다: 아미노산 3 내지 9; 아미노산 10 내지 13; 아미노산 88 내지 93; 및 아미노산 135 내지 147.
항체 및 그의 항원 결합 단편의 제조 방법
모 (예를 들어, 설치류) 모노클로날 항-X 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 관련 기술분야에서 통상적으로 공지되어 있는 방법에 의해 생성할 수 있다. 이들 방법은 문헌 [Kohler, et al., (1975) (Nature 256:495-497)]에 최초로 보고된 하이브리도마 기술 뿐만 아니라 트리오마(trioma) 기술 (문헌 [Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216] 및 [Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15]), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4:72] 및 [Cote, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:2026-2030]), EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole, et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985]), 및 시토 플러스(Cyto Pulse) 대형 챔버 도태 융합 전기천공기 [시토 플러스 사이언스, 인크. (Cyto Pulse Sciences, Inc.; 미국 메릴랜드주 글렌 버니)]를 이용한 전기장 기반 전기융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 마우스 비장 세포를 단리하고, 이를 PEG와 융합하거나 또는 표준 프로토콜에 근거하여 전기융합에 의해 마우스 골수종 세포주와 융합시킨다.
이어서, 이로써 생성된 하이브리도마를 대상으로 하여, 항원-특이적 항체의 생성에 관하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50% PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 평저 미세역가 플레이트 내에 대략 2 x 105개 세포/mL로 도말한 다음, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 적응용 배지, 5% 오리젠(origen) (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 젠타마이신 및 1X HAT [시그마(Sigma); 이 HAT는 융합 후 24시간에 가한다]를 함유하는 선택적 배지에서 2주 인큐베이션할 수 있다. 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 대상으로 하여 항-X 모노클로날 IgG 항체에 관하여 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10일 내지 14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 항-X 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 2회 이상 서브클로닝할 수 있다.
이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켜 그의 특징을 확인할 수 있다. 예를 들어, 약 1 그램의 22C3 항체는 다음 과정을 이용하여 마우스 하이브리도마 세포주 MEB037.22C3.138로부터 생성하고 정제할 수 있다. 동결된 MEB037.22C3.138 세포를 해동시키고, 0.18% 플루로닉(Pluronic) F-68을 수반하거나 수반하지 않으면서 2 mM 부가 L-글루타민을 수반한 하이브리도마 혈청 무함유 배지를 이용하여 진탕 플라스크 내로 적응시킨다. 플루로닉 F-68의 존재는 진탕 플라스크 배양물의 생육도를 개선시킬 수 있다. 일단 상기 세포가 진탕 플라스크 내로 완전하게 적응되면, 10% CHO CD 효율적 공급물 B [인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 #A10240-01]을 부가하면서 WAVE 생물 반응기 [GE 헬스케어 라이프 사이언스(GE Healthcare Life Sciences)] 내의 혈청 무함유 배지 중에서 20 리터 생성 배양을 수행한다. 세포 확장을 위하여, 1 리터 배양을 소형 WAVE 봉지에서 개시한 다음, 1 L WAVE 배양을 WAVE 생물 반응기 내의 20 L 배양으로 확장시킨다. 20 리터 배양을 0.5 x 106개 생존 세포/mL의 세포 밀도로 개시하고, 1일째에 10% CHO CD 효율적 공급물 B를 공급하며, 1 N Na2CO3를 이용하여 pH를 매일 조정할 수 있다. 4일 후에 세포를 채취한다. NOVA 분석하기 위하여 소형 샘플을 매일 수집할 수 있다.
본 발명의 항-hPD-L1 항체는 다음 공정에 의해 하이브리도마 배양물로부터 정제할 수 있다. 하이브리도마 배양물은 1.2 마이크로미터 유리 섬유 및 0.2 마이크로미터 셀룰로스 아세테이트 필터를 이용하여 심층 여과함으로써 정화한다. 등 용적의 2X 프로셉A(ProSepA) 완충액 (100 mM 붕산, 5 M NaCl, pH 8.5)을 상기 정화된 채취물에 가하고, 희석된 채취물을 170 mL 층 용적 단백질-A 칼럼 상으로 부하한다. 이 칼럼을 5 칼럼 용적 (CV)의 1X 프로셉A 완충액 (50 mM 붕산, 2.5 M NaCl, pH 8.5)으로 세척한 다음, 2 CV의 1X PBS로 세척하고, 항-hPD-L1 항체를 5 CV의 용출 완충액 ((0.1 M 글리신, pH 3.0)으로 용출시켰다. IgG를 함유하는 용출 분획을 합하고, 1.0 M 트리스(Tris), pH 완충제의 1/10 용적을 가함으로써 pH를 중화시켰다. 이어서, 이와 같이 중화된 항체 조성물은 10 kDa 1회용 TFF 카세트를 이용하여 멸균 여과시킨다. 이 항체를 20 용적 변화물을 이용하고 10 리터의 제제 완충액 (20 mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0)에 대항하여 정용여과함으로써 저장용으로 제제화할 수 있다. 이러한 프로토콜을 이용하여, 약 5.0 mg/ml 농도 하의 항체 22C3을 제조할 수 있고, SDS-PAGE, SEC HPLC 및 C8 RP-HPLC 측정법에 의해 98% 이상의 순도를 가질 수 있는데, 내독소 수준은 0.1 EU/ml 미만 및 0.02 EU/mg 미만이다.
본원에 개시된 항-PD-L1 항체는 또한, 재조합적으로 생성할 수 있다 [예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 이. 콜라이 (E. coli)/T7 발현 시스템에서 수행한다]. 이 실시양태에서는, 본 발명의 항체 분자 (예를 들어, VH 또는 VL)를 코딩하는 핵산을 pET-기반 플라스미드 내로 삽입하고 상기 이. 콜라이/T7 시스템에서 발현시킬 수 있다. 재조합 항체를 생성시키는 몇 가지 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항체를 재조합적으로 생성시키기 위한 방법 중 한 가지 예가 미국 특허 번호 4,816,567에 개시되어 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 모든 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포 내로 도입하기 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)를 리포솜 내에 피막화하는 방법, 유전자 총 주사, 및 DNA를 핵 내로 직접적으로 미소주사하는 방법을 포함한다. 또한, 핵산 분자를 바이러스성 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입할 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 및 4,959,455 참조).
항-PD-L1 항체는 또한, 미국 특허 번호 6,331,415에 제시된 방법 중 어느 것에 의해서도 합성할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 단편의 발현을 위한 숙주로서 입수 가능한 포유류 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수 가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 수많은 다른 세포주를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는 세포주가 고 발현 수준을 나타내는지를 결정함으로써 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아성 세포, 식물 세포 및 진균성 세포이다. 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분 또는 단편, 경쇄 및/또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 경우에는, 이러한 숙주 세포에서 상기 항체의 발현을 허용하거나 또는 보다 바람직하게, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 상기 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 상기 항체를 생성시킨다.
항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 추가로, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체 (또는 그로부터의 다른 부분)를 발현하는 것은 공지된 수많은 기술을 이용하여 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)이 특정의 조건 하에 발현을 증강시키기 위한 통상의 접근 방식이다. 이러한 GS 시스템은 유럽 특허 번호 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 연계해서 전부 또는 부분적으로 논의되어 있다.
폴리클로날 항체는 동일하지 않은 하나 이상의 다른 항체들 중에서 또는 이러한 항체들의 존재 하에 생성된 항체이다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 상이한 B-림프구의 컬렉션, 예를 들어 상이한 항체 집단 (이들 모두는 관심 면역원에 대해 유도된다)을 생성하는, 관심 면역원으로 처리한 동물의 B-림프구의 컬렉션으로부터 생성된다. 통상적으로 폴리클로날 항체는 면역시킨 동물, 예를 들어 비장, 혈청 또는 복수로부터 직접적으로 수득된다.
본 발명은 추가로, 본원에 개시된 항-PD-L1 항체의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 IgG를, 예를 들어 펩신에 의해 효소적으로 절단시킴으로써 생성될 수 있는 F(ab)2 단편을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어 F(ab)2를 디티오트레이톨 또는 메르캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 생성시킬 수 있다. Fab 단편은 디술피드 브릿지에 의해 VH-CH1 쇄에 첨부된 VL-CL 쇄이다. F(ab)2 단편은 결국 2개의 디술피드 브릿지에 의해 첨부되는 2개의 Fab 단편이다. F(ab)2 분자의 Fab 부분은 그 사이에 디술피드 브릿지가 위치하는 Fc 영역의 일부분을 포함한다. FV 단편은 VL 또는 VH 영역이다.
면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 이상의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 면역글로불린이 있고, 이들 중 몇 가지는 아부류 (이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가로 나눠질 수 있다. 본 발명은 이들 부류 또는 아부류의 항체 중 어느 것의 항체 및 항원 결합 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 불변 영역, 예컨대 γ1, γ2, γ3 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 람다 또는 카파 인간 경쇄 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 제한없이 예시하자면, 인간 중쇄 불변 영역은 γ1일 수 있고 인간 경쇄 불변 영역은 카파일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 수반한 γ4이다 (Schuurman, J et. al., Mol . Immunol . 38: 1-8, 2001).
일부 실시양태에서, 상이한 불변 도메인이, 본원에 제공된 CDR로부터 유래된 인간화 VL 및 VH 영역에 첨부될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 (또는 단편)의 특정한 의도 용도가 변경된 효과기 기능을 필요로 한 경우에는, 인간 IgG1 이외의 중쇄 불변 도메인을 사용할 수 있거나 또는 혼성체 IgG1/IgG4를 활용할 수도 있다.
항체 공학
특정한 실시양태에서, 노출된 측쇄를 함유하는 특정의 아미노산을, 다음과 같이 최종 항체의 보다 큰 화학적 안정성을 제공하기 위해 또 다른 아미노산 잔기로 변화시키는 것이 바람직할 것이다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 발생될 수 있고, 이로써 이소아스파르트산 잔기가 창출되는데, 이는 킹크(kink)를 폴리펩티드 쇄 내로 도입시키고 그의 안정성을 저하시킨다 (이소아스파르트산 효과). 특정의 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 아스파라긴 이성질화 부위를 함유하지 않는다.
예를 들어, 아스파라긴 (Asn) 잔기는 Gln 또는 Ala로 변화시켜, 특히 CDR 내의 어느 Asn-Gly 서열에서의 이소아스파르테이트의 형성 가능성을 저하시킬 수 있다. 유사한 문제가 Asp-Gly 서열에서 발생할 수도 있다 (Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol . Life Sci . 60:1281). 이소아스파르테이트 형성은 항체가 그의 표적 항원과 결합하는 것을 약화시키거나 또는 완전히 폐기시킬 수 있다 (문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol . 116:731] (734) 참조). 한 실시양태에서, 아스파라긴은 글루타민 (Gln)으로 변화시킨다. 아스파라긴 (Asn) 또는 글루타민 (Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경시켜 탈아미드화 (이는 소형 아미노산이 아스파라긴 또는 글루타민에 인접하여 존재하는 경우에 더 큰 비율로 발생한다)의 가능성을 저하시키는 것이 바람직할 수도 있다 (문헌 [Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261] 참조). 또한, CDR 내의 어떠한 메티오닌 잔기 (전형적으로, 용매 노출된 Met)도 Lys, Leu, Ala, 또는 Phe로 변화시켜, 메티오닌 황이 산화될 확률 (이는 항원 결합 친화성을 저하시킬 수 있고, 또한 최종 항체 제제 중의 분자 이질성의 원인이 될 수 있다)을 저하시킬 수 있다 (상기 문헌). 한 실시양태에서, 메티오닌은 알라닌 (Ala)으로 변화시킨다. 부가적으로, 잠재적으로 절단 가능한 Asn-Pro 펩티드 결합을 방지 또는 최소화하기 위해, CDR에서 발견된 모든 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro, 또는 Asn-Ala로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치환을 수반하는 항체를 대상으로 하여 연속해서, 이러한 치환이 인간 PD-L1에 대한 항체의 친화성 또는 특이성, 또는 다른 목적하는 생물학적 활성을 허용되지 않는 수준으로 감소시키지 않는다는 것을 보장하는지에 관하여 스크리닝한다.
[표 5]
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항체 접합체
본원에 개시된 항-PD-L1 항체 분자는 또한, 화학적 부분, 예컨대 방사성핵종 또는 다른 검출 가능한 표지와 접합시킬 수 있다. 방사성핵종은 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 및 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe를 포함한다. 형광성 또는 화학발광성 표지는 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트제, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민, 152Eu, 댄실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 아에쿠오린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 유리 라디칼을 포함한다.
항체 분자를 각종 부분에 접합시키는 것으로 관련 기술분야에 공지된 모든 방법을 이용할 수 있는데, 이는 문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945]; [David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014]; [Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219]; 및 [Nygren, J., (1982) Histochem . and Cytochem . 30:407]에 기재된 방법을 포함한다. 항체를 접합시키는 방법은 통상적이고 관련 기술분야에 매우 잘 공지되어 있다.
실험적 및 진단 용도
본원에 개시된 항-PD-L1 항체 및 항체 단편을 사용하여, 세포의 표면 상에 발현된 인간 PD-L1을 특이적으로 검출할 수 있다. 이러한 세포는 인간 개개인으로부터 수득된 조직 또는 혈청 샘플에 존재할 수 있고, PD-L1 발현의 검출은 관련 기술분야에 공지된 각종 시험관내 검정 방법 중 어느 것을 이용하여 수행한다.
예를 들어, 특정한 실시양태는, 전형적으로 다음 단계를 포함하는 ELISA 검정 (효소 결합 면역흡착 검정)을 포함한다:
(a) 기판 (예를 들어, 미세역가 플레이트 웰, 예를 들어 플라스틱 플레이트의 표면)을 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 코팅하는 단계;
(b) 인간 PD-L1의 존재에 대해 시험하고자 하는 샘플을 상기 기판에 적용하는 단계;
(c) 상기 플레이트를 세척하여, 샘플 중의 결합되지 않은 물질을 제거하는 단계;
(d) 인간 PD-L1에 대해 또한 특이적인, 검출 가능하게 표지된 항체 (예를 들어, 효소 결합된 항체)를 적용하는 단계;
(e) 상기 기판을 세척하여, 결합되지 않은 표지된 항체를 제거하는 단계;
(f) 이러한 표지된 항체가 효소 결합되는 경우에는, 이 효소에 의해 형광성 신호로 전환되는 화학물질을 적용하는 단계; 및
(g) 표지된 항체의 존재를 검출하는 단계.
추가 실시양태에서, 표지된 항체는, ABTS [예를 들어, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)] 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 반응하여 검출 가능한 색상 변화를 초래하는 퍼옥시다제로 표지시킨다. 또 다른 한편, 표지된 항체는 신틸런트(scintillant)의 존재 하에 신틸레이션 계수기에 의해 검출될 수 있는, 검출 가능한 방사성 동위원소 (예를 들어, 3H)로 표지시킨다.
본 발명의 항-PD-L1 항체 및 그의 항원 결합 단편은 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 면역단백질 블롯 과정에 사용할 수 있다. 이러한 과정은 본 발명의 일부를 형성하고, 예를 들어 다음을 포함한다:
(1) 인간 PD-L1의 존재에 대해 시험하고자 하는 막 또는 다른 고체 기판을 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계. 이러한 막은 비-변성 PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔 또는 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔에서 X 의 존재에 대해 시험하고자 한 단백질을 옮겨 놓았던 (예를 들어, 겔에서의 전기영동 분리에 따름) 니트로셀룰로스 또는 비닐-기반 [예를 들어, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)] 막의 형태를 취할 수 있다. 막을 항-PD-L1 항체 또는 단편과 접촉시키기 전에, 이러한 막을 임의로, 예를 들어 탈지 분유 등으로 차단시켜 막 위에 비-특이적 단백질 결합 부위를 결합시킨다.
(2) 상기 막을 1회 이상 세척하여 결합되지 않은 항-PD-L1 항체 또는 단편, 및 다른 결합되지 않은 물질을 제거하는 단계; 및
(3) 결합된 항-PD-L1 항체 또는 단편을 검출하는 단계.
결합된 항체 또는 단편은, 이러한 결합된 항체 또는 단편을 검출 가능하게 표지되는 2차 항체 (항-면역글로불린 항체)와 함께 인큐베이션한 다음, 2차 항체의 존재를 검출함으로써 검출할 수 있다.
본원에 개시된 항-PD-L1 항체 및 그의 항원 결합 단편은 또한, 면역조직화학 (IHC) 검정에 사용할 수 있는데, 이는 관련 기술분야에 공지된 각종 IHC 포맷을 이용하여 수행할 수 있고, 본 발명의 실시양태를 구성한다. 전형적인 IHC 검정은 현미경 슬라이드 상에 올려 놓고 건조시킨, 약 3 내지 4 밀리미터, 바람직하게 4 마이크로미터의 FFPE 조직 박편을 이용하는데, 예를 들어 (1) 이러한 조직 박편을 탈파라핀화 및 수화시키고, 재수화된 조직 박편을, 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (2) 이러한 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 상기 조직 중의 하나 이상의 세포의 표면 상에서 검출하는 단계를 포함한다. 상기 항체 또는 단편 그 자체가 검출 가능하게 표지되는 경우에는, 이를 직접 검출할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 항체 또는 단편은, 검출되는 검출 가능하게 표지된 2차 항체에 의해 결합될 수 있다.
바람직한 IHC 검정은 시판용 다코 엔비젼(Dako EnVision™) FLEX 검출 시스템을 이용하는데, 이는 다코 자동염색 기기 (애질런트 테크놀로지 캄파니인 다코; 덴마크 글로스트럽)와 함께 사용하도록 의도된다. 이러한 시스템을 22C3 항체, 또는 22C3 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 함께 이용하는 경우에는, IHC 검정를 다음과 같이 수행할 수 있다. 슬라이드 위에 올려진 조직의 4 마이크로미터 두께의 FFPE 박편을 밤새 공기-건조시키고, 60℃ 하에 45분 동안 베이킹하며, 탈파라핀화한 다음 재수화시킨다. 탈파라핀화한 후, FFPE 슬라이드를 대상으로 하여, 97℃ 하에 이어서 실온 하에 20분 동안, 엔비젼™ FLEX 고 pH 표적 검색 용액을 이용하여 열-유도된 에피토프 검색을 수행한다. 그 다음, 상기 슬라이드를 세척하고, 2 ㎍/mL 하의 22C3으로 60분 동안 염색한 다음, 다코 엔비젼™ FLEX 시약을 이용하여 다음과 같이 검출한다: 엔비젼™ FLEX+ MS 링커 (15분), 엔비젼™ FLEX/HRP (20분), 엔비젼™ FLEX DAB (10분), 및 DAB 증강인자 (7분) (중간에 세척 단계를 수반한다).
본원에 개시된 특정의 항-PD-L1 항체 및 그의 항원 결합 단편은 또한, 생체내 종양 영상화를 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을, PD-L1 발현과 연관된 종양의 존재에 대해 시험하고자 하는 인간 환자의 체내로 주사한 다음, 이러한 환자의 신체를 핵 영상화하여, 예를 들어 종양과 결합되는 고 농도의 상기 항체 또는 단편을 포함하는 유전자 자리에서 상기 표지된 항체 또는 단편의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
영상화 기술은 SPECT 영상화 (단일 광자 방출 전산화 단층 촬영) 또는 PET 영상화 (양전자 방출 단층 촬영)를 포함한다. 표지는, 예를 들어 SPECT 영상화와 연계되는 요오드-123 (123I) 및 테크네튬-99m (99mTc), 또는 예를 들어, PET 영상화와 연계되는 11C, 13N, 15O 또는 18F, 또는 인듐-111을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440] 참조).
검출 키트 및 치료 키트
편의상, 본원에 개시된 항체 또는 특이적 결합 제제가 키트에 제공될 수 있는데, 즉 진단 또는 검출 검정을 수행하기 위한 지시 사항과 함께 미리 결정된 양의 시약의 패키지된 조합물로 제공될 수 있다. 상기 항체를 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 부가제, 예컨대 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대량은 검정의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약의 용액 중 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 이러한 시약은 통상 동결건조된 건조 분말로서 제공되는데, 이는 용해시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함한다.
또한, 예를 들어 면역검정, 예컨대 ELISA (샌드위치형 또는 경쟁적 포맷)를 포함한 각종 검출 검정에 사용하기 위한, 진단 또는 검출 시약 및 이러한 시약을 하나 이상 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트의 성분은 고체 지지체에 미리-부착시킬 수 있거나, 또는 키트가 사용될 때 고체 지지체의 표면에 적용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생 수단은 사용에 앞서, 본 발명의 항체와 미리-연합될 수 있거나, 또는 하나 이상의 성분, 예를 들어 완충제, 항체-효소 접합체, 효소 기질 등과 조합될 수 있어야 한다. 키트는 또한, 부가의 시약, 예를 들어 고체 상 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위한 차단 시약, 세척 시약, 효소 기질 등을 포함할 수 있다. 고체 상 표면은 튜브, 비드, 미세역가 플레이트, 미소구, 또는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 고정화시키기에 적합한 다른 물질의 형태일 수 있다. 특정한 측면에서, 화학발광성 또는 발색 생성물의 형성을 촉매하거나 또는 화학발광성 또는 발색 기질의 환원을 촉매하는 효소가 신호 발생 수단의 한 성분이다. 이러한 효소는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 키트는 본원에 기재된 포획 제제 및 검출 시약 중 어느 것을 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시 사항을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나 이상과, 검출 시약으로서의 조성물의 사용 설명서를 포함하는, 본원에 개시된 검출 키트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 키트에 사용하기 위한 용기는 전형적으로, 이들 내로 검출 조성물(들) 중 하나 이상을 놓아둘 수 있는, 바람직하게는 적합하게 등분할 수 있는 하나 이상의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 적합한 용기를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 키트는 또한 전형적으로, 상업적 판매를 위해 엄중히 밀폐되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단, 예를 들어 주사 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기 (이들 내로 목적하는 바이알(들)이 보관 유지된다)를 포함할 것이다. 방사성 표지, 발색, 형광발생, 또는 다른 유형의 검출 가능한 표지 또는 검출 수단이 키트 내에 포함되는 경우에는, 표지화 제제를 검출 조성물 자체와 동일한 용기 내에 제공할 수 있거나, 또는 또 다른 한편으론, 제2 조성물을 놓아둘 수 있고 적합하게 등분될 수 있는 제2의 별개의 용기 수단 내에 놓아둘 수 있다. 또 다른 한편으론, 검출 시약을 단일 용기 수단 내에서 제조할 수 있고, 대부분의 경우에는, 키트가 또한 전형적으로, 상업적 판매 및/또는 편리한 패키징 및 운반을 위해 엄중히 밀페되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
본원에 기재된 검출 또는 모니터링 방법을 수행하기 위한 기구 또는 장치가 또한 제공된다. 이러한 장치는 샘플을 유입할 수 있는 챔버 또는 튜브; 기구를 통한 샘플의 유동을 지시하기 위한 밸브 또는 펌프를 임의로 포함한 유동 조작 시스템; 임의로, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 분리하기 위한 필터; 포획제 또는 검출 시약을 부가하기 위한 혼합 챔버; 및 임의로, 포획제 면역복합체와 결합된 일정 량의 검출 가능한 표지를 검출하기 위한 검출 기구를 포함할 수 있다. 샘플의 유동은 수동적 (예를 들어, 샘플이 일단 적용되면, 상기 기구의 추가 조작을 필요로 하지 않는 다른 힘이나 모세관 또는 정압에 의함) 또는 능동적 (예를 들어, 기계적 펌프, 전기삼투압 펌프, 원심분리력, 또는 증가된 공기압을 통하여 발생된 힘의 적용에 의함)일 수 있거나, 또는 능동적 힘과 수동적 힘의 조합에 의할 수 있다.
추가 실시양태는 또한, 프로세서, 컴퓨터 판독 가능 메모리, 및 컴퓨터 판독 가능 메모리에 저장되고 본원에 기재된 방법 중 어느 것을 수행하기 위해 프로세서상에서 실행되도록 적응시킨 루틴(routine)을 제공한다. 적합한 컴퓨팅 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는 개인용 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 휴대용 또는 랩탑 기구, 멀티프로세서 시스템, 마이크로 프로세서 기반 시스템, 셋톱 박스, 프로그램 가능한 가전 제품, 네트워크 PC, 미니 컴퓨터, 메인 프레임 컴퓨터를 포함하고, 상기 시스템 또는 기구 중 어느 것, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 모든 시스템을 포함하는 분산 컴퓨팅 환경을 포함한다.
일반적 방법
분자 생물학에서의 표준 방법은 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한, 박테리아성 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이 유발 (Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3) 및 생물 정보학 (Vol. 4)이 기재되어 있는 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 제시되어 있다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함한, 단백질 정제 방법은 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]에 기재되어 있다. 화학적 분석, 화학적 변형, 해독 후 변형, 융합 단백질의 생성, 단백질의 글리코실화는 문헌 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17]; [Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89]; [Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조)에 기재되어 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생성, 정제 및 단편화는 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 참조]에 기재되어 있다. 리간드/수용체 상호 작용을 명확히 규명하기 위한 표준 기술은 이용 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
모노클로날, 폴리클로날 및 인간화 항체를 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY]; [Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York]; [Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243]; [Carpenter, et al. (2000) J. Immunol . 165:6205]; [He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029]; [Tang et al. (1999) J. Biol . Chem . 274:27371-27378]; [Baca et al. (1997) J. Biol . Chem . 272:10678-10684]; [Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883]; [Foote and Winter (1992) J. Mol . Biol . 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).
인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리, 또는 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 [Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol . Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:397-399].
항원의 정제는 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물은 관심 항원을 보유하고 있는 세포로 면역시킬 수 있다. 이어서, 비장 세포를 상기 면역시킨 동물로부터 단리할 수 있고, 이 비장 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290]; [Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242]; [Preston et al., supra]; [Kaithamana et al. (1999) J. Immunol . 163:5157-5164] 참조).
항체는, 예를 들어 소형 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합시킬 수 있다. 항체는 치료적, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하고, 예를 들어 염료, 방사성 동위원소, 효소 또는 금속, 예를 들어 콜로이드성 금과 커플링된 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Le Doussal et al. (1991) J. Immunol . 146:169-175]; [Gibellini et al. (1998) J. Immunol . 160:3891-3898]; [Hsing and Bishop (1999) J. Immunol . 162:2804-2811]; [Everts et al. (2002) J. Immunol . 168:883-889] 참조).
형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함한, 유동 세포측정을 위한 방법이 이용 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]; [Givan (2001) Flow Cytometry , 2 nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ]; [Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드 및 항체를 포함한, 핵산을 변형시키는 데 적합한 형광성 시약이 입수 가능하다 (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
면역계의 조직학의 표준 방법이 문헌 (예를 들어, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY]; [Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA]; [Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조)에 기재되어 있다.
예를 들어, 항원성 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 입수 가능하다 (예를 들어, 유전자은행, 벡터 NTI® 스위트 [인포맥스, 인크. (Informax, Inc.; 미국 메릴랜드주 베데스타)]; GCG 위스콘신 패키지 (Wisconsin Package) [아셀리스, 인크. (Accelrys, Inc.; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]; DeCypher® [타임로직 코포레이션 (TimeLogic Corp.; 미국 네바다주 크리스털 베이)]; 문헌 [Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742]; [Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742]; [Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed . 68:177-181]; [von Heijne (1983) Eur . J. Biochem. 133:17-21]; [von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).
실시예
실시예 1. 항-PD-L1 하이브리도마의 생성 및 스크리닝
Balb/C 마우스를 아주반트 중의 인간 PD-L1-Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈® 카탈로그 번호 156-B7-100)로 면역시켰다. 이 융합 단백질은 인간 IgG1 단편 (Pro100-Lys300)과 융합된 PD-L1의 세포외 도메인 (Phe19-Thr239)을 함유하고 있다. 12회 면역 후, 인간 PD-L1에 대한 고 역가를 나타내는 2마리 마우스로부터 림프절을 채취하였고, 전기융합을 수행하여 2개 배치의 하이브리도마를 생성시켰는데, 이에 MEB033 및 MEB037의 실험실 명칭이 부여되었다.
이러한 MEB033 및 MEB037 하이브리도마 배치의 상등액을 대상으로 하여, 인간 PD-L1에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하기 위하여 스크리닝하였다. 이러한 스크린은 인간 hPD-L1-Fc 단백질에 대한 결합을 알아보기 위해 단백질 기반 ELISA를 이용하였고; 음성 대조군으로서의 모 CHO 세포 및 인간 PD-L1-CHO 안정한 형질전환체에 대한 결합을 알아보기 위해서는, 세포 기반 ELISA를 이용하였다. 항-PD-L1 항체 (데이터는 제시되지 않음) 및 그의 샘플의 존재에 대해 양성인 것으로 시험된 MEB033 하이브리도마의 23개 클론으로부터의 상등액 및 MEB037의 88개 클론으로부터의 상등액을 대상으로 하여, 정상 인간 편도로부터의 FFPE 조직 박편 상에서의 IHC 반응성에 관하여 시험하였다 (데이터는 제시되지 않음).
상기 MEB037 배치로부터의 88개 클론 중에서 11개 클론만이, 다음 표에 열거된 시판용 항-PD-L1 항체를 이용하여 수득된 염색 패턴과의 비교에 근거하여, 추가 평가를 타당하게 만드는 데 충분한 세기와 겉보기 특이성의 염색 패턴을 생성시켰다:
[표 6]
Figure 112015068492245-pct00008
본 발명자들이 실험적 항체를 이용하여 수득된 각종 염색 패턴을, 이들 시판용 항-인간 PD-L1 항체를 이용하여 수득된 패턴과 비교한 경우에, 염색의 국재화 및 염색된 세포의 유형을 포함하여, 이들 염색 패턴 간에 상당한 차이를 관찰하였다. 이들 차이를 설명하려는 시도로, 본 발명자들은 수많은 부가 실험을 수행하였고, 그 결과 이들 시판용 항체 중 어느 것도 FFPE 박편에서 PD-L1 발현을 IHC에 사용하는 데 요구되는 다음 속성의 조합을 제공하지 않았다는 사실을 발견하였다: (1) 민감도 - 양성 대조군 조직 (예를 들어, 인간 편도)에서의 정상적인 생리학적 발현 뿐만 아니라 종양 조직 (예를 들어, 인간 흑색종 샘플)에서의 발현을 검출할 수 있는 능력; (2) 특이도 - 염색 패턴은 PD-L1의 공지된 해부학적/세포성 분포와 상관 관계가 필요하고 중화시킬 필요가 있다; (3) 강건성 - "사본" 조직 박편을 검정하기 위해 사용되는 경우에는, 염색 패턴 상의 변동이 거의 없거나 전혀 없다.
예를 들어, 본 발명자들은 시그마/프로사이 PRS4059 항체가 편도 용해물 상에 여러 개의 밴드를 나타냈는데, 이들 중 어느 것도 PD-L1을 나타내는 것으로 확증할 수 없었다는 사실을 밝혀냈고; 유동 세포계수법에 의해 PD-L1 양성인 것으로 밝혀진 바 있는 LOX 흑색종 세포주를 염색하지 못하였으며; IHC에 의해 양성 세포주와 음성 세포주 간을 구별하지 못하였다.
이들 데이터 중 일부가 도 4에 도시되어 있는데, 여기서는 편도 박편의 면역조직화학 염색으로, FFPE 조직 박편에서 PD-L1 발현을 검출하기 위한 15개의 항-인간 PD-L1 항체 중에서 유일한 적합한 후보로서 문헌 (상기 문헌 [Gadiot et al.] 참조)에 의해 확인된 PRS4059 항체와 비교해서, FFPE 조직 상에 독특하고 유용한 면역조직화학적 특성을 지닌 2개의 항체로서 22C3 및 20C3이 확인되었다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험에서는, 일차적으로 0.4 mg/ml로 사용된 프로사이 항체 (PRS4059, lot 40590604)에 이어 토끼 중합체 검출 시스템 (다코 엔비젼)이 편도 내의 조혈 계통 모두를 동등한 세기로 염색시킨 반면 (도 4a), 22C3 항체는 편도 음와 상피 세포 및 난포 CD68+ 골수성 세포 (이는 형태학상 대식세포와 일치한다)를 선택적으로 염색하였다 (도 4b). 실질적으로 동일한 염색 패턴이 항체 20C3을 이용한 경우에 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 더욱이, 22C3 및 20C3은 이들 2가지 별개의 세포 집단 간에 일관되는 염색 세기 차이를 명확하게 보여주는데, 음와 상피 세포가 난포 대식세포보다 훨씬 더 크다. 3개 항체 모두는 PD-L1 항원과의 예비-인큐베이션에 의해 중화시킬 수 있었는데, 이는 그 반응성이 항원 결합 도메인 (CDR)에 의해 매개된다는 것을 표시한다.
실시예 2. 20C3 및 22C3 항-PD-L1 항체의 품질 평가
본 실시예는 FFPE 조직 박편의 IHC 검정에 사용하기 위한 20C3 및 22C3 항체의 유용성을 평가하기 위해 수행되었던 부가 실험을 설명하고 있다.
하나의 실험에서는, 정상 인간 FFPE 편도 박편의 IHC 검정에서 범위의 인간 PD-L1 (hPD-L1) 단백질 발현을 검출할 수 있는 이들 두 항체의 능력을 평가하였고, 22C3에 대한 대표적인 영상이 도 5a에 도시되어 있다. 22C3을 이용한 면역조직화학 염색은 편도 음와 상피 세포를 강력하게 표지시킬 뿐만 아니라 CD68+ 난포 골수성 집단 (대식세포로 추정됨)을 약한 수준 내지 중간 수준으로 염색시킨 것으로 입증된다. 양 항체 (20C3 데이터는 제시되지 않음)는 이들 2가지 세포 유형에서 명확히 정의된 막성/세포 표면 패턴으로 세포를 표지시킨다. 편도에서의 hPD-L1 발현의 적절성 [즉, 2가지 세포 집단 (음와 상피 세포 및 난포 대식세포)으로의 IHC 염색의 제한]은 인접한 FFPE 편도 조직 박편 상에서의 독립적인 방법론 (hPD-L1 mRNA에 대한 계내 혼성화 [ISH])에 의해 확증되었다. 또한, IHC에 의해 평가된 바와 같은 hPD-L1 단백질의 시차 발현 (음와 상피 세포 >> 난포 대식세포)은 ISH를 이용하여 관찰된 hPD-L1 mRNA의 상대적 존재도에 상응한다.
또 다른 실험에서는, hPD-L1-발현성 세포에 대한 20C3 및 22C3의 결합 특이성을 평가하였다. mRNA 분석 (qPCR)에 의해 hPD-L1의 발현에 대해 음성인 것으로 공지된 HT144 세포, 및 고 수준의 hPD-L1 mRNA (qPCR)를 발현하는 것으로 공지된 LOX 흑색종 세포를, 상기 실시예 1에 기재된 실험에서 생성된 7개 하이브리도마로부터의 정제된 마우스 IgG 1 마이크로그램/ml로 염색하였다. 무관한 이소형 대조군 마우스 항체를 또한, 동일한 농도로 사용하였다. 형광성-표지된 항-마우스 2차 항체를 사용하여 1차 마우스 항체를 검출하였다. 염색하고 반복해서 세척한 후, 상기 세포를 유동 세포계수법에 의해 분석하였는데, 상기 집단에 대해 중간 정도의 형광성 세기가 계산되었다 (>10,000 현상이 수집됨). 그 결과가 도 6에 도시되어 있다.
20C3 및 22C3 뿐만 아니라 다른 hPD-L1 항체를 유동 세포계수용 시약으로서 이용하여 세포 표면 hPD-L1을 검출하였다. 이소형 대조군 항체 곡선과 비교해서 20C3 및 22C3 히스토그램 곡선 둘 다가 상당히 우측으로 이동하였다는 것은 (도 6a) hPD-L1-양성 LOX 흑색종 세포주 상에서의 hPD-L1의 선택적 검출을 반영하고 있다. 이들 히스토그램과 연관된 중간 수준의 형광성 세기 및 이 분석으로부터의 다른가 도 6b에 도시되어 있다. 20C3 및 22C3 결합의 선택성은 음성 세포주 HT144 상에서의 실제적 결합의 결여 (즉, 이소형과 거의 동등한 수준의 22C3 및 20C3의 MFI)에 의해 추가로 확증된다. 이와는 달리, 도 6b 내의 데이터는 20C3과 22C3 둘 다가 hPD-L1 양성 LOX 흑색종 세포주 상에서 이소형과 비교해서 MFI에 있어서 10배 이상의 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. 따라서, 20C3과 22C3 둘 다는 (클론 5F9, 7C8, 13D2 및 31D3에 덧붙여) 유동 세포계수 평가에 의해 hPD-L1-발현성 세포에 대한 선택적 결합을 명확히 보여준다.
또 다른 실험에서는, 조작된 세포주 및 인간 세포주 상에서 hPD-L1의 발현을 검출할 수 있는 22C3 항체의 능력을 평가하였다. hPD-L1에 대해 음성인 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주를, 인간 PD-L1을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켜 조작된 양성 대조군 세포주를 창출시켰다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 모 CHO 세포주 (음성 대조군) 및 형질감염된 CHO 세포주 (양성 대조군)의 포르말린-고정되고 파라핀-봉매된 (FFPE) 세포 펠릿을 22C3으로 면역조직화학적으로 염색하면, 적당한 양성 및 음성 염색이 명확히 나타난다.
부가의 FFPE 인간 세포주 펠릿 (A375, HS578T 및 LOX 흑색종)을 22C3으로 염색하였고, 그 결과, 도 7b에 도시된 바와 같이 범위의 염색 패턴과 세기가 입증되었다. 22C3 염색은 Lox 흑색종 세포 상에서 강력하고 균일하였지만, A375 및 HS578T 세포 펠릿에서는 드문 단일 양성 세포만을 나타내었다. 20C3 항체를 이용한 경우에 유사한 염색이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). IHC 검정에서 22C3에 의해 이들 3개의 세포주에서 검출된 hPD-L1 발현 수준은 기준선으로서 유비퀴틴 mRNA를 수반한 qPCR을 이용하여 평가된 바와 같이, 이들 세포주에서의 PD-L1 mRNA 수준과 상당한 상관이 있었다.
hPD-L1-발현성 세포에 대한 22C3의 선택적 결합 및 상대적 친화성을 세포-기반 ELISA 실험에서 평가하였다. 몇 가지 세포주 (hPDL1-CHOK1 세포, 모 CHOK1 세포, hPDL2-CHOK1 세포, 및 LOX 세포)를 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트의 개개의 웰 상에 도말하고, 밀집되게 성장시켰다. 배지를 꺼내고, 이를 1.4 내지 3,000 ng/ml의 증가 농도 하의 1차 항체를 함유하는 신선한 CHOK1 배지 (10% BCS를 함유하는 DMEM/F12)로 대체시켰다. 다음 1차 항체, 즉 항체 20C3 및 22C3 각각의 2가지 상이한 생성 로트를 사용하였는데, 마우스 IgG1 이소형, 항-PD-L1 항체 (바이오레전드), 및 항-PD-L2 항체가 대조군으로서 제공되었다. 1차 항체를 37℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS/0.01% 트윈(Tween) 20으로 3X 세척하며, 2차 항체, 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적-HRP [서던 바이오텍 (Southern Biotech, Cat#1030-05)] 접합체를 CHOK1 배지에 1:2,000 희석도로 가하였다. 2차 항체를 37℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하고, 상기와 같이 5X 세척하였다. TMB를 이용하여 ELISA를 현상하고, 0.1 N 인산을 이용하여 중지시킨 다음, 650 nm 하에서의 배경 공제를 이용하여 450 nm 하에서 흡광도를 판독하였다. 도 8에 도시되는 결과는 hPD-L1을 발현하는 세포에 대한 22C3 및 20C3의 선택적 결합을 명확히 보여주는데, hPD-L1 CHOK1 조작된 세포와 LOX 세포 둘 다에 대한 22C3 결합 친화성은 20C3 보다 더 컸다
유사한 ELISA 실험을 수행하여, 20C3 항체 또는 22C3 항체 중 어느 것이 마우스 PD-L1과 결합하는 지를 평가하였다. 마우스 PD-L1에 대한 어느 하나의 항체의 실제적 결합이 전혀 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 1에 기재된 실험에서 확인된 항-hPD-L1 항체의 상이한 쌍 간의 항체 결합 경쟁 검정 ("교차-차단")을 수행하였다. 이 검정은 바이오-층 간섭 분광법에 근거하는 포르테바이오(ForteBio®) 옥텟® 플랫폼을 이용한다. 간략하게 언급하면, 이러한 기술은 결합된 항체가 시간이 경과함에 따라 (X-축) 바이오센서 팁에서의 광학 두께 (Y-축)를 증가시키기 때문에, 파장 시프트 (Δλ)로서 바이오센서 팁 표면에 대한 초기 항체 (mAb1)의 결합을 측정한다. 이러한 팁은 그 위에 hPD-L1-Fc가 결합되는 항-huIgG 센서로 이루어진다. 항-PD-L1 항체의 결합시 광학 두께 상의 변화는 첫 번째 세로 적색 점선에서 시작하여 우상향 곡선에 반영되는데 (도 9a, 9b 및 9c의 그래프 참조), 이는 포화 농도의 mAb1 (10 마이크로그램/ml)을 용액 내로 부가한 것을 나타낸다. 평형을 허용한 후 (약 1,000초), 제2 항체를 검정 용액 내로 주사한다 (도 9a, 9b 및 9c에서 두 번째 세로 적색 점선으로써 표시됨). 곡선의 부가의 편위로써 표시된 제2 mAb2의 결합은 두 항체가 비-중복 에피토프와 결합한다는 것을 제안하는 반면, 곡선의 편위가 거의 없거나 전혀 없다는 것은 두 항체가 중복되거나 동일한 에피토프와 결합한다는 것을 제안한다.
요약하면, 상기 결과는 22C3 결합이 5H9를 제외한 mAb2로서 시험된 다른 모든 항-hPD-L1 클론의 부가 결합과 경쟁한다는 것을 입증해 준다 (도 9a). 유사하게, 20C3은 또한, 5H9 결합과 경쟁하지 못하지만, 22C3 뿐만 아니라 4B7과 중간 정도의 부가 결합을 나타낸다 (도 9b). 취합해 보면, 이들 데이터는 20C3 및 22C3이 중복 에피토프와 결합한다는 것을 표시한다.
상이한 종양 유형에서 소정의 범위의 hPD-L1 발현을 검출할 수 있는 22C3 항체의 능력은 다음 종양으로부터 제조된 FFPE 박편 상에서 IHC 분석을 수행함으로써 평가하였다: 방광, 식도, 두경부, 신장, HCC, 유방, 폐, 난소 및 위. 이들 종양 조직 박편과의 22C3 반응성의 예비 스크린은 염색 정도를 반-정량적 "게슈탈트" 해석하는 것을 이용하여 수행하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 22C3은 본질적으로 염색이 없는 (스코어 = 0) 것에서부터 현저하게 강력한 발현 (스코어 = 4)까지 범위의 PD-L1 발현을 검출할 수 있는데, 이는 면역억제성 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단에 반응할 수 있는 향후의 종양 유형을 안내하기 위한 22C3을 이용한 IHC 검정의 유용성을 입증해준다.
PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 차단하는 요법에 더 잘 반응할 것으로 예상되는 환자를 계층화하기 위한 22C3 항체의 유용성은, 머크 앤드 캄파니, 인크.(Merck and Co., Inc.)에 의해 개발된 항-PD1 치료 항체인 MK-3475를 이용하는 1 상 (P001) 시험에 참여한 18명의 흑색종 환자로부터 수득된 보존 샘플의 22C3 면역조직화학적 평가를 활용하는 연구에서 평가하였다. 그 증례들은 두 명의 병리학자가 독립적으로 평가하였고, "양성", "음성" 또는 "불분명한" 것으로 배정하였으며, 이들 3가지 범주를 도시한 대표적인 영상이 도 11a에 도시되어 있다. 이러한 샘플 세트 (n=18)에 대한 병리학자 간의 일치가 100%였다.
면역 관련 반응 기준 (irRC)을 이용하여 임상 반응을 평가하였고, 이는 IHC 결과와 상관이 있었다. 이러한 분석을 위해, "불분명한" 증례를 음성인 것으로 간주하였는데, 이로써 검정 민감도는 72%이고 특이도는 86%였다. 도 11b에 도시되어 있는 결과는 FFPE 조직 상에서의 22C3 면역조직화학 염색은 환자 선별 바이오마커로서 유용성을 지닐 것이란 사실을 제안하고 있다.
상기 언급된 실험 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 88개의 실험용 하이브리도마 중 2개, 즉 MEB037.20C3.138 및 MEB037.20C3.116에 의해 생성된 항체가 후보 FFPE-반응성 IHC 진단 시약으로서 개발될 것으로 간주되는 데 필요한 민감도, 특이도 및 강건성의 조합을 가졌다는 것을 본 발명에서 밝혀내었다.
실시예 3. 22C3 항-PD-L1 항체에 대한 인간 PD -L1 상의 에피토프의 맵핑
11량체 히스티딘 태그와 융합된 성숙한 인간 PD-L1의 세포외 도메인 (서열 38)을 함유한 PD-L1-His 단백질 및 항체 22C3을 이용하여, HDX-MS 에피토프 맵핑를 수행하였다. 인간 PD-L1의 세포외 도메인 (서열 38) 상의 절편 156 내지 178 및 196 내지 206은 항체 22C3과의 결합시 강력한 보호를 나타내었다 (평균 중수소화 수준 차이 > 10%). 또한, 절편 3 내지 9, 10 내지 13, 88 내지 93, 및 135 내지 147은 중요하지는 않지만, 실제적인 보호를 나타내었다 (평균 중수소화 수준 차이 5% 내지 10%).
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적인 공보, 데이터베이스 입력 (예를 들어, 유전자은행 서열 또는 유전자ID 입력), 특허 출원 또는 특허가 구체적이고도 개별적으로 참조로 포함된다고 표시되는 바와 동일한 정도로 참조로 포함된다. 이러한 참조로 포함된다는 설명서는, 심지어 상기 인용이 참조로 혼입된다는 전용 설명서에 바로 인접하지 않은 경우에도, 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라서 본 출원인에 의해, 각각의 그리고 모든 개별적인 공보, 데이터베이스 입력 (예를 들어, 유전자은행 서열 또는 유전자ID 입력), 특허 출원 또는 특허 [이들 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인된다]에 관한 것으로 의도된다. 존재하는 경우, 본 명세서 내에 참조로 포함된다는 전용 설명서가 포함되는 것이, 참조로 포함된다는 일반적인 설명을 어떠한 방식으로든지 약화시키지 않는다. 본원의 참고 문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 선행 기술과 관련있는 것으로 인정하는 것으로 간주되지 않아야 하거나 또는 이들 공보 또는 문헌의 내용 또는 일자로서 어떠한 승인도 구성하지 않는다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적 실시양태로써 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이, 전술된 설명 및 수반되는 도면으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범의 내에 속하는 것으로 의도된다.
전술된 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있게 하는 데 충분한 것으로 간주된다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구범위 내에 속할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MERCK SHARP & DOHME CORP. Pierce, Robert H. Linda, Liang Bourne, Patricia Bigler, Michael E. <120> ANTIBODIES THAT BIND TO HUMAN PROGRAMMED DEATH LIGAND I (PD-LI) <130> 23411 <140> PCT/US13/75932 <141> 2013-12-18 <150> US 61/745,386 <151> 2012-12-21 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 may be His or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 may be Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 may be Arg or Ser <400> 1 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Xaa Xaa Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 may be Gln or Lys <400> 3 Xaa Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr 1 5 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial 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His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Ile Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 32 <211> 122 <212> PRT <213> Mus Musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 may be Gln or Pyro-Glutamate <400> 32 Xaa Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Ile Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 396 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 33 atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctttggg 60 gacattgtga tgtcacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gccagcaatc ttatgatgtg 360 gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396 <210> 34 <211> 423 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 34 atggaaaggc actggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gtccaggttc agcagtctgg ggctgaactg gcagaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacat ctttactagc tactggatgc actggctaaa gcagaggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatcccagca gtgattataa tgaatacagt 240 gagaaattca tggacaaggc cacattgact gcagacaaag cctccaccac agcctacatg 300 caactgatca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag atcgggatgg 360 ttagtacatg gagactatta ttttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420 tca 423 <210> 35 <211> 396 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 35 atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccctcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgacctgca aatccagtca gagtctgctc cacactagca cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctattgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaacaatc ttatgatgtg 360 gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396 <210> 36 <211> 423 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 36 atggaaaggc actggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gtccaccttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac gtttactagt tactggatac actggataaa gcagaggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatccttcct ctggttatca tgaatacaat 240 cagaaattca ttgacaaggc cacattgact gctgacagat cctccagcac agcctacatg 300 cacctgacca gcctgacgtc tgaagactct gcagtctatt actgtgcaag atcgggatgg 360 ttaatacatg gagactacta ctttgacttc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420 tca 423 <210> 37 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 38 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr 210 215 220

Claims (20)

  1. 인간 PD-L1과 특이적으로 결합하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 3개 경쇄 CDR, 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서
    3개 경쇄 CDR은 서열 9, 서열 2 및 서열 10이고, 3개 중쇄 CDR은 서열 14, 서열 16 및 서열 17이거나; 또는
    3개 경쇄 CDR은 서열 21, 서열 2 및 서열 22이고, 3개 중쇄 CDR은 서열 26, 서열 28 및 서열 29인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 3개 경쇄 CDR이 서열 9, 서열 2 및 서열 10이고, 3개 중쇄 CDR이 서열 14, 서열 16 및 서열 17인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 3개 경쇄 CDR이 서열 21, 서열 2 및 서열 22이고, 3개 중쇄 CDR이 서열 26, 서열 28 및 서열 29인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서
    (a) 경쇄 가변 영역은 서열 13이고, 중쇄 가변 영역은 서열 20이거나;
    (b) 경쇄 가변 영역은 서열 25이고, 중쇄 가변 영역은 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 Q임)이거나; 또는
    (c) 경쇄 가변 영역은 서열 25이고, 중쇄 가변 영역은 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 pE임)인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 여기서
    (a) 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 33이고, 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 34이거나; 또는
    (b) 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 35이고, 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 36인, 단리된 핵산.
  10. 삭제
  11. 제9항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. (a) 인간으로부터 분리된 조직 샘플을 인간 PD-L1에 대한 PD-L1 결합 시약의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에 PD-L1 결합 시약과 접촉시키며, 여기서 결합 시약은 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 것인 단계;
    (b) 결합되지 않은 PD-L1 결합 시약을 제거하는 단계; 및
    (c) 결합된 PD-L1 결합제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 인간으로부터 분리된 조직 샘플을 PD-L1 발현에 대해 검정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 결합된 결합 시약의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 결합 시약이 서열 13 및 서열 20을 포함하거나 또는 서열 25 및 서열 32를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 인간 PD-L1과 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 복합체를 검출하기 위한 시약 세트를 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 서열 13 및 서열 20을 포함하거나 또는 서열 25 및 서열 32를 포함하는 것인 키트.
  18. 항체 분자의 혼합물을 포함하며, 여기서 이러한 혼합물 중의 항체 분자의 60% 초과는 서열 25 및 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 pE임)를 포함하고, 혼합물 중의 항체 분자의 나머지는 서열 25 및 서열 32 (여기서, 서열 32 중의 X는 Q임)를 포함하는 것인 항체 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
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