JP2023071948A - ヒトプログラム死リガンド1(pd-l1)に結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトプログラム死リガンド1(PD-L1)に結合し、免疫組織化学的(IHC)分析によるヒト組織サンプルにおけるPD-L1発現の検出に有用である特異的配列を有する抗体を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するCDRL1、CDRL2およびCDRL3の、3個の軽鎖CDR、ならびに特定のアミノ酸配列を有するCDRH1、CDRH2およびCDRH3の、3個の重鎖CDRを含む、ヒトPD-L1に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本開示の抗体および抗原結合性フラグメントをコードする核酸分子ならびに発現ベクターおよびその発現のための宿主細胞も提供する。【選択図】図11B
Description
本発明は、ヒトプログラム死リガンド1(PD-L1)に結合し、免疫組織化学的(I
HC)分析によるヒト組織サンプルにおけるPD-L1発現の検出に有用である特異的配
列を有する抗体に関する。本発明はまた、これらの抗ヒトPD-L1抗体を使用する特異
的IHCアッセイに関する。
HC)分析によるヒト組織サンプルにおけるPD-L1発現の検出に有用である特異的配
列を有する抗体に関する。本発明はまた、これらの抗ヒトPD-L1抗体を使用する特異
的IHCアッセイに関する。
PD-L1は、プログラム死1(PD-1)のための2つの公知リガンドの1つである
細胞表面糖タンパク質であり、これは免疫調節および末梢性トレランスの維持の重要な担
い手として認識されている。PD-L1の発現は、ナイーブリンパ球ならびに活性化Bお
よびT細胞、単球ならびに樹状細胞を含む種々の免疫細胞の表面上で観察されている(同
誌)。更に、PD-L1 mRNAは、血管内皮細胞、上皮細胞、筋細胞を含む非リンパ
系組織により、ならびに扁桃および胎盤組織において発現される。例えば、Keir,M
.E.ら,Annu Rev Immunol.26:677-704(2008);S
harp A.H.ら,Nature Immunol.8:239-245(2007
);Okazaki TおよびHonjo T,Internat.immunol.1
9:813-824(2007)を参照されたい。
細胞表面糖タンパク質であり、これは免疫調節および末梢性トレランスの維持の重要な担
い手として認識されている。PD-L1の発現は、ナイーブリンパ球ならびに活性化Bお
よびT細胞、単球ならびに樹状細胞を含む種々の免疫細胞の表面上で観察されている(同
誌)。更に、PD-L1 mRNAは、血管内皮細胞、上皮細胞、筋細胞を含む非リンパ
系組織により、ならびに扁桃および胎盤組織において発現される。例えば、Keir,M
.E.ら,Annu Rev Immunol.26:677-704(2008);S
harp A.H.ら,Nature Immunol.8:239-245(2007
);Okazaki TおよびHonjo T,Internat.immunol.1
9:813-824(2007)を参照されたい。
PD-L1発現は種々のヒト癌においても観察されており、PD-1との腫瘍細胞発現
PD-L1の相互作用は腫瘍特異的T細胞の抑制またはアポトーシスを誘導しうる。例え
ば卵巣、腎臓、結腸直腸、膵臓、肝臓癌およびメラノーマの大きなサンプルセットにおい
て、PD-L1発現は不良予後と相関し、後続治療に無関係に全生存期間を減少させるこ
とが示された。PD-1へのPD-L1の結合を遮断する抗PD-1モノクローナル抗体
は種々の腫瘍型に対する抗腫瘍活性を有することが示されており、初期のヒト臨床データ
は、PD-L1を発現する腫瘍を有する患者が抗PD-1療法に応答する可能性がより高
いことを示唆している。例えば、Iwaiら,PNAS 99:12293-12297
(2002);Ohigashiら,Clin Cancer Res 11:2947
-2953(2005);Ghebehら,Neoplasia 8:190-198(
2006);Hamanishi,Jら,PNAS 104:3360-3365(20
07);Yangら,Invest Ophthalmol Vis Sci.49(6
):2518-2525(2008);Gaoら,Clin Cancer Res 1
5:971-979(2009);Brahmer J.R.ら,J Clin Onc
ol.28:3167-3175(2010)を参照されたい。
PD-L1の相互作用は腫瘍特異的T細胞の抑制またはアポトーシスを誘導しうる。例え
ば卵巣、腎臓、結腸直腸、膵臓、肝臓癌およびメラノーマの大きなサンプルセットにおい
て、PD-L1発現は不良予後と相関し、後続治療に無関係に全生存期間を減少させるこ
とが示された。PD-1へのPD-L1の結合を遮断する抗PD-1モノクローナル抗体
は種々の腫瘍型に対する抗腫瘍活性を有することが示されており、初期のヒト臨床データ
は、PD-L1を発現する腫瘍を有する患者が抗PD-1療法に応答する可能性がより高
いことを示唆している。例えば、Iwaiら,PNAS 99:12293-12297
(2002);Ohigashiら,Clin Cancer Res 11:2947
-2953(2005);Ghebehら,Neoplasia 8:190-198(
2006);Hamanishi,Jら,PNAS 104:3360-3365(20
07);Yangら,Invest Ophthalmol Vis Sci.49(6
):2518-2525(2008);Gaoら,Clin Cancer Res 1
5:971-979(2009);Brahmer J.R.ら,J Clin Onc
ol.28:3167-3175(2010)を参照されたい。
最近の報告は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒトメラノーマサンプルに
おけるhPD-L1の発現を検出する際の有用性に関する15個の抗PD-L1抗体の比
較を記載している(Gadiot,J.ら,Cancer 117(10):2192-
2201(2011))。この比較において評価された有用性基準は、(1)パラフィン
包埋組織を染色する能力、(2)低いバックグラウンドの染色をもたらすこと、(3)P
D-L1融合タンパク質の存在下でプレインキュベーションすることにより、PD-L1
への結合が遮断されることであった。該著者は、ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体(Pr
oSci,Poway,CA USA)であるAb#4059が、これらの基準の全てを
許容可能に満たした試験された15個のうちの唯一の抗ヒトPD-L1抗体であると結論
づけた(同誌,2195,第2欄)。
おけるhPD-L1の発現を検出する際の有用性に関する15個の抗PD-L1抗体の比
較を記載している(Gadiot,J.ら,Cancer 117(10):2192-
2201(2011))。この比較において評価された有用性基準は、(1)パラフィン
包埋組織を染色する能力、(2)低いバックグラウンドの染色をもたらすこと、(3)P
D-L1融合タンパク質の存在下でプレインキュベーションすることにより、PD-L1
への結合が遮断されることであった。該著者は、ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体(Pr
oSci,Poway,CA USA)であるAb#4059が、これらの基準の全てを
許容可能に満たした試験された15個のうちの唯一の抗ヒトPD-L1抗体であると結論
づけた(同誌,2195,第2欄)。
本発明は、ProSci Ab#4059により産生されたものより免疫学的に適切で
あると本発明者らが考えているFFPE扁桃組織におけるIHC染色パターンを与える抗
ヒトPD-L1モノクローナル抗体に関する。後記実施例に記載されているとおり、この
ProSci抗体(PRS4059,Sigma-Aldrichロット4059060
4)は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、本発明の2つの抗体、
すなわち、22C3および20C3は、扁桃陰窩上皮および濾胞CD68+骨髄細胞(こ
れはマクロファージと形態学的に合致している)を選択的に染色したことを、本発明者ら
は見出した。更に、22C3および20C3はこれらの2つの別個の細胞集団の間の一貫
した強度の相違を示しており、陰窩上皮における染色強度は濾胞マクロファージにおける
ものより遥かに大きい。全3個の抗体(PRS4059、22C3および20C3)はP
D-L1抗原の存在下のプレインキュベーションにより中和され、このことは、該反応性
が抗原結合ドメイン(CDR)によりもたらされることを示している。したがって、本発
明はまた、FFPE組織切片においてPD-L1を検出するためのIHCアッセイを含む
、ヒト細胞の表面上のPD-L1発現の検出における、本発明の抗体の使用に関する。
あると本発明者らが考えているFFPE扁桃組織におけるIHC染色パターンを与える抗
ヒトPD-L1モノクローナル抗体に関する。後記実施例に記載されているとおり、この
ProSci抗体(PRS4059,Sigma-Aldrichロット4059060
4)は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、本発明の2つの抗体、
すなわち、22C3および20C3は、扁桃陰窩上皮および濾胞CD68+骨髄細胞(こ
れはマクロファージと形態学的に合致している)を選択的に染色したことを、本発明者ら
は見出した。更に、22C3および20C3はこれらの2つの別個の細胞集団の間の一貫
した強度の相違を示しており、陰窩上皮における染色強度は濾胞マクロファージにおける
ものより遥かに大きい。全3個の抗体(PRS4059、22C3および20C3)はP
D-L1抗原の存在下のプレインキュベーションにより中和され、このことは、該反応性
が抗原結合ドメイン(CDR)によりもたらされることを示している。したがって、本発
明はまた、FFPE組織切片においてPD-L1を検出するためのIHCアッセイを含む
、ヒト細胞の表面上のPD-L1発現の検出における、本発明の抗体の使用に関する。
1つの態様においては、本発明は、ヒトPD-L1に特異的に結合する単離された抗体
またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該単離モノクローナル抗体またはその抗
原結合性フラグメントは、CDRL1、CDRL2およびCDRL3の、3個の軽鎖CD
R、ならびにCDRH1、CDRH2およびCDRH3の、3個の重鎖CDRを含む。
またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該単離モノクローナル抗体またはその抗
原結合性フラグメントは、CDRL1、CDRL2およびCDRL3の、3個の軽鎖CD
R、ならびにCDRH1、CDRH2およびCDRH3の、3個の重鎖CDRを含む。
CDRL1は、配列番号1、配列番号9、配列番号21、配列番号9の変異体および配
列番号21の変異体からなる群から選択される。CDRL2は、配列番号2および配列番
号2の変異体からなる群から選択される。CDRL3は、配列番号3、配列番号10、配
列番号22、配列番号10の変異体および配列番号22の変異体からなる群から選択され
る。
列番号21の変異体からなる群から選択される。CDRL2は、配列番号2および配列番
号2の変異体からなる群から選択される。CDRL3は、配列番号3、配列番号10、配
列番号22、配列番号10の変異体および配列番号22の変異体からなる群から選択され
る。
CDRH1は、配列番号5、配列番号14、配列番号15、配列番号26、配列番号2
7、配列番号14の変異体、配列番号15の変異体、配列番号26の変異体および配列番
号27の変異体からなる群から選択される。CDRH2は、配列番号6、配列番号16、
配列番号28、配列番号16の変異体および配列番号28の変異体からなる群から選択さ
れる。CDRH3は、配列番号7、配列番号17、配列番号29、配列番号17の変異体
および配列番号29の変異体からなる群から選択される。
7、配列番号14の変異体、配列番号15の変異体、配列番号26の変異体および配列番
号27の変異体からなる群から選択される。CDRH2は、配列番号6、配列番号16、
配列番号28、配列番号16の変異体および配列番号28の変異体からなる群から選択さ
れる。CDRH3は、配列番号7、配列番号17、配列番号29、配列番号17の変異体
および配列番号29の変異体からなる群から選択される。
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントにおいては、変異体CDR配列(軽鎖また
は重鎖)は、参照配列における1個または2個の保存的アミノ酸置換を有すること以外は
参照配列と同一であり、好ましくは、参照配列における唯一の保存的アミノ酸置換を有す
る。好ましい実施形態においては、前記の3個の軽鎖CDRの多くとも2個は変異体配列
であり、前記の3個の重鎖CDRの多くとも2個は変異体配列である。より好ましい実施
形態においては、前記の6個のCDRの3個、2個または1個のみが変異体配列である。
は重鎖)は、参照配列における1個または2個の保存的アミノ酸置換を有すること以外は
参照配列と同一であり、好ましくは、参照配列における唯一の保存的アミノ酸置換を有す
る。好ましい実施形態においては、前記の3個の軽鎖CDRの多くとも2個は変異体配列
であり、前記の3個の重鎖CDRの多くとも2個は変異体配列である。より好ましい実施
形態においては、前記の6個のCDRの3個、2個または1個のみが変異体配列である。
1つの好ましい実施形態においては、前記の3個の軽鎖CDRは配列番号1、配列番号
2および配列番号3であり、前記の3個の重鎖は配列番号5、配列番号6および配列番号
7である。
2および配列番号3であり、前記の3個の重鎖は配列番号5、配列番号6および配列番号
7である。
もう1つの好ましい実施形態においては、前記の3個の軽鎖CDRは配列番号9、配列
番号2および配列番号10であり、前記の3個の重鎖CDRは配列番号14、配列番号1
6および配列番号17である。
番号2および配列番号10であり、前記の3個の重鎖CDRは配列番号14、配列番号1
6および配列番号17である。
更にもう1つの好ましい実施形態においては、前記の3個の軽鎖CDRは配列番号21
、配列番号2および配列番号22であり、前記の3個の重鎖CDRは配列番号26、配列
番号28および配列番号29である。
、配列番号2および配列番号22であり、前記の3個の重鎖CDRは配列番号26、配列
番号28および配列番号29である。
本発明の幾つかの抗体および抗原結合性フラグメントは軽鎖可変領域および重鎖可変領
域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号4、配列番号13、配列番号13の変異体、配列番
号25および配列番号25の変異体からなる群から選択され、重鎖可変領域は、配列番号
8、配列番号20、配列番号20の変異体、配列番号32および配列番号32の変異体か
らなる群から選択される。そのような実施形態においては、可変体軽鎖可変領域配列は、
フレームワーク領域(すなわち、CDR以外)における5個までの保存的アミノ酸置換を
有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領域における4個
未満、3個未満または2個未満の保存的アミノ酸置換を有する。同様に、可変体重鎖可変
領域配列は、フレームワーク領域(すなわち、CDR以外)における17個までの保存的
アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領
域における10個未満、9個未満、8個未満、7個未満、6個未満または5個未満の保存
的アミノ酸置換を有する。
域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号4、配列番号13、配列番号13の変異体、配列番
号25および配列番号25の変異体からなる群から選択され、重鎖可変領域は、配列番号
8、配列番号20、配列番号20の変異体、配列番号32および配列番号32の変異体か
らなる群から選択される。そのような実施形態においては、可変体軽鎖可変領域配列は、
フレームワーク領域(すなわち、CDR以外)における5個までの保存的アミノ酸置換を
有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領域における4個
未満、3個未満または2個未満の保存的アミノ酸置換を有する。同様に、可変体重鎖可変
領域配列は、フレームワーク領域(すなわち、CDR以外)における17個までの保存的
アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領
域における10個未満、9個未満、8個未満、7個未満、6個未満または5個未満の保存
的アミノ酸置換を有する。
本発明の1つの好ましい抗体または抗原結合性フラグメントにおいては、軽鎖可変領域
は配列番号13であり、重鎖可変領域は配列番号20である。
は配列番号13であり、重鎖可変領域は配列番号20である。
本発明のもう1つの好ましい抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号25の軽鎖
可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含む。
可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含む。
更にもう1つの実施形態においては、本発明の抗体または結合性フラグメントは配列番
号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号32
におけるXはpEである。
号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号32
におけるXはpEである。
更にもう1つの実施形態においては、本発明の抗体または結合性フラグメントは配列番
号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号32
におけるXはQである。
号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号32
におけるXはQである。
前記の抗体の実施形態の全てにおいては、該単離抗体は、IgM、IgG、IgD、I
gAおよびIgEを含む免疫グロブリンの任意のクラスの完全長抗体でありうる。好まし
くは、該抗体はIgG抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である
。1つの実施形態においては、該抗体はマウスIgG1定常領域を含む。
gAおよびIgEを含む免疫グロブリンの任意のクラスの完全長抗体でありうる。好まし
くは、該抗体はIgG抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である
。1つの実施形態においては、該抗体はマウスIgG1定常領域を含む。
特に好ましい抗体はモノクローナル抗体20C3および22C3であり、これらは、そ
れぞれハイブリドーマMEB037.20C3およびMEB037.22C3により発現
されるIgG1抗体である。
れぞれハイブリドーマMEB037.20C3およびMEB037.22C3により発現
されるIgG1抗体である。
本発明はまた、ヒトPD-L1に特異的に結合し20C3もしくは22C3の又は配列
番号25および配列番号32を含む参照抗体のヒトPD-L1への結合を遮断する単離さ
れたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。1つの好ましい
実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは20C3および22
C3のそれぞれの又は(a)配列番号13および配列番号20を含む参照抗体ならびに(
b)配列番号25および配列番号32を含む参照抗体のそれぞれのヒトPD-L1への結
合を遮断する。
番号25および配列番号32を含む参照抗体のヒトPD-L1への結合を遮断する単離さ
れたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。1つの好ましい
実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは20C3および22
C3のそれぞれの又は(a)配列番号13および配列番号20を含む参照抗体ならびに(
b)配列番号25および配列番号32を含む参照抗体のそれぞれのヒトPD-L1への結
合を遮断する。
本発明はまた、前記抗体または抗体フラグメントのいずれかを製剤(処方)中に含む抗
体組成物を提供する。1つの適当な製剤は20mM 酢酸ナトリウムおよび9% スクロ
ースをpH5.0で含む。好ましい実施形態においては、該組成物は抗体分子の混合物を
含み、この場合、該混合物中の抗体分子の大部分(すなわち、60%、65%、70%、
80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号25および配列番
号32(ここで、配列番号32におけるXはpEである)を含み、該混合物中の抗体分子
の残りは配列番号25および配列番号32(ここで、配列番号32におけるXはQである
)を含む。
体組成物を提供する。1つの適当な製剤は20mM 酢酸ナトリウムおよび9% スクロ
ースをpH5.0で含む。好ましい実施形態においては、該組成物は抗体分子の混合物を
含み、この場合、該混合物中の抗体分子の大部分(すなわち、60%、65%、70%、
80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号25および配列番
号32(ここで、配列番号32におけるXはpEである)を含み、該混合物中の抗体分子
の残りは配列番号25および配列番号32(ここで、配列番号32におけるXはQである
)を含む。
前記実施形態のいずれかにおいては、該抗原結合性フラグメントはFabフラグメント
、Fab’フラグメント、(Fab’)2フラグメントである。
、Fab’フラグメント、(Fab’)2フラグメントである。
前記実施形態のいずれかにおいては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可
能な標識を更に含みうる。
能な標識を更に含みうる。
本発明はまた、前記で開示された抗体可変領域のいずれかをコードする単離された核酸
を提供する。1つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番号33および配列番号
34の一方または両方を含む。もう1つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番
号35および配列番号36の一方または両方を含む。これらの実施形態のいずれかにおい
ては、該単離核酸は好ましくは発現ベクターである。
を提供する。1つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番号33および配列番号
34の一方または両方を含む。もう1つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番
号35および配列番号36の一方または両方を含む。これらの実施形態のいずれかにおい
ては、該単離核酸は好ましくは発現ベクターである。
本発明はまた、前記で開示されている抗体可変領域のいずれかをコードする発現ベクタ
ーを含む宿主細胞に関する。好ましくは、該発現ベクターは配列番号33および配列番号
34を含み、または配列番号35および配列番号36を含む。
ーを含む宿主細胞に関する。好ましくは、該発現ベクターは配列番号33および配列番号
34を含み、または配列番号35および配列番号36を含む。
本発明はまた、ヒトから摘出されたヒト組織サンプルをPD-L1発現に関してアッセ
イする方法を提供する。該アッセイ方法は、ヒトPD-L1へのPD-L1結合試薬の特
異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをPD-L1結合試薬と接触させ、未結合
PD-L1結合試薬を除去し、結合したPD-L1結合剤の存在または非存在を検出する
ことを含む。1つの好ましい実施形態においては、該方法は、結合した結合試薬の量を定
量することを更に含む。該結合試薬は前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグ
メントのいずれかである。好ましくは、該結合試薬は、配列番号13および配列番号20
を含む又は配列番号25および配列番号32を含む抗体である。1つの好ましい実施形態
においては、該結合試薬は、配列番号25および配列番号32を含む抗体分子の混合物を
含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分(すなわち、60%、65%、70%
、80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号32におけるX
位にpEを有し、該分子の残りは配列番号32におけるX位にQを有する。
イする方法を提供する。該アッセイ方法は、ヒトPD-L1へのPD-L1結合試薬の特
異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをPD-L1結合試薬と接触させ、未結合
PD-L1結合試薬を除去し、結合したPD-L1結合剤の存在または非存在を検出する
ことを含む。1つの好ましい実施形態においては、該方法は、結合した結合試薬の量を定
量することを更に含む。該結合試薬は前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグ
メントのいずれかである。好ましくは、該結合試薬は、配列番号13および配列番号20
を含む又は配列番号25および配列番号32を含む抗体である。1つの好ましい実施形態
においては、該結合試薬は、配列番号25および配列番号32を含む抗体分子の混合物を
含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分(すなわち、60%、65%、70%
、80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号32におけるX
位にpEを有し、該分子の残りは配列番号32におけるX位にQを有する。
もう1つの態様においては、本発明は、ヒト組織サンプルをPD-L1発現に関してア
ッセイするためのキットを提供する。該キットは、PD-L1結合剤と、ヒトPD-L1
に結合した結合剤を含む複合体を検出するための試薬のセットとを含む。該PD-L1結
合剤は、ヒトPD-L1に特異的に結合する前記の任意のモノクローナル抗体または抗原
結合性フラグメントである。前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントの
いずれかである。好ましくは、該抗体または結合性フラグメントは配列番号13および配
列番号20を含む、または配列番号25および配列番号32を含む。1つの好ましい実施
形態においては、該結合試薬は、配列番号25および配列番号32を含む抗体分子の混合
物を含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分(すなわち、60%、65%、7
0%、80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号32におけ
るX位にpEを有し、該分子の残りは配列番号32におけるX位にQを有する。
ッセイするためのキットを提供する。該キットは、PD-L1結合剤と、ヒトPD-L1
に結合した結合剤を含む複合体を検出するための試薬のセットとを含む。該PD-L1結
合剤は、ヒトPD-L1に特異的に結合する前記の任意のモノクローナル抗体または抗原
結合性フラグメントである。前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントの
いずれかである。好ましくは、該抗体または結合性フラグメントは配列番号13および配
列番号20を含む、または配列番号25および配列番号32を含む。1つの好ましい実施
形態においては、該結合試薬は、配列番号25および配列番号32を含む抗体分子の混合
物を含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分(すなわち、60%、65%、7
0%、80%、85%、90%または95%のいずれかを超える)は配列番号32におけ
るX位にpEを有し、該分子の残りは配列番号32におけるX位にQを有する。
詳細な説明
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
ADCC:抗体依存性細胞傷害
CDC:補体依存性細胞傷害
CDR:特に示されていない限り、Kabat番号付け系を用いて定められた、免疫グ
ロブリン可変領域における相補性決定領域
CHO:チャイニーズハムスター卵巣
Clothia(クロチア):Al-Lazikaniら,JMB 273:927-
948(1997)に記載されている抗体番号付け系
EC50:50%の効力または結合をもたらす濃度
ELISA:酵素結合イムノソルベントアッセイ
FFPE:ホルマリン固定パラフィン包埋
FR:抗体フレームワーク領域:CDR領域以外の免疫グロブリン可変領域
HRP:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IFN:インターフェロン
IC50:50%の抑制をもたらす濃度
IgG:免疫グロブリンG
Kabat(カバト):Elvin A.Kabat((1991)Sequence
s of Proteins of Immunological Interest,
5th Ed.Public Health Service,National In
stitutes of Health,Bethesda,Md.)により先駆的に案
出された免疫グロブリンアライメントおよび番号付け系
mAbまたはMabまたはMAb:モノクローナル抗体
MES:2(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
MOA:作用メカニズム
NHS:正常ヒト血清
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
pE:ピログルタミン酸
PK:薬物動態
SEB:スタヒロコッカスエンテロトキシンB
TT:破傷風トキソイド
V領域:異なる抗体間で配列において可変性であるIgG鎖のセグメント。それは軽鎖
内のKabat残基109および重鎖内の同残基113に伸長する。
CDC:補体依存性細胞傷害
CDR:特に示されていない限り、Kabat番号付け系を用いて定められた、免疫グ
ロブリン可変領域における相補性決定領域
CHO:チャイニーズハムスター卵巣
Clothia(クロチア):Al-Lazikaniら,JMB 273:927-
948(1997)に記載されている抗体番号付け系
EC50:50%の効力または結合をもたらす濃度
ELISA:酵素結合イムノソルベントアッセイ
FFPE:ホルマリン固定パラフィン包埋
FR:抗体フレームワーク領域:CDR領域以外の免疫グロブリン可変領域
HRP:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IFN:インターフェロン
IC50:50%の抑制をもたらす濃度
IgG:免疫グロブリンG
Kabat(カバト):Elvin A.Kabat((1991)Sequence
s of Proteins of Immunological Interest,
5th Ed.Public Health Service,National In
stitutes of Health,Bethesda,Md.)により先駆的に案
出された免疫グロブリンアライメントおよび番号付け系
mAbまたはMabまたはMAb:モノクローナル抗体
MES:2(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
MOA:作用メカニズム
NHS:正常ヒト血清
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
pE:ピログルタミン酸
PK:薬物動態
SEB:スタヒロコッカスエンテロトキシンB
TT:破傷風トキソイド
V領域:異なる抗体間で配列において可変性であるIgG鎖のセグメント。それは軽鎖
内のKabat残基109および重鎖内の同残基113に伸長する。
VH:免疫グロブリン重鎖可変領域
VK:免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用途を特に以下に定義する。本
明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書で用いられている全ての他の科
学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されている意味を有す
る。
VK:免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用途を特に以下に定義する。本
明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書で用いられている全ての他の科
学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されている意味を有す
る。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の単語は、文脈に明らかに
矛盾しない限り、対応する複数形対象物を含む。
矛盾しない限り、対応する複数形対象物を含む。
「活性化」は、それが細胞または受容体に適用される場合、文脈により又は明示的に特
に示されていない限り、リガンドでの細胞または受容体の活性化または処理を意味する。
「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、
類似体、突然変異タンパク質、および抗体由来の結合性化合物を含む。「リガンド」はま
た、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣体を含
む。「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的または環境要因により調節される細胞
活性化を意味しうる。
に示されていない限り、リガンドでの細胞または受容体の活性化または処理を意味する。
「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、
類似体、突然変異タンパク質、および抗体由来の結合性化合物を含む。「リガンド」はま
た、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣体を含
む。「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的または環境要因により調節される細胞
活性化を意味しうる。
分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性;遺
伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力;抗原活性、他の分
子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間
相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構
造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比
活性、例えば、[触媒活性]/[mgタンパク質]、または[免疫活性]/[mgタンパ
ク質]、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「活性」は、先天性または適応免疫
系の構成要素のモジュレーションを意味しうる。
伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力;抗原活性、他の分
子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間
相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構
造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比
活性、例えば、[触媒活性]/[mgタンパク質]、または[免疫活性]/[mgタンパ
ク質]、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「活性」は、先天性または適応免疫
系の構成要素のモジュレーションを意味しうる。
「投与」および「治療(処理)」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官
または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官また
は生物学的流体と、外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。「
投与」および「治療(処理)」は、例えば、治療方法、プラセボ方法、薬物動態学的方法
、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。「細胞の処理」は、該細胞と試薬の
接触、および該細胞に接触している流体と試薬の接触を含む。「投与」および「処理(治
療)」は、試薬、診断剤、結合性成分または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロ
およびエクスビボ(ex vivo)処理をも意味する。「対象」なる語は、任意の生物
、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウ
サギ)、最も好ましくはヒトを含む。
または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官また
は生物学的流体と、外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。「
投与」および「治療(処理)」は、例えば、治療方法、プラセボ方法、薬物動態学的方法
、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。「細胞の処理」は、該細胞と試薬の
接触、および該細胞に接触している流体と試薬の接触を含む。「投与」および「処理(治
療)」は、試薬、診断剤、結合性成分または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロ
およびエクスビボ(ex vivo)処理をも意味する。「対象」なる語は、任意の生物
、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウ
サギ)、最も好ましくはヒトを含む。
「治療(処理)する」または「治療(処理)」は、治療用物質、例えば、本発明の抗体
または抗原結合性フラグメントを含有する組成物を、該物質が治療活性を有する1以上の
疾患症状を有する又は疾患を有すると疑われる対象または患者に内的または外的に投与す
ることを意味する。典型的には、該物質は、いずれかの臨床的に測定可能な度合でそのよ
うな症状の退縮を誘導する又はそのような症状の進行を抑制することにより、治療された
対象または集団における1以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。いずれ
かの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用物質の量(「治療的有効量」とも称され
る)は、病態、患者の年齢および体重ならびにその薬物が対象において所望の応答を惹起
する能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の
重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者により典型的
に用いられるいずれかの臨床測定により評価されうる。本発明の1つの実施形態(例えば
、治療方法または製造品)は、全ての対象における標的疾患症状を軽減するのに有効でな
いかもしれないが、それは、スチューデントt検定、カイ2乗検定、MannおよびWh
itneyによるU検定、クラスカル-ウォリス(Kruskal-Wallis)検定
(H検定)、ヨンクヒール-テルプストラ(Jonckheere-Terpstra)
検定ならびにウィルコクソン(Wilcoxon)検定のような当技術分野で公知のいず
れかの統計的検定により決定された統計的に有意な対象数において標的疾患症状を軽減す
るはずである。
または抗原結合性フラグメントを含有する組成物を、該物質が治療活性を有する1以上の
疾患症状を有する又は疾患を有すると疑われる対象または患者に内的または外的に投与す
ることを意味する。典型的には、該物質は、いずれかの臨床的に測定可能な度合でそのよ
うな症状の退縮を誘導する又はそのような症状の進行を抑制することにより、治療された
対象または集団における1以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。いずれ
かの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用物質の量(「治療的有効量」とも称され
る)は、病態、患者の年齢および体重ならびにその薬物が対象において所望の応答を惹起
する能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の
重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者により典型的
に用いられるいずれかの臨床測定により評価されうる。本発明の1つの実施形態(例えば
、治療方法または製造品)は、全ての対象における標的疾患症状を軽減するのに有効でな
いかもしれないが、それは、スチューデントt検定、カイ2乗検定、MannおよびWh
itneyによるU検定、クラスカル-ウォリス(Kruskal-Wallis)検定
(H検定)、ヨンクヒール-テルプストラ(Jonckheere-Terpstra)
検定ならびにウィルコクソン(Wilcoxon)検定のような当技術分野で公知のいず
れかの統計的検定により決定された統計的に有意な対象数において標的疾患症状を軽減す
るはずである。
「治療(処理)」は、それがヒト、獣医学的または研究対象に適用される場合には、治
療的処置ならびに研究および診断用途を意味する。「治療(処理)」は、それがヒト、獣
医学的もしくはまたは研究対象または細胞、組織または器官に適用される場合には、ヒト
もしくは動物対象、細胞、組織、生理的区画または生理学的流体との本発明の抗体または
抗原結合性フラグメントの接触を含む。
療的処置ならびに研究および診断用途を意味する。「治療(処理)」は、それがヒト、獣
医学的もしくはまたは研究対象または細胞、組織または器官に適用される場合には、ヒト
もしくは動物対象、細胞、組織、生理的区画または生理学的流体との本発明の抗体または
抗原結合性フラグメントの接触を含む。
抗PD-L1抗体
抗体20C3は、ハイブリドーマサブクローンMEB037.20C3.116により
産生される抗体である。
抗体20C3は、ハイブリドーマサブクローンMEB037.20C3.116により
産生される抗体である。
抗体22C3は、ハイブリドーマサブクローンMEB037.22C3.138により
産生される抗体であり、マウスIgG1のアロタイプS414Rに対応する。22C3の
成熟重鎖のN末端残基はグルタミンまたはピログルタミン酸(ピログルタマート)(pE
)のいずれかであり、これは、遺伝子配列が成熟重鎖または軽鎖におけるN末端グルタミ
ンをコードしている場合にモノクローナル抗体において頻繁に認められる一般的な翻訳後
修飾である。
産生される抗体であり、マウスIgG1のアロタイプS414Rに対応する。22C3の
成熟重鎖のN末端残基はグルタミンまたはピログルタミン酸(ピログルタマート)(pE
)のいずれかであり、これは、遺伝子配列が成熟重鎖または軽鎖におけるN末端グルタミ
ンをコードしている場合にモノクローナル抗体において頻繁に認められる一般的な翻訳後
修飾である。
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、あるヒト細胞の表面上で発現されるヒ
トPD-L1の成熟形態(リーダーペプチドとも称される前分泌リーダー配列を欠く)に
結合する。「PD-L1」および「成熟PD-L1」なる語は本明細書においては互換的
に用いられ、特に示されていない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、同じ分子を意
味すると理解される。成熟ヒトPD-L1分子は以下の配列(配列番号37)のアミノ酸
19-290からなる:MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYV
VEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVH
GEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDA
GVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTS
EHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEK
LFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPEL
PLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDV
KKCGIQDTNSKKQSDTHLEET。
トPD-L1の成熟形態(リーダーペプチドとも称される前分泌リーダー配列を欠く)に
結合する。「PD-L1」および「成熟PD-L1」なる語は本明細書においては互換的
に用いられ、特に示されていない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、同じ分子を意
味すると理解される。成熟ヒトPD-L1分子は以下の配列(配列番号37)のアミノ酸
19-290からなる:MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYV
VEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVH
GEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDA
GVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTS
EHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEK
LFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPEL
PLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDV
KKCGIQDTNSKKQSDTHLEET。
成熟ヒトPD-L1の細胞外ドメインは以下の配列(配列番号38)からなる:FTV
TVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMED
KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQI
TDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRI
LVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTT
TNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHT
AELVIPELPLAHPPNERT。
TVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMED
KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQI
TDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRI
LVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTT
TNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHT
AELVIPELPLAHPPNERT。
本明細書中で用いる抗ヒトPD-L1抗体または抗hPD-L1抗体は、ヒトPD-L
1に特異的に結合する抗体を意味する。「ヒトPD-L1に特異的に結合する」抗体また
は「ヒトPD-L1のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他
の抗原と比較してヒトPD-L1への優先的な結合を示す抗体であるが、この特異性は絶
対的な結合特異性を要しない。抗hPD-L1抗体がヒトPD-L1に対して特異的とみ
なされるのは、例えば、IHC診断アッセイにおける偽陽性のような望ましくない結果を
もたらすことなく、その結合がサンプル中のヒトPD-L1の存在の決定因子である場合
である。本発明の抗hPD-L1抗体に必要な特異性の度合は該抗体の意図される用途に
左右されうるが、いずれにせよ、意図される目的の用途のためのその適合性により定めら
れる。本発明の抗体またはその結合性フラグメントは、いずれかの非PD-L1タンパク
質に対するアフィニティより少なくとも2倍大きな、好ましくは少なくとも10倍大きな
、より好ましくは少なくとも20倍大きな、最も好ましくは少なくとも100倍大きなア
フィニティでヒトPD-L1に結合する。本明細書中で用いる抗体が、ある与えられた配
列を含むポリペプチド、例えば成熟ヒトPD-L1(この場合、配列番号37のアミノ酸
19-290)に特異的に結合すると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチド
には結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。例えば、配列番
号37の19-290を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は配列番号37の19
-290のFLAG(登録商標)タグ付き形態には結合しうるが、他のFLAG(登録商
標)タグ付きタンパク質には結合しない。
1に特異的に結合する抗体を意味する。「ヒトPD-L1に特異的に結合する」抗体また
は「ヒトPD-L1のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他
の抗原と比較してヒトPD-L1への優先的な結合を示す抗体であるが、この特異性は絶
対的な結合特異性を要しない。抗hPD-L1抗体がヒトPD-L1に対して特異的とみ
なされるのは、例えば、IHC診断アッセイにおける偽陽性のような望ましくない結果を
もたらすことなく、その結合がサンプル中のヒトPD-L1の存在の決定因子である場合
である。本発明の抗hPD-L1抗体に必要な特異性の度合は該抗体の意図される用途に
左右されうるが、いずれにせよ、意図される目的の用途のためのその適合性により定めら
れる。本発明の抗体またはその結合性フラグメントは、いずれかの非PD-L1タンパク
質に対するアフィニティより少なくとも2倍大きな、好ましくは少なくとも10倍大きな
、より好ましくは少なくとも20倍大きな、最も好ましくは少なくとも100倍大きなア
フィニティでヒトPD-L1に結合する。本明細書中で用いる抗体が、ある与えられた配
列を含むポリペプチド、例えば成熟ヒトPD-L1(この場合、配列番号37のアミノ酸
19-290)に特異的に結合すると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチド
には結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。例えば、配列番
号37の19-290を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は配列番号37の19
-290のFLAG(登録商標)タグ付き形態には結合しうるが、他のFLAG(登録商
標)タグ付きタンパク質には結合しない。
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体を意味
する。したがって、それは最も広義に用いられ、所望の生物活性を示す限り、特にモノク
ローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗
体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化
単一ドメイン抗体(これらに限定されるものではない)を含む。「親抗体」は、意図され
る用途のための抗体の修飾(例えば、ヒト治療用抗体としての使用のための抗体のヒト化
)の前の、抗原への免疫系の曝露により得られた抗体である。
する。したがって、それは最も広義に用いられ、所望の生物活性を示す限り、特にモノク
ローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗
体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化
単一ドメイン抗体(これらに限定されるものではない)を含む。「親抗体」は、意図され
る用途のための抗体の修飾(例えば、ヒト治療用抗体としての使用のための抗体のヒト化
)の前の、抗原への免疫系の曝露により得られた抗体である。
「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、抗体の抗原結合性フラグ
メントを、すなわち、完全長抗体に結合する抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体
フラグメント、例えば、1以上のCDR領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結
合性フラグメントの例には、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント
;ジアボディ;直鎖状抗体;一本鎖抗体分子、例えばsc-Fv;ナノボディならびに抗
体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。
メントを、すなわち、完全長抗体に結合する抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体
フラグメント、例えば、1以上のCDR領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結
合性フラグメントの例には、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント
;ジアボディ;直鎖状抗体;一本鎖抗体分子、例えばsc-Fv;ナノボディならびに抗
体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。
「Fabフラグメント」は1本の軽鎖と1本の重鎖のCH1および可変領域とから構成
される。Fab分子の重鎖は別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。「Fa
bフラグメント」は抗体のパパイン切断の生成物でありうる。
される。Fab分子の重鎖は別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。「Fa
bフラグメント」は抗体のパパイン切断の生成物でありうる。
「Fc」領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む2本の重鎖フラグメントを
含有する。それらの2つの重鎖フラグメントは2以上のジスルフィド結合により、および
CH3ドメインの疎水性相互作用により合体している。
含有する。それらの2つの重鎖フラグメントは2以上のジスルフィド結合により、および
CH3ドメインの疎水性相互作用により合体している。
「Fab’フラグメント」は1本の軽鎖と、VHドメインおよびCH1ドメインを含有
する1本の重鎖の一部分またはフラグメント、そしてまた、CH1およびCH2ドメイン
の間の領域を含有していて、2個のFab’フラグメントの2本の重鎖の間で鎖間ジスル
フィド結合が形成されて、F(ab’)2分子を形成しうる。
する1本の重鎖の一部分またはフラグメント、そしてまた、CH1およびCH2ドメイン
の間の領域を含有していて、2個のFab’フラグメントの2本の重鎖の間で鎖間ジスル
フィド結合が形成されて、F(ab’)2分子を形成しうる。
「F(ab’)2フラグメント」は、CH1およびCH2ドメインの間の定常領域の一
部分を2本の重鎖と、2本の軽鎖とを含有していて、それらの2本の重鎖の間で鎖間ジス
ルフィド結合が形成される。したがって、F(ab’)2フラグメントは、2本の重鎖の
間のジスルフィド結合により合体する2本のFab’フラグメントから構成される。「F
(ab’)2フラグメント」は抗体のペプシン切断の生成物でありうる。
部分を2本の重鎖と、2本の軽鎖とを含有していて、それらの2本の重鎖の間で鎖間ジス
ルフィド結合が形成される。したがって、F(ab’)2フラグメントは、2本の重鎖の
間のジスルフィド結合により合体する2本のFab’フラグメントから構成される。「F
(ab’)2フラグメント」は抗体のペプシン切断の生成物でありうる。
「Fv領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「一本鎖Fv」または「scFv」抗体なる語は、抗体のVHおよびVLドメインを含
む抗体フラグメントを意味し、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在
する。一般に、Fvポリペプチドは更に、該scFvが抗原結合のための所望の構造を形
成するのを可能にする、VHおよびVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。sc
Fvの概説としては、Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOG
Y OF MONOCLONAL ANTIBODIES,vol.113,Rosen
burgおよびMoore編,Springer-Verlag,New York,p
p.269-315を参照されたい。また、国際特許出願公開番号WO 88/0164
9および米国特許第4,946,778号および第5,260,203号も参照されたい
。
む抗体フラグメントを意味し、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在
する。一般に、Fvポリペプチドは更に、該scFvが抗原結合のための所望の構造を形
成するのを可能にする、VHおよびVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。sc
Fvの概説としては、Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOG
Y OF MONOCLONAL ANTIBODIES,vol.113,Rosen
burgおよびMoore編,Springer-Verlag,New York,p
p.269-315を参照されたい。また、国際特許出願公開番号WO 88/0164
9および米国特許第4,946,778号および第5,260,203号も参照されたい
。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、2以上のVH領域がペ
プチドリンカーと共有結合して2価ドメイン抗体を形成している。2価ドメイン抗体の、
2つのVH領域は、同じ又は異なる抗原を標的としうる。
機能的な免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、2以上のVH領域がペ
プチドリンカーと共有結合して2価ドメイン抗体を形成している。2価ドメイン抗体の、
2つのVH領域は、同じ又は異なる抗原を標的としうる。
「2価抗体」は2つの抗原結合部位を含む。幾つかの場合には、それらの2つの結合部
位は同じ抗原特異性を有する。しかし、2価抗体は二重特異性である(後記を参照された
い)。
位は同じ抗原特異性を有する。しかし、2価抗体は二重特異性である(後記を参照された
い)。
ある実施形態においては、本明細書におけるモノクローナル抗体には、ラクダ化単一ド
メイン抗体も含まれる。例えば、Muyldermansら(2001)Trends
Biochem.Sci.26:230;Reichmannら(1999)J.Imm
unol.Methods 231:25;WO 94/04678;WO 94/25
591;米国特許第6,005,079号を参照されたい。1つの実施形態においては、
本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を伴う2つのVHドメインを含む単
一ドメイン抗体を提供する。
メイン抗体も含まれる。例えば、Muyldermansら(2001)Trends
Biochem.Sci.26:230;Reichmannら(1999)J.Imm
unol.Methods 231:25;WO 94/04678;WO 94/25
591;米国特許第6,005,079号を参照されたい。1つの実施形態においては、
本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を伴う2つのVHドメインを含む単
一ドメイン抗体を提供する。
本明細書中で用いる「ジアボディ」なる語は、2つの抗原結合部位を有する小型抗体フ
ラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン(V
L)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH-VLまたはVL-VH)。同
一鎖上の2つのドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることに
より、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペア形成を強要され、2つの抗原
結合部位を形成する。ジアボディは、例えばEP 404,097、WO 93/111
61およびHolligerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:6444-6448に更に詳しく記載されている。操作された抗体変異体の
概説としては、全般的には、HolligerおよびHudson(2005)Nat.
Biotechnol,23:1126-1136を参照されたい。
ラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン(V
L)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH-VLまたはVL-VH)。同
一鎖上の2つのドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることに
より、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペア形成を強要され、2つの抗原
結合部位を形成する。ジアボディは、例えばEP 404,097、WO 93/111
61およびHolligerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:6444-6448に更に詳しく記載されている。操作された抗体変異体の
概説としては、全般的には、HolligerおよびHudson(2005)Nat.
Biotechnol,23:1126-1136を参照されたい。
典型的には、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは(親抗体と比較された場合
)そのヒトPD-L1結合活性の少なくとも10%(その活性がモルに基づいて表された
場合)を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、親抗体
としてのヒトPD-L1結合アフィニティの少なくとも20%、50%、70%、80%
、90%、95%または100%またはそれ以上を保有する。本発明の抗体または抗原結
合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸
置換(該抗体の「保存的変異体」または「機能的保存変異体」と称される)を含みうるこ
とも意図される。
)そのヒトPD-L1結合活性の少なくとも10%(その活性がモルに基づいて表された
場合)を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、親抗体
としてのヒトPD-L1結合アフィニティの少なくとも20%、50%、70%、80%
、90%、95%または100%またはそれ以上を保有する。本発明の抗体または抗原結
合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸
置換(該抗体の「保存的変異体」または「機能的保存変異体」と称される)を含みうるこ
とも意図される。
「単離された抗体」は精製状態を意味し、そのような文脈においては、該分子が他の生
物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または細胞残渣および増殖培地の
ような他の物質を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離(された)」なる
語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味す
ることを意図されないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的ま
たは治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。
物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または細胞残渣および増殖培地の
ような他の物質を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離(された)」なる
語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味す
ることを意図されないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的ま
たは治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味
する。すなわち、該集団を構成する抗体分子は、少量で存在しうる可能な天然に生じる突
然変異以外はアミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の(ポリクロー
ナル)抗体調製物は、典型的には、可変ドメイン、特にCDR内に種々のアミノ酸配列を
有する多数の種々の抗体を含み、これらは種々のエピトープに特異的であることが多い。
「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたという、抗体の
特性を示し、いずれかの特定の方法による該抗体の産生を要すると解釈されるべきではな
い。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら(1975
)Nature 256:495に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造される
ことが可能であり、あるいは組換えDNA法により製造されることが可能である(例えば
、米国特許第4,816,567号を参照されたい)。「モノクローナル抗体」は、例え
ばClacksonら(1991)Nature 352:624-628およびMar
ksら(1991)J.Mol.Biol.222:581-597に記載されている技
術を用いるファージ抗体ライブラリーからも単離されうる。また、Presta(200
5)J.Allergy Clin.Immunol.116:731も参照されたい。
する。すなわち、該集団を構成する抗体分子は、少量で存在しうる可能な天然に生じる突
然変異以外はアミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の(ポリクロー
ナル)抗体調製物は、典型的には、可変ドメイン、特にCDR内に種々のアミノ酸配列を
有する多数の種々の抗体を含み、これらは種々のエピトープに特異的であることが多い。
「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたという、抗体の
特性を示し、いずれかの特定の方法による該抗体の産生を要すると解釈されるべきではな
い。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら(1975
)Nature 256:495に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造される
ことが可能であり、あるいは組換えDNA法により製造されることが可能である(例えば
、米国特許第4,816,567号を参照されたい)。「モノクローナル抗体」は、例え
ばClacksonら(1991)Nature 352:624-628およびMar
ksら(1991)J.Mol.Biol.222:581-597に記載されている技
術を用いるファージ抗体ライブラリーからも単離されうる。また、Presta(200
5)J.Allergy Clin.Immunol.116:731も参照されたい。
一般に、基本的抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、2つの
同一ペアを含み、各ペアは1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約5
0 70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約100
~110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、
エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパお
よびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガ
ンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、I
gAおよびIgEとしての、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、
可変領域および定常領域は約12個以上のアミノ酸の「J」領域により連結されており、
重鎖は約10個以上のアミノ酸の「D」領域をも含む。全般的には、Fundament
al Immunology Ch.7(Paul,W.編,2nd ed.Raven
Press,N.Y.(1989))を参照されたい。
同一ペアを含み、各ペアは1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約5
0 70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約100
~110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、
エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパお
よびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガ
ンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、I
gAおよびIgEとしての、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、
可変領域および定常領域は約12個以上のアミノ酸の「J」領域により連結されており、
重鎖は約10個以上のアミノ酸の「D」領域をも含む。全般的には、Fundament
al Immunology Ch.7(Paul,W.編,2nd ed.Raven
Press,N.Y.(1989))を参照されたい。
各軽/重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全抗体
は2つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの2つ
の結合部位は一般に同一である。
は2つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの2つ
の結合部位は一般に同一である。
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワー
ク領域(FR)内に位置する、相補性決定領域(CDR)とも称される3つの超可変領域
を含む。CDRは通常、フレームワーク領域と整列していて、特異的エピトープへの結合
を可能にする。一般に、N末端からC末端へと、軽鎖および重鎖可変ドメインは共に、F
R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメイン
へのアミノ酸の帰属は一般に、Sequences of Proteins of I
mmunological Interest,Kabatら;National In
stitutes of Health,Bethesda,Md.;5th ed.;
NIH Publ.No.91-3242(1991);Kabat(1978)Adv
.Prot.Chem.32:1-75;Kabatら(1977)J.Biol.Ch
em.252:6609-6616;Chothiaら(1987)J Mol.Bio
l.196:901-917またはChothiaら(1989)Nature 342
:878-883の定義に従っている。
ク領域(FR)内に位置する、相補性決定領域(CDR)とも称される3つの超可変領域
を含む。CDRは通常、フレームワーク領域と整列していて、特異的エピトープへの結合
を可能にする。一般に、N末端からC末端へと、軽鎖および重鎖可変ドメインは共に、F
R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメイン
へのアミノ酸の帰属は一般に、Sequences of Proteins of I
mmunological Interest,Kabatら;National In
stitutes of Health,Bethesda,Md.;5th ed.;
NIH Publ.No.91-3242(1991);Kabat(1978)Adv
.Prot.Chem.32:1-75;Kabatら(1977)J.Biol.Ch
em.252:6609-6616;Chothiaら(1987)J Mol.Bio
l.196:901-917またはChothiaら(1989)Nature 342
:878-883の定義に従っている。
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残
基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「CDR」(すなわち、軽
鎖可変ドメイン内のCDRL1、CDRL2およびCDRL3ならびに重鎖可変ドメイン
内のCDRH1、CDRH2およびCDRH3)からのアミノ酸残基を含む。Kabat
ら,(1991)Sequences of Proteins of Immunol
ogical Interest,5th Ed.Public Health Ser
vice,National Institutes of Health,Bethe
sda,Md.)(配列により抗体のCDR領域を定めている)を参照されたい。また、
ChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-9
17(構造により抗体のCDR領域を定めている)も参照されたい。本明細書中で用いる
「フレームワーク」または「FR」残基なる語は、本明細書中でCDR残基として定めら
れた超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。
基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「CDR」(すなわち、軽
鎖可変ドメイン内のCDRL1、CDRL2およびCDRL3ならびに重鎖可変ドメイン
内のCDRH1、CDRH2およびCDRH3)からのアミノ酸残基を含む。Kabat
ら,(1991)Sequences of Proteins of Immunol
ogical Interest,5th Ed.Public Health Ser
vice,National Institutes of Health,Bethe
sda,Md.)(配列により抗体のCDR領域を定めている)を参照されたい。また、
ChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-9
17(構造により抗体のCDR領域を定めている)も参照されたい。本明細書中で用いる
「フレームワーク」または「FR」残基なる語は、本明細書中でCDR残基として定めら
れた超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。
「相同性」は、2つのポリヌクレオチド配列間または2つのポリペプチド配列間の、そ
れらが最適に整列(アライメント)された場合の配列類似性を意味する。それらの2つの
比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより
占拠されている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンによ
り占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の百分率(%)は
、それらの2つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算
し、100を掛け算したものである。例えば、2つの配列における10個中8個の位置が
、それらの配列が最適に整列された場合に一致(マッチ)している又は相同であれば、そ
れらの2つの配列は80%相同である。一般に、該比較は、最大の相同性(%)を与える
ように2つの配列が整列された場合に行われる。例えば、該比較はBLASTアルゴリズ
ムにより行われることが可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞ
れの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択され
る。
れらが最適に整列(アライメント)された場合の配列類似性を意味する。それらの2つの
比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより
占拠されている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンによ
り占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の百分率(%)は
、それらの2つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算
し、100を掛け算したものである。例えば、2つの配列における10個中8個の位置が
、それらの配列が最適に整列された場合に一致(マッチ)している又は相同であれば、そ
れらの2つの配列は80%相同である。一般に、該比較は、最大の相同性(%)を与える
ように2つの配列が整列された場合に行われる。例えば、該比較はBLASTアルゴリズ
ムにより行われることが可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞ
れの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択され
る。
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが天然で見出される場合に付
随しているポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、あるいはそれが天然で連結さ
れていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、mRNA、cDNAまたは合成
由来のDNAまたはRNAあるいはそれらのいくつかの組合せを意味する。本開示の目的
においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は完全な染色体を含まないと理
解されるべきである。特定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定された
配列に加えて、10個まで又は更には20個以上の他のタンパク質またはそれらの一部も
しくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列の
コード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、およ
び/またはベクター配列を含むことが可能である。
随しているポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、あるいはそれが天然で連結さ
れていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、mRNA、cDNAまたは合成
由来のDNAまたはRNAあるいはそれらのいくつかの組合せを意味する。本開示の目的
においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は完全な染色体を含まないと理
解されるべきである。特定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定された
配列に加えて、10個まで又は更には20個以上の他のタンパク質またはそれらの一部も
しくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列の
コード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、およ
び/またはベクター配列を含むことが可能である。
「制御配列」なる表現は、特定の宿主生物における、機能的に連結されたコード配列の
発現に必要なDNA配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモー
ター、所望により存在しうるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。
真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公
知である。
発現に必要なDNA配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモー
ター、所望により存在しうるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。
真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公
知である。
核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的
な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAがポ
リペプチドのDNAに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの
分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハ
ンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響
を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されてい
ると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能
的に連結(されている)」は、連結されているそれらのDNA配列が連続的であり、分泌
リーダー配列の場合には、連続的であり、かつ、リーディングフレームが一致しているこ
とを意味する。しかし、エンハンサーは連続的でなくてもよい。連結は簡便な制限部位に
おける連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従っ
て合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAがポ
リペプチドのDNAに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの
分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハ
ンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響
を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されてい
ると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能
的に連結(されている)」は、連結されているそれらのDNA配列が連続的であり、分泌
リーダー配列の場合には、連続的であり、かつ、リーディングフレームが一致しているこ
とを意味する。しかし、エンハンサーは連続的でなくてもよい。連結は簡便な制限部位に
おける連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従っ
て合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用い
られ、全てのそのような語は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換
細胞」なる語は、導入の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含
む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代が厳密に同じDNAの内
容を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされた
ものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図さ
れる場合、それは文脈から明らかであろう。
られ、全てのそのような語は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換
細胞」なる語は、導入の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含
む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代が厳密に同じDNAの内
容を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされた
ものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図さ
れる場合、それは文脈から明らかであろう。
本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、例えば米国特許第
4,683,195号に記載されているとおり、特定の核酸配列、RNAおよび/または
DNAを増幅する方法または技術を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを
設計するために、関心のある領域の末端またはその外側の配列情報が用いられる。これら
のプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列において同一または類似であろう。それら
の2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と一致しうる。P
CRは、特異的RNA配列、全ゲノムDNAからの特異的DNA配列、および全細胞RN
Aから転写されたcDNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するた
めに用いられうる。全般的には、Mullisら,(1987)Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.51:263;Erlich編,(
1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)
を参照されたい。本明細書中で用いるPCRは、核酸の特異的断片を増幅し又は生成させ
るための核酸ポリメラーゼとプライマーとしての既知核酸との使用を含む、核酸試験サン
プルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例(しかし唯一の例ではない)とみな
される。
4,683,195号に記載されているとおり、特定の核酸配列、RNAおよび/または
DNAを増幅する方法または技術を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを
設計するために、関心のある領域の末端またはその外側の配列情報が用いられる。これら
のプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列において同一または類似であろう。それら
の2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と一致しうる。P
CRは、特異的RNA配列、全ゲノムDNAからの特異的DNA配列、および全細胞RN
Aから転写されたcDNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するた
めに用いられうる。全般的には、Mullisら,(1987)Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.51:263;Erlich編,(
1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)
を参照されたい。本明細書中で用いるPCRは、核酸の特異的断片を増幅し又は生成させ
るための核酸ポリメラーゼとプライマーとしての既知核酸との使用を含む、核酸試験サン
プルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例(しかし唯一の例ではない)とみな
される。
本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再編成免疫グロブリンDNA配列の配列を意
味する。いずれかの適当な未再編成免疫グロブリンDNA源が用いられうる。ヒト生殖系
列配列は、例えば、National Institute of Arthritis
and Musculoskeletal and Skin Diseases o
f the United States National Institutes
of Healthのウェブサイト上でJOINSOLVER(登録商標)生殖系列デー
タベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Giudicelliら,(
2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261に記載され
ているとおりに得られうる。
味する。いずれかの適当な未再編成免疫グロブリンDNA源が用いられうる。ヒト生殖系
列配列は、例えば、National Institute of Arthritis
and Musculoskeletal and Skin Diseases o
f the United States National Institutes
of Healthのウェブサイト上でJOINSOLVER(登録商標)生殖系列デー
タベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Giudicelliら,(
2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261に記載され
ているとおりに得られうる。
典型的な抗PD-L1抗体の物理的および機能的特性
本発明は、単離された抗PD-L1抗体、および細胞の表面上のPD-L1発現の検出
における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。本発明の抗P
D-L1抗体の例には、抗体20C3および22C3(図1および2を参照されたい)が
含まれるが、これらに限定されるものではない。20C3および22C3抗体は、同一で
はないが隣接するエピトープに結合し(実施例2および図9を参照されたい)、このこと
は、これらのエピトープの一方または両方においてPD-L1に特異的に結合する追加的
抗体を誘導するために、これらの2つの抗体のCDRが混合されうることを示している。
したがって、該単離抗体、またはヒトPD-L1に結合するその抗原結合性フラグメント
は、以下の表1~3に示す重鎖CDRの3つ及び軽鎖相補性決定領域(CDR)の3つを
含みうる。
本発明は、単離された抗PD-L1抗体、および細胞の表面上のPD-L1発現の検出
における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。本発明の抗P
D-L1抗体の例には、抗体20C3および22C3(図1および2を参照されたい)が
含まれるが、これらに限定されるものではない。20C3および22C3抗体は、同一で
はないが隣接するエピトープに結合し(実施例2および図9を参照されたい)、このこと
は、これらのエピトープの一方または両方においてPD-L1に特異的に結合する追加的
抗体を誘導するために、これらの2つの抗体のCDRが混合されうることを示している。
したがって、該単離抗体、またはヒトPD-L1に結合するその抗原結合性フラグメント
は、以下の表1~3に示す重鎖CDRの3つ及び軽鎖相補性決定領域(CDR)の3つを
含みうる。
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸が、
類似特性(例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性/親水性、バックボーンコンホメーション
および剛性など)を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、この場合、該変
化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプ
チドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業
者は認識している(例えば、Watsonら(1987)Molecular Biol
ogy of the Gene,The Benjamin/Cummings Pu
b.Co.,p.224(4th Ed.)を参照されたい)。また、構造的または機能
的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を
表4に記載する。
類似特性(例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性/親水性、バックボーンコンホメーション
および剛性など)を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、この場合、該変
化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプ
チドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業
者は認識している(例えば、Watsonら(1987)Molecular Biol
ogy of the Gene,The Benjamin/Cummings Pu
b.Co.,p.224(4th Ed.)を参照されたい)。また、構造的または機能
的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を
表4に記載する。
本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明により想定される。本明細書中で用いる「機
能保存的変異体」は、所望の特性、例えば抗原アフィニティおよび/または特異性を変化
させることなく1以上のアミノ酸残基が改変された抗体またはフラグメントを意味する。
そのような変異体には、あるアミノ酸が、類似特性を有するアミノ酸で置換(例えば、表
4の保存的アミノ酸置換)されたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
能保存的変異体」は、所望の特性、例えば抗原アフィニティおよび/または特異性を変化
させることなく1以上のアミノ酸残基が改変された抗体またはフラグメントを意味する。
そのような変異体には、あるアミノ酸が、類似特性を有するアミノ酸で置換(例えば、表
4の保存的アミノ酸置換)されたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
もう1つの実施形態においては、本発明は、PD-L1に特異的に結合し、VLドメイ
ンおよびVHドメインを有し、表1または2の軽鎖および重鎖CDRに対する100%の
配列相同性ならびに表1または2の軽鎖および重鎖成熟可変領域に対する少なくとも90
%、92%、94%、96%、98%または99%の配列相同性を有する抗体またはその
抗原結合性フラグメントを含む。
ンおよびVHドメインを有し、表1または2の軽鎖および重鎖CDRに対する100%の
配列相同性ならびに表1または2の軽鎖および重鎖成熟可変領域に対する少なくとも90
%、92%、94%、96%、98%または99%の配列相同性を有する抗体またはその
抗原結合性フラグメントを含む。
核酸
本発明は、本明細書に開示されている抗PD-L1抗体の免疫グロブリン鎖および抗原
結合性フラグメントをコードする核酸をも提供する。例えば、本発明は、表1、2および
3に記載されているアミノ酸をコードする核酸、ならびにそれにハイブリダイズする核酸
を含む。
本発明は、本明細書に開示されている抗PD-L1抗体の免疫グロブリン鎖および抗原
結合性フラグメントをコードする核酸をも提供する。例えば、本発明は、表1、2および
3に記載されているアミノ酸をコードする核酸、ならびにそれにハイブリダイズする核酸
を含む。
一般に、該核酸は、低い、中等度の、または高いストリンジェンシーの条件下でハイブ
リダイズし、PD-L1に特異的に結合する能力を維持する抗体をコードしている。第1
の核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下(Sambrook
ら,前掲を参照されたい)で第2の核酸分子にアニールしうる場合、第1の核酸分子が第
2の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は該ハイブ
リダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件は、55℃、5×SSC、0.1% SDSおよび無ホ
ルムアミド;または42℃での30% ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDSを
含む。典型的な中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は42℃での
5×または6×SSCおよび0.1% SDSを含有する40% ホルムアミドである。
高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は42℃あるいは所望により、よ
り高い温度(例えば、57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃または68℃)
での50% ホルムアミド、5×または6×SSCである。一般に、SSCは0.15M
NaClおよび0.015M クエン酸Naである。ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、
2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのため
の適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合、当技術分野でよく知られた
変数に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなれ
ばなるほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。10
0ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導かれて
いる(Sambrookら,前掲,9.50-9.51を参照されたい)。より短い核酸
、例えば、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が
より重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambroo
kら,前掲,11.7-11.8)。
リダイズし、PD-L1に特異的に結合する能力を維持する抗体をコードしている。第1
の核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下(Sambrook
ら,前掲を参照されたい)で第2の核酸分子にアニールしうる場合、第1の核酸分子が第
2の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は該ハイブ
リダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件は、55℃、5×SSC、0.1% SDSおよび無ホ
ルムアミド;または42℃での30% ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDSを
含む。典型的な中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は42℃での
5×または6×SSCおよび0.1% SDSを含有する40% ホルムアミドである。
高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は42℃あるいは所望により、よ
り高い温度(例えば、57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃または68℃)
での50% ホルムアミド、5×または6×SSCである。一般に、SSCは0.15M
NaClおよび0.015M クエン酸Naである。ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、
2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのため
の適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合、当技術分野でよく知られた
変数に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなれ
ばなるほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。10
0ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導かれて
いる(Sambrookら,前掲,9.50-9.51を参照されたい)。より短い核酸
、例えば、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が
より重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambroo
kら,前掲,11.7-11.8)。
以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるBLASTアルゴリズムに関するも
のである:BLASTアルゴリズム:Altschul,S.F.ら,(1990)J.
Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.ら,(1993)Natu
re Genet.3:266-272;Madden,T.Lら,(1996)Met
h.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.ら,(19
97)Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,
J.ら,(1997)Genome Res.7:649-656;Wootton,J
.C.ら,(1993)Comput.Chem.17:149-163;Hancoc
k,J.M.ら,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-7
0;アライメントスコアリング系:Dayhoff,M.O.ら,“A model o
f evolutionary change in proteins.”in At
las of Protein Sequence and Structure,(1
978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(編),pp.345-
352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC
;Schwartz,R.M.ら,“Matrices for detecting
distant relationships.”in Atlas of Prote
in Sequence and Structure,(1978)vol.5,su
ppl.3.“M.O.Dayhoff(編),pp.353-358,Natl.Bi
omed.Res.Found.,Washington,DC;Altschul,S
.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565;States,
D.J.ら,(1991)Methods 3:66-70;Henikoff,S.ら
,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-1
0919;Altschul,S.F.ら,(1993)J.Mol.Evol.36:
290-300;アライメント統計学:Karlin,S.ら,(1990)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268;Karlin,S.
ら,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5
877;Dembo,A.ら,(1994)Ann.Prob.22:2022-203
9;およびAltschul,S.F.“Evaluating the statis
tical significance of multiple distinct
local alignments.”in Theoretical and Com
putational Methods in Genome Research(S.
Suhai編),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。
のである:BLASTアルゴリズム:Altschul,S.F.ら,(1990)J.
Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.ら,(1993)Natu
re Genet.3:266-272;Madden,T.Lら,(1996)Met
h.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.ら,(19
97)Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,
J.ら,(1997)Genome Res.7:649-656;Wootton,J
.C.ら,(1993)Comput.Chem.17:149-163;Hancoc
k,J.M.ら,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-7
0;アライメントスコアリング系:Dayhoff,M.O.ら,“A model o
f evolutionary change in proteins.”in At
las of Protein Sequence and Structure,(1
978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(編),pp.345-
352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC
;Schwartz,R.M.ら,“Matrices for detecting
distant relationships.”in Atlas of Prote
in Sequence and Structure,(1978)vol.5,su
ppl.3.“M.O.Dayhoff(編),pp.353-358,Natl.Bi
omed.Res.Found.,Washington,DC;Altschul,S
.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565;States,
D.J.ら,(1991)Methods 3:66-70;Henikoff,S.ら
,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-1
0919;Altschul,S.F.ら,(1993)J.Mol.Evol.36:
290-300;アライメント統計学:Karlin,S.ら,(1990)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268;Karlin,S.
ら,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5
877;Dembo,A.ら,(1994)Ann.Prob.22:2022-203
9;およびAltschul,S.F.“Evaluating the statis
tical significance of multiple distinct
local alignments.”in Theoretical and Com
putational Methods in Genome Research(S.
Suhai編),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。
もう1つの実施形態においては、本発明は、単離された抗PD-L1抗体または抗原結
合性フラグメント(本明細書に記載されているもの)のポリペプチド鎖の少なくとも1つ
をコードする単離された核酸、例えばDNAを提供する。幾つかの実施形態においては、
該単離核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードしており、他の実施形態に
おいては、軽鎖および重鎖は別々の核酸分子上でコードされる。もう1つの実施形態にお
いては、該核酸はシグナル配列を更にコードしている。
合性フラグメント(本明細書に記載されているもの)のポリペプチド鎖の少なくとも1つ
をコードする単離された核酸、例えばDNAを提供する。幾つかの実施形態においては、
該単離核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードしており、他の実施形態に
おいては、軽鎖および重鎖は別々の核酸分子上でコードされる。もう1つの実施形態にお
いては、該核酸はシグナル配列を更にコードしている。
本発明はまた、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、該核酸
は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に該宿主細胞により認識される
制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、およ
び本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供し
、該製造方法は、該抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有
する宿主細胞を培地内で培養し、該抗原またはその抗原結合性フラグメントを該宿主細胞
または培地から単離することを含む。
は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に該宿主細胞により認識される
制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、およ
び本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供し
、該製造方法は、該抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有
する宿主細胞を培地内で培養し、該抗原またはその抗原結合性フラグメントを該宿主細胞
または培地から単離することを含む。
エピトープ結合
本発明は更に、ヒトPD-L1への抗体20C3または22C3の結合を、それぞれ2
0C3または22C3と同じエピトープへの結合により遮断する抗体またはその抗原結合
性フラグメントを提供する。実施例2に記載されているオクテット(Octet)競合分
析を含む当技術分野で公知のいずれかの交差遮断または競合分析を用い、ついで、該交差
遮断抗体が結合するヒトPD-L1上のエピトープを特定することにより、そのような抗
体および結合性フラグメントは特定されうる。第1抗体が第2抗体の結合を交差遮断する
とみなされるのは、標的を第1抗体に飽和状態まで前結合させることが、標的の最大半量
結合を達成するのに必要な第2抗体の濃度を2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、
50倍、100倍、200倍またはそれ以上増加させる場合である。交差遮断性抗体に対
する結合エピトープは、当技術分野でよく知られた技術を用いて特定されうる。
本発明は更に、ヒトPD-L1への抗体20C3または22C3の結合を、それぞれ2
0C3または22C3と同じエピトープへの結合により遮断する抗体またはその抗原結合
性フラグメントを提供する。実施例2に記載されているオクテット(Octet)競合分
析を含む当技術分野で公知のいずれかの交差遮断または競合分析を用い、ついで、該交差
遮断抗体が結合するヒトPD-L1上のエピトープを特定することにより、そのような抗
体および結合性フラグメントは特定されうる。第1抗体が第2抗体の結合を交差遮断する
とみなされるのは、標的を第1抗体に飽和状態まで前結合させることが、標的の最大半量
結合を達成するのに必要な第2抗体の濃度を2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、
50倍、100倍、200倍またはそれ以上増加させる場合である。交差遮断性抗体に対
する結合エピトープは、当技術分野でよく知られた技術を用いて特定されうる。
1つのそのようなエピトープマッピング技術は、タンパク質分解および質量分析と共役
した水素/重水素交換(HDX-MS)である。この方法は、重水(D2O)の単体中お
よび対応抗体の存在下で種々の時間間隔でインキュベートされた場合の抗原による重水素
の取り込みの度合の正確な測定および比較に基づく。重水素は露出領域におけるタンパク
質のアミドバックボーン上の水素と交換され、一方、抗体に結合した抗原の領域は保護さ
れ、タンパク質分解フラグメントの液体クロマトグラフィー-縦列質量分析(LC-MS
/MS)による分析の後、より少ない交換を示すか又は交換を全く示さないであろう。
した水素/重水素交換(HDX-MS)である。この方法は、重水(D2O)の単体中お
よび対応抗体の存在下で種々の時間間隔でインキュベートされた場合の抗原による重水素
の取り込みの度合の正確な測定および比較に基づく。重水素は露出領域におけるタンパク
質のアミドバックボーン上の水素と交換され、一方、抗体に結合した抗原の領域は保護さ
れ、タンパク質分解フラグメントの液体クロマトグラフィー-縦列質量分析(LC-MS
/MS)による分析の後、より少ない交換を示すか又は交換を全く示さないであろう。
実施例3に記載されているHDX-MSエピトープマッピングに基づけば、抗体22C
3に対する成熟ヒトPD-L1上の提示されているエピトープは細胞外ドメイン(配列番
号38)内の2つの不連続なアミノ酸セグメントにおける残基(156~178および1
96~206)を含む。追加的エピトープ残基は、細胞外ドメイン(配列番号38)内の
以下のセグメント内に存在する可能性がある:3~9、10~13、88~93および1
35~147。
3に対する成熟ヒトPD-L1上の提示されているエピトープは細胞外ドメイン(配列番
号38)内の2つの不連続なアミノ酸セグメントにおける残基(156~178および1
96~206)を含む。追加的エピトープ残基は、細胞外ドメイン(配列番号38)内の
以下のセグメント内に存在する可能性がある:3~9、10~13、88~93および1
35~147。
したがって、1つの実施形態においては、22C3と同じエピトープへの結合によるヒ
トPD-L1への抗体22C3の結合を遮断する抗体は、配列番号38のアミノ酸156
~178の第1セグメントにおける残基、および配列番号38のアミノ酸196~206
の第2セグメントにおける残基に結合し、そして幾つかの実施形態においては、配列番号
38の以下のセグメントの、いずれか1つ、2つ若しくは3つにおける又は4つ全部にお
ける残基にも結合する:アミノ酸3~9、アミノ酸10~13、アミノ酸88~93、お
よびアミノ酸135~147。
トPD-L1への抗体22C3の結合を遮断する抗体は、配列番号38のアミノ酸156
~178の第1セグメントにおける残基、および配列番号38のアミノ酸196~206
の第2セグメントにおける残基に結合し、そして幾つかの実施形態においては、配列番号
38の以下のセグメントの、いずれか1つ、2つ若しくは3つにおける又は4つ全部にお
ける残基にも結合する:アミノ酸3~9、アミノ酸10~13、アミノ酸88~93、お
よびアミノ酸135~147。
抗体およびその抗原結合性フラグメントの製造方法
親(例えば、げっ歯類)モノクローナル抗X抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当
技術分野で一般に公知の方法により産生されうる。これらの方法には、Kohlerら(
1975)(Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリ
ドーマ技術、およびトリオーマ技術(Heringら(1988)Biomed.Bio
chim.Acta.47:211-216およびHagiwaraら(1993)Hu
m.Antibod.Hybridomas 4:15)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技
術(Kozborら(1983)Immunology Today 4:72およびC
oteら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:20
26-2030)、EBV-ハイブリドーマ技術(Coleら,Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Lis
s,Inc.,pp.77-96,1985)、およびサイトパルス大チャンバー細胞融
合エレクトロポレーター(Cyto Pulse large chamber cul
l fusion electroporator)(Cyto Pulse Scie
nces,Inc.,Glen Burnie,MD)を使用する電場に基づく電気融合
が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、標準的なプロトコールに
基づいて、マウス脾細胞を単離し、PEGで又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞系と融
合させる。
親(例えば、げっ歯類)モノクローナル抗X抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当
技術分野で一般に公知の方法により産生されうる。これらの方法には、Kohlerら(
1975)(Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリ
ドーマ技術、およびトリオーマ技術(Heringら(1988)Biomed.Bio
chim.Acta.47:211-216およびHagiwaraら(1993)Hu
m.Antibod.Hybridomas 4:15)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技
術(Kozborら(1983)Immunology Today 4:72およびC
oteら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:20
26-2030)、EBV-ハイブリドーマ技術(Coleら,Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Lis
s,Inc.,pp.77-96,1985)、およびサイトパルス大チャンバー細胞融
合エレクトロポレーター(Cyto Pulse large chamber cul
l fusion electroporator)(Cyto Pulse Scie
nces,Inc.,Glen Burnie,MD)を使用する電場に基づく電気融合
が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、標準的なプロトコールに
基づいて、マウス脾細胞を単離し、PEGで又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞系と融
合させる。
ついで、生じたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングするこ
とが可能である。例えば、免疫化マウスからの脾リンパ球の単個細胞浮遊液を、50%
PEGを使用して、P3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC,C
RL 1580)の数の6分の1と融合させることが可能である。細胞を平底マイクロタ
イタープレート内で約2×105細胞/mLでプレーティングし、ついで、20% 胎児
クローン血清(Clone Serum)、18% 「653」馴らし培地、5% オリ
ゲン(origen)(IGEN)、4mM L-グルタミン、1mM L-グルタミン
、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプ
トエタノール、50単位/ml ペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、5
0mg/ml ゲンタマイシンおよび1×HAT(Sigma;該HATは該融合の24
時間後に添加される)を含有する選択培地内で2週間インキュベートすることが可能であ
る。2週間後、該HATがHTと交換された培地内で細胞を培養することが可能である。
ついで個々のウェルを抗XモノクローナルIgG抗体に関してELISAによりスクリー
ニングすることが可能である。著しいハイブリドーマ増殖が生じたら、通常は10~14
日後に培地を観察することが可能である。該抗体分泌性ハイブリドーマを再プレーティン
グし、再びスクリーニングし、ヒトIgG抗Xモノクローナル抗体に関して尚も陽性であ
る場合には、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングすることが可能である。
とが可能である。例えば、免疫化マウスからの脾リンパ球の単個細胞浮遊液を、50%
PEGを使用して、P3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC,C
RL 1580)の数の6分の1と融合させることが可能である。細胞を平底マイクロタ
イタープレート内で約2×105細胞/mLでプレーティングし、ついで、20% 胎児
クローン血清(Clone Serum)、18% 「653」馴らし培地、5% オリ
ゲン(origen)(IGEN)、4mM L-グルタミン、1mM L-グルタミン
、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプ
トエタノール、50単位/ml ペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、5
0mg/ml ゲンタマイシンおよび1×HAT(Sigma;該HATは該融合の24
時間後に添加される)を含有する選択培地内で2週間インキュベートすることが可能であ
る。2週間後、該HATがHTと交換された培地内で細胞を培養することが可能である。
ついで個々のウェルを抗XモノクローナルIgG抗体に関してELISAによりスクリー
ニングすることが可能である。著しいハイブリドーマ増殖が生じたら、通常は10~14
日後に培地を観察することが可能である。該抗体分泌性ハイブリドーマを再プレーティン
グし、再びスクリーニングし、ヒトIgG抗Xモノクローナル抗体に関して尚も陽性であ
る場合には、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングすることが可能である。
ついで安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地内
で少量の抗体を産生させることが可能である。例えば、約1グラムの22C3抗体を産生
させ、以下の方法を用いてマウスハイブリドーマ細胞系MEB037.22C3.138
から精製することが可能である。凍結MEB037.22C3.138細胞を解凍し、0
.18 プルロニック(Pluronic)F-68の存在下または非存在下に2mM
追加的L-グルタミンを含有するハイブリドーマ無血清培地を使用して振とうフラスコに
順応させる。プルロニックF-68の存在は該振とうフラスコ培養の生存性を改善しうる
。該細胞が振とうフラスコに完全に順応したら、20リットルの生産培養を、10% C
HO CD高効率的フィード(efficient Feed)B(Invitroge
n,Catalogue#A10240-01)を添加しながら、WAVEバイオリアク
ター(GE Healthcare Life Sciences)内の無血清培地内で
行う。細胞増殖のために、1リットルの培養を小さなWAVEバッグ内で開始させ、つい
で該1L WAVE培養を該WAVEバイオリアクター内の20L培養へと拡大させる。
該20リットル培養を0.5×106 生細胞/mLの細胞密度で開始し、第1日に10
% CHO CD高効率フィードBを供給し、1N Na2CO3でpHを毎日調節する
。4日後に該細胞を回収する。NOVA解析のために、小さなサンプルを毎日集めること
が可能である。
で少量の抗体を産生させることが可能である。例えば、約1グラムの22C3抗体を産生
させ、以下の方法を用いてマウスハイブリドーマ細胞系MEB037.22C3.138
から精製することが可能である。凍結MEB037.22C3.138細胞を解凍し、0
.18 プルロニック(Pluronic)F-68の存在下または非存在下に2mM
追加的L-グルタミンを含有するハイブリドーマ無血清培地を使用して振とうフラスコに
順応させる。プルロニックF-68の存在は該振とうフラスコ培養の生存性を改善しうる
。該細胞が振とうフラスコに完全に順応したら、20リットルの生産培養を、10% C
HO CD高効率的フィード(efficient Feed)B(Invitroge
n,Catalogue#A10240-01)を添加しながら、WAVEバイオリアク
ター(GE Healthcare Life Sciences)内の無血清培地内で
行う。細胞増殖のために、1リットルの培養を小さなWAVEバッグ内で開始させ、つい
で該1L WAVE培養を該WAVEバイオリアクター内の20L培養へと拡大させる。
該20リットル培養を0.5×106 生細胞/mLの細胞密度で開始し、第1日に10
% CHO CD高効率フィードBを供給し、1N Na2CO3でpHを毎日調節する
。4日後に該細胞を回収する。NOVA解析のために、小さなサンプルを毎日集めること
が可能である。
本発明の抗hPD-L1抗体は以下の方法によりハイブリドーマ培養から精製されうる
。1.2マイクロメーターガラス繊維および0.2マイクロメーター酢酸セルロースフィ
ルターを使用するデプス濾過により、該ハイブリドーマ培養を清澄化する。等体積の2×
ProSepAバッファー(100mM ホウ酸,5M NaCl,pH8.5)を該清
澄化回収物に加え、該希釈回収物を170mL床体積プロテインAカラム上にローディン
グする。該カラムを5カラム体積(CV)の1×ProSepAバッファー(50mM
ホウ酸,2.5M NaCl,pH8.5)で洗浄し、ついで2CVの1×PBSで洗浄
し、該抗hPD-L1抗体を5CVの溶出バッファー(0.1M グリシン,pH3.0
)で溶出する。IgGを含有する溶出画分を一緒にし、1.0M Tris,pHバッフ
ァーの1/10の体積を加えることによりpHを中和する。ついで該中和抗体組成物を、
10kDa 使い捨てTFFカセットを使用して滅菌濾過する。該抗体は、10リットル
の製剤化バッファー(20mM 酢酸ナトリウム,9% スクロース,pH5.0)に対
するダイアフィルトレーションおよび20体積の交換により、保存のために製剤化されう
る。この方法を用いて、SDS-PAGE、SEC HPLCおよびC8 RP-HPL
C測定により少なくとも98%の純度を有し、0.1EU/ml未満および0.02EU
/mg未満の内毒素レベルを有する、約5.0mg/mlの濃度の抗体22C3が製造さ
れうる。
。1.2マイクロメーターガラス繊維および0.2マイクロメーター酢酸セルロースフィ
ルターを使用するデプス濾過により、該ハイブリドーマ培養を清澄化する。等体積の2×
ProSepAバッファー(100mM ホウ酸,5M NaCl,pH8.5)を該清
澄化回収物に加え、該希釈回収物を170mL床体積プロテインAカラム上にローディン
グする。該カラムを5カラム体積(CV)の1×ProSepAバッファー(50mM
ホウ酸,2.5M NaCl,pH8.5)で洗浄し、ついで2CVの1×PBSで洗浄
し、該抗hPD-L1抗体を5CVの溶出バッファー(0.1M グリシン,pH3.0
)で溶出する。IgGを含有する溶出画分を一緒にし、1.0M Tris,pHバッフ
ァーの1/10の体積を加えることによりpHを中和する。ついで該中和抗体組成物を、
10kDa 使い捨てTFFカセットを使用して滅菌濾過する。該抗体は、10リットル
の製剤化バッファー(20mM 酢酸ナトリウム,9% スクロース,pH5.0)に対
するダイアフィルトレーションおよび20体積の交換により、保存のために製剤化されう
る。この方法を用いて、SDS-PAGE、SEC HPLCおよびC8 RP-HPL
C測定により少なくとも98%の純度を有し、0.1EU/ml未満および0.02EU
/mg未満の内毒素レベルを有する、約5.0mg/mlの濃度の抗体22C3が製造さ
れうる。
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体は組換え法(例えば、前記の大腸菌(E.
coli)/T7発現系において)によっても製造されうる。この実施形態においては、
本発明の抗体分子(例えば、VHまたはVL)をコードする核酸が、pETに基づくプラ
スミド内に挿入され、大腸菌(E.coli)/T7系において発現されうる。当技術分
野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造
のための方法の一例は米国特許第4,816,567号に開示されている。形質転換は、
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するためのいずれかの公知方法によるものでありう
る。哺乳類細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は当技術分野でよく知ら
れており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレ
ン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソ
ーム内へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入および核内へのDNAの直接マイクロ
インジェクションを包含する。また、核酸分子はウイルスベクターにより哺乳類細胞内に
導入されうる。細胞の形質転換方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許
第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号および第4
,959,455号を参照されたい。
coli)/T7発現系において)によっても製造されうる。この実施形態においては、
本発明の抗体分子(例えば、VHまたはVL)をコードする核酸が、pETに基づくプラ
スミド内に挿入され、大腸菌(E.coli)/T7系において発現されうる。当技術分
野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造
のための方法の一例は米国特許第4,816,567号に開示されている。形質転換は、
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するためのいずれかの公知方法によるものでありう
る。哺乳類細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は当技術分野でよく知ら
れており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレ
ン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソ
ーム内へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入および核内へのDNAの直接マイクロ
インジェクションを包含する。また、核酸分子はウイルスベクターにより哺乳類細胞内に
導入されうる。細胞の形質転換方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許
第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号および第4
,959,455号を参照されたい。
抗体PD-L1抗体は、米国特許第6,331,415号に記載されている方法のいず
れかによっても合成されうる。
れかによっても合成されうる。
本明細書に開示されている抗体またはフラグメントの発現のための宿主として利用可能
な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、American Type Cul
ture Collection(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞系を包含
する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、S
P2細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒ
ト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293
細胞および多数の他の細胞系が含まれる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、
イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細
胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを判断することにより選択される。使用
されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばSf9細胞、両生類細胞、細菌細胞、
植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメ
ント、軽鎖および/またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクター
を哺乳類宿主細胞内に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現、またはより
好ましくは、該宿主細胞が増殖する培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間
にわたり、該宿主細胞を培養することにより、該抗体を産生させる。
な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、American Type Cul
ture Collection(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞系を包含
する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、S
P2細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒ
ト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293
細胞および多数の他の細胞系が含まれる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、
イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細
胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを判断することにより選択される。使用
されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばSf9細胞、両生類細胞、細菌細胞、
植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメ
ント、軽鎖および/またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクター
を哺乳類宿主細胞内に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現、またはより
好ましくは、該宿主細胞が増殖する培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間
にわたり、該宿主細胞を培養することにより、該抗体を産生させる。
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞
系からの本発明の抗体(またはそれからの他の部分)の発現は、幾つかの公知技術を用い
て増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)は、ある条件
下の発現を増強するための一般的なアプローチである。GS系は全体的または部分的に欧
州特許第0 216 846号、第0 256 055および第0 323 997号な
らびに欧州特許出願第89303964.4号に記載されている。
系からの本発明の抗体(またはそれからの他の部分)の発現は、幾つかの公知技術を用い
て増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)は、ある条件
下の発現を増強するための一般的なアプローチである。GS系は全体的または部分的に欧
州特許第0 216 846号、第0 256 055および第0 323 997号な
らびに欧州特許出願第89303964.4号に記載されている。
ポリクローナル抗体は、1以上の他の非同一抗体のなかで又はそのような非同一抗体の
存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は種々のBリンパ球(例え
ば、全て免疫原に対するものである種々の抗体の集団を産生する、関心のある免疫原で処
理された動物のBリンパ球)の集団から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫
化動物、例えば脾臓、血清または腹水から直接的に得られる。
存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は種々のBリンパ球(例え
ば、全て免疫原に対するものである種々の抗体の集団を産生する、関心のある免疫原で処
理された動物のBリンパ球)の集団から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫
化動物、例えば脾臓、血清または腹水から直接的に得られる。
本発明は更に、本明細書に開示されている抗PD-L1抗体の抗体フラグメントを含む
。該抗体フラグメントには、F(ab)2フラグメントが含まれ、これは例えばペプシン
によるIgGの酵素的切断により産生されうる。Fabフラグメントは、例えば、ジチオ
トレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのF(ab)2の還元により製造されうる
。Fabフラグメントは、ジスルフィド架橋によりVH-CH1鎖に結合したVL-CL
鎖である。F(ab)2フラグメントは、2つのジスルフィド架橋により結合した2つの
Fabフラグメントである。F(ab)2分子のFab部分はFc領域の一部を含み、そ
の間にジスルフィド架橋が位置する。FvフラグメントはVLまたはVH領域である。
。該抗体フラグメントには、F(ab)2フラグメントが含まれ、これは例えばペプシン
によるIgGの酵素的切断により産生されうる。Fabフラグメントは、例えば、ジチオ
トレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのF(ab)2の還元により製造されうる
。Fabフラグメントは、ジスルフィド架橋によりVH-CH1鎖に結合したVL-CL
鎖である。F(ab)2フラグメントは、2つのジスルフィド架橋により結合した2つの
Fabフラグメントである。F(ab)2分子のFab部分はFc領域の一部を含み、そ
の間にジスルフィド架橋が位置する。FvフラグメントはVLまたはVH領域である。
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラス
に帰属されうる。少なくとも5つの免疫グロブリンの主要クラス(IgA、IgD、Ig
E、IgGおよびIgM)が存在し、これらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)
、例えばIgG-1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4;IgA-1およびIg
A-2に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗
体および抗原結合性フラグメントを含む。
に帰属されうる。少なくとも5つの免疫グロブリンの主要クラス(IgA、IgD、Ig
E、IgGおよびIgM)が存在し、これらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)
、例えばIgG-1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4;IgA-1およびIg
A-2に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗
体および抗原結合性フラグメントを含む。
1つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは重鎖定常領域、例
えばヒト定常領域、例えばγ1、γ2、γ3またはγ4ヒト重鎖定常領域またはそれらの
変異体を含む。もう1つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは
軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパヒト軽鎖領域または
それらの変異体を含む。限定的ではない例示に過ぎないが、ヒト重鎖定常領域はγ1であ
ることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう1つの実
施形態においては、該抗体のFc領域は、Ser228Pro突然変異を有するγ4であ
る(Schuurman,Jら,Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
えばヒト定常領域、例えばγ1、γ2、γ3またはγ4ヒト重鎖定常領域またはそれらの
変異体を含む。もう1つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは
軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパヒト軽鎖領域または
それらの変異体を含む。限定的ではない例示に過ぎないが、ヒト重鎖定常領域はγ1であ
ることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう1つの実
施形態においては、該抗体のFc領域は、Ser228Pro突然変異を有するγ4であ
る(Schuurman,Jら,Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
幾つかの実施形態においては、種々の定常ドメインは、本明細書に記載されているCD
Rから誘導されたヒト化VLおよびVH領域に連結されうる。例えば、本発明の抗体(ま
たはフラグメント)の個々の意図される用途がエフェクター機能の改変を望むものである
場合には、ヒトIgG1以外の重鎖定常ドメインが使用されることが可能であり、あるい
はハイブリッドIgG1/IgG4が利用されうる。
Rから誘導されたヒト化VLおよびVH領域に連結されうる。例えば、本発明の抗体(ま
たはフラグメント)の個々の意図される用途がエフェクター機能の改変を望むものである
場合には、ヒトIgG1以外の重鎖定常ドメインが使用されることが可能であり、あるい
はハイブリッドIgG1/IgG4が利用されうる。
抗体の操作
特定の実施形態においては、以下のとおりに、最終抗体のより大きな化学的安定性を得
るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基に変化させることが望ま
しいであろう。アスパラギンの脱アミド化はN-GまたはD-G配列上で生じ、イソアス
パラギン酸残基の生成をもたらすことが可能であり、これはポリペプチド鎖内に捻じれ(
キンク)を導入し、その安定性を低減する(イソアスパラギン酸効果)。ある実施形態に
おいては、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を含有しない。
特定の実施形態においては、以下のとおりに、最終抗体のより大きな化学的安定性を得
るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基に変化させることが望ま
しいであろう。アスパラギンの脱アミド化はN-GまたはD-G配列上で生じ、イソアス
パラギン酸残基の生成をもたらすことが可能であり、これはポリペプチド鎖内に捻じれ(
キンク)を導入し、その安定性を低減する(イソアスパラギン酸効果)。ある実施形態に
おいては、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を含有しない。
例えば、いずれかのAsn-Gly配列における、特にCDR内のイソアスパルタート
の形成の可能性を減少させるために、アスパラギン(Asn)残基はGlnまたはAla
に変換されうる。Asp-Gly配列においても、類似した問題が生じうる。Reiss
nerおよびAswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:12
81。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を低減し、または完全に阻
止しうる。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.
116:731(734における)を参照されたい。1つの実施形態においては、アスパ
ラギンはグルタミン(Gln)に変換される。脱アミド化(これは、アスパラギンまたは
グルタミンの隣に小さなアミノ酸が存在する場合に、より大きな比率で生じる)の可能性
を減少させるために、アスパラギン(Asn)またはグルタミン(Gln)残基に隣接す
るアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Bischoff & Kolbe
(1994)J.Chromatog.662:261を参照されたい。また、メチオニ
ン硫黄が酸化する可能性(これは抗原結合アフィニティを減少させ、そしてまた、最終抗
体調製物における分子不均一性に寄与しうるであろう)を減少させるために、CDRにお
けるいずれかのメチオニン残基(典型的には溶媒露出Met)がLys、Leu、Ala
またはPheに変換されうる(同誌)。1つの実施形態においては、該メチオニンはアラ
ニン(Ala)に変換される。また、潜在的なAsn-Proペプチド結合の切断性を阻
止または最小にするために、CDR内で見出されるいずれかのAsn-Proの組合せを
Gln-Pro、Ala-ProまたはAsn-Alaに改変することが望ましいかもし
れない。ついで、該置換がヒトPD-L1に対する該抗体のアフィニティもしくは特異性
または他の所望の生物活性を、許容し得ないレベルへと低減しないことが保証されるよう
に、そのような置換を有する抗体をスクリーニングする。
の形成の可能性を減少させるために、アスパラギン(Asn)残基はGlnまたはAla
に変換されうる。Asp-Gly配列においても、類似した問題が生じうる。Reiss
nerおよびAswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:12
81。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を低減し、または完全に阻
止しうる。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.
116:731(734における)を参照されたい。1つの実施形態においては、アスパ
ラギンはグルタミン(Gln)に変換される。脱アミド化(これは、アスパラギンまたは
グルタミンの隣に小さなアミノ酸が存在する場合に、より大きな比率で生じる)の可能性
を減少させるために、アスパラギン(Asn)またはグルタミン(Gln)残基に隣接す
るアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Bischoff & Kolbe
(1994)J.Chromatog.662:261を参照されたい。また、メチオニ
ン硫黄が酸化する可能性(これは抗原結合アフィニティを減少させ、そしてまた、最終抗
体調製物における分子不均一性に寄与しうるであろう)を減少させるために、CDRにお
けるいずれかのメチオニン残基(典型的には溶媒露出Met)がLys、Leu、Ala
またはPheに変換されうる(同誌)。1つの実施形態においては、該メチオニンはアラ
ニン(Ala)に変換される。また、潜在的なAsn-Proペプチド結合の切断性を阻
止または最小にするために、CDR内で見出されるいずれかのAsn-Proの組合せを
Gln-Pro、Ala-ProまたはAsn-Alaに改変することが望ましいかもし
れない。ついで、該置換がヒトPD-L1に対する該抗体のアフィニティもしくは特異性
または他の所望の生物活性を、許容し得ないレベルへと低減しないことが保証されるよう
に、そのような置換を有する抗体をスクリーニングする。
抗体コンジュゲート
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体分子はまた、放射性核種または他の検出可
能な標識のような化学的部分にコンジュゲート化されうる。放射性核種には、99Tc、
90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、1
3N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57S
e、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109P
d、234Thおよび40K、157Gd、55Mn、52Tr、および56Feが含ま
れる。蛍光または化学発光標識には、発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセイン
およびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリ
ン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、
152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナ
ール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標
識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ビオ
チン/アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルが含まれる。
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体分子はまた、放射性核種または他の検出可
能な標識のような化学的部分にコンジュゲート化されうる。放射性核種には、99Tc、
90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、1
3N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57S
e、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109P
d、234Thおよび40K、157Gd、55Mn、52Tr、および56Feが含ま
れる。蛍光または化学発光標識には、発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセイン
およびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリ
ン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、
152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナ
ール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標
識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ビオ
チン/アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルが含まれる。
抗体分子を種々の部分にコンジュゲート化するための当技術分野で公知のいずれかの方
法が使用可能であり、これらには、Hunterら(1962)Nature 144:
945;Davidら(1974)Biochemistry 13:1014;Pai
nら(1981)J.Immunol.Meth.40:219;およびNygren,
J.(1982)Histochem.and Cytochem.30:407に記載
されている方法が含まれる。抗体をコンジュゲート化する方法は通常のものであり、当技
術分野で非常によく知られている。
法が使用可能であり、これらには、Hunterら(1962)Nature 144:
945;Davidら(1974)Biochemistry 13:1014;Pai
nら(1981)J.Immunol.Meth.40:219;およびNygren,
J.(1982)Histochem.and Cytochem.30:407に記載
されている方法が含まれる。抗体をコンジュゲート化する方法は通常のものであり、当技
術分野で非常によく知られている。
実験的および診断的用途
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体および抗体フラグメントは、細胞の表面上
で発現されたヒトPD-L1を特異的に検出するために使用されうる。該細胞は、ヒト個
体から得られた組織または血清サンプル中に存在することが可能であり、PD-L1発現
の検出は、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ方法のいずれかを用いて行われ
る。
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体および抗体フラグメントは、細胞の表面上
で発現されたヒトPD-L1を特異的に検出するために使用されうる。該細胞は、ヒト個
体から得られた組織または血清サンプル中に存在することが可能であり、PD-L1発現
の検出は、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ方法のいずれかを用いて行われ
る。
例えば、特定の実施形態はELISAアッセイ(酵素結合イムノソルベントアッセイ)
を含み、これは典型的には以下の工程を含む:
(a)基質(例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレー
トの表面)を抗PD-L1抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆(コート)し、
(b)ヒトPD-L1の存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用し、
(c)該サンプル中の未結合物質が除去されるように、該プレートを洗浄し、
(d)同様にヒトPD-L1に特異的である検出可能な様態で標識された抗体(例え
ば、酵素結合抗体)を適用し、
(e)未結合標識抗体が除去されるように、該基体を洗浄し、
(f)該標識抗体が、結合した酵素である場合には、該酵素により蛍光シグナルへと
変換される化学物質を適用し、
(g)該標識抗体の存在を検出する。
を含み、これは典型的には以下の工程を含む:
(a)基質(例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレー
トの表面)を抗PD-L1抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆(コート)し、
(b)ヒトPD-L1の存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用し、
(c)該サンプル中の未結合物質が除去されるように、該プレートを洗浄し、
(d)同様にヒトPD-L1に特異的である検出可能な様態で標識された抗体(例え
ば、酵素結合抗体)を適用し、
(e)未結合標識抗体が除去されるように、該基体を洗浄し、
(f)該標識抗体が、結合した酵素である場合には、該酵素により蛍光シグナルへと
変換される化学物質を適用し、
(g)該標識抗体の存在を検出する。
もう1つの実施形態においては、ABTS(例えば、2,2’-アジノ-ビス(3-エ
チルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))または3,3’,5,5’-テトラメチルベ
ンジジンと反応して、検出可能な変色を引き起こすペルオキシダーゼで、標識抗体を標識
する。あるいは、シンチラント(scintillant)の存在下でシンチレーション
カウンターにより検出されうる検出可能な放射性同位体(例えば、3H)で標識抗体を標
識する。
チルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))または3,3’,5,5’-テトラメチルベ
ンジジンと反応して、検出可能な変色を引き起こすペルオキシダーゼで、標識抗体を標識
する。あるいは、シンチラント(scintillant)の存在下でシンチレーション
カウンターにより検出されうる検出可能な放射性同位体(例えば、3H)で標識抗体を標
識する。
本発明の抗PD-L1抗体およびその抗原結合性フラグメントはウエスタンブロットま
たは免疫タンパク質ブロット法において使用されうる。そのような方法は本発明の一部を
構成し、例えば以下を含む:
(1)ヒトPD-L1の存在に関して試験されるべき膜または他の固体基体を本発明
の抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させる。そのような膜は、非変性PAG
E(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルまたはSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルにおいてXの存在に関して試験されるべき
タンパク質が(例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で)移されたニトロセルロース
またはビニル系(例えば、ポリビニリデンフルオリド(PVDF))膜の形態をとりうる
。該抗PD-L1抗体またはフラグメントとの膜の接触の前に、該膜を、所望により、例
えば乾燥脱脂乳などでブロッキングして、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合す
るようにする。
たは免疫タンパク質ブロット法において使用されうる。そのような方法は本発明の一部を
構成し、例えば以下を含む:
(1)ヒトPD-L1の存在に関して試験されるべき膜または他の固体基体を本発明
の抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させる。そのような膜は、非変性PAG
E(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルまたはSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルにおいてXの存在に関して試験されるべき
タンパク質が(例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で)移されたニトロセルロース
またはビニル系(例えば、ポリビニリデンフルオリド(PVDF))膜の形態をとりうる
。該抗PD-L1抗体またはフラグメントとの膜の接触の前に、該膜を、所望により、例
えば乾燥脱脂乳などでブロッキングして、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合す
るようにする。
(2)該膜を1回以上洗浄して、未結合抗PD-L1抗体またはフラグメントおよび
他の未結合物質を除去する。
他の未結合物質を除去する。
(3)結合抗PD-L1抗体またはフラグメントを検出する。該結合抗体またはフラ
グメントは、検出可能な様態で標識された二次抗体(抗免疫グロブリン抗体)と共に該結
合抗体またはフラグメントをインキュベートし、ついで該二次抗体の存在を検出すること
により検出されうる。
グメントは、検出可能な様態で標識された二次抗体(抗免疫グロブリン抗体)と共に該結
合抗体またはフラグメントをインキュベートし、ついで該二次抗体の存在を検出すること
により検出されうる。
本明細書に開示されている抗PD-L1抗体および抗原結合性フラグメントは免疫組織
化学(IHC)アッセイにおいて使用可能であり、これは当技術分野で公知の種々のIH
C形態を用いて実施可能であり、それは本発明の実施形態を構成する。典型的なIHCア
ッセイは、顕微鏡スライド上でマウントされ乾燥される約3~4ミリメートル、好ましく
は4マイクロメートルのFFPE組織切片を使用し、例えば、(1)組織切片を脱パラフ
ィンおよび水和に付し、該再水和組織切片を抗PD-L1抗体またはその抗原結合性フラ
グメントと接触させ、(2)該組織内の1以上の細胞の表面上で抗PD-L1抗体または
その抗原結合性フラグメントを検出することを含む。該抗体またはフラグメント自体が検
出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、該抗体ま
たはフラグメントは、検出可能な様態で標識された検出される二次抗体により結合されう
る。
化学(IHC)アッセイにおいて使用可能であり、これは当技術分野で公知の種々のIH
C形態を用いて実施可能であり、それは本発明の実施形態を構成する。典型的なIHCア
ッセイは、顕微鏡スライド上でマウントされ乾燥される約3~4ミリメートル、好ましく
は4マイクロメートルのFFPE組織切片を使用し、例えば、(1)組織切片を脱パラフ
ィンおよび水和に付し、該再水和組織切片を抗PD-L1抗体またはその抗原結合性フラ
グメントと接触させ、(2)該組織内の1以上の細胞の表面上で抗PD-L1抗体または
その抗原結合性フラグメントを検出することを含む。該抗体またはフラグメント自体が検
出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、該抗体ま
たはフラグメントは、検出可能な様態で標識された検出される二次抗体により結合されう
る。
好ましいIHCアッセイは、商業的に入手可能なDako EnVision(商標)
FLEX検出系を使用し、これはDako Autostainer装置(Dako,a
n Agilent Technologies Company,Glostrup,
Denmark)と併用されることが意図される。22C3抗体、または22C3抗体の
重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体と共にこの系を使用する場合、IHCアッセイは以下
のとおりに行われうる。スライド上にマウントされた4ミクロンの厚さのFFPE組織切
片を一晩風乾し、60℃で45分間にわたって焼き、脱パラフィン処理し、再水和させる
。脱パラフィン後、97℃、ついで室温で20分間、EnVision(商標)FLEX
High pH Target Retrieval Solutionを使用してF
FPEスライドを熱誘発性エピトープ回復に付す。ついで該スライドを洗浄し、2μg/
mLの22C3で60分間染色し、ついで、以下のとおりにDako EnVision
(商標)FLEX試薬を使用して検出した:EnVision(商標)FLEX+MS
Linker(15分間)、EnVision(商標)FLEX/HRP(20分間)、
EnVision(商標)FLEX DAB(10分間)およびDAB Enhance
r(7分間)(介在する洗浄工程を伴う)。
FLEX検出系を使用し、これはDako Autostainer装置(Dako,a
n Agilent Technologies Company,Glostrup,
Denmark)と併用されることが意図される。22C3抗体、または22C3抗体の
重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体と共にこの系を使用する場合、IHCアッセイは以下
のとおりに行われうる。スライド上にマウントされた4ミクロンの厚さのFFPE組織切
片を一晩風乾し、60℃で45分間にわたって焼き、脱パラフィン処理し、再水和させる
。脱パラフィン後、97℃、ついで室温で20分間、EnVision(商標)FLEX
High pH Target Retrieval Solutionを使用してF
FPEスライドを熱誘発性エピトープ回復に付す。ついで該スライドを洗浄し、2μg/
mLの22C3で60分間染色し、ついで、以下のとおりにDako EnVision
(商標)FLEX試薬を使用して検出した:EnVision(商標)FLEX+MS
Linker(15分間)、EnVision(商標)FLEX/HRP(20分間)、
EnVision(商標)FLEX DAB(10分間)およびDAB Enhance
r(7分間)(介在する洗浄工程を伴う)。
本明細書に開示されている或る抗PD-L1抗体およびその抗原結合性フラグメントは
インビボ腫瘍イメージングにも使用されうる。そのような方法は、放射能標識抗PD-L
1抗体またはその抗原結合性フラグメントを、PD-L1発現を伴う腫瘍の存在に関して
試験されるべきヒト患者の体内に注射し、ついで、例えば、該腫瘍に結合した高濃度の該
抗体またはフラグメントを含む部位における、該標識抗体またはフラグメントの存在を検
出するために、患者の身体の核イメージングを行うことを含みうる。
インビボ腫瘍イメージングにも使用されうる。そのような方法は、放射能標識抗PD-L
1抗体またはその抗原結合性フラグメントを、PD-L1発現を伴う腫瘍の存在に関して
試験されるべきヒト患者の体内に注射し、ついで、例えば、該腫瘍に結合した高濃度の該
抗体またはフラグメントを含む部位における、該標識抗体またはフラグメントの存在を検
出するために、患者の身体の核イメージングを行うことを含みうる。
イメージング技術には、SPECTイメージング(単一光子放出型コンピュータ断層撮
影)またはPETイメージング(陽電子放射断層撮影)が含まれる。標識には、例えば、
SPECTイメージングと組合されたヨウ素-123(123I)およびテクネチウム-
99m(99mTc)、または例えばPETイメージングと組合された11C、13N、
15Oもしくは18F、またはインジウム-111が含まれる(例えば、Gordonら
(2005)International Rev.Neurobiol.67:385
-440を参照されたい)。
影)またはPETイメージング(陽電子放射断層撮影)が含まれる。標識には、例えば、
SPECTイメージングと組合されたヨウ素-123(123I)およびテクネチウム-
99m(99mTc)、または例えばPETイメージングと組合された11C、13N、
15Oもしくは18F、またはインジウム-111が含まれる(例えば、Gordonら
(2005)International Rev.Neurobiol.67:385
-440を参照されたい)。
検出キットおよび治療用キット
便宜上、本明細書に開示されている抗体または特異的結合剤は、キット、すなわち、診
断または検出アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージされた組合せと
して提供されうる。該抗体が酵素で標識される場合、該キットは基質と、酵素により要求
される補因子(例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体)とを含む
であろう。また、安定剤、バッファー(例えば、ブロックバッファーまたは細胞溶解バッ
ファー)などのような他の添加剤が含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度
を実質的に最適化する該試薬の溶液中の濃度がもたらされるように広範に変動しうる。特
に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解に際して与える賦形剤を含む乾燥粉末
、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。
便宜上、本明細書に開示されている抗体または特異的結合剤は、キット、すなわち、診
断または検出アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージされた組合せと
して提供されうる。該抗体が酵素で標識される場合、該キットは基質と、酵素により要求
される補因子(例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体)とを含む
であろう。また、安定剤、バッファー(例えば、ブロックバッファーまたは細胞溶解バッ
ファー)などのような他の添加剤が含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度
を実質的に最適化する該試薬の溶液中の濃度がもたらされるように広範に変動しうる。特
に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解に際して与える賦形剤を含む乾燥粉末
、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。
また、例えばELISA(サンドイッチ型または競合形態)のようなイムノアッセイを
含む種々の検出アッセイにおける使用のための、1以上のそのような試薬を含む診断また
は検出試薬およびキットを提供する。該キットの成分は固体支持体に予め付着しているこ
とが可能であり、あるいは、該キットが使用される際に固体支持体の表面に適用されるこ
とが可能である。幾つかの実施形態においては、シグナル生成手段は、本発明の抗体に予
め結合したものであることが可能であり、あるいは、使用前に1以上の成分、例えばバッ
ファー、抗体-酵素コンジュゲート、酵素基質などと組合されることを要しうる。キット
はまた、追加的試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング
試薬、洗浄試薬、酵素基質などを含みうる。該固相表面はチューブ(管)、ビーズ、マイ
クロタイタープレート、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを固定化する
のに適した他の材質の形態でありうる。特定の態様においては、化学発光もしくは色素原
産物の形成または化学発光もしくは色素原基質の還元を触媒する酵素がシグナル生成手段
の一成分である。そのような酵素は当技術分野でよく知られている。キットは、本明細書
に記載されている捕捉剤および検出試薬のいずれかを含みうる。所望により、該キットは
、本発明の方法を実施するための説明をも含みうる。
含む種々の検出アッセイにおける使用のための、1以上のそのような試薬を含む診断また
は検出試薬およびキットを提供する。該キットの成分は固体支持体に予め付着しているこ
とが可能であり、あるいは、該キットが使用される際に固体支持体の表面に適用されるこ
とが可能である。幾つかの実施形態においては、シグナル生成手段は、本発明の抗体に予
め結合したものであることが可能であり、あるいは、使用前に1以上の成分、例えばバッ
ファー、抗体-酵素コンジュゲート、酵素基質などと組合されることを要しうる。キット
はまた、追加的試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング
試薬、洗浄試薬、酵素基質などを含みうる。該固相表面はチューブ(管)、ビーズ、マイ
クロタイタープレート、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを固定化する
のに適した他の材質の形態でありうる。特定の態様においては、化学発光もしくは色素原
産物の形成または化学発光もしくは色素原基質の還元を触媒する酵素がシグナル生成手段
の一成分である。そのような酵素は当技術分野でよく知られている。キットは、本明細書
に記載されている捕捉剤および検出試薬のいずれかを含みうる。所望により、該キットは
、本発明の方法を実施するための説明をも含みうる。
本明細書に開示されている検出キットはまた、本明細書に開示されている抗体または抗
原結合性フラグメントの少なくとも1つと、検出試薬として該組成物を使用するための説
明とを含むものとして製造されうる。そのようなキットにおいて使用する容器は、典型的
には、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または該検出
組成物の1以上が配置され、好ましくは適切にアリコート化されうる他の適当な容器を含
みうる。本明細書に開示されているキットは、典型的には、商業的販売のために密封され
た、バイアルを含有するための手段、例えば、所望のバイアルが収容される射出成型また
はブロー成型プラスチック容器をも含むであろう。放射能標識、色素原、発蛍光または他
のタイプの検出可能な標識または検出手段が該キット内に含まれる場合には、該標識剤は
検出組成物自体と同じ容器内で提供されることが可能であり、あるいはこの第2の組成物
が配置され適切にアリコート化されうる第2の別個の収容手段内に配置されることが可能
である。あるいは、該検出試薬は単一容器手段において調製されることが可能であり、ほ
とんどの場合、該キットは、典型的には、商業的販売および/または簡便なパッケージン
グおよび運搬のために密封された、該バイアルを収容するための手段をも含むであろう。
原結合性フラグメントの少なくとも1つと、検出試薬として該組成物を使用するための説
明とを含むものとして製造されうる。そのようなキットにおいて使用する容器は、典型的
には、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または該検出
組成物の1以上が配置され、好ましくは適切にアリコート化されうる他の適当な容器を含
みうる。本明細書に開示されているキットは、典型的には、商業的販売のために密封され
た、バイアルを含有するための手段、例えば、所望のバイアルが収容される射出成型また
はブロー成型プラスチック容器をも含むであろう。放射能標識、色素原、発蛍光または他
のタイプの検出可能な標識または検出手段が該キット内に含まれる場合には、該標識剤は
検出組成物自体と同じ容器内で提供されることが可能であり、あるいはこの第2の組成物
が配置され適切にアリコート化されうる第2の別個の収容手段内に配置されることが可能
である。あるいは、該検出試薬は単一容器手段において調製されることが可能であり、ほ
とんどの場合、該キットは、典型的には、商業的販売および/または簡便なパッケージン
グおよび運搬のために密封された、該バイアルを収容するための手段をも含むであろう。
本明細書に記載されている検出またはモニタリング方法を行うための装置または器具も
提供する。そのような装置は、サンプルが投入されうるチャンバ(室)またはチューブ、
流体処理系(これは、所望により、サンプル流を装置へ導くための弁またはポンプを含み
うる)、血液から血漿または血清を分離するための所望により含まれうるフィルター、捕
捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバ、および捕捉剤免疫複合体に結合した検
出可能な標識の量を検出するための所望により含まれうる検出装置を含みうる。サンプル
流は受動的なもの(例えば、毛管力、静水力、またはサンプルが一旦適用されると装置の
更なる操作を要しない他の力によるもの)または能動的なもの(例えば、機械式ポンプ、
電気浸透ポンプにより生じる力、遠心力、増加した空気圧の適用によるもの)または能動
的な力および受動的な力の組合せによるものでありうる。
提供する。そのような装置は、サンプルが投入されうるチャンバ(室)またはチューブ、
流体処理系(これは、所望により、サンプル流を装置へ導くための弁またはポンプを含み
うる)、血液から血漿または血清を分離するための所望により含まれうるフィルター、捕
捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバ、および捕捉剤免疫複合体に結合した検
出可能な標識の量を検出するための所望により含まれうる検出装置を含みうる。サンプル
流は受動的なもの(例えば、毛管力、静水力、またはサンプルが一旦適用されると装置の
更なる操作を要しない他の力によるもの)または能動的なもの(例えば、機械式ポンプ、
電気浸透ポンプにより生じる力、遠心力、増加した空気圧の適用によるもの)または能動
的な力および受動的な力の組合せによるものでありうる。
更なる実施形態はまた、プロセッサ、コンピュータ読取可能メモリ、およびコンピュー
タ読取可能メモリ上に保存され、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うために
該プロセッサ上で実行されるように適合化されたルーチンを提供する。適当なコンピュー
ティング(計算)システム、環境および/または構成の例には、パーソナルコンピュータ
、サーバコンピュータ、携帯式またはラップトップ装置、マルチプロセッサシステム、マ
イクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能な大衆消費電
子商品、ネットワークPC、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、前記シス
テムまたは装置のいずれかを含む分散コンピューティング環境、あるいは当技術分野で公
知のいずれかの他のシステムが含まれる。
タ読取可能メモリ上に保存され、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うために
該プロセッサ上で実行されるように適合化されたルーチンを提供する。適当なコンピュー
ティング(計算)システム、環境および/または構成の例には、パーソナルコンピュータ
、サーバコンピュータ、携帯式またはラップトップ装置、マルチプロセッサシステム、マ
イクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能な大衆消費電
子商品、ネットワークPC、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、前記シス
テムまたは装置のいずれかを含む分散コンピューティング環境、あるいは当技術分野で公
知のいずれかの他のシステムが含まれる。
一般的方法
分子生物学における標準的な方法はSambrook,FritschおよびMani
atis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Ed
ition)Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor,NY;SambrookおよびRussell
(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.21
7,Academic Press,San Diego,CAに記載されている。標準
的な方法はAusbelら(2001)Current Protocols in M
olecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and
Sons,Inc.New York,NYにも見られ、これは細菌細胞におけるクロ
ーニングおよびDNA突然変異誘発(Vol.1)、哺乳類細胞および酵母におけるクロ
ーニング(Vol.2)、複合糖質およびタンパク質発現(Vol.3)ならびにバイオ
インフォマティクス(Vol.4)を記載している。
分子生物学における標準的な方法はSambrook,FritschおよびMani
atis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Ed
ition)Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor,NY;SambrookおよびRussell
(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.21
7,Academic Press,San Diego,CAに記載されている。標準
的な方法はAusbelら(2001)Current Protocols in M
olecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and
Sons,Inc.New York,NYにも見られ、これは細菌細胞におけるクロ
ーニングおよびDNA突然変異誘発(Vol.1)、哺乳類細胞および酵母におけるクロ
ーニング(Vol.2)、複合糖質およびタンパク質発現(Vol.3)ならびにバイオ
インフォマティクス(Vol.4)を記載している。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精
製方法が記載されている(Coliganら(2000)Current Protoc
ols in Protein Science,Vol.1,John Wiley
and Sons,Inc.,New York)。化学的分析、化学的修飾、翻訳後修
飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている(例えば、Co
liganら(2000)Current Protocols in Protein
Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,
New York;Ausubelら(2001)Current Protocols
in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley a
nd Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17;Si
gma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life S
cience Research,St.Louis,MO;pp.45-89;Ame
rsham Pharmacia Biotech(2001)BioDirector
y,Piscataway,N.J.,pp.384-391)を参照されたい)。ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造、精製およびフラグメント化が記載され
ている(Coliganら(2001)Current Protcols in Im
munology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,
New York;HarlowおよびLane(1999)Using Antibo
dies,Cold Spring Harbor Laboratory Press
,Cold Spring Harbor,NY;HarlowおよびLane,前掲)
。リガンド/受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である(例えば
、Coliganら(2001)Current Protocols in Immu
nology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New Yorkを参照
されたい)。
製方法が記載されている(Coliganら(2000)Current Protoc
ols in Protein Science,Vol.1,John Wiley
and Sons,Inc.,New York)。化学的分析、化学的修飾、翻訳後修
飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている(例えば、Co
liganら(2000)Current Protocols in Protein
Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,
New York;Ausubelら(2001)Current Protocols
in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley a
nd Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17;Si
gma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life S
cience Research,St.Louis,MO;pp.45-89;Ame
rsham Pharmacia Biotech(2001)BioDirector
y,Piscataway,N.J.,pp.384-391)を参照されたい)。ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造、精製およびフラグメント化が記載され
ている(Coliganら(2001)Current Protcols in Im
munology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,
New York;HarlowおよびLane(1999)Using Antibo
dies,Cold Spring Harbor Laboratory Press
,Cold Spring Harbor,NY;HarlowおよびLane,前掲)
。リガンド/受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である(例えば
、Coliganら(2001)Current Protocols in Immu
nology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New Yorkを参照
されたい)。
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体は製造可能である(例えば
、SheperdおよびDean(編)(2000)Monoclonal Antib
odies,Oxford Univ.Press,New York,NY;Kont
ermannおよびDubel(編)(2001)Antibody Engineer
ing,Springer-Verlag,New York;HarlowおよびLa
ne(1988)Antibodies A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,NY,pp.139-243;Carpenterら(2
000)J.Immunol.165:6205;Heら(1998)J.Immuno
l.160:1029;Tangら(1999)J.Biol.Chem.274:27
371-27378;Bacaら(1997)J.Biol.Chem.272:106
78-10684;Chothiaら(1989)Nature 342:877-88
3;FooteおよびWinter(1992)J.Mol.Biol.224:487
-499;米国特許第6,329,511号を参照されたい)。
、SheperdおよびDean(編)(2000)Monoclonal Antib
odies,Oxford Univ.Press,New York,NY;Kont
ermannおよびDubel(編)(2001)Antibody Engineer
ing,Springer-Verlag,New York;HarlowおよびLa
ne(1988)Antibodies A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,NY,pp.139-243;Carpenterら(2
000)J.Immunol.165:6205;Heら(1998)J.Immuno
l.160:1029;Tangら(1999)J.Biol.Chem.274:27
371-27378;Bacaら(1997)J.Biol.Chem.272:106
78-10684;Chothiaら(1989)Nature 342:877-88
3;FooteおよびWinter(1992)J.Mol.Biol.224:487
-499;米国特許第6,329,511号を参照されたい)。
ヒト化に代わる手段は、ファージ上で提示されるヒト抗体ライブラリー、またはトラン
スジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーを使用することである(Vaugha
nら(1996)Nature Biotechnol.14:309-314;Bar
bas(1995)Nature Medicine 1:837-839;Mende
zら(1997)Nature Genetics 15:146-156;Hooge
nboomおよびChames(2000)Immunol.Today 21:371
-377;Barbasら(2001)Phage Display:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y Press,Cold Spring Harbor,New York;Kayら
(1996)Phage Display of Peptides and Prot
eins:A Laboratory Manual,Academic Press,
San Diego,CA;de Bruinら(1999)Nature Biote
chnol.17:397-399)。
スジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーを使用することである(Vaugha
nら(1996)Nature Biotechnol.14:309-314;Bar
bas(1995)Nature Medicine 1:837-839;Mende
zら(1997)Nature Genetics 15:146-156;Hooge
nboomおよびChames(2000)Immunol.Today 21:371
-377;Barbasら(2001)Phage Display:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y Press,Cold Spring Harbor,New York;Kayら
(1996)Phage Display of Peptides and Prot
eins:A Laboratory Manual,Academic Press,
San Diego,CA;de Bruinら(1999)Nature Biote
chnol.17:397-399)。
抗原の精製は抗体の製造に必要ではない。関心のある抗原を含有する細胞で動物を免疫
化することが可能である。ついで該免疫化動物から脾細胞を単離し、該脾細胞を骨髄腫細
胞系と融合させてハイブリドーマを得ることが可能である(例えば、Meyaardら(
1997)Immunity 7:283-290;Wrightら(2000)Imm
unity 13:233-242;Prestonら,前掲;Kaithamanaら
(1999)J.Immunol.163:5157-5164を参照されたい)。
化することが可能である。ついで該免疫化動物から脾細胞を単離し、該脾細胞を骨髄腫細
胞系と融合させてハイブリドーマを得ることが可能である(例えば、Meyaardら(
1997)Immunity 7:283-290;Wrightら(2000)Imm
unity 13:233-242;Prestonら,前掲;Kaithamanaら
(1999)J.Immunol.163:5157-5164を参照されたい)。
抗体は例えば小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール(PEG)にコ
ンジュゲート化されうる。抗体は治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例え
ば色素、放射性同位体、酵素または金属、例えばコロイド金に結合した抗体を包含する(
例えば、Le Doussalら(1991)J.Immunol.146:169-1
75;Gibelliniら(1998)J.Immunol.160:3891-38
98;HsingおよびBishop(1999)J.Immunol.162:280
4-2811;Evertsら(2002)J.Immunol.168:883-88
9を参照されたい)。
ンジュゲート化されうる。抗体は治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例え
ば色素、放射性同位体、酵素または金属、例えばコロイド金に結合した抗体を包含する(
例えば、Le Doussalら(1991)J.Immunol.146:169-1
75;Gibelliniら(1998)J.Immunol.160:3891-38
98;HsingおよびBishop(1999)J.Immunol.162:280
4-2811;Evertsら(2002)J.Immunol.168:883-88
9を参照されたい)。
蛍光標識細胞分取(FACS)を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能で
ある(例えば、Owensら(1994)Flow Cytometry Princi
ples for Clinical Laboratory Practice,Jo
hn Wiley and Sons,Hoboken,NJ;Givan(2001)
Flow Cytometry,2nd ed.;Wiley-Liss,Hoboke
n,NJ;Shapiro(2003)Practical Flow Cytomet
ry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJを参照されたい
)。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、
ポリペプチドおよび抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である(Molecu
lar Probes(2003)Catalogue,Molecular Prob
es,Inc.,Eugene,OR;Sigma-Aldrich(2003)Cat
alogue,St.Louis,MO)。
ある(例えば、Owensら(1994)Flow Cytometry Princi
ples for Clinical Laboratory Practice,Jo
hn Wiley and Sons,Hoboken,NJ;Givan(2001)
Flow Cytometry,2nd ed.;Wiley-Liss,Hoboke
n,NJ;Shapiro(2003)Practical Flow Cytomet
ry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJを参照されたい
)。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、
ポリペプチドおよび抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である(Molecu
lar Probes(2003)Catalogue,Molecular Prob
es,Inc.,Eugene,OR;Sigma-Aldrich(2003)Cat
alogue,St.Louis,MO)。
免疫系の標準的な組織学的方法が記載されている(例えば、Muller-Harme
link(編)(1986)Human Thymus:Histopathology
and Pathology,Springer Verlag,New York,
NY;Hiattら(2000)Color Atlas of Histology,
Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA
;Louisら(2002)Basic Histology:Text and At
las,McGraw-Hill,New York,NYを参照されたい)。
link(編)(1986)Human Thymus:Histopathology
and Pathology,Springer Verlag,New York,
NY;Hiattら(2000)Color Atlas of Histology,
Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA
;Louisら(2002)Basic Histology:Text and At
las,McGraw-Hill,New York,NYを参照されたい)。
例えば抗原フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイ
ン、グリコシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージ
およびデータベースが利用可能である(例えば、GenBank,Vector NTI
(登録商標)Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD);GC
G Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Di
ego,CA);DeCypher(登録商標)(TimeLogic Corp.,C
rystal Bay,Nevada);Menneら(2000)Bioinform
atics 16:741-742;Menneら(2000)Bioinformat
ics Applications Note 16:741-742;Wrenら(2
002)Comput.Methods Programs Biomed.68:17
7-181;von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:
17-21;von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.
14:4683-4690を参照されたい)。
ン、グリコシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージ
およびデータベースが利用可能である(例えば、GenBank,Vector NTI
(登録商標)Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD);GC
G Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Di
ego,CA);DeCypher(登録商標)(TimeLogic Corp.,C
rystal Bay,Nevada);Menneら(2000)Bioinform
atics 16:741-742;Menneら(2000)Bioinformat
ics Applications Note 16:741-742;Wrenら(2
002)Comput.Methods Programs Biomed.68:17
7-181;von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:
17-21;von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.
14:4683-4690を参照されたい)。
実施例
実施例1.抗PD-L1ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
アジュバント中のヒトPD-L1-Fc融合タンパク質(R&D Systems(登
録商標)Catalogue No.156-B7-100)でBalb/Cマウスを免
疫化した。この融合タンパク質は、ヒトIgG1フラグメント(Pro100-Lys3
00)に融合したPD-L1の細胞外ドメイン(Phe19-Thr239)を含有する
。12回の免疫化後、ヒトPD-L1に対する高い力価を有する2匹のマウスからのリン
パ節を集め、電気融合を行って2バッチのハイブリドーマを得、これを研究名称MEB0
33およびMEB037と命名した。
実施例1.抗PD-L1ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
アジュバント中のヒトPD-L1-Fc融合タンパク質(R&D Systems(登
録商標)Catalogue No.156-B7-100)でBalb/Cマウスを免
疫化した。この融合タンパク質は、ヒトIgG1フラグメント(Pro100-Lys3
00)に融合したPD-L1の細胞外ドメイン(Phe19-Thr239)を含有する
。12回の免疫化後、ヒトPD-L1に対する高い力価を有する2匹のマウスからのリン
パ節を集め、電気融合を行って2バッチのハイブリドーマを得、これを研究名称MEB0
33およびMEB037と命名した。
ヒトPD-L1に対する抗体を産生するハイブリドーマを特定するために、MEB03
3およびMEB037ハイブリドーマバッチの上清をスクリーニングした。該スクリーニ
ングは、ヒトhPD-L1-Fcタンパク質への結合に関する、タンパク質に基づくEL
ISA、ならびにヒトPD-L1-CHO ヒトPD-L1CHO安定形質転換体および
陰性対照としての親CHO細胞への結合に関する、細胞に基づくELISAを用いた。抗
PD-L1抗体の存在に関して陽性の試験結果(データ非表示)を示したMEB033ハ
イブリドーマのクローン23個およびMEB037のクローン88個からの上清ならびに
それらのサンプルを正常ヒト扁桃からのFFPE組織切片上のIHC反応性に関して試験
した(データ非表示)。
3およびMEB037ハイブリドーマバッチの上清をスクリーニングした。該スクリーニ
ングは、ヒトhPD-L1-Fcタンパク質への結合に関する、タンパク質に基づくEL
ISA、ならびにヒトPD-L1-CHO ヒトPD-L1CHO安定形質転換体および
陰性対照としての親CHO細胞への結合に関する、細胞に基づくELISAを用いた。抗
PD-L1抗体の存在に関して陽性の試験結果(データ非表示)を示したMEB033ハ
イブリドーマのクローン23個およびMEB037のクローン88個からの上清ならびに
それらのサンプルを正常ヒト扁桃からのFFPE組織切片上のIHC反応性に関して試験
した(データ非表示)。
該クローン88個のうち、MEB037バッチからのクローン11個のみが、後記表に
挙げられている商業的に入手可能な抗PD-L1抗体で得られた染色パターンとの比較に
基づいて、更なる評価を保証するのに十分な強度および見掛け特異性の染色パターンを示
した。
挙げられている商業的に入手可能な抗PD-L1抗体で得られた染色パターンとの比較に
基づいて、更なる評価を保証するのに十分な強度および見掛け特異性の染色パターンを示
した。
本発明者らが、該実験抗体で得られた種々の染色パターンを、これらの商業的に入手可
能な抗ヒトPD-L1抗体で得られたパターンと比較したところ、染色の局在化および染
色細胞のタイプを含む、染色パターン間の有意な相違を認めた。これらの相違を説明する
ために、本発明者らは幾つかの追加的実験を行い、これらの商業的に入手可能な抗体がい
ずれも、FFPE切片におけるPD-L1発現のIHCにおける使用に要求される以下の
属性の組合せを与えないことを見出した:(1)感度 - 陽性対照組織(例えば、ヒト
扁桃)における正常生理的発現および腫瘍組織(例えば、ヒトメラノーマサンプル)にお
ける発現を検出する能力;(2)特異性 - 染色パターンはPD-L1の既知解剖的/
細胞分布と相関する必要があり、中和可能である必要がある;ならびに(3)頑強(ロバ
スト) - 「重複」組織切片をアッセイするために使用された場合に染色パターンにお
ける変動がほとんど乃至全く無い。
能な抗ヒトPD-L1抗体で得られたパターンと比較したところ、染色の局在化および染
色細胞のタイプを含む、染色パターン間の有意な相違を認めた。これらの相違を説明する
ために、本発明者らは幾つかの追加的実験を行い、これらの商業的に入手可能な抗体がい
ずれも、FFPE切片におけるPD-L1発現のIHCにおける使用に要求される以下の
属性の組合せを与えないことを見出した:(1)感度 - 陽性対照組織(例えば、ヒト
扁桃)における正常生理的発現および腫瘍組織(例えば、ヒトメラノーマサンプル)にお
ける発現を検出する能力;(2)特異性 - 染色パターンはPD-L1の既知解剖的/
細胞分布と相関する必要があり、中和可能である必要がある;ならびに(3)頑強(ロバ
スト) - 「重複」組織切片をアッセイするために使用された場合に染色パターンにお
ける変動がほとんど乃至全く無い。
例えば、Sigma/ProSco PRS4059抗体は扁桃ライセート上で複数の
バンド(それらはいずれもPD-L1を表すとは証明できなかった)を示し、フローサイ
トメトリーではPD-L1陽性であることを示したLOXメラノーマ細胞系を染色せず、
そしてIHCにより陽性細胞系と陰性細胞系とを識別しないことを、本発明者らは見出し
た。
バンド(それらはいずれもPD-L1を表すとは証明できなかった)を示し、フローサイ
トメトリーではPD-L1陽性であることを示したLOXメラノーマ細胞系を染色せず、
そしてIHCにより陽性細胞系と陰性細胞系とを識別しないことを、本発明者らは見出し
た。
これらのデータの幾つかを図4に示す。この図において、扁桃切片の免疫組織化学的染
色は、FFPE組織切片におけるPD-L1発現を検出するための15個の抗ヒトPD-
L1抗体のなかで唯一の適当な候補としてGadiotら(前掲)により特定されたPR
S4059抗体と比較して、FFPE組織上で特異かつ有用な免疫組織化学的特性を有す
る2つの抗体として、22C3および20C3を特定した。本発明者らにより行われた実
験においては、Prosci抗体(PRS4059,ロット40590604;0.4m
g/ml(一次)で使用)およびそれに続くウサギポリマー検出系(DAKO Envi
sion)は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、22C3抗体は
扁桃陰窩上皮および濾胞CD68+骨髄細胞(これはマクロファージと形態学的に合致し
ている)を選択的に染色した(図4B)。抗体20C3で実質的に同じ染色パターンが観
察された(データ非表示)。更に、22C3および20C3は、これらの2つの異なる細
胞集団の間で、一貫した染色強度の相違を示しており、陰窩上皮での染色強度は濾胞マク
ロファージでの強度より遥かに大きい。3個全ての抗体がPD-L1抗原とのプレインキ
ュベーションにより中和可能であった。このことは、該反応性が抗原結合性ドメイン(C
DR)によりもたらされることを示している。
色は、FFPE組織切片におけるPD-L1発現を検出するための15個の抗ヒトPD-
L1抗体のなかで唯一の適当な候補としてGadiotら(前掲)により特定されたPR
S4059抗体と比較して、FFPE組織上で特異かつ有用な免疫組織化学的特性を有す
る2つの抗体として、22C3および20C3を特定した。本発明者らにより行われた実
験においては、Prosci抗体(PRS4059,ロット40590604;0.4m
g/ml(一次)で使用)およびそれに続くウサギポリマー検出系(DAKO Envi
sion)は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、22C3抗体は
扁桃陰窩上皮および濾胞CD68+骨髄細胞(これはマクロファージと形態学的に合致し
ている)を選択的に染色した(図4B)。抗体20C3で実質的に同じ染色パターンが観
察された(データ非表示)。更に、22C3および20C3は、これらの2つの異なる細
胞集団の間で、一貫した染色強度の相違を示しており、陰窩上皮での染色強度は濾胞マク
ロファージでの強度より遥かに大きい。3個全ての抗体がPD-L1抗原とのプレインキ
ュベーションにより中和可能であった。このことは、該反応性が抗原結合性ドメイン(C
DR)によりもたらされることを示している。
実施例2.20C3および22C3抗PD-L1抗体の品質評価
この実施例は、FFPE組織切片のIHCアッセイにおける使用のための20C3およ
び22C3抗体の有用性を評価するために行った追加的実験を記載する。
この実施例は、FFPE組織切片のIHCアッセイにおける使用のための20C3およ
び22C3抗体の有用性を評価するために行った追加的実験を記載する。
1つの実験は、正常ヒトFFPE扁桃切片のIHCアッセイにおいて或る範囲のヒトP
D-L1(hPD-L1)タンパク質発現を検出する、これらの2つの抗体の能力を評価
した。22C3に関する代表的イメージを図5Aに示す。22C3での免疫組織化学的染
色は扁桃陰窩上皮を強力に標識し、CD68+濾胞骨髄集団(推定マクロファージ)の弱
ないし中等度の染色を示している。両方の抗体(20C3のデータは非表示)は、これら
の2つの細胞型において、明確な膜/細胞表面パターンで細胞を標識する。扁桃における
hPD-L1発現の妥当性(すなわち、2つの細胞集団(陰窩上皮および濾胞マクロファ
ージ)へのIHC染色の限局)は、隣接FFPE扁桃組織切片上で、独立した方法(hP
D-L1 mRNAに関するin-situハイブリダイゼーション[ISH])により
確証された。また、IHCにより評価されたhPD-L1タンパク質の差次的発現(陰窩
上皮>>濾胞マクロファージ)は、ISHで観察されたhPD-L1 mRNAの相対存
在量に対応している。
D-L1(hPD-L1)タンパク質発現を検出する、これらの2つの抗体の能力を評価
した。22C3に関する代表的イメージを図5Aに示す。22C3での免疫組織化学的染
色は扁桃陰窩上皮を強力に標識し、CD68+濾胞骨髄集団(推定マクロファージ)の弱
ないし中等度の染色を示している。両方の抗体(20C3のデータは非表示)は、これら
の2つの細胞型において、明確な膜/細胞表面パターンで細胞を標識する。扁桃における
hPD-L1発現の妥当性(すなわち、2つの細胞集団(陰窩上皮および濾胞マクロファ
ージ)へのIHC染色の限局)は、隣接FFPE扁桃組織切片上で、独立した方法(hP
D-L1 mRNAに関するin-situハイブリダイゼーション[ISH])により
確証された。また、IHCにより評価されたhPD-L1タンパク質の差次的発現(陰窩
上皮>>濾胞マクロファージ)は、ISHで観察されたhPD-L1 mRNAの相対存
在量に対応している。
もう1つの実験はhPD-L1発現細胞に対する20C3および22C3の結合特異性
を評価した。mRNA分析(qPCR)によりhPD-L1の発現に関して陰性であるこ
とが判明したHT144細胞、および高レベルのhPD-L1 mRNA(qPCR)を
発現することが知られているLOXメラノーマ細胞を、前記実施例1に記載されている実
験において得られた7個のハイブリドーマからの1マイクログラム/mlの精製マウスI
gGで染色した。同じ濃度の無関係なアイソタイプ対照マウス抗体も使用した。一次マウ
ス抗体を検出するために蛍光標識抗マウス二次抗体を使用した。染色および反復洗浄の後
、該細胞をフローサイトメトリーにより分析し、該集団に関する中央値蛍光強度を計算し
た(>10,000の収集事象)。結果を図6に示す。
を評価した。mRNA分析(qPCR)によりhPD-L1の発現に関して陰性であるこ
とが判明したHT144細胞、および高レベルのhPD-L1 mRNA(qPCR)を
発現することが知られているLOXメラノーマ細胞を、前記実施例1に記載されている実
験において得られた7個のハイブリドーマからの1マイクログラム/mlの精製マウスI
gGで染色した。同じ濃度の無関係なアイソタイプ対照マウス抗体も使用した。一次マウ
ス抗体を検出するために蛍光標識抗マウス二次抗体を使用した。染色および反復洗浄の後
、該細胞をフローサイトメトリーにより分析し、該集団に関する中央値蛍光強度を計算し
た(>10,000の収集事象)。結果を図6に示す。
細胞表面hPD-L1を検出するためのフローサイトメトリー試薬として、20C3お
よび22C3ならびに他のhPD-L1抗体を使用した。アイソタイプ対照抗体曲線と比
較した場合の20C3および22C3ヒストグラム曲線(図6A)の両方の有意な右シフ
トはhPD-L1陽性LOXメラノーマ細胞系上のhPD-L1の選択的検出を反映して
いる。この分析からのこれらのヒストグラムなどに関連した中央値蛍光強度を図6Bに示
す。20C3および22C3結合の選択性は陰性細胞系HT144上の有意な結合の欠如
(すなわち、アイソタイプと同程度の22C3および20C3のMFI)により更に確証
される。これとは対照的に、図6Bにおけるデータは、hPD-L1陽性LOXメラノー
マ細胞系において、20C3および22C3の両方が、アイソタイプと比較して、少なく
とも10倍のMFI増加をもたらすことを示している。したがって、(クローン5F9、
7C8、13D2および31D3に加えて)20C3および22C3はフローサイトメト
リー評価によりhPD-L1発現細胞への選択的結合を示す。
よび22C3ならびに他のhPD-L1抗体を使用した。アイソタイプ対照抗体曲線と比
較した場合の20C3および22C3ヒストグラム曲線(図6A)の両方の有意な右シフ
トはhPD-L1陽性LOXメラノーマ細胞系上のhPD-L1の選択的検出を反映して
いる。この分析からのこれらのヒストグラムなどに関連した中央値蛍光強度を図6Bに示
す。20C3および22C3結合の選択性は陰性細胞系HT144上の有意な結合の欠如
(すなわち、アイソタイプと同程度の22C3および20C3のMFI)により更に確証
される。これとは対照的に、図6Bにおけるデータは、hPD-L1陽性LOXメラノー
マ細胞系において、20C3および22C3の両方が、アイソタイプと比較して、少なく
とも10倍のMFI増加をもたらすことを示している。したがって、(クローン5F9、
7C8、13D2および31D3に加えて)20C3および22C3はフローサイトメト
リー評価によりhPD-L1発現細胞への選択的結合を示す。
もう1つの実験は、操作された及びヒト細胞系上のhPD-L1の発現を検出する、2
2C3抗体の能力を評価した。hPD-L1に関して陰性であるチャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞系を、ヒトPD-L1をコードする発現ベクターでトランスフェクト
して、操作された陽性対照細胞系を得た。図7Bに示されているとおり、親CHO細胞系
(陰性対照)およびトランスフェクト化CHO細胞系(陽性対照)のホルマリン固定パラ
フィン包埋(FFPE)細胞ペレットの22C3での免疫組織化学的染色は適当な陽性お
よび陰性染色を示す。
2C3抗体の能力を評価した。hPD-L1に関して陰性であるチャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞系を、ヒトPD-L1をコードする発現ベクターでトランスフェクト
して、操作された陽性対照細胞系を得た。図7Bに示されているとおり、親CHO細胞系
(陰性対照)およびトランスフェクト化CHO細胞系(陽性対照)のホルマリン固定パラ
フィン包埋(FFPE)細胞ペレットの22C3での免疫組織化学的染色は適当な陽性お
よび陰性染色を示す。
追加的なFFPEヒト細胞系ペレット(A375、HS578TおよびLOXメラノー
マ)が22C3で染色され、図7Bに示されているとおり、ある範囲の染色パターンおよ
び強度を示した。22C3染色はLoxメラノーマ細胞上では強力かつ均一であったが、
A375およびHS578T細胞ペレットにおいては、稀有な単一陽性細胞を示したに過
ぎなかった。20C3抗体で、類似した染色が観察された(データ非表示)。これらの3
つの細胞系において22C3によりIHCアッセイで検出されたhPD-L1発現レベル
は、ベースラインとしてのユビキチンmRNAと共にqPCRを用いて評価されたこれら
の細胞系におけるPD-L1 mRNAレベルと良く相関した。
マ)が22C3で染色され、図7Bに示されているとおり、ある範囲の染色パターンおよ
び強度を示した。22C3染色はLoxメラノーマ細胞上では強力かつ均一であったが、
A375およびHS578T細胞ペレットにおいては、稀有な単一陽性細胞を示したに過
ぎなかった。20C3抗体で、類似した染色が観察された(データ非表示)。これらの3
つの細胞系において22C3によりIHCアッセイで検出されたhPD-L1発現レベル
は、ベースラインとしてのユビキチンmRNAと共にqPCRを用いて評価されたこれら
の細胞系におけるPD-L1 mRNAレベルと良く相関した。
hPD-L1発現細胞に対する22C3の選択的結合および相対アフィニティを、細胞
に基づくELISA実験において評価した。幾つかの細胞系(hPDL1-CHOK1細
胞、親CHOK1細胞、hPDL2-CHOK1細胞およびLOX細胞)をコラーゲン被
覆96ウェルプレートの個々のウェル上でプレーティングし、コンフルエント状態まで増
殖させた。培地を除去し、1.4~3,000ng/mlの漸増濃度の一次抗体を含有す
る新鮮なCHOK1培地(10% BCSを含有するDMEM/F12)と交換した。以
下の一次抗体を使用した:抗体20C3および22C3の、マウスIgG1アイソタイプ
を有するそれぞれ2つの異なる生産ロット、抗PD-L1抗体(BioLegend)お
よび対照として働く抗PD-L2抗体。該一次抗体を37℃で1時間インキュベートし、
PBS/0.01% Tween20で3回洗浄し、二次抗体であるヤギ抗ヒトIgG,
Fc特異的HRP(Southern Biotech,Cat#1030-05)コン
ジュゲートをCHOK1培地中の1:2000の希釈度で加えた。該二次抗体を37℃で
1時間インキュベートし、前記のとおりに5回洗浄した。ELISAを、TMBを使用し
て現像し、0.1N リン酸で停止させ、吸光度を450nmで読取った(650nmの
バックグラウンド除去を伴う)。図8に示す結果は、hPD-L1を発現する細胞への2
2C3および20C3の選択的結合を示しており、22C3の結合アフィニティは、hP
D-L1 CHOK1操作細胞およびLOX細胞の両方に関して、20C3より大きい。
に基づくELISA実験において評価した。幾つかの細胞系(hPDL1-CHOK1細
胞、親CHOK1細胞、hPDL2-CHOK1細胞およびLOX細胞)をコラーゲン被
覆96ウェルプレートの個々のウェル上でプレーティングし、コンフルエント状態まで増
殖させた。培地を除去し、1.4~3,000ng/mlの漸増濃度の一次抗体を含有す
る新鮮なCHOK1培地(10% BCSを含有するDMEM/F12)と交換した。以
下の一次抗体を使用した:抗体20C3および22C3の、マウスIgG1アイソタイプ
を有するそれぞれ2つの異なる生産ロット、抗PD-L1抗体(BioLegend)お
よび対照として働く抗PD-L2抗体。該一次抗体を37℃で1時間インキュベートし、
PBS/0.01% Tween20で3回洗浄し、二次抗体であるヤギ抗ヒトIgG,
Fc特異的HRP(Southern Biotech,Cat#1030-05)コン
ジュゲートをCHOK1培地中の1:2000の希釈度で加えた。該二次抗体を37℃で
1時間インキュベートし、前記のとおりに5回洗浄した。ELISAを、TMBを使用し
て現像し、0.1N リン酸で停止させ、吸光度を450nmで読取った(650nmの
バックグラウンド除去を伴う)。図8に示す結果は、hPD-L1を発現する細胞への2
2C3および20C3の選択的結合を示しており、22C3の結合アフィニティは、hP
D-L1 CHOK1操作細胞およびLOX細胞の両方に関して、20C3より大きい。
20C3または22C3抗体のいずれかがマウスPD-L1に結合するかどうかを評価
するために、類似したELISA実験を行った。マウスPD-L1へのいずれの抗体の有
意な結合も観察されなかった(データ非表示)。
するために、類似したELISA実験を行った。マウスPD-L1へのいずれの抗体の有
意な結合も観察されなかった(データ非表示)。
実施例1に記載されている実験において特定された抗hPD-L1抗体の異なるペアの
間の抗体結合競合アッセイ(「交差遮断」)を行った。該アッセイはForteBio(
登録商標)Octet(登録商標)プラットフォームを使用し、これはバイオ・レイヤー
(bio-layer)インターフェロメトリーに基づく。簡潔に説明すると、この技術
は、時間(X時間)の経過に伴いバイオセンサー先端における光学的厚さ(Y軸)を増加
させる結合抗体による波長シフト(Δλ)として、バイオセンサー先端表面への初期抗体
(mAb1)の結合を測定する。該先端は、hPD-L1-Fcが結合している抗huI
gGセンサーからなる。抗PD-L1抗体の結合の際の光学的厚さの変化は、第1の垂直
の赤色点線において始まる上向きの傾きの曲線において反映され(図9A、9Bおよび9
Cにおけるグラフを参照されたい)、これらは溶液中への飽和濃度のmAb1(10マイ
クログラム/ml)の添加を表す。平衡状態にした後(~1000秒)、二次抗体をアッ
セイ溶液中に注入する(図9A、9Bおよび9Cにおける第2の垂直の赤色点線により示
されている)。該曲線の追加的な可動域により示される、二次mAb2の結合は、それら
の2つの抗体が非重複エピトープに結合することを示唆しており、一方、該曲線の可動域
がほとんど乃至全く無いことは、それらの2つの抗体が重複または同一エピトープに結合
することを示唆している。
間の抗体結合競合アッセイ(「交差遮断」)を行った。該アッセイはForteBio(
登録商標)Octet(登録商標)プラットフォームを使用し、これはバイオ・レイヤー
(bio-layer)インターフェロメトリーに基づく。簡潔に説明すると、この技術
は、時間(X時間)の経過に伴いバイオセンサー先端における光学的厚さ(Y軸)を増加
させる結合抗体による波長シフト(Δλ)として、バイオセンサー先端表面への初期抗体
(mAb1)の結合を測定する。該先端は、hPD-L1-Fcが結合している抗huI
gGセンサーからなる。抗PD-L1抗体の結合の際の光学的厚さの変化は、第1の垂直
の赤色点線において始まる上向きの傾きの曲線において反映され(図9A、9Bおよび9
Cにおけるグラフを参照されたい)、これらは溶液中への飽和濃度のmAb1(10マイ
クログラム/ml)の添加を表す。平衡状態にした後(~1000秒)、二次抗体をアッ
セイ溶液中に注入する(図9A、9Bおよび9Cにおける第2の垂直の赤色点線により示
されている)。該曲線の追加的な可動域により示される、二次mAb2の結合は、それら
の2つの抗体が非重複エピトープに結合することを示唆しており、一方、該曲線の可動域
がほとんど乃至全く無いことは、それらの2つの抗体が重複または同一エピトープに結合
することを示唆している。
要約すると、該結果は、22C3結合が、5H9を除くmAb2として試験された全て
の他の抗hPDL-1クローンの追加的結合と競合することを示している(図9A)。同
様に、20C3も5H9結合とは競合しないが、22C3および4B7との中間的な度合
の追加的結合を示している(図B)。総合すると、これらのデータは、20C3および2
2C3が重複エピトープに結合することを示している。
の他の抗hPDL-1クローンの追加的結合と競合することを示している(図9A)。同
様に、20C3も5H9結合とは競合しないが、22C3および4B7との中間的な度合
の追加的結合を示している(図B)。総合すると、これらのデータは、20C3および2
2C3が重複エピトープに結合することを示している。
以下の腫瘍(膀胱、食道、頭頸部、腎臓、HCC、乳房、肺、卵巣および胃)から調製
されたFFPE切片上でIHC分析を行うことにより、種々の腫瘍型における或る範囲の
hPD-L1発現を検出する、22C3抗体の能力を評価した。これらの腫瘍組織切片と
の22C3反応性の予備的スクリーニングを、染色の度合の半定量的「ゲシュタルト(g
estalt)」解釈を用いて行った。図10に示されているとおり、22C3は、実質
的に染色無し(スコア=0)から顕著な強力発現(スコア=4)までの範囲のPD-L1
発現を検出可能であり、これは、免疫抑制性PD-1/PD-L1相互作用の阻止に応答
しうる将来の腫瘍型を誘導するための、22C3によるIHCアッセイの有用性を示して
いる。
されたFFPE切片上でIHC分析を行うことにより、種々の腫瘍型における或る範囲の
hPD-L1発現を検出する、22C3抗体の能力を評価した。これらの腫瘍組織切片と
の22C3反応性の予備的スクリーニングを、染色の度合の半定量的「ゲシュタルト(g
estalt)」解釈を用いて行った。図10に示されているとおり、22C3は、実質
的に染色無し(スコア=0)から顕著な強力発現(スコア=4)までの範囲のPD-L1
発現を検出可能であり、これは、免疫抑制性PD-1/PD-L1相互作用の阻止に応答
しうる将来の腫瘍型を誘導するための、22C3によるIHCアッセイの有用性を示して
いる。
Merck and Co.,Inc.により開発されている抗PD1治療用抗体であ
るMK-3475に関する第1相(P001)治験に登録された18名のメラノーマ患者
から得られたアーカイブサンプルの22C3免疫組織化学的評価を利用する研究において
、PD-1およびPD-L1の相互作用を遮断する療法に応答する可能性がより高い患者
を層別化するための22C3抗体の有用性を評価した。症例は2名の病理医により独立し
て評価され、「陽性」、「陰性」または「曖昧」として帰属された。3つの範疇を示すこ
れらの代表的イメージを図11Aに示す。このサンプルセット(n=18)に関する病理
医間の一致は100%であった。
るMK-3475に関する第1相(P001)治験に登録された18名のメラノーマ患者
から得られたアーカイブサンプルの22C3免疫組織化学的評価を利用する研究において
、PD-1およびPD-L1の相互作用を遮断する療法に応答する可能性がより高い患者
を層別化するための22C3抗体の有用性を評価した。症例は2名の病理医により独立し
て評価され、「陽性」、「陰性」または「曖昧」として帰属された。3つの範疇を示すこ
れらの代表的イメージを図11Aに示す。このサンプルセット(n=18)に関する病理
医間の一致は100%であった。
臨床応答を、免疫関連応答基準(irRC)を用いて評価し、IHC結果と相関させた
。この分析では、「曖昧」例は陰性とみなされ、72%のアッセイ感度および86%の特
異性を示した。図11Bに示す結果は、FFPE組織上の22C3免疫組織化学的染色が
患者選択バイオマーカーとしての有用性を有することを示唆している。
。この分析では、「曖昧」例は陰性とみなされ、72%のアッセイ感度および86%の特
異性を示した。図11Bに示す結果は、FFPE組織上の22C3免疫組織化学的染色が
患者選択バイオマーカーとしての有用性を有することを示唆している。
前記実験の結果に基づいて、本発明者らは、前記の88個の実験用ハイブリドーマのう
ちの2つ(MEB037.20C3.138およびMEB037.20C3.116)に
より産生された抗体が、候補FFPE反応性IHC診断試薬としての開発のために考慮さ
れるための感度、特異性および頑強さの必須組合せを有すると判定した。
ちの2つ(MEB037.20C3.138およびMEB037.20C3.116)に
より産生された抗体が、候補FFPE反応性IHC診断試薬としての開発のために考慮さ
れるための感度、特異性および頑強さの必須組合せを有すると判定した。
実施例3.22C3抗PD-L1抗体に対するヒトPD-L1上のエピトープのマッピ
ング
11マーのヒスチジンタグに融合した成熟ヒトPD-L1(配列番号38)の細胞外ド
メインを含有する抗体22C3およびPD-L1-Hisタンパク質を使用して、HDX
-MSエピトープマッピングを行った。ヒトPD-L1(配列番号38)の細胞外ドメイ
ン上のセグメント156~178および196~206は抗体22C3への結合に際して
強力な防御(>10%の平均重水素化レベルの相違)を示した。また、セグメント3~9
、10~13、88~93および135~147は、限界的であるが有意な防御を示した
(5%~10%の平均重水素化レベルの相違)。
ング
11マーのヒスチジンタグに融合した成熟ヒトPD-L1(配列番号38)の細胞外ド
メインを含有する抗体22C3およびPD-L1-Hisタンパク質を使用して、HDX
-MSエピトープマッピングを行った。ヒトPD-L1(配列番号38)の細胞外ドメイ
ン上のセグメント156~178および196~206は抗体22C3への結合に際して
強力な防御(>10%の平均重水素化レベルの相違)を示した。また、セグメント3~9
、10~13、88~93および135~147は、限界的であるが有意な防御を示した
(5%~10%の平均重水素化レベルの相違)。
本明細書中に引用されている全ての参考文献は、各個の刊行物、データベースエントリ
ー(例えば、GenBank配列またはGeneIDエントリー)、特許出願または特許
が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、
参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、
そのような引用が、参照により組み入れるという特別な陳述に直に隣接して存在しない場
合であっても、37 C.F.R.(米国特許規則)§1.57(b)(1)に従い、各
個の刊行物、データベースエントリー(例えば、Genbank配列またはGeneID
エントリー)、特許出願または特許[それらのそれぞれは37 C.F.R.(米国特許
規則)§1.57(b)(2)に従い明らかに特定されるものである]に関するものであ
ることが出願人により意図される。参照により組み入れるという特別な陳述が明細書中に
含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的(general)
陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連
先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内
容または日付に関して何ら自認するものでもない。
ー(例えば、GenBank配列またはGeneIDエントリー)、特許出願または特許
が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、
参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、
そのような引用が、参照により組み入れるという特別な陳述に直に隣接して存在しない場
合であっても、37 C.F.R.(米国特許規則)§1.57(b)(1)に従い、各
個の刊行物、データベースエントリー(例えば、Genbank配列またはGeneID
エントリー)、特許出願または特許[それらのそれぞれは37 C.F.R.(米国特許
規則)§1.57(b)(2)に従い明らかに特定されるものである]に関するものであ
ることが出願人により意図される。参照により組み入れるという特別な陳述が明細書中に
含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的(general)
陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連
先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内
容または日付に関して何ら自認するものでもない。
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されるも
のではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記
説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は添付の特許請
求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
のではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記
説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は添付の特許請
求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分なものであると
みなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記
説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
みなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記
説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
Claims (20)
- CDRL1、CDRL2およびCDRL3の、3個の軽鎖CDR、ならびにCDRH1
、CDRH2およびCDRH3の、3個の重鎖CDRを含む、ヒトPD-L1に特異的に
結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
(a)CDRL1が、配列番号1、配列番号9、配列番号21、配列番号9の変異体お
よび配列番号21の変異体からなる群から選択され、
(b)CDRL2が、配列番号2および配列番号2の変異体からなる群から選択され、
(c)CDRL3が、配列番号3、配列番号10、配列番号22、配列番号10の変異
体および配列番号22の変異体からなる群から選択され、
(d)CDRH1が、配列番号5、配列番号14、配列番号15、配列番号26、配列
番号27、配列番号14の変異体、配列番号15の変異体、配列番号26の変異体および
配列番号27の変異体からなる群から選択され、
(e)CDRH2が、配列番号6、配列番号16、配列番号28、配列番号16の変異
体および配列番号28の変異体からなる群から選択され、ならびに
(f)CDRH3が、配列番号7、配列番号17、配列番号29、配列番号17の変異
体および配列番号29の変異体からなる群から選択される、単離された抗体またはその抗
原結合性フラグメント。 - 前記の3個の軽鎖CDRが配列番号1、配列番号2および配列番号3であり、前記の3
個の重鎖CDRが配列番号5、配列番号6および配列番号7である、請求項1記載の単離
された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 前記の3個の軽鎖CDRが配列番号9、配列番号2および配列番号10であり、前記の
3個の重鎖CDRが配列番号14、配列番号16および配列番号17である、請求項1記
載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 前記の3個の軽鎖CDRが配列番号21、配列番号2および配列番号22であり、前記
の3個の重鎖CDRが配列番号26、配列番号28および配列番号29である、請求項1
記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗
原結合性フラグメントであって、
(a)該軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号13、配列番号13の変異体、配列番
号25および配列番号25の変異体からなる群から選択され、ならびに
(b)該重鎖可変領域が、配列番号8、配列番号20、配列番号20の変異体、配列番
号32および配列番号32の変異体からなる群から選択される、請求項1記載の単離され
た抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗
原結合性フラグメントであって、
(a)該軽鎖可変領域が配列番号13であり、該重鎖可変領域が配列番号20であり、
(b)該軽鎖可変領域が配列番号25であり、該重鎖可変領域が配列番号32であり、
配列番号32におけるXがQであり、または
(c)該軽鎖可変領域が配列番号25であり、該重鎖可変領域が配列番号32であり、
配列番号32におけるXがpEである、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結
合性フラグメント。 - (a)配列番号13の軽鎖可変領域および配列番号20の重鎖可変領域、または
(b)配列番号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含む、ヒトP
D-L1に特異的に結合し、参照抗体の結合を遮断する単離された抗体またはその抗原結
合性フラグメント。 - 該参照抗体が配列番号25の軽鎖可変領域および配列番号32の重鎖可変領域を含み、
遮断抗体が配列番号38のアミノ酸156~178の第1セグメントにおける残基、およ
び配列番号38のアミノ酸196~206の第2セグメントにおける残基に結合する、請
求項7記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 遮断抗体が、配列番号32のアミノ酸3~9、配列番号38のアミノ酸10~13、配
列番号38のアミノ酸88~93、および配列番号38のアミノ酸135~147からな
る群から選択されるヒトPD-L1セグメントのいずれか1つ、2つ、もしくは3つ、ま
たは4つ全てにおける残基に更に結合する、請求項8記載の単離された抗体またはその抗
原結合性フラグメント。 - 抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核
酸であって、
(a)該抗体軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号13および配列番号25からなる
群から選択され、ならびに
(b)該抗体重鎖可変領域が、配列番号8、配列番号20および配列番号32(ここで
、配列番号32におけるXはQである)からなる群から選択される、単離された核酸。 - 該抗体軽鎖可変領域が配列番号13または配列番号25であり、該抗体重鎖可変領域が
配列番号20または配列番号32である、請求項10記載の単離された核酸。 - (a)配列番号33および配列番号34の一方もしくは両方、または
(b)配列番号35および配列番号36の一方もしくは両方を含む、請求項10記載の
単離された核酸。 - 発現ベクターである、請求項10~12のいずれか1項記載の単離された核酸。
- 請求項12記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- ヒトから摘出されたヒト組織サンプルをPD-L1発現に関してアッセイする方法であ
って、
(a)ヒトPD-L1へのPD-L1結合試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組
織サンプルをPD-L1結合試薬と接触させ、ここで、該結合試薬は、請求項1~7のい
ずれか1項記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含み、
(b)未結合PD-L1結合試薬を除去し、
(c)結合したPD-L1結合剤の存在または非存在を検出することを含む、方法。 - 結合した結合試薬の量を定量することを更に含む、請求項15記載の方法。
- 該結合試薬が配列番号13および配列番号20を含む、または配列番号25および配列
番号32を含む、請求項15または請求項16記載の方法。 - 請求項1~9のいずれか1項記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント
と、ヒトPD-L1に結合した該抗体または該抗原結合性フラグメントの複合体を検出す
るための試薬のセットとを含むキット。 - 該抗体または抗原結合性フラグメントが配列番号13および配列番号20を含む、また
は配列番号25および配列番号32を含む、請求項18記載のキット。 - 抗体分子の混合物を含む抗体組成物であって、該混合物における抗体分子の大部分が配
列番号25および配列番号32(ここで、配列番号32におけるXはpEである)を含み
、該混合物における抗体分子の残りが配列番号25および配列番号32(ここで、配列番
号32におけるXはQである)を含む、抗体組成物。
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---|---|---|---|
US201261745386P | 2012-12-21 | 2012-12-21 | |
US61/745,386 | 2012-12-21 | ||
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---|---|
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