KR20180014009A - 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 cpg-c 유형 올리고뉴클레오티드의 조합 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 프로그램화된 사멸 1 수용체 (PD-1)의 길항제 및 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 효능제를 포함하는 조합 요법, 및 암의 치료를 위한 조합 요법의 용도를 기재한다.

Description

암을 치료하기 위한 PD-1 길항제 및 CPG-C 유형 올리고뉴클레오티드의 조합

본 발명은 암의 치료에 유용한 조합 요법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 프로그램화된 사멸 1 단백질 (PD-1)의 길항제 및 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 효능제인 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조합 요법에 관한 것이다.

PD-1은 면역 조절 및 말초 내성의 유지에서 중요한 분자로 인식된다. PD-1은 나이브 T, B 및 NKT 세포 상에서 중간 정도로 발현되고 림프구, 단핵구 및 골수 세포 상에서 T/B 세포 수용체 신호전달에 의해 상향-조절된다 (1).

PD-1에 대한 2종의 공지된 리간드인 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)는 다양한 조직에서 발생하는 인간 암에서 발현된다. 예를 들어, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암 및 흑색종의 큰 샘플 세트에서, PD-L1 발현은 후속 치료에 관계없이 불량한 예후와 상관되고 전체 생존을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (2-13). 유사하게, 종양 침윤 림프구 상의 PD-1 발현은 유방암 및 흑색종에서의 기능장애성 T 세포를 나타내고 (14-15) 신암에서의 불량한 예후와 상관되는 (16) 것으로 밝혀졌다. 따라서, PD-L1 발현 종양 세포는 PD-1 발현 T 세포와 상호작용하여 T 세포 활성화 및 면역 감시의 회피를 감쇠시키고, 그에 따라 종양에 대한 손상된 면역 반응에 기여하는 것으로 제안되었다.

PD-1과 그의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 다 사이의 상호작용을 억제하는 여러 모노클로날 항체가 암을 치료하기 위해 임상 개발 중에 있다. 이러한 항체의 효능은 다른 승인된 또는 실험적 암 요법, 예를 들어, 방사선, 수술, 화학요법제, 표적화 요법, 종양에서 조절이상인 다른 신호전달 경로를 억제하는 작용제, 및 다른 면역 증강제와 조합하여 투여되는 경우에 증진될 수 있는 것으로 제안된 바 있다.

일반적으로 면역자극 서열로서 공지된 특정 DNA 서열의 투여는, Th1-연관 시토카인의 분비에 의해 나타내어진 바와 같이 Th1-유형 편향을 갖는 면역 반응을 유도한다. 항원과 면역자극 폴리뉴클레오티드의 투여는 투여된 항원에 대한 Th1-유형 면역 반응을 일으킨다. 문헌 [Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-854]. 예를 들어, 염수 또는 아주반트 명반 중 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이) β-갈락토시다제 (β-Gal)로 피내로 주사된 마우스는 특정한 IgG1 및 IgE 항체, 및 IL-4 및 IL-5를 분비하나 IFN-γ는 분비하지 않는 CD4⁺ 세포를 생산함으로써 반응하였으며, 이는 T 세포가 우세하게 Th2 하위세트의 것임을 입증한다. 그러나, β-Gal을 코딩하고 면역자극 서열을 함유하는 (염수 중) 플라스미드 DNA로 피하로 (또는 타인(tyne) 피부 스크래치 어플리케이터로) 주사된 마우스는 IgG2a 항체 및 IFN-γ를 분비하나 IL-4 및 IL-5는 분비하지 않는 CD4⁺ 세포를 생산함으로써 반응하였으며, 이는 T 세포가 우세하게 Th1 하위세트의 것임을 입증한다. 더욱이, 플라스미드 DNA-주사된 마우스에 의한 특정한 IgE 생산은 66-75% 감소되었다. 문헌 [Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145]. 일반적으로, 네이키드 DNA 면역화에 대한 반응은 IL-2, TNFα 및 항원-자극된 CD4⁺ T 세포에 의한 IFN-γ의 생산을 특징으로 하며, 이는 Th1-유형 반응을 나타낸다. 이는 감소된 IgE 생산에 의해 보여진 바와 같이 알레르기 및 천식의 치료에 특히 중요하다. Th1-유형 면역 반응을 자극하는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 능력은 박테리아 항원, 바이러스 항원 및 알레르겐으로 입증되었다 (예를 들어, WO 98/55495 참조).

관련 기술분야에서 암 면역요법의 효능을 개선시키는 것이 필요하다. 따라서, PD-1 길항제 및 면역자극 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 조합 요법을 연구하는 것이 바람직하다.

한 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 PD-1 길항제 및 TLR9 효능제를 포함하는 조합 요법을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 TLR9 효능제와 조합하여 사용하기 위한 PD-1 길항제를 포함하는 암을 치료하기 위한 의약을 제공하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PD-1 길항제와 조합하여 사용하기 위한 TLR9 효능제를 포함하는 암을 치료하기 위한 의약을 제공하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이다.

다른 실시양태는 TLR9 효능제와 조합하여 투여되는 경우 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 PD-1 길항제의 용도 및 PD-1 길항제와 조합하여 투여되는 경우 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 TLR9 효능제의 용도를 제공한다. 이러한 실시양태에서, TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 PD-1 길항제 및 TLR9 효능제의 용도를 제공하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 의약은 키트를 포함하고, 키트는 또한 개체에서 암을 치료하기 위해 TLR9 효능제와 조합하여 PD-1 길항제를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 논의된 방법, 의약 또는 키트의 조합 요법은 항-IL-10 항체를 추가로 포함한다.

도 1은 본 발명에 유용한 예시적인 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 CDR의 아미노산 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1-6)을 보여준다.
도 2는 본 발명에 유용한 또 다른 예시적인 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 CDR의 아미노산 서열 (서열식별번호: 7-12)을 보여준다.
도 3은 본 발명에 유용한 예시적인 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 및 전장 중쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14)을 보여준다.
도 4는 본 발명에 유용한 예시적인 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 대안적인 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 15-17)을 보여준다.
도 5는 본 발명에 유용한 예시적인 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 대안적인 경쇄의 아미노산 서열을 보여주며, 도 5a는 K09A-L-11 및 K09A-L-16 경쇄의 아미노산 서열 (각각, 서열식별번호: 18 및 19)을 보여주고 도 5b는 K09A-L-17 경쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 20)을 보여준다.
도 6은 펨브롤리주맙에 대한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (각각, 서열식별번호: 21 및 22)을 보여준다.
도 7은 니볼루맙에 대한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (각각, 서열식별번호: 23 및 24)을 보여준다.
도 8은 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 34의 중쇄 서열을 갖는, 항-IL-10 hum12G8의 아미노산 서열을 보여준다.
도 9는 서열식별번호: 37의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 36의 중쇄 서열을 갖는, 항-IL-10 TC40.11D8의 아미노산 서열을 보여준다.
도 10은 마우스 TC-1 양측 종양 모델에서의 주사된 종양의 종양 성장을 보여준다. 패널 a는 개별 동물에 대한 주사된 종양의 부피 및 군당 완전 퇴행 (CR)의 수를 보여준다. 패널 b는 주사된 종양의 중앙 부피를 68% 신뢰 구간을 나타내는 오차 막대와 함께 보여준다. 패널 c는 치료군 사이의 주사된 종양의 부피를 일별로 비교한다. 패널 d는 치료 사이의 주사된 종양의 부피의 비교를 위한 비조정된 및 다중도-조정된 P-값을 보여준다. 비조정된 p 값은 적정-검열 데이터를 위한 게한-브레슬로우(Gehan-Breslow) 비파라미터 검정 통계의 페토 & 페토(Peto & Peto) 버전에 기초한 양측 p-값을 지칭한다. P-값은 비교되는 2개의 치료 사이의 동물의 20,000 무작위 재할당으로부터 추정되었다. 다중도 조정된 p-값은 주어진 쌍의 치료에 대해 모든 시점에 걸쳐 집단적 오차율을 제어하기 위해 조정된 p-값을 지칭한다. 조정은 순열 분포에 웨스트폴 앤드 영(Westfall and Young)의 맥스티(maxT) 절차를 적용함에 의한 것이었다.
도 11은 마우스 TC-1 양측 종양 모델에서의 비-주사된 종양의 종양 성장을 보여준다. 패널 a는 개별 동물에 대한 비-주사된 종양의 부피 및 군당 완전 퇴행 (CR)의 수를 보여준다. 패널 b는 비-주사된 종양의 중앙 부피를 68% 신뢰 구간을 나타내는 오차 막대와 함께 보여준다. 패널 c는 치료군 사이의 비-주사된 종양의 부피를 일별로 비교한다. 패널 d는 치료 사이의 비-주사된 종양의 부피의 비교를 위한 비조정된 및 다중도-조정된 P-값을 보여준다. 비조정된 p 값은 적정-검열 데이터를 위한 게한-브레슬로우 비파라미터 검정 통계의 페토 & 페토 버전에 기초한 양측 p-값을 지칭한다. P-값은 비교되는 2개의 치료 사이의 동물의 20,000 무작위 재할당으로부터 추정되었다. 다중도 조정된 p-값은 주어진 쌍의 치료에 대해 모든 시점에 걸쳐 집단적 오차율을 제어하기 위해 조정된 p-값을 지칭한다. 조정은 순열 분포에 웨스트폴 앤드 영의 맥스티 절차를 적용함에 의한 것이었다.
도 12는 24시간 동안의 C59-08의 치료로의 인간 PBMC (2명의 공여자)에서의 IFNα2a 및 IL-10의 유도를 보여준다.
도 13은 24시간 동안의 C59-08로의 치료 후 인간 신세포 암종 조직배양에서의 IFNα-유도성 유전자 (패널 a), 시토카인 (패널 b), 및 면역 활성화 마커 (패널 c)의 mRNA 발현의 유도를 보여준다.
도 14a는 CT-26 결장 암종 세포로 주사된 마우스에서의 종양 결절 크기의 분포를 보여준다. 도 14b는 종양 조직의 그램당 종양 침윤 백혈구 (TIL)의 수를 보여준다. 유의성은 프리즘 그래프패드(Prism GraphPad) 소프트웨어를 사용하는 독립표본 검정을 사용하여 계산되었다. 도 14c는 T 세포 침윤 및 활성화의 다양한 마커의 유전자 발현의 수준 대 종양 크기를 보여주는 한편, 도 14d는 종양 조직에서의 다양한 제I형 인터페론 (IFN) 반응성 마커의 유전자 발현의 수준 대 종양 크기를 보여준다.
도 15a는 평균 종양 크기를 보여주고, 도 15b는 퍼센트 생존을 보여주고, 도 15c는 CT-26 결장 암종 세포가 생착된 치료된 및 비치료된 마우스의 다양한 군의 퍼센트 생존을 보여준다.
도 16은 CD4 또는 CD8 세포의 존재 또는 부재 하에, 항-PD-1 Ab를 전신으로 및 C59-08을 종양내로 받았거나 또는 비치료된 채로 남겨진, CT-26 결장 암종 세포가 생착된 마우스의 퍼센트 생존을 보여준다.
도 17은 항-PD-1 Ab를 전신으로 및 C59-08을 종양내로 받았거나 또는 비치료된 채로 남겨진, CT-26 결장 암종 세포가 양측으로 생착된 마우스의 퍼센트 생존을 보여준다.
도 18a는 대조군 올리고뉴클레오티드-치료된 마우스의 평균 종양 부피에 비한, 다양한 치료를 받은, CT-26 결장 암종 세포가 생착된 마우스의 종양 부피를 보여준다. 도 18b는 CD45+ 종양-침윤 백혈구 중 퍼센트 CD8+ T 세포, 및 종양 조직의 그램당 CD8+ T 세포의 총수를 보여준다. 도 18c 및 도 18d는 BFA (산포된 점선 막대) 또는 BFA 단독 (밀집된 점선 막대)의 존재 하에 PMA 및 이오노마이신으로 3시간 동안 자극된 후, 세포내 염색 및 CD8+ T 세포 상에 게이팅된 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이, 150,000개 종양 침윤 백혈구에 의한 TNF-α 및 IFN-γ 생산의 수준을 보여준다. 도 18c의 경우, Y 축에 라벨링된 수는 하측으로부터 상측까지 각각 -10³, 0, 10³, 10⁴, 10⁵이고, X 축에 라벨링된 수는 좌측으로부터 우측까지 각각 -10³, 0, 10³, 10⁴, 10⁵이다.
도 19a는 C59-08을 종양내로 또는 대조군 올리고뉴클레오티드를 종양내로 받은, CT-26 결장 암종 세포가 생착된 마우스의 종양 성장 곡선을 보여준다. 도 19b는 C59-08 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 치료된 마우스의 종양 침윤 백혈구에 의한 다양한 제I형 인터페론 반응성 유전자의 발현의 수준을 보여준다. 데이터를 하우스키핑 유전자인 유비퀴틴에 비한 관심 유전자의 상대 역치 사이클 (CT)로서 나타냈다.

약어. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐 하기 약어가 사용될 것이다:

BOR 최상의 전체 반응

BID 1일 2회 1회분 투여

CBR 임상 이익률

CDR 상보성 결정 영역

CHO 차이니즈 햄스터 난소

CR 완전 반응

DCR 질환 제어율

DFS 무질환 생존

DLT 용량 제한 독성

DOR 반응 지속기간

DSDR 지속적인 안정 질환율

FFPE 포르말린-고정, 파라핀-포매

FR 프레임워크 영역

IgG 이뮤노글로불린 G

IHC 면역조직화학 또는 면역조직화학적

irRC 면역 관련 반응 기준

IV 정맥내

MTD 최대 허용 용량

NCBI 국립 생물 정보 센터

NCI 국립 암 연구소

ORR 객관적 반응률

OS 전체 생존

PD 진행성 질환

PD-1 프로그램화된 사멸 1

PD-L1 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1

PD-L2 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 2

PFS 무진행 생존

PR 부분 반응

Q2W 2주마다 1회 투여

Q3W 3주마다 1회 투여

QD 1일에 1회 투여

RECIST 고형 종양의 반응 평가 기준

SD 안정 질환

VH 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역

VK 이뮤노글로불린 카파 경쇄 가변 영역

I. 정의

본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 기술 및 과학 용어가 하기에 구체적으로 정의된다. 이 문헌의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.

첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 단어는, 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 그의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다.

동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용된 바와 같은 "투여"는 외인성 제약, 치료제, 진단제, 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체의 접촉을 지칭한다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것 뿐만 아니라 시약을 세포와 접촉되어 있는 유체와 접촉시키는 것을 포괄한다. 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 항체의 임의의 형태를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화, 완전 인간 항체, 키메라 항체 및 낙타화 단일 도메인 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "모 항체"는 항체의 의도된 사용을 위한 변형, 예컨대 인간 치료제로서 사용하기 위한 항체의 인간화 전에 항원에 대한 면역계의 노출에 의해 수득된 항체이다.

일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하는데, 각 쌍이 1개는 "경쇄" (약 25 kDa)를 갖고 1개는 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 게다가, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 항체의 이소형을 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 이 때 중쇄는 또한 약 10개 더 많은 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.

각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.

전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치하는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 통상적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특정한 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 N-말단에서부터 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 할당하는 것은 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252: 6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878-883]의 정의에 따른다.

본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체가 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체 단편, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역을 유지하는 단편을 지칭한다. 항체 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv; 나노바디 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

명시된 표적 단백질에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 단백질에 비해 이러한 표적에 대한 우선적인 결합을 나타내는 항체이지만, 이러한 특이성은 절대적인 결합 특이성을 요구하지는 않는다. 항체는 그의 결합이, 예를 들어 목적하지 않는 결과 예컨대 가양성을 생성하지 않으면서, 샘플 중 표적 단백질의 존재를 결정하는 경우, 그의 의도된 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에 유용한 항체 또는 그의 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 보다 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 가장 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화도로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체가 주어진 아미노산 서열, 예를 들어 성숙 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지만 그 서열이 결여되어 있는 단백질에는 결합하지 않는 경우, 항체는 그 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.

"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종 (예를 들어, 인간)으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 지칭한다.

"인간 항체"는 단지 인간 이뮤노글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우에 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각, 단지 마우스 또는 래트 이뮤노글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다.

"인간화 항체"는 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 뿐만 아니라 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 것이다. 접두어 "hum", "hu" 또는 "h"는 인간화 항체를 모 설치류 항체로부터 구분하기 위해 필요한 경우 항체 클론 명칭에 추가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이지만, 친화도를 증가시키기 위해, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위해, 또는 다른 이유를 위해 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.

치료 요법, 예컨대 본원에 기재된 조합 요법으로 치료되는 암 환자를 지칭하는 경우 "항종양 반응"은, 적어도 하나의 양성 치료 효과, 예컨대 예를 들어, 감소된 암 세포의 수, 감소된 종양 크기, 감소된 말초 기관 내로의 암 세포 침윤 속도, 감소된 종양 전이 또는 종양 성장 속도, 또는 무진행 생존을 의미한다. 암에서의 양성 치료 효과는 다수의 방식으로 측정될 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Null. Med. 50: 1S-10S (2009); Eisenhauer et al., 상기 문헌] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조합 요법에 대한 항종양 반응은 RECIST 1.1 기준, 2차원 irRC, 또는 1차원 irRC를 사용하여 평가된다. 일부 실시양태에서, 항종양 반응은 SD, PR, CR, PFS, 또는 DFS 중 임의의 것이다.

"2차원 irRC"는 문헌 [Wolchok JD, et al. Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin Cancer Res. 2009;15(23):7412-7420]에 기재된 기준 세트를 지칭한다. 이들 기준은 각 병변의 가장 긴 직경 및 가장 긴 수직 직경을 곱함 (cm²)으로써 입수된 표적 병변의 2차원 종양 측정값을 이용한다.

"생물요법제"는 종양 유지 및/또는 성장을 지지하거나 또는 항종양 면역 반응을 억제하는 임의의 생물학적 경로 내의 리간드 / 수용체 신호전달을 차단하는 생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 융합 단백질을 의미한다. 생물요법제의 부류는 VEGF, EGFR, Her2/neu, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, 및 ICOS에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "암", "암성", 또는 "악성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 조건을 지칭 또는 기재한다. 암의 예는: 심장: 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성 암종 (편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암종), 폐포 (세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골성 과오종, 중피종; 위장: 식도 (편평 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위 (암종, 림프종, 평활근육종), 췌장 (관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, VIP종), 소장 (선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암종, 관상 선종, 융모성 선종, 과오종, 평활근종) 결장직장; 비뇨생식기: 신장 (선암종, 윌름스 종양 [신모세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도 (편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아성 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선종양 종양, 지방종); 간: 간세포암 (간세포성 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골: 골원성 육종 (골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉육종, 악성 림프종 (세망 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 골연골종 (골연골성 외골종), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종 및 거대 세포 종양; 신경계: 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배세포종 [송과체종], 다형성 교모세포종, 핍지교종, 슈반세포종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁 (자궁내막 암종), 자궁경부 (자궁경부 암종, 종양 전 자궁경부 이형성증), 난소 (난소 암종 [장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종], 과립막 난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양, 미분화배세포종, 악성 기형종), 외음부 (편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상 육종 (배아성 횡문근육종), 난관 (암종), 유방; 혈액: 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성], 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비 호지킨 림프종 [악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 및 부신: 신경모세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종, 및 육종이다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 위장 (관) 암, 신암, 난소암, 간암, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암을 포함한다. 암의 또 다른 특정한 예는 신세포 암종을 포함한다. 암의 또 다른 특정한 예는 비-호지킨 림프종 또는 피부 T- 세포 림프종이다. 암의 또 다른 특정한 예는 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 골수이형성 증후군이다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 검정된 조직 샘플에서의 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 다의 상승된 발현을 특징으로 하는 것들을 포함한다.

"CpG-C ON" 또는 "CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드"는 12 내지 100개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드이며, 이는 5'-T가 올리고뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 0, 1, 2, 또는 3개 염기에 위치되는 것인 하나 이상의 5'-TCG 트리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 비메틸화된 CG 디뉴클레오티드를 포함하는 적어도 8개 염기 길이의 적어도 하나의 회문식 서열을 갖는다. 하나 이상의 5'-TCG 트리뉴클레오티드 서열은 회문식 서열의 5'-말단으로부터 0, 1, 또는 2개 염기만큼 분리될 수 있거나 또는 회문식 서열은 하나 이상의 5'-TCG 트리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2'-올리고데옥시뉴클레오티드이다. CpG-C ODN은 B 세포를 자극하고, 형질세포양 수지상 세포 (PDC) 성숙을 유도하고 높은 수준의 제I형 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-γ 등)의 분비를 유발하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, CpG-C ODN은 12 내지 100개 염기 길이이거나, 바람직하게는 12 내지 50개 염기 길이이거나, 바람직하게는 12 내지 40개 염기 길이이거나, 또는 바람직하게는 12-30개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, ODN은 적어도 (하한치) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, ODN은 최대 (상한치) 100, 90, 80, 70, 60, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 또는 30개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 회문식 서열은 8 내지 97개 염기 길이이거나, 바람직하게는 8 내지 50개 염기 길이이거나 또는 바람직하게는 8 내지 32개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 회문식 서열은 적어도 (하한치) 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 회문식 서열은 최대 (상한치) 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12 또는 10개 염기 길이이다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, CpG-C ODN의 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 연결이다. 한 실시양태에서, CpG-C ODN의 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 (PS) 연결이다. 한 실시양태에서, CpG-C ODN의 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 (PS) 연결이다. 포스포로티오에이트 백본은 CpG-C ODN의 모든 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 (PS) 연결인 것을 지칭한다.

본원에서 논의되는 CpG-C 유형 ODN 및 서열식별번호: 38-51은 달리 나타내지 않는 한 그의 제약상 허용되는 염 형태로 존재한다. 예시적인 염기성 염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염 예컨대 나트륨, 리튬, 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염 예컨대 칼슘 및 마그네슘 염, 아연 염, 유기 염기 (예를 들어, 유기 아민)와의 염 예컨대 N-Me-D-글루카민, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 콜린, 트로메타민, 디시클로헥실아민, t-부틸 아민, 및 아미노산 예컨대 아르기닌, 리신과의 염 등을 포함한다. 한 실시양태에서, CpG-C 유형 ODN은 암모늄, 나트륨, 리튬, 또는 칼륨 염 형태로 존재한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, CpG-C 유형 ODN은 나트륨 염 형태로 존재한다. CpG-C ODN은 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 용액 중에 제공될 수 있다. 대안적으로, CpG-C ODN은 동결건조된 고체로서 제공될 수 있으며, 이는 투여 전에 멸균수, 염수 또는 제약상 허용되는 완충제 중에서 후속적으로 재구성된다.

본 개시내용의 제약상 허용되는 부형제는 예를 들어, 용매, 벌킹제, 완충제, 장성 조정제, 및 보존제를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Pramanick et al., Pharma Times, 45:65-77, 2013] 참조). 일부 실시양태에서 제약 조성물은 용매, 벌킹제, 완충제, 및 장성 조정제 중 하나 이상으로서 기능하는 부형제를 포함할 수 있다 (예를 들어, 염수 중 염화나트륨은 수성 비히클 및 장성 조정제 둘 다로서의 역할을 할 수 있음). 본 개시내용의 제약 조성물은 비경구 투여를 위해 적합하다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 용매로서 수성 비히클을 포함한다. 적합한 비히클은 예를 들어 멸균수, 염수 용액, 포스페이트 완충 염수, 및 링거액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 등장성이다.

제약 조성물은 벌킹제를 포함할 수 있다. 벌킹제는 제약 조성물이 투여 전에 동결건조될 경우에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 벌킹제는 동결 또는 분무 건조 동안 및/또는 저장 동안 활성제의 안정화 및 분해의 방지에서 보조하는 보호제이다. 적합한 벌킹제는 당 (모노-, 디- 및 폴리사카라이드) 예컨대 수크로스, 락토스, 트레할로스, 만니톨, 소르비탈, 글루코스 및 라피노스이다.

제약 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 pH를 제어하여 가공, 저장, 및 임의로는 재구성 동안 활성제의 분해를 억제한다. 적합한 완충제는 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 술페이트를 포함하는 염을 포함한다. 다른 적합한 완충제는 예를 들어 아미노산 예컨대 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 및 리신을 포함한다. 완충제는 염산 또는 수산화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제는 조성물의 pH를 4 내지 9의 범위 내로 유지한다. 일부 실시양태에서, pH는 (하한치) 4, 5, 6, 7 또는 8 초과이다. 일부 실시양태에서, pH는 (상한치) 9, 8, 7, 6 또는 5 미만이다. 즉, pH는 하한치가 상한치 미만인 약 4 내지 9의 범위이다.

제약 조성물은 장성 조정제를 포함할 수 있다. 적합한 장성 조정제는 예를 들어 덱스트로스, 글리세롤, 염화나트륨, 글리세린 및 만니톨을 포함한다.

제약 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어 항산화제 및 항미생물제를 포함한다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 상태 하에서 제조되고 단일 사용 용기에 존재하고, 따라서 보존제의 포함을 필요로 하지 않는다.

용어 "회문식 서열" 또는 "회문"은 역위 반복인 핵산 서열, 예를 들어 ABCDD'C'B'A'에서, 염기 예를 들어, A 및 A', B 및 B', C 및 C', D 및 D'가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 지칭한다. 이러한 서열은 단일-가닥일 수 있거나 또는 이중-가닥 구조를 형성할 수 있거나 또는 일부 조건 하에 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 "8개 염기 회문"은 회문식 서열이 8개 염기 길이인 핵산 서열, 예컨대 ABCDD'C'B'A'를 지칭한다. 회문식 서열은 또한 비-회문식 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 부분일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 회문식 서열 부분 및 하나 이상의 비-회문식 서열 부분을 함유할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 서열은 완전히 회문식일 수 있다. 하나 초과의 회문식 서열 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드에서, 회문식 서열 부분은 서로 중첩되거나 또는 중첩되지 않을 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 CpG-C ODN은

(a) N이 뉴클레오시드이고, x = 0, 1, 2 또는 3이고, y = 1, 2, 3 또는 4이고, w = 0, 1 또는 2이고, p= 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v= 0 내지 89이고 z = 1 내지 20이고, X₁ 및 X₁'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, (TCG(N_q))_y 서열의 5'-T가 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 0-3개 염기에 있는 것인 5'-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z,N_v (서열식별번호: 38); 및

(b) 적어도 8개 염기 길이의 회문식 서열이며 (X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z (서열식별번호: 56) 서열의 처음 (X₁X₂CGX₂'X₁') (서열식별번호: 55)을 포함하는 회문식 서열을 포함하고, 여기서 ODN은 12 내지 100개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, x = 0이고, y = 1이고, w = 0이고, p= 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v=0 내지 20이고 z = 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 실시양태에서, X₁ 및 X₂는 각각 A 또는 T이다. 일부 실시양태에서, 회문식 서열은 1/3 초과의 A 및 T의 염기 조성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CpG-C ODN은 서열식별번호: 38-51로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CpG-C ODN은 TCGN_q(X₁X₂CGX₂'X₁'CG)_zN_v (서열식별번호: 39)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, v=0 내지 20이고, z= 1 내지 4이고, X₁ 및 X₁'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, ODN은 적어도 12개 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, CpG-C ODN은 서열식별번호: 38-51로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CpG-C ODN은

5'-TCGN_qTTCGAACGTTCGAACGTTN_s-3' (서열식별번호: 40)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, s = 0 내지 20이고, ODN은 적어도 12개 염기 길이이다. 한 실시양태에서, s = 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 일부 실시양태에서, CpG-C ODN은

로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다.

한 실시양태에서, TLR9 효능제는 서열 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 CpG-C ODN이다. 또 다른 실시양태에서, CpG-C ODN은 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)의 나트륨 염이다. 추가 실시양태에서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)로 이루어진 서열을 갖는다. 추가 실시양태에서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)의 나트륨 염이다.

또 다른 실시양태에서, TLR9 효능제 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는

로 이루어진 군으로부터 선택된다.

표 1 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드의 모티프 및 서열

본원에 기재된 화학식 또는 서열 모티프와 관련하여, 임의의 및 모든 파라미터가 독립적으로 선택된다는 것은 이해된다. 예를 들어, x=0-2인 경우, y는, 총 올리고뉴클레오티드 길이 제한이 충족되는 한, x의 값 (또는 화학식에서의 임의의 다른 선택가능한 파라미터)에 관계없이 독립적으로 선택될 수 있다.

본 개시내용의 모티프에 의해 포괄된 서열을 갖는 추가의 CpG-C 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 방법 및 의약에 사용하기에 적합하다. 본 개시내용의 모티프에 의해 포괄된 서열을 갖는 복수의 추가의 CpG-C 올리고뉴클레오티드는 디나박스 테크놀로지스 코포레이션(Dynavax Technologies Corporation)의 미국 특허 번호 7,745,606, 8,158,768, 및 8,871,732에 기재되어 있다. 이들 서열은 본원에 참조로 포함된다.

CpG 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에서 기재되어 왔고 그의 활성은, 면역 반응의 다양한 측면 (예를 들어, 시토카인 분비, 항체 생산, NK 세포 활성화, B 세포 증식, T 세포 증식 등)을 측정하는 표준 검정을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275, WO 98/55495 및 WO 00/61151 뿐만 아니라, 디나박스 테크놀로지스 코포레이션의 미국 특허 번호 7,745,606, 8,158,768, 및 8,871,732에 기재되어 있다. 따라서, 이들 및 다른 방법은 CpG 올리고뉴클레오티드의 면역조정 활성을 검출하고 정량화하는 데 사용될 수 있다.

CpG-C 올리고뉴클레오티드는 변형을 함유할 수 있다. 적합한 변형은, 3'OH 또는 5'OH 기의 변형, 뉴클레오티드 염기의 변형, 당 성분의 변형, 및 포스페이트 기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 변형된 염기는 변형된 염기(들)가 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통해 그의 천연 상보성에 대한 동일한 특이성을 유지하는 한 회문식 서열에 포함될 수 있다 (예를 들어, CpG-C 올리고뉴클레오티드의 회문식 부분은 자기-상보적으로 유지됨).

CpG-C 올리고뉴클레오티드는 선형일 수 있거나, 원형일 수 있거나 또는 원형 부분 및/또는 헤어핀 루프를 포함한다. CpG-C 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. CpG-C 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다.

CpG-C 올리고뉴클레오티드는 자연 발생 또는 변형된, 비-자연 발생 염기를 함유할 수 있고, 변형된 당, 포스페이트, 및/또는 말단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 연결 이외에도, 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 (가교 또는 비-가교), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-C 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결 단독, 포스포디에스테르 연결 단독, 또는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결의 조합을 갖는다.

관련 기술분야에 공지된 당 변형, 예컨대 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라 및 본원에 기재된 다른 것이 또한 제조되고 임의의 포스페이트 변형과 조합될 수 있다. 염기 변형의 예는 CpG-C 올리고뉴클레오티드의 시토신 (예를 들어, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-아이오도시토신)의 C-5 및/또는 C-6에 대한 전자-끄는 모이어티의 첨가 및 CpG-C 올리고뉴클레오티드의 우라실 (예를 들어, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-아이오도우라실)의 C-5 및/또는 C-6에 대한 전자-끄는 모이어티의 첨가를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 바와 같이, CpG-C 올리고뉴클레오티드의 회문식 서열에서의 염기 변형의 사용은 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 위해 수반된 염기의 자기-상보성을 방해하여서는 안 된다. 그러나, 회문식 서열의 외부에서, 변형된 염기는 이러한 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 2'-O-메틸-우리딘 및 2'-O-메틸-시티딘은 회문식 서열의 외부에서 사용될 수 있는 반면에, 5-브로모-2'-데옥시시티딘은 회문식 서열 내부 및 외부 둘 다에서 사용될 수 있다. 회문식 서열의 내부 및 외부 둘 다에서 사용될 수 있는 다른 변형된 뉴클레오티드는 7-데아자-8-아자-dG, 2-아미노-dA, 및 2-티오-dT를 포함한다.

대부분의 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 (즉, 이중 가닥) 및 헤어핀 형태는 동적 평형에 있으며, 헤어핀 형태는 일반적으로 낮은 올리고뉴클레오티드 농도 및 보다 높은 온도에서 선호된다. 공유 가닥간 또는 가닥내 가교는, 열-, 이온-, pH-, 및 농도-유도된 입체형태적 변화에 대해, 각각 듀플렉스 또는 헤어핀 안정성을 증가시킨다. 화학적 가교는 물리화학적 및 생물학적 특징화를 위해 폴리뉴클레오티드를 듀플렉스 또는 헤어핀 형태로 고정시키는 데 사용될 수 있다. 입체형태적으로 균질하고 그의 가장 활성인 형태 (듀플렉스 또는 헤어핀 형태)로 "고정된" 가교된 올리고뉴클레오티드는 잠재적으로 그의 비가교된 대응물보다 더 활성일 수 있었다. 따라서, 본 개시내용의 일부 CpG-C 올리고뉴클레오티드는 공유 가닥간 및/또는 가닥내 가교를 함유한다.

듀플렉스 DNA를 화학적으로 가교시키는 다양한 방식은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 가교 방법은 가교된 폴리뉴클레오티드 생성물이 원하는 면역조정 활성을 보유하는 한 사용될 수 있다. 한 방법은, 예를 들어, 듀플렉스 또는 헤어핀의 말단에서 2개의 대향하는 티미딘 사이에 디술피드 가교를 생성한다. 이러한 가교 방법의 경우, 관심 올리고뉴클레오티드(들)는 5'-DMT-N3-(tBu-SS-에틸)티미딘-3'-포스포르아미다이트 ("T*")로 합성된다. 디술피드 가교를 형성하기 위해, 혼합된 디술피드 결합은 감소되고, 올리고뉴클레오티드는 정제되고, 가닥은 혼성화되고 화합물은 공기-산화되어 헤어핀 형태의 경우 가닥내 가교 또는 듀플렉스 형태의 경우 가닥간 가교를 형성한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 먼저 혼성화되고 이어서 감소되고, 정제되고 공기 산화될 수 있다. 이러한 방법 및 다른 것은 관련 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Glick et al., J Org Chem, 56:6746-6747, 1991, Glick et al., J Am Chem Soc, 114:5447-5448, 1992, Goodwin et al., Tetrahedron Letters 35:1647-1650, 1994, Wang et al., J Am Chem Soc, 117:2981-2991, 1995, Osborne et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6:2339-2342, 1996 및 Osborne et al., J Am Chem Soc, 118:11993-12003, 1996] 참조).

또 다른 가교 방법은 듀플렉스 또는 헤어핀 구조에서 상쇄된 잔기 사이에 디술피드 가교를 형성한다. 이러한 가교 방법의 경우, 관심 올리고뉴클레오티드(들)는 전환가능한 뉴클레오시드 (예를 들어, 글렌 리서치(Glen Research)로부터 상업적으로 입수가능함)로 합성된다. 이러한 방법은, 예를 들어, A-A 디술피드 또는 C-A 디술피드 가교를 이용하고 다른 염기를 통한 연결이 또한 가능하다. 디술피드-변형된 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해, 전환가능한 뉴클레오시드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 시스타민 (또는 다른 디술피드-함유 아민)과 반응된다. 디술피드 가교를 형성하기 위해, 혼합된 디술피드 결합은 감소되고, 올리고뉴클레오티드는 정제되고, 가닥은 혼성화되고 화합물은 공기-산화되어 헤어핀 형태의 경우 가닥내 가교 또는 듀플렉스 형태의 경우 가닥간 가교를 형성한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 먼저 혼성화되고 이어서 감소되고, 정제되고 공기-산화될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ferentz et al., J Am Chem Soc, 113:4000-4002, 1991, 및 Ferentz et al., J Am Chem Soc, 115:9006-9014, 1993] 참조).

폴리뉴클레오티드 및 변형된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 포스포디에스테르 연결을 함유하는 자연 발생 DNA 또는 RNA는 일반적으로 적절한 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 3'-말단에서 고체 지지체에 부착된 성장하는 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시 기에 순차적으로 커플링시킨 후, 중간체 포스파이트 트리에스테르의 포스페이트 트리에스테르로의 산화에 의해 합성된다. 일단 원하는 폴리뉴클레오티드 서열이 합성되면, 폴리뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 포스페이트 트리에스테르 기는 포스페이트 디에스테르로 탈보호되고 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다 (예를 들어, 문헌 [Beaucage "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ, 1993; Warner et al., DNA 3:401, 1984] 및 미국 특허 번호 4,458,066 참조).

CpG-C 올리고뉴클레오티드는 포스페이트-변형된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 그의 일부는 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태는 안정화된 CpG-C 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 포스페이트 연결 또는 비-포스페이트 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Matteucci "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY, 1997] 참조). 올리고뉴클레오티드에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등일 수 있다. 상기-언급된 포스페이트 유사체의 제조 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드로의 그의 혼입은 이미 그 자체로 널리 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Peyrottes et al., Nucleic Acids Res, 24:1841-1848, 1996; Chaturvedi et al., Nucleic Acids Res, 24:2318-2323, 1996; 및 Schultz et al., Nucleic Acids Res, 24:2966-2973, 1996] 참조). 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성은 산화 단계가 황화 단계에 의해 대체된다는 것을 제외하고는 자연 발생 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 기재된 것과 유사하다 (Zon "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190, 1993).

CpG-C 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 (단독 또는 주요 당 성분으로서 리보스 함유), 데옥시리보뉴클레오티드 (주요 당 성분으로서 데옥시리보스 함유), 변형된 당 또는 당 유사체를 포함할 수 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 이외에도, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 및 당 유사체 시클로펜틸 기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태로 존재할 수 있다. CpG-C 올리고뉴클레오티드에서, 당 모이어티는 바람직하게는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보오스의 푸라노시드이고, 당은 각 헤테로시클릭 염기에 아노머 배위로 부착될 수 있다. 당 변형은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, CpG-C 올리고뉴클레오티드에서의 당 변형은 2'-O-메틸-우리딘 및 2'-O-메틸-시티딘을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 당 또는 당 유사체 및 이러한 당 또는 유사체가 그 자체로 헤테로시클릭 염기 (핵산 염기)에 부착되는 각 뉴클레오시드의 제조는 공지되어 있고, 따라서 여기서 기재될 필요는 없다. 당 변형은 또한 CpG-C 올리고뉴클레오티드의 제조에서 제조되고 임의의 포스페이트 변형과 조합될 수 있다.

CpG-C 올리고뉴클레오티드에 혼입된 헤테로시클릭 염기, 또는 핵산 염기는 자연 발생 주요 퓨린 및 피리미딘 염기 (즉 상기 언급된 바와 같은 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 뿐만 아니라, 상기 주요 염기의 자연 발생 및 합성 변형일 수 있다. 따라서, CpG-C 올리고뉴클레오티드는 이노신, 2'-데옥시우리딘 및 2-아미노-2'-데옥시아데노신 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

"CBR" 또는 "임상 이익률"은 CR + PR + 지속적인 SD를 의미한다.

본원에 사용된 "CDR" 또는 "CDR들"은, 달리 나타내지 않는 한, 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 정의된 이뮤노글로불린 가변 영역에서의 상보성 결정 영역(들)을 의미한다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 부류는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 알킬화제, 항대사물, 키나제 억제제, 방추체 독 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 광증감제, 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 항-프로게스테론, 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD), 에스트로겐 수용체 길항제, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 효능제, 항안드로겐, 아로마타제 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제 및 비정상 세포 증식 또는 종양 성장에 연루된 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드. 본 발명의 치료 방법에 유용한 화학요법제는 세포증식억제제 및/또는 세포독성제를 포함한다.

본원에 사용된 "코티아"는 문헌 [Al-Lazikani et al., JMB 273: 927-948 (1997)]에 기재된 항체 넘버링 시스템을 의미한다.

"포함하는" 또는 변형 예컨대 "포함하다", "포함한다" 또는 "로 구성된다"는 언어 또는 필요한 함축을 표현하기 위해 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 포괄적인 의미로, 즉 언급된 특색의 존재를 명시하지만, 임의의 본 발명의 실시양태의 작용 또는 유용성을 실질적으로 증진시킬 수 있는 추가적인 특색의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 단백질 내의 아미노산을, 유사한 특징 (예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하여, 단백질의 생물학적 활성 또는 다른 목적하는 특성, 예컨대 항원 친화도 및/또는 특이성을 변경시키지 않으면서 변화가 빈번하게 이루어질 수 있도록 하는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수 영역 내 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 게다가, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다. 예시적인 보존적 치환은 하기 표 2에 제시된다.

표 2. 예시적인 보존적 아미노산 치환

명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 "로 본질적으로 이루어진다", 및 변형 예컨대 "로 본질적으로 이루어지다" 또는 "로 본질적으로 이루어진"은 임의의 열거된 요소 또는 요소 군의 포함, 및 명시된 투여 요법, 방법, 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 실질적으로 변화시키지 않는, 열거된 요소 이외의 유사한 또는 상이한 특성의 다른 요소의 임의적인 포함을 나타낸다. 비-제한적인 예로서, 열거된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 PD-1 길항제는 또한 결합 화합물의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는, 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

"DCR" 또는 "질환 제어율"은 CR + PR + SD를 의미한다.

"진단 항-PD-L 모노클로날 항체"는 특정 포유동물 세포의 표면 상에서 발현되는 성숙 형태의 지정된 PD-L (PD-L1 또는 PD-L2)에 특이적으로 결합하는 mAb를 의미한다. 성숙 PD-L은, 리더 펩티드로 또한 지칭되는 분비전 리더 서열이 결여되어 있다. 용어 "PD-L" 및 "성숙 PD-L"은 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 용이하게 명백하지 않는 한 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 동일한 분자를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 진단 항-인간 PD-L1 mAb 또는 항-hPD-L1 mAb는 성숙 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 지칭한다. 성숙 인간 PD-L1 분자는 하기 서열의 아미노산 19-290으로 이루어진다:

포르말린-고정, 파라핀-포매 (FFPE) 종양 조직 절편에서의 PD-L1 발현의 면역조직화학 (IHC) 검출을 위한 진단 mAb로서 유용한 진단 항-인간 PD-L1 mAb의 구체적 예는 2013년 12월 18일에 출원되고 2014년 6월 26일에 WO2014/100079로 공개된 공동계류 중인 국제 특허 출원 PCT/US13/075932에 기재된 항체 20C3 및 항체 22C3이다. FFPE 조직 절편에서의 PD-L1 발현의 IHC 검출에 유용한 것으로 보고된 바 있는 또 다른 항-인간 PD-L1 mAb (Chen, B.J. et al., Clin Cancer Res 19: 3462-3473 (2013))는 시노 바이올로지칼, 인크.(Sino Biological, Inc.) (중국 베이징; 카탈로그 번호 10084-R015)로부터 공중 이용가능한 토끼 항-인간 PD-L1 mAb이다.

"항-IL-10 항체"는 IL-10에 결합하여 IL-10의 활성을 억제하는 길항제 항체를 의미한다. IL-10에 대한 대안적 명칭 또는 동의어는 인터류킨-10, 시토카인 합성 억제제 인자 또는 CSIF를 포함한다. 인간 IL-10 아미노산 서열은 미국 특허 6217857에서 발견될 수 있다. 성숙 인간 IL-10 단백질의 아미노산 서열은

이다.

본 발명의 임의의 치료 방법, 의약 및 용도에 유용한 항-IL-10 항체는, IL-10에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 IL-10에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (mAb) 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. mAb는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')₂, scFv 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 일부 바람직한 실시양태에서, 항-IL-10 항체는 (a) 항-IL-10 hum12G8의 서열식별번호: 26, 27 및 28의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 29, 30 및 31의 중쇄 CDR을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 다른 바람직한 실시양태에서, 항-IL-10 항체는 인간 IL-10에 특이적으로 결합하고 (a) 서열식별번호: 32를 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 그의 변이체, 및 (b) 서열식별번호: 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 그의 변이체를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 중쇄 가변 영역 서열의 변이체는 프레임워크 영역 (즉, CDR의 외부)에 17개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 프레임워크 영역에 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다. 경쇄 가변 영역 서열의 변이체는 프레임워크 영역 (즉, CDR의 외부)에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 프레임워크 영역에 4, 3 또는 2개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다.

하기 표 3은 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에 사용하기 위한 예시적인 항-IL-10 mAb의 아미노산 서열의 목록을 제공하고, 서열은 도 8-9에 제시된다.

본원에서 사용된 "항-IL-10 hum 12G8 변이체"는 경쇄 CDR 외부에 위치하는 위치에서의 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환 및 중쇄 CDR 외부에 위치하는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는, 항-IL-10 hum 12G8에서의 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고, 예를 들어, 변이체 위치는 FR 영역 또는 불변 영역 내에 위치한다. 다시 말해서, 항-IL-10 hum 12G8 및 항-IL-10 hum 12G8 변이체는 동일한 CDR 서열을 포함하지만, 각각 그의 전장 경쇄 및 중쇄 서열 내의 3 또는 6개 이하의 다른 위치에 보존적 아미노산 치환을 갖기 때문에 서로 상이하다. 항-IL-10 hum 12G8 변이체는 하기 특성과 관련하여 항-IL-10 hum 12G8과 실질적으로 동일하다: IL-10에 대한 결합 친화도 및 생체내 중화 효과.

"DSDR" 또는 "지속적인 안정 질환율"은 ≥ 23주 동안의 SD를 의미한다.

본원에 사용된 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 CDR 영역을 제외한 이뮤노글로불린 가변 영역을 의미한다.

본원에 사용된 "카바트"는 엘빈 에이. 카바트(Elvin A. Kabat)에 의해 개척된 이뮤노글로불린 정렬 및 넘버링 시스템을 의미한다 ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

본원에 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는, 실질적으로 동종인 항체의 집단을 지칭하고, 즉 집단을 포함하는 항체 분자는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열에서 동일하다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로, 상이한 에피토프에 대해 종종 특이적인 그의 가변 도메인, 특히 그의 CDR에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득됨에 따른 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]을 참조한다.

"비-반응자 환자"는, 본원에 기재된 조합 요법으로의 치료에 대한 특정 항종양 반응을 지칭하는 경우, 환자가 항종양 반응을 나타내지 않았다는 것을 의미한다.

"ORR" 또는 "객관적 반응률"은 일부 실시양태에서 CR + PR을 지칭하고, ORR_(제24주)은 펨브롤리주맙과 조합된 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드로의 치료 24주 후에 코호트에서 각각의 환자에서 irRECIST를 사용하여 측정된 CR 및 PR을 지칭한다.

"환자" 또는 "대상체"는 요법이 요구되거나 또는 임상 검정, 역학적 연구에 참여 중이거나 또는 대조군으로서 사용되는 임의의 단일 대상체를 지칭하며 인간 및 포유동물 수의학적 환자, 예컨대 소, 말, 개, 및 고양이를 포함한다.

"PD-1 길항제"는 암 세포 상에서 발현되는 PD-L1이 면역 세포 (T 세포, B 세포 또는 NKT 세포) 상에서 발현되는 PD-1에 결합하는 것을 차단하고, 바람직하게는 암 세포 상에서 발현되는 PD-L2가 면역 세포 발현된 PD-1에 결합하는 것을 또한 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. PD-1 및 그의 리간드에 대한 대안적 명칭 또는 동의어는 하기를 포함한다: PD-1에 대하여 PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2; PD-L1에 대하여 PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H; 및 PD-L2에 대하여 PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273. 인간 개체를 치료하는 본 발명의 임의의 치료 방법, 의약 및 용도에서, PD-1 길항제는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하고, 바람직하게는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 차단한다. 인간 PD-1 아미노산 서열은 NCBI 로커스 번호 NP_005009에서 찾아볼 수 있다. 인간 PD-L1 및 PD-L2 아미노산 서열은 각각 NCBI 로커스 번호 NP_054862 및 NP_079515에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 임의의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (mAb), 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. mAb는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')₂, scFv 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

인간 PD-1에 결합하고, 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 mAb의 예는 US7488802, US7521051, US8008449, US8354509, US8168757, WO2004/004771, WO2004/072286, WO2004/056875, 및 US2011/0271358에 기재되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정 항-인간 PD-1 mAb는 하기를 포함한다: 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)]에 기재된 구조를 갖고 도 6에 제시된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간화 IgG4 mAb인 펨브롤리주맙 (또한 MK-3475로 공지됨); 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 1, pages 68-69 (2013)]에 기재된 구조를 갖고 도 7에 제시된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간화 IgG4 mAb인 니볼루맙 (BMS-936558); WO2008/156712에 기재된 인간화 항체 h409A11, h409A16 및 h409A17 및 메드이뮨(MedImmune)에 의해 개발 중인 AMP-514.

인간 PD-L1에 결합하고, 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 mAb의 예는 WO2013/019906, W02010/077634 A1 및 US8383796에 기재되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정 항-인간 PD-L1 mAb는 MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C, 및 WO2013/019906의 각각 서열식별번호: 24 및 서열식별번호: 21의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 다른 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이뮤노어드헤신, 예를 들어, 이뮤노글로불린 분자의 불변 영역 예컨대 Fc 영역에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 함유하는 융합 단백질을 포함한다. PD-1에 특이적으로 결합하는 면역부착 분자의 예는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정 융합 단백질은 PD-L2-FC 융합 단백질이고 인간 PD-1에 결합하는 AMP-224 (또한 B7-DCIg로서 공지됨)를 포함한다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 일부 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 (a) 경쇄 CDR 서열식별번호: 1, 2 및 3 및 중쇄 CDR 서열식별번호: 4, 5 및 6; 또는 (b) 경쇄 CDR 서열식별번호: 7, 8 및 9 및 중쇄 CDR 서열식별번호: 10, 11 및 12를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 다른 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고 (a) 서열식별번호: 13 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (b) 서열식별번호: 15 또는 그의 변이체; 서열식별번호: 16 또는 그의 변이체; 및 서열식별번호: 17 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 중쇄 가변 영역 서열의 변이체는 프레임워크 영역 (즉, CDR의 외부)에 17개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 프레임워크 영역에 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다. 경쇄 가변 영역 서열의 변이체는 프레임워크 영역 (즉, CDR의 외부)에 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 프레임워크 영역에 4, 3 또는 2개 미만의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일하다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 또 다른 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고 (a) 서열식별번호: 14를 포함하는 중쇄 및 (b) 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도의 또 다른 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고 (a) 서열식별번호: 14를 포함하는 중쇄 및 (b) 서열식별번호: 18을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체이다.

상기 모든 치료 방법, 의약 및 용도에서, PD-1 길항제는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하고, 바람직하게는 PD-1에 대한 PD-L2의 결합을 또한 억제한다. 상기 치료 방법, 의약 및 용도의 일부 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이고, 여기서 중쇄 및 경쇄는 도 6에 제시된 아미노산 서열 (서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22)을 포함한다.

하기 표 4는 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 사용하기 위한 예시적인 항-PD-1 mAb의 아미노산 서열의 목록을 제공하고, 서열은 도 1-5에 제시된다.

표 5는 서열 목록 내의 PD-1 길항제 서열의 간단한 설명을 제공한다.

본원에 사용된 "PD-L1" 또는 "PD-L2" 발현은 세포 표면 상의 지정된 PD-L 단백질의 또는 세포 또는 조직 내에서의 지정된 PD-L mRNA의 임의의 검출가능한 수준의 발현을 의미한다. PD-L 단백질 발현은 종양 조직 절편의 IHC 검정에서의 진단 PD-L 항체로 또는 유동 세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 종양 세포에 의한 PD-L 단백질 발현은 목적하는 PD-L 표적, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2에 특이적으로 결합하는 결합제 (예를 들어, 항체 단편, 아피바디 등)를 사용하여 PET 영상화에 의해 검출될 수 있다. PD-L mRNA 발현을 검출하고 측정하기 위한 기술은 RT-PCR 및 실시간 정량적 RT-PCR을 포함한다.

종양 조직 절편의 IHC 검정에서 PD-L1 단백질 발현을 정량화하기 위한 여러 접근법이 기재된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Thompson, R. H., et al., PNAS 101 (49); 17174-17179 (2004); Thompson, R. H. et al., Cancer Res. 66:3381-3385 (2006); Gadiot, J., et al., Cancer 117:2192-2201 (2011); Taube, J. M. et al., Sci Transl Med 4, 127ra37 (2012); 및 Toplian, S. L. et al., New Eng. J Med. 366 (26): 2443-2454 (2012)]을 참조한다.

하나의 접근법은 PD-L1 발현에 대해 양성 또는 음성인 단순한 이원 종점을 사용하며, 양성 결과는 세포-표면 막 염색의 조직학적 증거를 나타내는 종양 세포의 백분율의 관점에서 정의된다. PD-L1 발현이 총 종양 세포의 적어도 1%, 및 바람직하게는 5%인 경우, 종양 조직 절편은 양성인 것으로 계수된다.

또 다른 접근법에서, 종양 조직 절편에서의 PD-L1 발현은 종양 세포 뿐만 아니라 림프구를 우세하게 포함하는 침윤 면역 세포에서 정량화된다. 막 염색을 나타내는 종양 세포 및 침윤 면역 세포의 백분율은 개별적으로 < 5%, 5 내지 9%, 및 이후 10% 증분으로 100%까지 정량화된다. 종양 세포의 경우, PD-L1 발현은 스코어가 < 5% 스코어인 경우 음성, 및 스코어가 ≥ 5%인 경우 양성으로 계수된다. 면역 침윤물에서의 PD-L1 발현은 보정된 염증 스코어 (AIS)로 불리는 반-정량적 측정으로서 보고되며, 이는 없음 (0), 경도 (스코어 1, 희귀 림프구), 중등도 (스코어 2, 림프조직구성 응집체에 의한 종양의 초점성 침윤), 또는 심함 (스코어 3, 미만성 침윤)으로서 등급화되는 침윤물의 강도를 막 염색 세포의 퍼센트에 곱함으로써 결정된다. 종양 조직 절편은 AIS가 ≥ 5인 경우 면역 침윤물에 의해 PD-L1 발현에 대해 양성인 것으로 계수된다.

PD-L mRNA 발현의 수준은 정량적 RT-PCR에 빈번하게 사용되는 1종 이상의 참조 유전자, 예컨대 유비퀴틴 C의 mRNA 발현 수준과 비교될 수 있다.

일부 실시양태에서, 악성 세포에 의한 및/또는 종양 내의 침윤 면역 세포에 의한 PD-L1 발현 (단백질 및/또는 mRNA)의 수준은 적절한 대조군에 의한 PD-L1 발현 (단백질 및/또는 mRNA)의 수준과의 비교에 기초하여 "과다발현된" 또는 "상승된" 것으로 결정된다. 예를 들어, 대조군 PD-L1 단백질 또는 mRNA 발현 수준은 동일한 유형의 비-악성 세포에서 또는 매칭된 정상 조직으로부터의 절편에서 정량화된 수준일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 종양 샘플에서의 PD-L1 발현은 샘플에서의 PD-L1 단백질 (및/또는 PD-L1 mRNA)이 대조군에서보다 적어도 10%, 20%, 또는 30% 더 큰 경우에 상승된 것으로 결정된다.

본원에 사용된 "펨브롤리주맙 변이체"는 경쇄 CDR 외부에 위치하는 위치에 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환 및 중쇄 CDR 외부에 위치한 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는, 펨브롤리주맙에서의 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고, 예를 들어, 변이체 위치는 FR 영역 또는 불변 영역 내에 위치한다. 다시 말해서, 펨브롤리주맙 및 펨브롤리주맙 변이체는 동일한 CDR 서열을 포함하지만, 각각 이들의 전장 경쇄 및 중쇄 서열 내의 3 또는 6개 이하의 다른 위치에 보존적 아미노산 치환을 갖기 때문에 서로 상이하다. 펨브롤리주맙 변이체는 하기 특성과 관련하여 펨브롤리주맙과 실질적으로 동일하다: PD-1에 대한 결합 친화도 및 PD-1에 대한 각 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 차단하는 능력.

본원에 사용된 "RECIST 1.1 반응 기준"은 적절하게는 반응이 측정되고 있는 맥락에 기초하여, 표적 병변 또는 비표적 병변에 대해 문헌 [Eisenhauer et al., E.A. et al., Eur. J Cancer 45:228-247 (2009)]에 제시된 정의를 의미한다.

"반응자 환자"는, 본원에 기재된 조합 요법으로의 치료에 대한 특정 항종양 반응을 지칭하는 경우, 환자가 항종양 반응을 나타내었다는 것을 의미한다.

"지속 반응"은 치료제 또는 본원에 기재된 조합 요법으로의 치료의 중지 후의 지속되는 치료 효과를 의미한다. 일부 실시양태에서, 지속 반응은 치료 지속기간과 적어도 동일하거나, 치료 지속기간보다 적어도 1.5, 2.0, 2.5 또는 3배 더 긴 지속기간을 갖는다.

"조직 절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어, 정상 조직의 또는 종양의 샘플로부터 절단된 얇은 조직 슬라이스를 지칭한다.

본원에 사용된 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"은 암을 갖거나 또는 암으로 진단된 대상체에게 PD-1 길항제 및 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드의 조합 요법을 투여하여, 적어도 하나의 양성 치료 효과, 예컨대 예를 들어, 감소된 암 세포 수, 감소된 종양 크기, 감소된 말초 기관 내로의 암 세포 침윤 속도, 또는 감소된 종양 전이 또는 종양 성장 속도를 달성하는 것을 의미한다. 암에서의 양성 치료 효과는 다수의 방식으로 측정될 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)] 참조). 예를 들어, 종양 성장 억제와 관련하여, NCI 표준에 따르면 T/C ≤ 42%가 최소 수준의 항종양 활성이다. T/C < 10%는 높은 항종양 활성 수준으로 간주되며, T/C (%) = 치료된 것의 중앙 종양 부피/대조군의 중앙 종양 부피 x 100이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조합 요법에 대한 반응은 RECIST 1.1 기준 또는 irRC (2차원 또는 1차원)를 사용하여 평가되고 본 발명의 조합에 의해 달성된 치료는 PR, CR, OR, PFS, DFS 및 OS 중 임의의 것이다. "종양 진행까지의 시간"으로 또한 지칭되는 PFS는 치료 동안의 및 치료 후의 암이 성장하지 않는 시간의 길이를 나타내고, 환자가 CR 또는 PR을 경험한 시간의 양 뿐만 아니라, 환자가 SD를 경험한 시간의 양을 포함한다. DFS는 치료 동안의 및 치료 후의 환자가 질환없이 유지되는 시간의 길이를 지칭한다. OS는 나이브한 또는 비치료된 개체 또는 환자와 비교하여 기대 수명에서의 연장을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조합에 대한 반응은 RECIST 1.1 반응 기준을 사용하여 평가된 PR, CR, PFS, DFS, OR 또는 OS 중 임의의 것이다. 암 환자를 치료하는 데 효과적인, 본 발명의 조합에 대한 치료 요법은 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 및 대상체에서 항암 반응을 도출하는 요법의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 임의의 측면 중 한 실시양태가 모든 대상체에서 양성 치료 효과를 달성하는 데 효과적이지 않을 수는 있으나, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 통계적 검정 예컨대 스튜던트(Student's) t-검정, 카이(chi)²-검정, 만 앤드 휘트니((Mann and Whitney)에 따른 U-검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 (H-검정), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra)-검정 및 윌콕슨(Wilcoxon)-검정에 의해 결정 시 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 효과적이어야 한다.

용어 "치료 요법", "투여 프로토콜" 및 "투여 요법"은 상호교환가능하게 사용되며 본 발명의 조합에서의 각 치료제의 용량 및 투여 타이밍을 지칭한다.

암으로 진단되었거나 암을 갖는 것으로 추정되는 대상체에 적용된 바와 같은 "종양"은 임의의 크기의 악성이거나 잠재적으로 악성인 신생물 또는 조직 덩어리를 지칭하고, 원발성 종양 및 속발성 신생물을 포함한다. 고형 종양은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 덩어리이다. 고형 종양의 상이한 유형은 이들을 형성하는 세포 유형에 대해 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종, 및 림프종이다. 백혈병 (혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

"종양 부하"로 또한 지칭되는 "종양 부담"은, 신체 전반에 걸쳐 분포된 종양 물질의 총량을 지칭한다. 종양 부담은 림프절 및 골수를 포함하여, 신체 전반에 걸친, 암 세포의 총 수 또는 종양(들)의 총 크기를 지칭한다. 종양 부담은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 예를 들어 대상체로부터 분리 시, 예를 들어, 캘리퍼를 사용하여, 또는 신체 내에 있는 경우 영상화 기술, 예를 들어 초음파, 골 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

용어 "종양 크기"는 종양의 길이 및 폭으로서 측정될 수 있는 종양의 총 크기를 지칭한다. 종양 크기는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 예를 들어 대상체로부터의 분리 시, 예를 들어 캘리퍼를 사용하여, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예를 들어 골 스캔, 초음파, CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

"1차원 irRC"는 문헌 [Nishino M, Giobbie-Hurder A, Gargano M, Suda M, Ramaiya NH, Hodi FS. Developing a Common Language for Tumor Response to Immunotherapy: Immune-related Response Criteria using Unidimensional measurements. Clin Cancer Res. 2013;19(14):3936-3943]에 기재된 기준 세트를 지칭한다. 이들 기준은 각 병변의 가장 긴 직경 (cm)을 이용한다.

본원에 사용된 "가변 영역" 또는 "V 영역"은 상이한 항체 사이에 서열에서 가변적인 IgG 쇄의 절편을 의미한다. 이는 경쇄에서 카바트 잔기 109 및 중쇄에서 113까지 연장된다.

본 발명의 상기 치료 방법, 의약 및 용도의 일부 실시양태에서, 개체는 인간이고 암은 고형 종양이고, 일부 실시양태에서, 고형 종양은 방광암, 유방암, 투명 세포 신장암, 두경부의 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암 (RCC), 소세포 폐암 (SCLC) 또는 삼중 음성 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 NSCLC, 자궁내막암, 요로상피암, 두경부의 편평 세포 암종 또는 흑색종이다.

본 발명의 상기 치료 방법, 의약 및 용도의 다른 실시양태에서, 개체는 인간이고 암은 헴 악성종양이고, 일부 실시양태에서, 헴 악성종양은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격 대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발성 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수이형성 증후군 (MDS), 피부 T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 또는 소림프구성 림프종 (SLL)이다.

또한, 임의의 상기 치료 방법, 의약 및 용도의 일부 실시양태에서, 암은 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 다의 발현에 대해 양성 판정을 받은 것이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 상승된 PD-L1 발현을 갖는다.

상기 치료 방법, 의약 및 용도의 한 실시양태에서, 개체는 인간이고, 암은 인간 PD-L1에 대해 양성 판정을 받았고 NSCLC, 자궁내막암, 요로상피암, 두경부의 편평 세포 암종 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 치료 방법, 의약 및 용도의 한 실시양태에서, 개체는 인간이고, 암은 인간 PD-L1에 대해 양성 판정을 받았고 진행성 또는 전이성 흑색종이다.

II. 방법, 용도 및 의약

본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 PD-1 길항제 및 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조합 요법을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

조합 요법은 또한 1종 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 추가의 치료제는, 예를 들어, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드 이외의 화학요법제, 생물요법제, 면역원성 작용제 (예를 들어, 약독화된 암성 세포, 종양 항원, 종양 제시 세포 예컨대 종양 유래 항원 또는 핵산으로 펄스된 수지상 세포, 면역 자극 시토카인 (예를 들어, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 시토카인 예컨대 비제한적으로 GM-CSF를 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포)일 수 있다. 추가의 치료제의 특정 투여량 및 투여 스케줄은 추가로 달라질 수 있고, 최적 용량, 투여 스케줄 및 투여 경로는 사용되고 있는 특정한 치료제에 기초하여 결정될 것이다. 한 실시양태에서, 생물요법제는 항-IL-10 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.

화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 phiI1, 예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조; 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양 상의 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤)을 포함하는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트, 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸, 레트로졸, 및 아나스트로졸; 및 항안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본 발명의 조합 요법의 각 치료제는 단독으로 또는 치료제 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함하는 의약 (본원에서 제약 조성물로도 지칭됨)으로 표준 제약 실시에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 조합 요법의 각 치료제는 동시에 (즉, 동일한 의약으로), 공동으로 (즉, 임의의 순서로 하나의 투여 직후에 다른 것이 투여되는 개별 의약으로) 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 조합 요법의 치료제가 상이한 투여 형태 (하나의 작용제는 정제 또는 캡슐이고 또 다른 작용제는 멸균 액체임)이고/거나 상이한 투여 스케줄로 투여되는 경우, 예를 들어 적어도 매일 투여되는 화학요법제 및 덜 빈번하게, 예컨대 매주 1회, 2주마다 1회 또는 3주마다 1회 투여되는 생물요법제인 경우, 순차적 투여가 특히 유용하다.

일부 실시양태에서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 PD-1 길항제의 투여 전에 투여되는 반면, 다른 실시양태에서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 PD-1 길항제의 투여 후에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 PD-1 길항제와 공동으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 조합 요법의 치료제 중 적어도 1종이 작용제가 동일한 암을 치료하기 위한 단독요법으로서 사용되는 경우에 전형적으로 사용되는 동일한 투여 요법 (용량, 빈도 및 치료 지속기간)을 사용하여 투여된다. 다른 실시양태에서, 환자는 조합 요법의 치료제 중 적어도 1종을, 작용제가 단독요법으로 사용되는 경우보다 낮은 총량, 예를 들어 더 적은 용량, 덜 빈번한 투여, 및/또는 더 짧은 치료 지속기간으로 받는다.

본 발명의 조합 요법의 각 소분자 치료제는 경구로, 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장, 국소 및 경피 투여 경로를 포함하여 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 조합 요법은 종양을 제거하기 위한 수술 전에 또는 그 후에 사용될 수 있고, 방사선 요법 전에, 그 동안 또는 그 후에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조합 요법은 생물요법제 또는 화학요법제로 이전에 치료받은 적이 없는, 즉 치료-나이브인 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 조합 요법은 생물요법제 또는 화학요법제로의 선행 요법 후 지속 반응을 달성하는 데 실패한, 즉 치료-경험이 있는 환자에게 투여된다.

본 발명의 조합 요법은 전형적으로 촉진에 의해 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 영상화 기술, 예컨대 MRI, 초음파 또는 CAT 스캔에 의해 발견되기에 충분히 큰 종양을 치료하는 데 사용된다.

본 발명의 조합 요법은 바람직하게는 PD-L1 발현에 대해 양성 판정을 받은 암을 갖는 인간 환자에게 투여된다. 일부 바람직한 실시양태에서, PD-L1 발현은 환자로부터 분리된 종양 샘플의 FFPE 또는 냉동 조직 절편 상의 IHC 검정에서 진단 항-인간 PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 검출된다. 전형적으로, 환자의 의사는 PD-1 길항제 및 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드로의 치료를 개시하기 전에 환자로부터 분리된 종양 조직 샘플에서 PD-L1 발현을 측정하기 위한 진단 검정을 지시하지만, 의사는 치료 개시 후의 임의의 시간, 예컨대 예를 들어, 치료 주기 완료 후에 제1 또는 후속 진단 검정을 지시할 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 조합 요법을 위한 투여(dosage) 요법 (본원에서 또한 투여(administration) 요법으로 지칭됨)을 선택하는 것은 엔티티의 혈청 또는 조직 회전율, 증상의 수준, 엔티티의 면역원성, 및 치료될 개체에서의 표적 세포, 조직 또는 기관의 접근성을 포함하는 여러 인자들에 따라 달라진다. 바람직하게는, 투여 요법은 환자에게 전달되는 각 치료제의 양을 허용가능한 수준의 부작용에 부합하여 최대화한다. 따라서, 조합물의 각 생물요법제 및 화학요법제의 용량 양 및 투여 빈도는 부분적으로 특정 치료제, 치료될 암의 중증도, 및 환자 특징에 따라 달라진다. 항체, 시토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 것에 대한 안내가 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)]을 참조한다. 적절한 투여 요법의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 주는 것으로 관련 기술분야에 공지되었거나 의심되는, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예상되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어질 수 있고, 예를 들어 환자의 임상 병력 (예를 들어, 선행 요법), 치료될 암의 유형 및 병기 및 조합 요법의 치료제 중 1종 이상에 대한 반응의 바이오마커에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 조합 요법의 생물요법제는 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어, 매일, 격일, 1주마다 3회, 또는 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월마다 1회 등의 간격으로의 투여에 의해 투여될 수 있다. 매주 총 용량은 일반적으로 적어도 0.05 μg/kg, 0.2 μg/kg, 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 체중 또는 그 초과이다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144]을 참조한다.

조합 요법의 PD-1 길항제로서 항-인간 PD-1 mAb를 사용하는 일부 실시양태에서, 투여 요법은 항-인간 PD-1 mAb를 치료 과정 전반에 걸쳐 약 14일 (± 2일) 또는 약 21일 (± 2일) 또는 약 30일 (± 2일) 간격으로 1, 2, 3, 5 또는 10 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다.

조합 요법의 PD-1 길항제로서 항-인간 PD-1 mAb를 사용하는 다른 실시양태에서, 투여 요법은 항-인간 PD-1 mAb를 환자-내 용량 증량으로 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다. 다른 용량 증량 실시양태에서, 투여 사이의 간격은, 예를 들어 제1 및 제2 투여 사이에 약 30일 (± 2일), 제2 및 제3 투여 사이에 약 14일 (± 2일)로 점진적으로 짧아질 것이다. 특정 실시양태에서, 투여 간격은 제2 투여에 후속하는 투여에서 약 14일 (± 2일)일 것이다.

특정 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 PD-1 길항제를 포함하는 의약의 정맥내 (IV) 주입을 투여받을 것이다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 조합 요법의 PD-1 길항제는 니볼루맙이며, 이는 1 mg/kg Q2W, 2 mg/kg Q2W, 3 mg/kg Q2W, 5 mg/kg Q2W, 10 mg Q2W, 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 및 10 mg Q3W로 이루어진 군으로부터 선택된 용량으로 정맥내로 투여된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조합 요법의 PD-1 길항제는 펨브롤리주맙, 또는 펨브롤리주맙 변이체이며, 이는 1 mg/kg Q2W, 2 mg/kg Q2W, 3 mg/kg Q2W, 5 mg/kg Q2W, 10 mg Q2W, 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 10 mg Q3W 및 임의의 이들 용량의 균일-용량 등가물, 즉, 예컨대 200 mg Q3W로 이루어진 군으로부터 선택되는 용량으로 액체 의약으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 10 mM 히스티딘 완충제 pH 5.5 중 25 mg/ml 펨브롤리주맙, 7% (w/v) 수크로스, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체 의약으로 제공된다.

일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙의 선택된 용량은 IV 주입에 의해 투여된다. 한 실시양태에서, 펨브롤리주맙의 선택된 용량은 25 내지 40분, 또는 약 30분의 기간에 걸쳐 IV 주입에 의해 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 조합 요법의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 45의 서열을 갖는다. 그러나, 본원에 기재된 모티프 및 서열을 갖는 다른 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 또한 본 발명의 조합 요법에 사용하기에 적합하다. 따라서, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법 또는 의약에 관한 임의의 설명이 또한 다른 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드, 특히 C59-01 - C59-14 (서열식별번호: 38-51)에 적용가능하다는 것이 이해되어야 한다. 간결함을 위해, 이 이해는 전체에 걸쳐 반복되지 않을 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조합 요법의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 45의 서열을 갖고, 1주 1회 0.1 내지 16.0 mg, 바람직하게는 1주 1회 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 4주 동안 1주 1회 0.1 내지 16.0 mg, 바람직하게는 4주 동안 1주 1회 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 7.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 3주마다 1회 0.1 내지 16.0 mg, 바람직하게는 3주마다 1회 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 7.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 4주 동안 1주 1회 2.0, 4.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 4주 동안 1주 1회, 이어서 3주마다 1회 2.0, 4.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 진행까지 또는 제1 투여 후 최대 12-24주 동안 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 총 4, 5, 6, 7 또는 8회 투여 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 매주 2회, 매주 1회, 격주, 3주마다 1회, 1개월 1회, 또는 격월로 투여된다.

CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드와 조합된 펨브롤리주맙의 최적 용량은 이들 작용제 중 하나 또는 둘 다의 용량 증량 또는 용량 감량에 의해 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 200 mg으로 Q3W 투여되고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 1주 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1주 1회 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 한 실시양태에서, 환자는 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙으로 Q3W 치료되고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드로 치료되며 이는 제1일에 시작하여 4주동안 1주 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 제1일에 시작하여 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 진행까지 또는 제1 투여 후 최대 24주 동안 투여된다. 추가 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 제1일에 시작하여 4주 동안 1주 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량에 이어 9주 동안 3주마다 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 진행까지 또는 제1 투여 후 최대 24주 동안 투여된다. 한 실시양태에서, 환자는 선행 항-PD-1 요법을 받는 동안 진행성 질환을 갖는 것으로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 정맥내로 투여되고 진행까지 또는 최대 45주 동안 투여된다.

또 다른 실시양태에서, 환자는 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙으로 Q3W 치료되고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드로 제22일에 시작하여 4주동안 1주 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 치료된다. 추가 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 제1일에 시작하여 4주 동안 1주 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량에 이어 9주 동안 3주마다 1회 1 내지 16 mg, 바람직하게는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여된다. 한 실시양태에서, 환자는 항-PD-1/L1 치료 나이브이다. 또 다른 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 정맥내로 투여되고, 진행까지 또는 최대 45주 동안 투여된다.

일부 실시양태에서, 환자는 적어도 24주, 예를 들어, 8회의 3-주 주기 동안 조합 요법으로 치료된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법으로의 치료는 환자가 PD 또는 CR의 증거를 나타낼 때까지 계속된다.

본 발명의 추가 측면에서, PD-1 길항제 및 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조합 요법은 항-IL-10 항체를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조합 요법의 항-IL-10 항체는 항-IL 10 hum 12G8이며, 이는 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 4 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 6 mg/kg Q3W, 7 mg/kg Q3W, 8 mg/kg Q3W, 9 mg/kg Q3W, 10 mg/kg Q3W, 11 mg/kg Q3W, 12 mg/kg Q3W, 13 mg/kg Q3W, 14 mg/kg Q3W 및 15 mg/kg Q3W로 이루어진 군으로부터 선택된 용량으로 정맥내로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조합 요법의 항-IL-10 항체는 항-IL-10 hum 12G8이며, 이는 1 mg/kg Q3W의 용량으로 정맥내로 투여된다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 조합 요법의 항-IL-10 항체는 항-IL 10 hum 12G8이며, 이는 3 mg/kg Q3W의 용량으로 정맥내로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조합 요법의 항-IL-10 항체는 항-IL 10 hum 12G8이며, 이는 10 mg/kg Q3W의 용량으로 정맥내로 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조합 요법의 항-IL-10 항체는 항-IL-10 hum 12G8 또는 항-IL-10 hum 12G8 변이체이며, 이는 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 4 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 6 mg/kg Q3W, 7 mg/kg Q3W, 8 mg/kg Q3W, 9 mg/kg Q3W, 10 mg/kg Q3W, 11 mg/kg Q3W, 12 mg/kg Q3W, 13 mg/kg Q3W, 14 mg/kg Q3W 및 15 mg/kg Q3W로 이루어진 군으로부터 선택된 용량으로 액체 의약으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 환자가 NSCLC, RCC, 자궁내막암, 요로상피암, 두경부의 편평 세포 암종 또는 흑색종으로 진단되었을 경우, 환자는 본 발명의 조합 요법으로의 치료를 위해 선택된다.

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 PD-1 길항제 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 의약을 제공한다. PD-1 길항제가 생물요법제, 예를 들어 mAb인 경우, 길항제는 통상적인 세포 배양 및 회수/정제 기술을 사용하여 CHO 세포에서 생산될 수 있다.

일부 실시양태에서, PD-1 길항제로서 항-PD-1 항체를 포함하는 의약은 액체 제제로서 제공되거나, 또는 사용 전에 주사용 멸균수로 동결건조된 분말을 재구성함으로써 제조될 수 있다. WO 2012/135408은 본 발명에서 사용하기에 적합한 펨브롤리주맙을 포함하는 액체 및 동결건조된 의약의 제조를 기재한다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙을 포함하는 의약은 4 ml의 용액 중에 약 100 mg의 펨브롤리주맙을 함유하는 유리 바이알로 제공된다. 각 1 mL의 용액은 25 mg의 펨브롤리주맙을 함유하고 하기로 제제화된다: L-히스티딘 (1.55 mg), 폴리소르베이트 80 (0.2 mg), 수크로스 (70 mg), 및 주사용수, USP. 용액은 IV 주입을 위한 희석을 필요로 한다.

본 발명은 또한 TLR9 효능제 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 의약을 제공하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이다. CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드는 종양내 주사를 위해 생리학적 완충제 중에서 재구성될 수 있다.

본원에 기재된 의약은 제1 용기 및 제2 용기 및 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서 제공될 수 있다. 제1 용기는 PD-1 길항제를 포함하는 의약의 적어도 1회 용량을 함유하고, 제2 용기는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약의 적어도 1회 용량을 함유하고, 패키지 삽입물 또는 라벨은 의약을 사용하여 암에 대해 환자를 치료하기 위한 지침서를 포함한다. 제1 및 제2 용기는 동일하거나 또는 상이한 형상 (예를 들어, 바이알, 시린지 및 병) 및/또는 물질 (예를 들어, 플라스틱 또는 유리)로 구성될 수 있다. 키트는 의약을 투여하는 데 유용할 수 있는 다른 물질, 예컨대 희석제, 필터, IV 백 및 라인, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 일부 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이고 지침서는 의약이 IHC 검정에 의해 PD-L1 발현에 대해 양성 판정을 받은 암을 갖는 환자를 치료하는 데 사용되도록 의도된 것임을 설명한다.

하기에 열거되는 예시적인 구체적 실시양태를 포함하는 본 발명의 이들 및 다른 측면은 본원에 함유된 교시로부터 명백할 것이다.

본 발명의 예시적인 구체적 실시양태

1. PD-1 길항제 및 TLR9 효능제를 포함하는 조합 요법을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인, 개체에서 암을 치료하는 방법.

2. PD-1 길항제, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 TLR9 효능제를 포함하는 조합 요법을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인, 개체에서 암을 치료하는 방법.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, PD-1 길항제가 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.

4. 개체에서 암을 치료하기 위한, TLR9 효능제와 조합하여 사용하기 위한 PD-1 길항제를 포함하는 의약이며, 여기서 PD-1 길항제는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드이고, 바람직하게는, PD-1 길항제는 TLR9 효능제 전에 투여되는 것인 의약.

5. 개체에서 암을 치료하기 위한, TLR9 효능제 및 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기 위한 PD-1 길항제를 포함하는 의약이며, 여기서 PD-1 길항제는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 의약.

6. 개체에서 암을 치료하기 위한, PD-1 길항제와 조합하여 사용하기 위한 TLR9 효능제를 포함하는 의약이며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 의약.

7. TLR9 효능제와 조합하여 투여되는 경우 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 PD-1 길항제의 용도이며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 용도.

8. TLR9 효능제 및 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 경우 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 PD-1 길항제의 용도이며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 용도.

9. PD-1 길항제와 조합하여 투여되는 경우 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 TLR9 효능제의 용도이며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 용도.

10. 개체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 PD-1 길항제 및 TLR9 효능제의 용도이며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 용도.

11. 제1 용기, 제2 용기 및 패키지 삽입물을 포함하며, 여기서 제1 용기는 항-PD-1 길항제를 포함하는 의약의 적어도 1회 용량을 포함하고, 제2 용기는 TLR9 효능제를 포함하는 의약의 적어도 1회 용량을 포함하고, 패키지 삽입물은 의약을 사용하여 암에 대해 개체를 치료하기 위한 지침서를 포함하고, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인 키트.

12. 실시양태 11에 있어서, 지침서가 의약이 면역조직화학적 (IHC) 검정에 의해 PD-L1 발현에 대해 양성 판정을 받은 암을 갖는 개체를 치료하는 데 사용되도록 의도된 것임을 설명하는 것인 키트.

13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 개체가 인간이고 PD-1 길항제가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하여 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

14. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-1 길항제가 MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C 또는 각각 WO2013/019906의 각각 서열식별번호: 24 및 서열식별번호: 21의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

15. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 개체가 인간이고, PD-1 길항제가 인간 PD-1에 특이적으로 결합하여 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

16. 실시양태 15에 있어서, PD-1 길항제가 또한 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L2의 결합을 차단하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

17. 실시양태 15에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (a) 서열식별번호: 1, 2 및 3의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 4, 5 및 6의 중쇄 CDR; 또는 (b) 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

18. 실시양태 15에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

19. 실시양태 15에 있어서, PD-1 길항제가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-PD-1 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 21을 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 22를 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

20. 실시양태 15에 있어서, PD-1 길항제가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-PD-1 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 23을 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 24를 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

21. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열식별번호: 32 및 서열식별번호: 33의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

22. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (a) 서열식별번호: 26, 27 및 28의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 29, 30 및 31의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

23. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-IL-10 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-IL-10 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 34를 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 35를 포함하는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

24. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-IL-10 항체가 항-IL-10 hum 12G8 또는 항-IL-10 hum 12G8 변이체인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가

(a) N이 뉴클레오시드이고, x = 0, 1, 2 또는 3이고, y = 1, 2, 3 또는 4이고, w = 0, 1 또는 2이고, p= 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v= 0 내지 89이고 z = 1 내지 20이고, X₁ 및 X₁'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'가 자기-상보적 뉴클레오시드인 5'-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z,N_v (서열식별번호: 38); 및

(b) 적어도 8개 염기 길이인 회문식 서열이며, (X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z 서열의 처음 (X₁X₂CGX₂'X₁')을 포함하는 회문식 서열

로 이루어지고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 12 내지 100개 염기 길이인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

26. 실시양태 25에 있어서, x = 0이고, y = 1이고, w = 0이고, p= 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v=0 내지 20이고 z = 1, 2, 3 또는 4인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

27. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 TCGN_q(X₁X₂CGX₂'X₁'CG)_zN_v (서열식별번호: 39)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, v=0 내지 20이고, z= 1 내지 4이고, X₁ 및 X₁'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 염기 길이인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

28. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGN_qTTCGAACGTTCGAACGTTN_s-3' (서열식별번호: 40)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, s = 0 내지 20이고, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 염기 길이인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

29. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

30. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 고형 종양인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

32. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 투명 세포 신장암, 두/경부 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암 (SCLC) 또는 삼중 음성 유방암인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

33. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 NSCLC, RCC, 자궁내막암, 요로상피암, 두경부의 편평 세포 암종 또는 흑색종인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

34. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 개체가 이전에 NSCLC, RCC, 자궁내막암, 요로상피암, 두경부의 편평 세포 암종 또는 흑색종에 대해 치료받은 적이 없는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

35. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

36. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발성 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수이형성 증후군 (MDS), 비-호지킨 림프종 (NHL), 피부 T- 세포 림프종, 또는 소림프구성 림프종 (SLL)인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

37. 실시양태 1 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 신세포 암종, 비소세포 폐암, 방광암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법 또는 의약.

38. 실시양태 1 내지 37 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 인간 PD-L1에 대해 양성 판정을 받은 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

39. 실시양태 38에 있어서, 인간 PD-L1 발현이 상승되는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

40. 실시양태 38에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체 또는 니볼루맙인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

41. 실시양태 40에 있어서, 펨브롤리주맙이 10 mM 히스티딘 완충제 pH 5.5 중 25 mg/ml 펨브롤리주맙, 7% (w/v) 수크로스, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체 의약으로 제제화되는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

42. 먼저 인간 개체에게 펨브롤리주맙을 투여한 후, 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드를 1 내지 4주 후에, 바람직하게는 1, 2 또는 3주 후에 종양내로 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 인간 개체에서 암을 치료하기 위한, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용하기 위한 펨브롤리주맙을 포함하는 의약.

43. 암으로 진단된 인간 개체에게 펨브롤리주맙 및 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조합 요법을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 펨브롤리주맙은 200 mg으로 Q3W 투여되고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 1주 1회 1 내지 16 mg의 용량으로, 바람직하게는 1주 1회 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여되는 것인, 암으로 진단된 인간 개체를 치료하는 방법.

44. 인간 개체에게 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙을 Q3W 투여하고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드를 제22일에 시작하고 이어서 4주 동안 1주 1회 1 내지 16 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 1 내지 16 mg의 용량으로 종양내로 투여하는 것을 포함하고 바람직하게는 여기서 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여되는 것인 방법에 의해 인간 개체에서 암을 치료하기 위한, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용하기 위한 펨브롤리주맙을 포함하는 의약.

45. 인간 개체에게 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙을 Q3W 투여하고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드를 제1일에 시작하여 4주 동안 1주 1회 1 내지 16 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 1 내지 16 mg의 용량으로 종양내로 투여하는 것을 포함하고 바람직하게는 여기서 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여되는 것인 방법에 의해 인간 개체에서 암을 치료하기 위한, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용하기 위한 펨브롤리주맙을 포함하는 의약.

46. 인간 개체에게 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙을 Q3W 투여하고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드를 제22일에 시작하여 4주 동안 1주 1회 1 내지 16 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 1 내지 16 mg의 용량으로 종양내로 투여하는 것을 포함하고 바람직하게는 여기서 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드는 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 또는 16.0 mg의 용량으로 종양내로 투여되는 것인 방법에 의해 인간 개체에서 암을 치료하기 위한, 서열식별번호: 45의 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용하기 위한 펨브롤리주맙을 포함하는 의약.

47. 실시양태 42 내지 44 및 46 중 어느 한 실시양태에 있어서, 개체가 이전에 항-PD-1 또는 항-PD-L1 요법으로 치료받은 적이 없는 것인 방법 또는 의약.

48. 실시양태 43 또는 45에 있어서, 개체가 선행 항-PD-1 요법을 받는 동안 진행성으로 확인된 것인 방법 또는 의약.

49. 실시양태 42 내지 48 중 어느 한 실시양태에 있어서, 펨브롤리주맙이 25 내지 40분 또는 약 30분 동안 IV 주입에 의해 투여되는 것인 방법 또는 의약.

50. 실시양태 42 내지 49 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-L1 발현에 대해 양성 판정을 받은 암의 조직 절편이 조합 요법의 투여 전에 개체로부터 분리되는 것인 방법 또는 의약.

51. 실시양태 50에 있어서, 조직 절편의 종양 세포의 적어도 50%가 면역조직화학적 (IHC) 검정에 의해 PD-L1 발현에 대해 양성 판정을 받은 것인 방법 또는 의약.

52. 실시양태 51에 있어서, IHC 검정이 PD-L1 발현을 검출하는 데 항체 22C3을 사용한 것인 방법 또는 의약.

53. 실시양태 1 내지 52 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)의 서열을 갖는 나트륨 염이고, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법 또는 의약.

54. 실시양태 1 내지 53 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

55. 실시양태 1 내지 53 중 어느 한 실시양태에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)의 나트륨 염인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

56. 실시양태 42 내지 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종인 방법, 의약, 용도 또는 키트.

57. 실시양태 1에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3'(서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.

58. 실시양태 1에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖고, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.

59. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종인 방법.

60. 실시양태 1에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.

61. 실시양태 1에 있어서, PD-1 길항제가 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가

(a) N이 뉴클레오시드이고, x = 0, 1, 2 또는 3이고, y = 1, 2, 3 또는 4이고, w = 0, 1 또는 2이고, p= 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v= 0 내지 89이고 z = 1 내지 20이고, X₁ 및 X₁'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'가 자기-상보적 뉴클레오시드인 5'-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z,N_v (서열식별번호: 38); 및

(b) 적어도 8개 염기 길이의 회문식 서열이며, (X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z (서열식별번호: 56) 서열의 처음 (X₁X₂CGX₂'X₁') (서열식별번호: 55)을 포함하는 회문식 서열

로 이루어지고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 12 내지 100개 염기 길이인 방법.

일반적 방법

분자 생물학의 표준 방법은 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2^nd Edition, 2001 3^rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3), 및 생물정보학 (Vol. 4)을 기재하는 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 나타난다.

면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제를 위한 방법이 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제, 및 단편화가 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 문헌). 리간드/수용체 상호작용을 특징화하기 위한 표준 기술이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).

모노클로날, 폴리클로날, 및 인간화 항체가 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).

인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스의 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

항원의 정제는 항체의 생성에 필수적이지는 않다. 동물은 관심 항원을 보유하는 세포로 면역화될 수 있다. 이어서, 비장세포는 면역화 동물로부터 단리될 수 있고, 비장세포는 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., 상기 문헌; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).

항체는, 예를 들어 소형 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에티렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하고, 예를 들어 염료, 방사성동위원소, 효소, 또는 금속, 예를 들어 콜로이드성 금에 커플링된 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).

형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함하는 유동 세포측정법에 대한 방법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2^nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 핵산, 폴리펩티드, 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

면역계 조직학의 표준 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조).

예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (예를 들어, 진뱅크(GenBank), 벡터 NTI(Vector NTI)® 스위트(Suite) (인포르맥스, 인크(Informax, Inc), 메릴랜드주 베데스다); GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package) (악셀리스, 인크.(Accelrys, Inc.), 캘리포니아주 샌디에고); 데시퍼(DeCypher)® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.), 네바다주 크리스탈 베이); 문헌 [Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690)] 참조).

실시예

실시예 1: C59-08에 의한 인간 세포의 면역조정

C59-08은 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)의 나트륨 염이다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 분리 방법을 사용하여 피콜-파크(Ficoll-Paque)™ PLUS (지이 헬스케어 바이오-사이언시스(GE Healthcare Bio-Sciences), 펜실베니아주 피츠버그)로 2명의 공여자로부터의 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단리된 PBMC를 2% 소 태아 혈청 (FBS), 및 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 2회 세척하였다. 세포를 재현탁시키고 96-웰 U-바닥 플레이트 내에서 웰당 1 x 10⁶개 세포로 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 세포를 0.016 μM 내지 5 μM의 범위의 용량의 C59-08 또는 7 μM 대조군 ODN 1040의 존재 하에 37℃, 5% CO₂에서의 가습 인큐베이터 내에서 0.2 mL의 최종 부피에서 48시간 동안 배양하였다. 상청액을 수거하고 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) 인간 IFNα2a 및 인간 IL-10 조직 배양 키트 (메릴랜드주 록빌)를 사용하여 IFNα2a 및 IL-10에 대해 검정하였다.

결과는 도 12에 제시된다. C59-08은 0.2 μM의 최적 농도에서 인간 PBMC에서 IFNα2a 및 IL-10 생산 둘 다를 유도한다.

실시예 2: C59-08에 의한 인간 종양 시편의 면역조정

인간 종양 조직배양

환자로부터의 인간 종양 시편을 상업적 공급원 (바이오-옵션스(Bio-Options), 폴리오(Folio), 컨버전트 바이오(Conversant Bio), 및 보스턴 바이오소스(Boston BioSource)) 및 로체스터 대학교로부터 입수하였다. 신선한 종양 조직을 수술 후 1시간 내에 수집하고 AQIX 수송 배지 (AQIX, 영국) 내에 위치시켰다. 조직을 4℃에서 머크 리서치 래보러토리즈(Merck Research Laboratories) (캘리포니아주 팔로 알토)로 밤새 수송하였다.

종양을 울트라퓨어™ 저융점 아가로스 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)에 포매하고 맥일웨인™ 조직 세단기 (스토엘팅 캄파니(Stoelting Co.), 일리노이주 우드 데일)로 400 μm 절단하였다. 종양 절편을 먼저 밀리셀-CM(Millicell-CM) 세포 배양 인서트 (밀리포어(Millipore), 캘리포니아주 빌러리카) 상에 놓고 공기와 4.5 g/L 글루코스, L-글루타민, 피루브산나트륨 (미디어테크, 인크.(Mediatech, Inc.), 버지니아주 마나사스), 10% FBS (SAFC 바이오사이언시스(SAFC Biosciences), 캔자스주 레넥사), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1 ml DMEM의 배지 사이의 계면에서 37℃, 5% CO₂에서의 가습 인큐베이터 내에서 배양하였다.

종양 절편을 0.1, 0.5, 및 1 μM C59-08 또는 1 μM 대조군 ODN 1040의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 종양 샘플을 드라이 아이스에서 순간 동결시키고 처리 전에 37℃에서 저장하였다.

RNA 단리 및 실시간 정량적 PCR

총 RNA를 폴리트론 균질화기를 사용하여 RNA STAT-60 (텔-테스트(Tel-Test), 텍사스주 프렌즈우드)으로의 균질화에 의해 단리하였다. 총 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 추출하였다. 이소프로판올로의 침전 후에, 총 RNA를 상-고정 경량 튜브를 사용하여 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)로 재-추출하였다.

DNase-처리된 총 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 퀀티텍트(QuantiTect) 리버스 트랜스크립션 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)을 사용하여 역전사시켰다. 프라이머를 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) (캘리포니아주 포스터 시티)로부터 상업적으로 입수하였다. 각 샘플로부터의 10 ng의 cDNA에 대한 실시간 정량적 PCR을 각각 250 nM의 FAM-표지된 프로브와 900 nM의 비표지된 프라이머를 사용하여 플루이다임 바이오마크(Fluidigm Biomark) 서열 검출 시스템 (플루이다임, 캘리포니아주 포스터 시티)에서의 택맨(TAQMAN)™ RTqPCR 반응에서 수행하였다. 유비퀴틴의 수준을 개별 반응에서 측정하고, Δ-Δ Ct 방법에 의해 데이터를 정규화하기 위해 사용하였다. 각 샘플에 대한 유비퀴틴 및 관심 유전자에 대한 평균 사이클 역치 (Ct) 값을 사용하여, 하기 방정식을 정규화된 값을 입수하기 위해 사용하였다: 1.8^{(Ct 유비퀴틴 - Ct 관심 유전자)} x 10⁴.

치료 결과

인간 종양의 C59-08로의 생체외 치료는 신세포 암종 (RC) (n = 5), 비소세포 폐암 (NSCLC) (n = 3), 및 방광암 (n = 1) 및 결장직장암 (n = 1) 조직배양에서 IFNα-유도성 유전자 (IFNα2, MCP1, MCP2, OAS2, IP-10, GBP1, ISG-54, MxB, 및 TRAIL), 시토카인 (IFNβ, IL-10, IL-12, IL-6 및 TNFα), 및 면역 활성화 마커 (CD80, CD86, CD40, CD70 및 OX40L)를 유도하였다. RCC 공여자로부터의 시편에 대한 데이터는 도 13에 제시된다: (a) IFNα-유도성 유전자; (b) 시토카인; 및 (c) 면역 활성화 마커.

실시예 3: 동물 모델에서의 항-IL-10 및 종양내 C59-08의 조합의 항종양 활성

TC40.11D8은 마우스 IL-10에 대해 표적화된 마우스 IgG1/카파 모노클로날 항체이다. 마우스 IgG1 이소형 대조군은 아데노바이러스 헥손 25에 특이적인 마우스 모노클로날 항체이다. 항체 둘 다를 내부 공급원으로부터 동결된 (-80℃) 스톡으로서 입수하였다.

항체의 제제

제제 완충제는 단백질을 안정화시키고 침전을 방지하기 위해 각 항체에 대해 특이적이다. TC40.11D8 및 마우스 IgG1 이소형 대조군 둘 다에 대한 제제는 75 mM 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 3% 수크로스, pH 7.3이었다.

올리고데옥시뉴클레오티드

시티딘 포스포-구아노신 (CpG)-기반 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) CpG 1826 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3' (서열식별번호: 53) (인비보젠(InvivoGen), 캘리포니아주 샌디에고)는 마우스 TLR9 특이적인 효능제이다. CpG 1826은 CpG- B 유형 서열을 갖는다. CpG-기반 포스포로티오에이트 ODN C59-08 (디나박스, 캘리포니아주 버클리)은 인간 및 마우스 TLR9 둘 다를 활성화시키는 효능제이다. C59-08은 CpG-C 유형 서열: 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)를 가지며, 여기서 5' 및 3'는 OH 기이다.

대조군 ODN (디나박스, 캘리포니아주 버클리)은 포스포로티오에이트 백본 5'-TGA CTG TGA ACC TTA GAG ATG A-3' (서열식별번호: 54)를 갖는 비-CpG 서열을 갖는다.

올리고데옥시뉴클레오티드의 제제

CpG 1826을 0.9% 염화나트륨 중에서 2 mg/mL의 농도로 재구성하고, 분취하고, -20℃에서 저장하였다. C59-08을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 4.53 mg/mL의 농도로 재구성하고, 분취하고, -20℃에서 저장하였다. 대조군 ODN을 PBS 중에서 4.47 mg/mL의 농도로 재구성하고, 분취하고, -20℃에서 저장하였다.

동물

대략 7 내지 8주령 암컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory) (캘리포니아주 새크라멘토)로부터 입수하였다. 통상적인 동물 사료 및 물을 무제한으로 제공하였다. 동물을 연구의 시작 전에 1주 동안 수용하였다. 연구의 시작 (즉, 종양 이식)에서의 동물의 평균 중량은 19 그램이었다.

연구에서 동물의 관리 및 사용을 수반하는 절차는 머크 리서치 래보러토리즈의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 검토되고 승인되었다. 본 연구 동안, 동물의 관리 및 사용은 실험 동물 관리 평가 인증 협회 (AAALAC), 동물 복지법, 미국 수의과 의사 협회 (AVMA)의 안락사에 대한 안락사 패널, 및 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 실험 동물 조사 연구소 (ILAR) 가이드의 지침에 명시된 원칙에 따라 수행되었다.

종양 세포주 제조 및 이식

존스 홉킨스 대학교 (메릴랜드주 볼티모어)에 의해 제공된 TC-1 세포주는 인간 유두종 바이러스 (HPV-16) E6 및 E7 및 c-Ha.ras 종양유전자로 동시형질전환된 마우스 1차 폐 상피 세포로부터 유래된 것이다 (Lin et al., Cancer Res., 56:21-6, 1996). TC-1 세포는 C57BL6/J 마우스 계통에 대해 동계이다.

TC-1 세포를 10% 소 태아 혈청 및 0.4 mg/mL 제네티신(Geneticin)으로 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. 전면생장 미만 TC-1 세포를 0.1 mL의 혈청-무함유 DMEM 중에서 각 동물의 하부 배측 측복부 둘 다 (우측 측복부에 1 x 10⁵개 및 좌측 측복부에 0.5 x 10⁵개)에 피하로 (SC) 주사하였다. 동물을 먼저 이식에 사용된 부위에서 전기 클리퍼로 면도하였다.

종양 측정 및 체중

종양을 제1 투여 전날 및 이후 1주 2회 측정하였다. 종양 길이 및 폭을 전자 캘리퍼를 사용하여 측정하고 종양 부피를 식 부피 (mm³) = 0.5 x 길이 x 폭² (여기서, 길이는 보다 긴 치수임)을 사용하여 결정하였다. 동물을 제1 투여 전날 및 이후 1주 2회 칭량하였다. 편향을 방지하기 위해, 중량 또는 종양 부피에 의한 임의의 이상치를 제거하고 남아있는 마우스를 우측 측복부에서의 종양 (주사된 종양으로서 지칭됨) 부피에 기초하여 다양한 치료군으로 군별화하였다.

투여 용액 제조

항체의 동결된 스톡을 해동시키고 습윤 얼음으로 옮겼다. 반복되는 동결 해동을 피하기 위해, 스톡의 각 바이알을 1회 해동시키고, 1회 사용에 충분한 부피의 분취액을 만들었다. 이러한 목적을 위해, 폴리프로필렌, 저 부착 튜브를 사용하였다. 분취물을 -80℃에서 저장하였다. 각 투여 전에, 하나의 분취물을 해동시키고 적절한 희석제 중에서 공칭 농도로 희석하였다.

각 투여 전에, ODN (대조군 ODN, CpG 1826, 및 C59-08)의 분취물을 해동시키고 0.9% 염화나트륨 중에서 공칭 농도로 희석하였다.

항체 및 올리고데옥시뉴클레오티드의 투여

이소형 대조군 mIgG1 및 항-IL-10 mIgG1을 제0일, 제4일, 제8일, 및 제12일에 10 mg/kg으로 복강내로 (IP) 투여하였다. 대조군 ODN (2.5 mg/kg), CpG 1826 (1 mg/kg), 및 C59-08 (2.5 mg/kg)을 제0일, 제4일, 제8일, 및 제12일에 단지 우측 종양에만 종양내로 (IT) 투여하였다.

통계적 방법

종양 부피를 각 추적일에 치료 사이에서 비교하였다. 개별 동물의 추적은 과도한 종양 부담 또는 다른 이유 때문에 조기에 종결될 수 있었다. 이유 및 마지막 측정에서의 종양 크기에 따라서, 마지막으로 관찰된 종양 부피를 그 동물에 대한 모든 이후 일수에서의 부피의 하한계 (적정-검열 데이터)로서 취급하였다.

주어진 일에서 2개의 치료군을 비교하기 위해, 적정-검열 데이터를 허용하는 비파라미터 만-휘트니(Mann-Whitney) (또는 윌콕슨(Wilcoxon) 순위 합계) 검정의 일반화를 사용하였다: 게한-브레슬로우 검정의 페토 앤드 페토 버전. 양측 p-값을 비교되는 2개의 치료 사이의 동물의 20,000 무작위 재할당으로부터 추정하였다. 주어진 쌍의 치료에 대해 모든 시점에 걸쳐 집단적 오차율을 제어하기 위해, p-값을 웨스트폴 앤드 영의 맥스티 절차를 순열 분포에 적용함으로써 다중도 조정하였다. 0.05 미만의 p-값을 사용하여 통계적 유의성을 규정하였다.

설명의 목적을 위해, 각 일 및 치료군에 대한 부피를 그의 중앙값에 의해 요약하였다. 검열을 허용하기 위해, 각 일 및 치료군에 대한 분포 함수를, 로그 스케일에서의 그린우드 식을 사용하는 신뢰 대역을 갖는, 카플란-마이어 방법에 의해 추정하였다. 중앙값을 신뢰 대역을 반전시킴으로써 획득한 신뢰 구간에서, 분포 함수의 50번째 백분위수로 추정하였다. 데이터를 요약하기 위한 통상의 "평균 ± SE" 포맷에 비교가능하게 되기 위해, 68% 신뢰 수준을 사용하였으며, 이는 후자가 평균에 대해 대략 68% 신뢰 구간이기 때문이다.

동물의 추적을 조기에 종결시키는 경우, 이유를 카테고리화하고 동물의 데이터를 하기와 같이 취급하였다: (1) 종양 부담: 마지막으로 측정된 값에서의 적정-검열; (2) 종양 궤양화: 역치 (1000 mm³)를 초과하였다면, 마지막으로 측정된 값에서의 적정-검열; 그렇지 않았다면 이후에는 동물을 제외시킴; (3) 중량 손실/병 (질병의 증거와 함께 죽은 것으로 발견된 것 포함): 이후에는 동물을 제외시킴; 및 (4) 치료와 비관련됨 (예를 들어, 질병의 어떠한 증거도 갖지 않는 죽은 것으로 발견된 사고, 관리 종결): 역치 (1000 mm³)를 초과하였다면, 마지막으로 측정된 값에서의 적정-검열; 그렇지 않았다면 이후에는 동물을 제외시킴.

치료 결과

TC-1 종양-보유 C57BL/6J 마우스를 우측 측복부에서의 종양의 평균 부피가 대략 60 mm³ (39 mm³ - 87 mm³)에 도달하였을 때 제1 투여 전날에 5개 치료군으로 군별화하였다: (1) mIgG1 이소형 대조군 + 대조군 ODN; (2) mIgG1 이소형 대조군 + C59-08; (3) 항-IL-10 + CpG 1826; (4) 항-IL-10 + 대조군 ODN; 및 (5) 항-IL-10 + C59-08. 좌측에서의 종양의 부피의 범위는 0 mm³ - 113 mm³이었다. 종양의 완전 퇴행 (CR)을, 종양이 동물이 군별화된 날에 측정가능하였다면, 측정이 수행되었던 시점에서의 측정가능한 종양의 부재로서 규정하였다.

결과는 도 10 및 11에 제시된다. 종양내 CpG 1826 (군 3) 또는 C59-08 (군 5)과 조합된 항-IL-10은 적어도 3마리의 동물에서 주사된 종양의 CR을 일으켰다 (도 10a). 그러나, 단지 C59-08 (군 5)과 조합된 항-IL-10만이 비-주사된 종양의 CR (10마리 동물 중 3마리)을 일으켰다 (도 11a). C59-08 단독요법 (군 2)을 포함하는 다른 치료는 주사된 또는 비-주사된 종양의 CR을 일으키지 않았다. 대조군 치료, 항-IL-10 단독요법, 및 C59-08 단독요법과 비교하여, C59-08와 조합된 항-IL-10의 투여 (IT)는 제6일, 제9일, 및 제12일에 대해 주사된 종양의 유의하게 감소된 부피를 일으켰다 (p < 0.05, 시점에 걸쳐 다중도 조정됨) (도 10b-d). 대조군 치료 및 항-IL-10 단독요법과 비교하여, C59-08과 조합된 항-IL-10의 투여 (IT)는 제6일, 제9일, 및 제12일에 대해 비-주사된 종양의 유의하게 감소된 부피를 일으켰다 (p < 0.05, 시점에 걸쳐 다중도 조정됨) (도 11b-d).

실시예 4: 전신 항-PD-1 항체 및 종양내 CpG-C 올리고뉴클레오티드의 조합의 항-종양 활성

항체.

2개의 항-PD-1 차단 항체를 사용하였다: 초기 연구에서 29F.1A12 및 후기 연구에서 RMP1-14. 각 용량은 250μg 항체 / 주사를 함유하였다. 29F.1A12는 바이오레전드(BioLegend) (캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수된 정제된 래트 항-마우스 PD-1 항체 (카탈로그 번호 135202)이다. 바이오레전드 항-PD-1 항체는 래트 IgG2a, 카파 모노클로날 항체이다. 클론 RMP1-14는 바이오엑셀 인크.(BioXCell Inc.) (뉴햄프셔주 웨스트 레바논)로부터 입수된 정제된 래트 항-마우스 PD-1 항체 (카탈로그 번호 BE0146)이다. 바이오엑셀 항-PD-1 항체는 래트 IgG2a 모노클로날 항체이다.

올리고데옥시뉴클레오티드.

비-CpG, 대조군 올리고데옥시뉴클레오티드 (CTRL-ODN)는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 서열 5'-TGA CTG TGA ACC TTA GAG ATG A-3' (서열식별번호: 54)를 갖는다. 각 용량은 50 μg ODN / 주사를 함유하였다.

동물 및 세포.

6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 하를란 래보러토리즈(Harlan Laboratories) (인디애나주 인디애나폴리스)로부터 입수하였다. CT26은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수한 뮤린, 섬유모세포 세포주 (CT26.WT, 카탈로그 번호 CRL-2638™)이다. CT26은 N-니트로소-N-메틸우레탄-유도된, 미분화 결장 암종 세포주이며 이는 면역치료 요법을 검정하기 위한 모델로서 빈번하게 사용된다 (Wang et al., J Immunol, 154: 4685-4692, 1995).

단독요법 투여 요법.

약 8 x 10⁴개 CT26 세포를, 이전에 공개된 방법 (Brattain et al., Cancer Res, 40:2142-2146, 1980)을 사용하여, 제0일에 BALB/c 마우스 (n = 5 내지 6마리/군)의 측복부 내에 피하로 (SC) 주사하였다. 항-PD-1 차단 항체를 제5일, 제8일, 제11일, 제14일 및 제18일에 복강내로 (IP) 주사하였다.

조합 요법 투여 요법.

약 8 x 10⁴개 CT26 세포를 제-7일에 BALB/c 마우스 (n = 5 내지 6마리/군)의 측복부 내에 피하로 (SC) 주사하였다 (Brattain et al., 상기문헌, 1980). 치료 요법을 연구 제0일 (종양 세포 이식 7일 후; 평균 종양 길이 5mm)에 시작하였다. 마우스를 비치료된 채로 남기거나 또는 200 mcg의 마우스 항-PD-1 차단 항체로 200 μL의 부피 (제조업체에 의해 제공된 바와 같은 순수 제제)에서 복강내로 (IP) 주사하였다. 항-PD-1 주사를 제0일, 제3일, 제7일, 제10일, 제14일, 제18일, 제21일 및 제25일에 투여하였다. 수회의 항-PD-1 주사 후에 (제12일), 마우스를 50 mcg의 C59-08 또는 CTRL-ODN으로 150 μL PBS의 부피에서 종양내로 (IT) 주사하였다. C59-08 및 CTRL-ODN 주사를 제12일, 제14일, 제18일, 제21일, 제25일, 및 제28일에 투여하였다. 군 둘 다에서, 항-PD-1 치료를 상기 기재된 바와 같이 계속하였다. 유사-크기 종양 (종양 세포는 연구 제0일에 주사됨)을 갖는 마우스의 개별 군을 C59-08 단독으로 제12일, 제14일, 제18일, 제21일, 제25일, 및 제28일에, 항-PD-1 사전-치료의 부재 하에 주사하였다.

조합 요법 투여 및 T 세포 고갈 요법.

약 8 x 10⁴개 CT-26 종양 세포를 제0일에 마우스의 측복부에 SC 주사하였다 (Brattain et al., 상기문헌, 1980). 마우스를 비치료된 채로 남기거나, 또는 항-PD-1로 제5일, 제9일, 제12일, 제15일, 제19일, 제22일, 제26일 및 제29일에 IP 주사에 의해 치료하였다. 수회의 항-PD-1 주사 후에 (제15일), 마우스를 C59-08로 제15일, 제19일, 제22일, 제26일 및 제29일에 IT 주사에 의해 치료하거나, 또는 비치료된 채로 남겼다. 항-CD8 또는 항-CD4 고갈성 항체를 항-PD1 / C59-08 치료군의 마우스에게 제14일, 제15일, 제16일, 제19일, 제22일, 제26일 및 제29일에 IP 주사에 의해 투여하였다. 항-PD-1 치료된 마우스는 250μg / 주사의 바이오엑셀 RMP1-14 항체를 받았다. 마우스는 또한 50μg / 주사의 C59-08을 받았다. 고갈의 경우, 마우스는, 둘 다 바이오엑셀로부터 입수된 250μg / 주사의 항-CD8 Ab (YTS 169.4) 또는 항-CD4 Ab (GK1.5)를 받았다.

조합 요법 투여 대측성 종양 거부 요법.

약 8 x 10⁴개 CT-26 세포를 제0일에 좌측 측복부에 및 제2일에 우측 측복부에 SC 주사하였다. 마우스를 비치료된 채로 남기거나 (n=18), 또는 항-PD-1 Ab로 제5일, 제7일, 제11일, 제14일, 제21일, 제23일 및 제26일에 IP 주사하였다 (n=19). 수회의 항-PD-1 Ab 주사 후에 (제14일), 항-PD-1-치료된 마우스를 좌측 종양에 C59-08로 제14일, 제19일, 제21일, 제23일, 및 제26일에 주사하였다. 항-PD-1 Ab 치료된 마우스는 250μg / 주사의 바이오엑셀 RMP1-14 항체, 및 50μg / 주사의 C59-08을 받았다.

종양 침윤 백혈구의 추출을 위한 종양 처리.

종양을 겸자를 사용하여 페트리 디쉬에 위치시키고, 5mL의 RPMI 배지 중 5% FCS를 첨가하였다. 종양을 가위를 사용하여 작은 조각으로 절단하고, 3mL 시린지 플런저의 하부를 사용하여 종양 조직이 50mL 피펫으로 피펫팅될 수 있을 때까지 세절하였다. 종양 조직 현탁액을 50mL 튜브로 옮기고, 페트리 디쉬를 5mL의 RPMI 배지 중 5% FCS를 사용하여 2회 세정하였다. 조직 현탁액을 50 mg/mL 콜라게나제 4 (클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 시그마-알드리치 C5138-100MG 콜라게나제) 및 2 mg/mL DNase I (소 췌장으로부터의 시그마-알드리치 DN25-100MG 데옥시리보뉴클레아제 I)을 함유하는 100X 종양 소화 효소 혼합물 중에서 소화시켰다. 튜브를 37℃에서 20분 동안 3분마다 완만하게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 샘플을 70μm 필터를 통해 여과하고, 필터를 RPMI 중 5% FCS로 후속적으로 세척하였다. 샘플을 1400 rpm에서 7분 동안 실온에서 원심분리하였다. 세포를 종양 크기에 따라 1 내지 5 부피의 RPMI 중 5% FCS 중에 재현탁시켰다. 생성된 현탁액 중에서의 세포를 혈구계를 사용하여 계산하였다.

유전자 발현 분석을 위한 전체 종양으로부터의 RNA 추출.

전체 종양을 퀴아젠 (네덜란드 벤로)으로부터 입수된 RNA레이터(RNAlater) (카탈로그 번호 76104) 중에 동결시켰다. 해동시킨 후, 총 RNA를 30 mg의 총 균질화된 전체 종양으로부터 퀴아젠으로부터의 RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (카탈로그 번호 74106)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 단리하였다. 간략하게, RNA레이터 RNA 안정화 시약에 저장된 전체 종양을 해동시키고, 칭량하고, 5mm 스테인리스강 비드 및 BME를 갖는 RLT 완충제 (700μL/30mg 조직, 튜브당 최대 1mL RLT)를 함유하는 2mL PCR클린 세이프-록(PCRclean Safe-Lock) 에펜도르프 튜브에 위치시켰다. 튜브를 티슈라이저 어댑터 세트(TissueLyser Adapter Set) 2x24에 위치시키고, 이를 2분 동안 25Hz에서 2회 작동시켰다. 용해물을 3분 동안 13,500rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 15mL 튜브로 후속적으로 옮겼다. RLT 완충제를 필요에 따라 첨가하여 700μL/30mg 요건을 충족시켰다. 약 700μL의 용해물을 사용하고 나머지를 -80℃에서 저장하였다. 하나의 부피의 70% 에탄올을 정화된 용해물에 첨가하고 700μL의 샘플을 2mL 수집 튜브의 RN이지 스핀 칼럼에 옮기고 1분 동안 13,500 rpm에서 원심분리하였다. 샘플이 700μL를 초과한 경우, 연속 분취물을 동일한 RN이지 스핀 칼럼에서 처리하고, 통과물을 폐기하였다. 350μL의 완충제 RW1을 RN이지 스핀 칼럼에 첨가하고 샘플을 원심분리하였다. DNase I 인큐베이션 혼합물 (80μL: 10μL DNase I 원액 플러스 70μL 완충제 RDD)을 RN이지 스핀 칼럼에 직접 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 350μL의 완충제 RW1을 첨가하고, 튜브를 원심분리하고 RN이지 스핀 칼럼을 새로운 튜브에 옮겼다. 2개 부피의 500μL 완충제 RPE를 칼럼에 첨가하고 1분 동안 원심분리하여 칼럼을 세척하였다. RN이지 스핀 칼럼을 새로운 2mL 수집 튜브에 옮기고, 전속력으로 1분 동안 원심분리하였다. RN이지 스핀 칼럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브에 옮기고 45μL의 RNase-무함유 물 (라이프 테크놀로지스)을 칼럼에 첨가하고 1분 동안 13,500 rpm에서 원심분리하여 RNA를 용리하였다.

정량적 실시간 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (택맨)

5 μg의 용리된 RNA를 5X 제1 가닥 완충제 (라이프 테크놀로지스), 소 혈청 알부민 (라이프 테크놀로지스), 재조합 RNasin 리보뉴클레아제 억제제 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨), 올리고(dT)15 (프로메가), 무작위 프라이머 (프로메가), dNTP (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), DTT (라이프 테크놀로지스) 및 슈퍼스크립트(SuperScript) III 리버스 트랜스크립타제 (라이프 테크놀로지스)를 사용함으로써 MyiQ 실시간 PCR 기계 (바이오-래드((Bio-Rad)))를 사용하여 역전사시켰다. 데이터를 95℃에서의 15분에 이어, 40회 라운드의 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분의 사이클링 조건에서 유비퀴틴 발현에 대해 정규화하였다. mRNA의 정량화를 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix) (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 수행하였다. 모든 정량화 및 분석을 스텝원(StepOne) v2.1 소프트웨어를 사용하는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (캘리포니아주 칼스배드) 스텝원플러스(StepOnePlus) 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. 상대 유전자 발현 수준을 하기 식을 사용하여 계산하였다: 1.8^{(평균 Ct 유비퀴틴- Ct 유전자)}*100,000.

림포라이트(Lympholyte)®-포유동물 세포 분리 배지로의 종양 세포 분리.

이 절차를 사용하여 종양 세포로부터 종양 침윤 백혈구 (TIL)를 분리하였다. 종양으로부터 수득된 세포 현탁액을 필요에 따라 RPMI 중 5% FCS의 첨가에 의해 7mL가 되도록 하였다. 7mL 림포라이트®-포유동물 세포 분리 배지 (세달란(Cedarlane), 카탈로그 번호: CL5120)를 15mL 원추형, 원심분리 튜브에 첨가하고 이어서 7mL의 세포 현탁액을 상부에 조심스럽게 적층하였다. 세포를 800 x g에서 20분 동안 실온에서 제동 없이 회전 침강시켰다. 형성된 상부 층을 50mL 튜브에 옮기고 RPMI 배지 중 5% FCS로 50mL 표시까지 채웠다. 세포를 1800 rpm에서 7분 동안 실온에서, 최대 가속 및 최대 제동 하에 펠릿화하였다. 배지를 흡인하고 TIL-함유 펠릿을 1mL RPMI 배지 중 5% FCS 중에서 재현탁시켰다. 한 분획의 세포 (150μL)를 96-웰 U-바닥 플레이트에 위치시키고, 2000 rpm에서 3분 동안 펠릿화하고, 이어서 유전자 발현 검정을 위해 250μL RLT 완충제로 재현탁시켰다. 세포의 나머지를 FACS 분석에 사용하고, 약 100-150μL의 TIL 샘플을 각 염색 패널에 사용하였다.

시토카인 생산을 위한 종양 침윤 백혈구의 검정관내 자극.

림포라이트® 포유동물 세포 분리 배지 (세달란, 카탈로그 번호: CL5120)로 단리된 약 1.5x10⁵개 TIL을 3시간 동안 37℃에서 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA), 이오노마이신 및 브레펠딘 A (BFA), 또는 BFA 단독 (3μg/mL 최종 농도)과 함께, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) (카탈로그 번호 550583)로부터 입수된 비디 골지플러그(BD GolgiPlug) (500X)를 함유하는 백혈구 활성화 칵테일로 200μL의 최종 부피에서 자극하였다. 샘플을 세포내 염색 및 유동 세포측정법에 의해 시토카인 생산에 대해 분석하였다.

세포 염색 및 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석

모든 시약을 4℃에서 유지하였다. 모든 세척은 플레이팅된 세포 현탁액을 상하로 3회 피펫팅한 후, 1800 rpm에서 3분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하는 것을 수반하였다. 세포를 3시간 동안의 자극 후 펠릿화하고, 각 샘플에 대해 80μL/웰 FACS 완충제 (PBS, 10% FBS, 0.1% 아지드화나트륨) 중에서 재현탁시켜 샘플당 2μL Fc 차단제 및 0.5μg/mL의 각 관심 항체를 포함하는 칵테일을 생성하였다. 샘플을 200μL/웰 FACS 완충제 중에서의 세척 및 재현탁 전에 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정시키기 위해, 200μL의 1% 파라포름알데히드를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 표면 염색을 위해 암실에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 세척하고, 펠릿화하고 300μl/웰 FACS 완충제 중에서 재현탁시키고, 데이터를 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스로부터의 LSRII)를 사용하여 즉시 입수하였다. 세포내 염색을 위해, 샘플을 4℃에서 밤새 저장하고 펠릿화하고 PBS 중 0.5% 사포닌 완충제 중에서 10분 동안 실온에서 재현탁시켜 세포를 투과시켰다. 추가의 회전 후에, 세포를 80μL의 염색 혼합물 플러스 2μL Fc 차단제 및 관심 항체로 PBS 중 0.5% 사포닌 완충제 중에서 30분 동안 4℃에서 염색하였다: 2.5μL 항-마우스 IFN-γ-PE (톤보 바이오사이언시스(Tonbo Biosciences), Cat. 50-7311-U100), 및 2.5μL 항-마우스 TNF-α-APC (바이오레전드, Cat. 506308). 세포를 300μL의 FACS 완충제 중에서의 재현탁 전에 펠릿화하고 세척하고, 데이터를 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스로부터의 LSRII)를 사용하여 즉시 입수하였다.

CT-26 종양 결절을 보유하는 마우스는 전신 PD-1 차단에 대한 불균일한 반응을 생성함.

종양 결절 크기를 마지막 항-PD-1 주사 2일 후 (제21일)에 측정하였다. 도 14a는 43개 종양 중 17개 (40%)가 항-PD-1 치료에 대한 반응을 나타내며, 17개 종양 중 8개 (19%)는 완전히 퇴행되었다는 것을 보여준다. 43개 종양 중 남아있는 26개는 대조군 (CTRL) 비치료된 마우스의 것과 유사한 크기 분포를 나타냈다. 즉, 종양의 60%가 PD-1 차단에 반응하였다. 도 14b에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 치료에 대한 반응을 가졌던 종양은 비치료된 (CTRL) 종양 또는 항-PD-1 치료에 반응하지 않았던 종양과 비교하여 증가된 수의 종양 침윤 백혈구 (TIL)를 갖는다. 마지막 항-PD-1 주사 2-4일 후에 수거된 전체 종양을 택맨 검정을 사용하는 유전자 발현의 분석을 위해 처리하였다. 항-PD-1에 대한 반응은 T 세포 침윤 및 활성화 마커 (도 14c) 및 제I형 인터페론 반응성 마커 (도 14d)의 발현의 수준과 상호 연관되었다.

이들 데이터는 CT-26 종양 모델이 명백한 이중-모드 반응을 따른다는 것을 입증한다: 항종양 반응을 생성할 수 있는 마우스는 종양 성장에 대한 유의한 제어를 입증하나, 반면에 치료에 반응할 수 없는 마우스는 비치료된 종양과 동일한 성장 속도로 진행된다. 게다가, 이들 데이터는 종양 부피 및 T 세포 침윤 및 활성화, 및 제I형 인터페론 반응성 유전자의 발현 사이의 부정적인 상관관계를 보여준다.

종양내 C59-08은 항-PD-1 요법으로부터의 종양 회피를 역전시키고 종양 성장의 장기간, 면역-매개 제어를 일으킴.

도 15a는 시간 경과에 따른 평균 종양 부피를 보여주는 한편, 도 15b-c는 다양한 치료군의 마우스의 장기간 생존을 보여준다. 계속되는 항-PD-1 치료와의 종양내 C59-08은 C59-08 또는 항-PD-1 단독요법과 비교하여 생존율을 개선시킨다. 이러한 개념 증명 연구는 항-PD-1 항체와 C59-08의 조합이 비-반응자를 완전한 종양 거부가 가능한 반응자로 전환시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

CD8+ T 세포는 항-PD-1 플러스 C59-08 조합 치료의 효능을 위해 필요하나, CD4+ T 세포는 그렇지 않음.

도 16은 CD8+ T 세포의 고갈이 항-PD-1 플러스 C59-08 조합 치료의 효능을 무효화시킨다는 것을 보여준다.

항-PD-1 플러스 C59-08 조합 요법은 대측성 종양의 거부를 가능하게 함.

도 17은 19마리 마우스 중 13마리 (68%)가 생존하고 항-PD-1 플러스 C59-08 치료군에서 C59-08-주사된 뿐만 아니라 C59-08-비주사된 종양 결절을 둘 다 거부하였다는 것을 보여준다. 비치료된 마우스는 종양 크기의 감소를 입증하거나 또는 임의의 종양을 거부하는 데 실패하였다 (0% 생존). 따라서, C59-08 플러스 항-PD-1 조합 요법에 의해 생성된 항종양 반응은 C59-08 주사로부터 원위인 부위에서 종양을 제거할 수 있다.

PD-1 차단과 조합된 C59-08은 다관능성 CD8+ T 세포의 침윤 및 활성화를 강력하게 유도함.

수집 시에, 항-PD-1로 치료된 종양을 반응률에 기초하여 군별화하였다. 종양 부피 (mm³)를 식: (폭)² x 길이/2에 따라 계산하였다. 항-PD-1에 대해 비-반응성인 것으로 분류된 종양은 대조군 올리고뉴클레오티드 치료된 종양과 비교하여 약 20%의 부피의 평균 감소를 입증하였다. 대조적으로, 항-PD-1에 대해 반응성인 것으로 분류된 종양은 대조군 올리고뉴클레오티드 치료된 종양과 비교하여 약 80%의 부피의 평균 감소를 입증하였다.

도 18a-d에 제시된 바와 같이, C59-08은 항-PD-1과 강력하게 상승작용하여 IFN-감마 및 TNF-알파를 공동으로 생산할 수 있는 다관능성 세포에서 CD8 T 세포 침윤 및 분화를 유도하는 것으로 보여졌다. 간략하게, 조합 치료된 종양의 CD8+ T 세포 침윤물의 수 및 활성화 상태의 증가는 C59-08의 부재 하에서의 항-PD-1-반응성 종양의 것보다 훨씬 더 양호하다. 이는 C59-08이 항-PD-1 반응자, 뿐만 아니라 항-PD-1 비반응자 둘 다에서 항종양 반응을 개선시키는 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.

C59-08 단독요법은 종양 부피를 감소시키고 인터페론-자극된 및 염증성 유전자의 발현을 유도하는 데 효과적임.

CT26 결장 암종을 보유하는 마우스를 C59-08 또는 대조군 올리고데옥시뉴클레오티드로 종양-내로 (IT) 치료하였다. 제25일 (마지막 치료 3일 후)에, CTRL-ODN으로 주사된 군을 과도하게 확대된 종양으로 인해 안락사시켰다. 제35일 (마지막 치료 13일 후)에, C59-08로 주사된 군을 안락사시켰다. 제35일에, C59-08로 치료된 6마리 마우스 중 2마리는 종양을 거부하였고, 수거가능한 어떠한 조직도 남기지 않았다. 이들 경우에서, 0의 값을 사용하여 평균 종양 부피를 계산하였다. 6개 종양 결절 중 남아있는 4개를 사용하여 TIL을 추출하였다.

도 19a-b에 제시된 바와 같이, C59-08은 종양 성장을 억제하고 치료된 종양으부터 정제된 백혈구에서 IFN-자극된 (ISG15, ISG20, IRF7, MX1, IP-10, 및 IFIT) 및 염증성 (MIG, TNF-알파, 및 IFN-감마) 유전자의 발현을 유도할 수 있었다. 이는 C59-08이 TIL에서 유리한 유전자 발현 패턴의 장기 지속적인 상향조절을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

개요

T 세포 표면 PD-1 수용체에 대한 항체는 암 세포에 의해 켜진 면역 억제 경로를 차단하는 작용을 한다 (Wolchok and Chan, Nature, 515:496-498, 2014). 본원에 기재된 바와 같이 현재, C59-08로 지칭되는 CpG-C ODN은 단독으로, 또는 PD-1에 대한 항체와 조합하여 투여되는 경우, 이식가능한 결장 암종의 뮤린 CT26 모델에서의 확립된 종양의 성장을 억제하는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, C59-08은 종양 성장을 억제하고, TIL의 수를 증가시키고, 바람직한 유전자 발현 패턴을 유도할 수 있었다. 그러나, 단독으로 주어진 C59-08은 종양 거부에 영향을 미칠 수 없었고, C59-08은 항 PD-1 치료와 상승작용하여 확립된 종양의 거부, 및 무재발 생존의 지속기간의 증가를 일으키는 것으로 보여졌다. 놀랍게도, 확립된 항-PD-1 요법에 대한 종양내 C59-08의 부가는 활성화된 T 세포의 두드러진 침윤을 일으켰으며 이는 종양 거부와 상호 연관된다. 따라서, 항-PD1 항체 및 CpG-C ODN의 조합은 단일 작용제 단독보다 종양 거부를 유도함에 있어 우월한 것으로 밝혀졌다.

실시예 5 전이성 흑색종을 갖는 환자에서의 펨브롤리주맙과 조합된 종양내 C59-08의 1b/2상 검정.

파트 1 (1b상 용량 증량)은 전이성 흑색종을 갖는 환자에서 C59-08의 3개의 용량 증량 수준을 평가하고, 파트 2 (2상 확장)는 특정한 흑색종 집단에서의 효능 및 안전성을 추가로 평가하기 위한 확장 코호트로 이루어질 것이다. 환자 집단은

1) 항-프로그램화된 사멸 수용체-1/리간드-1 (항-PD-1/L1) 요법을 받은 적이 없는 전이성 흑색종 환자;

2) 항-PD-1 요법을 받는 동안 확인된 진행성 질환을 갖는 전이성 흑색종 환자

를 포함한다.

파트 둘 다에서, 환자를 200 mg IV 펨브롤리주맙으로 3주마다 진행까지 또는 제1 투여 후 최대 45주 동안 치료하였다.

파트 1에서, 제1일에 시작하여, 환자를 2, 4 또는 8 mg의 C59-08의 4회 매주 투여에 이어 3주마다 1회 투여로 진행까지 또는 제1 투여 후 최대 24주 동안 치료한다. C59-08을 검정 전체에 걸쳐 사용되는 동일한 부위인 병변 A 내로 종양내로 주사한다. 치료 동안의 임의의 시점에, 병변 A가 완전히 퇴행된 경우, 남아있는 C59-08 주사를 병변 A의 부위 내로 종양주위 주사에 의해 제공한다.

확장 코호트에서의 파트 2에서, 각 환자를 C59-08과 조합된 펨브롤리주맙으로 파트 1로부터 선택된 용량을 사용하여 치료한다.

코호트 1 (항-PD-1/L1 나이브)에서, 제22일에 시작하여 환자를 C59-08로 4주 동안 1주 1회에 이어 9주 동안 3주마다 1회 치료한다.

코호트 2 (항-PD-1 요법 중의 진행성 질환)에서, 제1일에 시작하여 환자를 C59-08로 4주 동안 1주 1회에 이어 9주 동안 3주마다 1회 치료한다.

파트 2에서, C59-08을 최대 4개의 병변 (병변 A, 병변 B, 병변 C, 병변 D) 내에 종양내로 주사하고, 검정 전체에 걸쳐 동일한 부위(들)를 사용한다. 치료 동안의 임의의 시점에 주사된 병변(들)이 완전히 퇴행된 경우, C59-08을 주사된 병변의 부위(들) 내로 종양주위 주사에 의해 투여한다.

참고문헌

본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공보, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 진ID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 구체적이고도 개별적으로 참조로 포함된다고 나타내는 바와 동일한 정도로 참조로 포함된다. 미국 가출원 62/169,309 및 62/168,449는 본원에 참조로 포함된다. 이러한 참조로 포함된다는 진술은 심지어 이러한 인용에 참조로 포함된다는 명확한 진술이 바로 이어지지 않는 경우에도, 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 출원인에 의해, 각각의 및 모든 개별 공보, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 진ID 엔트리), 특허 출원 또는 특허 (이들 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인됨)에 관한 것으로 의도된다. 명세서 내에, 존재하는 경우, 참조로 포함된다는 명확한 진술을 포함시키는 것은 참조로 포함된다는 이 일반적 진술을 어떠한 방식으로도 약화시키지 않는다. 본원의 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 선행 기술과 관련이 있음을 인정하는 것으로 의도되지 않거나 또는 이들 공보 또는 문헌의 내용 또는 일자로서 어떠한 인정도 받지 않아야 한다. 참조가 본 명세서에 제공된 정의와 충돌하는 본 용어에 대한 정의를 제공하는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 본 발명을 해석하는 데 사용될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MERCK SHARP & DOHME CORP. DYNAVAX TECHNOLOGIES CORPORATION YU, YING DENKER, ANDREW EVAN SADEKOVA, SVETLANA PHAN, UYEN TRUONG KASTELEIN, ROBERT A. KAUFMAN, DAVID ROSS COFFMAN, ROBERT L. 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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Nivolumab Light Chain <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 25 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26 Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 27 Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 28 His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 29 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr His Met Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 30 Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 31 His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 <210> 34 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 35 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 36 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 37 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Trp Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 38 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> This region may encompass 0-3 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> misc_feature <222> (4)..(23) <223> This region may encompass 1-4 'tcgnn' repeats wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (12)..(13) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (26)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (26)..(185) <223> This region may encompass 1-20 'nncgnncg' repeats wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (30)..(31) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (42)..(43) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (46)..(47) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (48)..(49) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (50)..(51) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (54)..(55) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (58)..(59) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (62)..(63) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (64)..(65) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (66)..(67) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (70)..(71) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (74)..(75) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (78)..(79) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (80)..(81) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (82)..(83) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (86)..(87) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (88)..(89) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (90)..(91) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (94)..(95) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (96)..(97) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (98)..(99) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (102)..(103) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (104)..(105) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (106)..(107) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (110)..(111) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (112)..(113) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (114)..(115) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (118)..(119) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (120)..(121) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (122)..(123) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (126)..(127) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (128)..(129) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (130)..(131) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (134)..(135) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (136)..(137) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (138)..(139) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (142)..(143) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (144)..(145) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (146)..(147) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (150)..(151) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (152)..(153) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (154)..(155) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (158)..(159) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (160)..(161) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (162)..(163) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (166)..(167) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (168)..(169) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (170)..(171) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (174)..(175) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (176)..(177) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (178)..(179) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (182)..(183) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (184)..(185) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (186)..(274) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (186)..(274) <223> This region may encompass 0-89 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 38 nnntcgnntc gnntcgnntc gnnnnnncgn ncgnncgnnc gnncgnncgn ncgnncgnnc 60 gnncgnncgn ncgnncgnnc gnncgnncgn ncgnncgnnc gnncgnncgn ncgnncgnnc 120 gnncgnncgn ncgnncgnnc gnncgnncgn ncgnncgnnc gnncgnncgn ncgnncgnnc 180 gnncgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 274 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(8) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (4)..(8) <223> This region may encompass 0-5 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> misc_feature <222> (9)..(40) <223> This region may encompass 1-4 'nncgnncg' repeats wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (9)..(10) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (41)..(60) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (41)..(60) <223> This region may encompass 0-20 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 39 tcgnnnnnnn cgnncgnncg nncgnncgnn cgnncgnncg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 <210> 40 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (4)..(8) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (4)..(8) <223> This region may encompass 0-5 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (27)..(46) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (27)..(46) <223> This region may encompass 0-20 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 40 tcgnnnnntt cgaacgttcg aacgttnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 46 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 41 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 42 tcgttcgaac gttcgaacgt tcgaa 25 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 43 tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 44 tcgaacgttc gaacgttcga atttt 25 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 45 tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 46 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacgtta 27 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 47 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacgtt 26 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 48 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacgt 25 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 49 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacg 24 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 50 tcgtaacgtt cgaacgttcg aac 23 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 51 tcgtaacgtt cgaacgttcg aa 22 <210> 52 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 53 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 54 tgactgtgaa ccttagagat ga 22 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRL1 <400> 55 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRL2 <400> 56 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRL3 <400> 57 Lys Gln Ser Tyr Asp Val Val Thr 1 5 <210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3; Mature Variable Region <400> 58 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Val Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRH1 <400> 59 Ser Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRH1 <400> 60 Gly Thr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His 1 5 10 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRH2 <400> 61 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Ile 1 5 10 15 Asp <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3 CDRH3 <400> 62 Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 63 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Antibody MEB037.22C3; Mature Variable Region <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Gln or pGlu <400> 63 Xaa Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr His Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Ile Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> This sequence may encompass 1-4 'nncgnncg' repeats wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (9)..(10) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> May or may not be present <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> May or may not be present <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 64 nncgnncgnn cgnncgnncg nncgnncgnn cg 32 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 'tcgnn' repeats wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (9)..(10) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <221> modified_base <222> (19)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> This region may encompass 0-2 nucleotides wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 65 tcgnntcgnn tcgnntcgnn 20

Claims (32)

1. PD-1 길항제 및 TLR9 효능제를 포함하는 조합 요법을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 TLR9 효능제는 CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드인, 개체에서 암을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, PD-1 길항제가 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
3. 제1항에 있어서, 개체가 인간이고, PD-1 길항제가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하고 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
4. 제1항에 있어서, 개체가 인간이고, PD-1 길항제가 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
5. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 또한 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L2의 결합을 차단하는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 (a) 서열식별번호: 1, 2 및 3의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 4, 5 및 6의 중쇄 CDR; 또는 (b) 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
7. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
8. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-PD-1 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 21을 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 22를 포함하는 것인 방법.
9. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-PD-1 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 23을 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 24를 포함하는 것인 방법.
10. 제4항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 변이체, 또는 니볼루맙인 방법.
11. 제1항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가
    (a) N이 뉴클레오시드이고, x = 0, 1, 2 또는 3이고, y = 1, 2, 3 또는 4이고, w = 0, 1 또는 2이고, p = 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v = 0 내지 89이고 z = 1 내지 20이고, X₁ 및 X₁'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'가 자기-상보적 뉴클레오시드인 5'-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z,N_v (서열식별번호: 38); 및
    (b) 적어도 8개 염기 길이의 회문식 서열이며, (X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z 서열의 처음 (X₁X₂CGX₂'X₁')을 포함하는 회문식 서열
    로 이루어지고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 12 내지 100개 염기 길이인 방법.
12. 제11항에 있어서, x = 0이고, y = 1이고, w = 0이고, p = 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v = 0 내지 20이고 z = 1, 2, 3 또는 4인 방법.
13. 제1항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 TCGN_q(X₁X₂CGX₂'X₁'CG)_zN_v (서열식별번호: 39)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, v = 0 내지 20이고, z = 1 내지 4이고, X₁ 및 X₁'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'는 자기-상보적 뉴클레오시드이고, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 염기 길이인 방법.
14. 제1항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGN_qTTCGAACGTTCGAACGTTN_s-3' (서열식별번호: 40)로 이루어지며, 여기서 N은 뉴클레오시드이고, q = 0, 1, 2, 3 또는 4이고, s = 0 내지 20이고, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 염기 길이인 방법.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
17. 제11항에 있어서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (a) 서열식별번호: 26, 27 및 28의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 29, 30 및 31의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 방법.
19. 제17항에 있어서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열식별번호: 32 및 서열식별번호: 33의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
20. 제17항에 있어서, 항-IL-10 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-IL-10 모노클로날 항체이고, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 34를 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 35를 포함하는 것인 방법.
21. 제17항에 있어서, 항-IL-10 항체가 항-IL-10 hum 12G8, 또는 항-IL-10 hum 12G8 변이체인 방법.
22. 먼저 암으로 진단된 인간 개체에게 펨브롤리주맙을 투여하고, 이어서 3주 후에 서열식별번호: 45로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 종양내로 투여하는 것을 포함하는, 암으로 진단된 인간 개체를 치료하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 개체에게 제1일에 시작하여 200 mg의 펨브롤리주맙을 Q3W 투여하고 서열식별번호: 45의 올리고뉴클레오티드를 제22일에 시작하여 4주 동안 1주 1회 2.0, 4.0 또는 8.0 mg의 용량에 이어 3주마다 1회 2.0, 4.0 또는 8.0 mg의 용량으로 종양내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 개체가 이전에 항-PD-1 또는 항-PD-L1 요법으로 치료된 적이 없거나 또는 선행 항-PD-1 요법을 받는 동안 진행성으로 확인된 것인 방법.
25. 제22항 또는 제23항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖는 나트륨 염이고, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
26. 제1항에 있어서, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.
27. 제1항 및 제22항 내지 제26항에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종, 신세포 암종, 비소세포 폐암, 방광암 또는 결장직장암인 방법.
28. 제1항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.
29. 제1항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (서열식별번호: 45)로 이루어진 서열을 갖고, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종, 신암종, NSCLC, 방광암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
31. 제1항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (서열식별번호: 42)로 이루어진 서열을 갖는 것인 방법.
32. 제1항에 있어서, PD-1 길항제가 서열식별번호: 7, 8 및 9의 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 10, 11 및 12의 중쇄 CDR을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, CpG-C 유형 올리고뉴클레오티드가
    (a) N이 뉴클레오시드이고, x = 0, 1, 2 또는 3이고, y = 1, 2, 3 또는 4이고, w = 0, 1 또는 2이고, p = 0 또는 1이고, q = 0, 1 또는 2이고, v= 0 내지 89이고 z = 1 내지 20이고, X₁ 및 X₁'가 자기-상보적 뉴클레오시드이고, X₂ 및 X₂'가 자기-상보적 뉴클레오시드인 5'-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z,N_v (서열식별번호: 38); 및
    (b) 적어도 8개 염기 길이의 회문식 서열이며, (X₁X₂CGX₂'X₁'(CG)_p)_z 서열의 처음 (X₁X₂CGX₂'X₁')을 포함하는 회문식 서열
    로 이루어지고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 12 내지 100개 염기 길이인 방법.

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