CN115996950A - 抗tnfr2抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对TNFR2具特异性的单克隆抗体和其抗原结合片段，以及使用所述单克隆抗体和其抗原结合片段来治疗癌症或自身免疫病症的方法，包括与PD‑1/PD‑L1免疫检查点的拮抗剂组合的疗法。

Description

抗TNFR2抗体和其用途
相关申请的引用
本申请要求2020年1月6日提交的美国临时专利申请号62/957,543和2020年6月19日提交的美国临时专利申请号63/041,234的申请日的权益，上文所提及的申请各自的完整内容(包括任何图式和序列表)均以引用的方式并入本文中。
背景技术
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)还称为肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(TNFRSF1B)和CD120b，是75kDa的I型跨膜蛋白，其含有具有4个富含半胱氨酸的结构域(CRD1至CRD4)的细胞外结构域(ECD，残基1-257)、跨膜结构域(TM，残基258-287)和具有TRAF2结合结构域的细胞内结构域(ICD，残基288-461)。TNFR2与另一TNFα受体，即肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)共享相对较低的序列同一性，并且其细胞外结构域之间的同源性仅为28％。
TNFR2以3:3三聚化模式结合至TNFα配体。已解析出TNFR2与TNFα的共晶体结构，并且已显示每个TNFR2分子结合至两个TNFα配体。另外，TNFα以420pM的Kd结合TNFR2，比其与TNFR1的结合(Kd＝19nM)弱约20倍。自然地，TNFα在其他条件相同时优先结合至TNFR1。
在正常T细胞中，TNFα-TNFR2相互作用经由NFkB信号传导途径触发细胞存活信号。然而，在自身免疫T细胞中，TNFα-TNFR2相互作用经由半胱天冬酶途径触发细胞凋亡信号。
人类TNFR2显示与小鼠TNFR2 62％的氨基酸序列同源性，但其与恒河猴TNFR297％同一。
TNFR1广泛地表达，而TNFR2表达主要局限于免疫细胞，并且主要由肿瘤浸润免疫抑制性CD4+FoxP3+调控T细胞(Treg)高度表达。最新研究已表明，TNFR2在刺激作为抗肿瘤免疫反应的主要检查点的Treg的活化和增殖方面起关键作用(Chen和Oppenheim,SciSignal10:eaal2328,2017)。TNFR2经由其配体TNFα的活化引起NFkB信号传导活化和TNFR2+Treg扩增。TNFR2还在CD8和CD4 Tconv细胞以及骨髓细胞中表达。特别地，TNFR2在耗竭的CD8 T细胞中表达，类似于经临床验证的免疫检查点。
T调控细胞(Treg)是具有不同临床应用的T淋巴球的一个小子集。一方面，TNFR2+Treg具有高度免疫抑制性，并且抑制活性比高度抑制性CD103+ Treg更强效(J Immunol179:154-161,2007；J Immunol180:6467-6471,2008)。因此，TNFR2+ Treg可用于依赖Treg的免疫抑制活性的疗法中，例如用于移植、过敏、哮喘、传染病、移植物抗宿主病(GVHD)和自身免疫性。举例说来，在实验GVHD小鼠模型中，CD4+CD25高Foxp3+胸腺源性Treg耗竭可能加强GVHD(Cohen等人,JEM 2002)。
TNFR2还在某些癌症(例如乳癌、子宫颈癌、结肠癌和肾癌)中表达(Front.Immunol.9:1170,2018)，并且可参与所述癌症中的免疫耐受。TNFR2的配体(TNFα)会促进所述癌细胞的存活和生长。已显示，TNFR2通过在肿瘤细胞中采用不同的信号途径参与肿瘤发展的多个过程。举例说来，核因子-κB(NFκB)参与TNFR2相关的上皮细胞的恶性转化。已显示，AKT信号传导是诱癌作用、肿瘤生长和血管生成中TNFR2的另一介体。同时，肌凝蛋白轻链激酶(MLCK)和细胞外信号调控的激酶(ERK)对于上文所提及的TNFR2功能也至关重要。因此，在肿瘤免疫中，抑制TNFR2功能可抑制Treg功能并且增加抗肿瘤T细胞反应。
因此，需要开发出治疗试剂以允许通过刺激TNFR2对TNFR2+Treg的功能来增强Treg的免疫抑制功能以治疗自身免疫病症，或抑制TNFR2活化来治疗诸如癌症的疾病。
发明内容
一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对人类TNFR2具特异性，并且其中所述单克隆抗体包含：(1a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:3的HCVR CDR3序列；和(1b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:4的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:5的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:6的LCVR CDR3序列；或(2a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:14的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:15的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:16的HCVR CDR3序列；和(2b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:17的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:18的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:19的LCVR CDR3序列；或(3a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:26的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:27的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:28的HCVR CDR3序列；和(3b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:29的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:30的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:31的LCVR CDR3序列；或(4a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:39的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:40的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:41的HCVR CDR3序列；和(4b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:42的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:43的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:44的LCVR CDR3序列；或(5a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:51的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:52的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:53的HCVR CDR3序列；和(5b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:54的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:55的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:56的LCVR CDR3序列；或(6a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:63的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:64的HCVR CDR2序列和SEQ IDNO:65的HCVR CDR3序列；和(6b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:66的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:67的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:68的LCVR CDR3序列。
在某些实施方案中，在所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段中，(1A)HCVR序列是SEQ ID NO:7；和/或(1B)LCVR序列是SEQ ID NO:8，或(2A)HCVR序列是SEQ ID NO:20；和/或(2B)LCVR序列是SEQ ID NO:21，或(3A)HCVR序列是SEQ ID NO:32；和/或(3B)LCVR序列是SEQ ID NO:33，或(4A)HCVR序列是SEQ ID NO:45；和/或(4B)LCVR序列是SEQ ID NO:46，或(5A)HCVR序列是SEQ ID NO:57；和/或(5B)LCVR序列是SEQ ID NO:58，或(6A)HCVR序列是SEQ ID NO:69；和/或(6B)LCVR序列是SEQ ID NO:70。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体具有：(1a)SEQ ID NO:9的重链序列；和/或(1b)SEQ ID NO:10的轻链序列，或(2a)SEQ ID NO:22的重链序列；和/或(2b)SEQ ID NO:23的轻链序列，或(3a)SEQ ID NO:34的重链序列；和/或(3b)SEQ ID NO:35的轻链序列，或(4a)SEQ ID NO:47的重链序列；和/或(4b)SEQ ID NO:48的轻链序列，或(5a)SEQ ID NO:59的重链序列；和/或(5b)SEQ ID NO:60的轻链序列，或(6a)SEQ ID NO:71的重链序列；和/或(6b)SEQ ID NO:72的轻链序列。
在某些实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人类-小鼠嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、CDR移植抗体或表面重塑抗体。
在某些实施方案中，其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与恒河猴TNFR2交叉反应，但大体上不与小鼠TNFR2交叉反应。
在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包括其氨基酸序列的一个或多个点突变，所述一个或多个点突变经设计以改进抗体的可开发性。举例说来，在某些实施方案中，所述一个或多个点突变使得抗体在其在宿主细胞中表达期间、其在制造过程中的纯化期间和/或配制过程期间和/或其施用于受试者患者期间更稳定。在某些实施方案中，所述一个或多个点突变使得抗体不太可能在制造和/或配制过程期间聚集。
在某些实施方案中，本发明提供具有最小化或减少的可开发性问题(例如去除或减小的疏水性和/或优化的电荷)的治疗抗体，这是通过置换其序列中(例如其一个或多个CDR中)的一个或多个氨基酸来实施。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段大体上不与TNFR1交叉反应。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段以小于约25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、2nM或1nM的Kd结合TNFα。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段增强TNFα与TNFR2之间的结合；增强TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下促进TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段增强Treg上TNFα介导的CD25表达。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:13的表位。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段促进TNFα与TNFR2的结合；抑制TNFα与TNFR2的结合；或对TNFα与TNFR2的结合无明显影响。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段不会阻断、抑制或以其他方式大体上拮抗TNFα与TNFR2的结合。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是TNFR2的激动剂，或刺激TNFR2信号传导(例如在TNFα存在下)，其中激动剂功能优选是不依赖Fc的。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段活化体外CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、其他效应T细胞和/或NK细胞。
本发明的另一方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与任一本发明抗体的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合至SEQ ID NO:13的表位。
本发明的另一方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合至SEQ ID NO:13的表位。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段增强TNFα与TNFR2之间的结合；增强TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下促进TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制TNFα与TNFR2之间的结合；抑制TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下抑制TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段促进Treg扩增。
本发明的另一方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合至同一表位。
本发明的另一方面提供一种治疗有需要的患者的癌症或自身免疫病症(AID，例如移植物抗宿主病(GVHD)和类风湿性关节炎)的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗AID，其中所述方法还包括施用第二剂，例如低剂量的抗IL2剂以治疗慢性GVHD，或抗TNFα剂(例如阿达木单抗(adalimumab)、英利昔单抗(infliximab)、依那西普(etenercept)、戈利木单抗(golimumab)等)以治疗类风湿性关节炎、慢性斑块状牛皮癣、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、IBS、EAE和非传染性眼色素层炎。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症，其中所述方法还包括施用免疫检查点的拮抗剂。
在某些实施方案中，所述免疫检查点是PD-1/PD-L1免疫检查点。
在某些实施方案中，所述免疫检查点的拮抗剂是对PD-1或PD-L1具特异性的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗体是抗PD-1抗体，例如西米普利单抗(cemiplimab)、纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
在某些实施方案中，所述抗体是抗PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、KN035或CK-301。
在某些实施方案中，所述免疫检查点的拮抗剂是PD-1/PD-L1的(非抗体)肽抑制剂，例如AUNP12；PD-L1的小分子抑制剂，例如CA-170，或大环肽，例如BMS-986189。
在某些实施方案中，所述癌症是乳癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、黑色素瘤、皮肤癌(例如鳞状细胞癌或基底细胞癌)、淋巴瘤或白血病。在某些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。
在某些实施方案中，所述方法还包括向患者施用化学治疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、肿瘤免疫剂和/或抗赘瘤组合物。
本发明的另一方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的重链或轻链或其抗原结合部分。
在某些实施方案中，所述多核苷酸经密码子优化以在人类细胞中表达。
本发明的另一方面提供一种载体，所述载体包含本发明的多核苷酸。
在某些实施方案中，所述载体是表达载体(例如哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
附图说明
图1示出人类-小鼠嵌合单克隆抗体HFB3-1、HFB3-3、HFB3-6、HFB3-14、HFB3-18、HFB3-19、HFB3-20、HFB3-21、HFB3-22、HFB3-23、HFB3-24和HFB3-25的VH和VL区的序列比对，以及其共有序列。
图2A示出针对重组人类TNFR2的细胞外结构域产生的所选人类-小鼠嵌合单克隆抗体的结合亲和力。针对表达人类TNFR2(CHO.hHFB3)或恒河猴TNFR2(CHO.mkHFB3)的CHO细胞测量测试抗体和同型匹配阴性对照抗体的EC50和Emax值。
图2B示出不同的抗TNFR2单克隆抗体可促进(HFB3-1)或抑制(HFB3-18)TNFα与TNFR2的结合，或对结合无影响(HFB3-6)。
图3示出人类-小鼠嵌合单克隆抗体不与亲本CHO细胞系结合并且不与表达小鼠TNFR2的CHO细胞结合(HFB3-18和HFB3-19抗体的边缘结合除外)。
图4A示出人类-小鼠嵌合抗体特异性针对TNFR2而非TNFR1的结合特异性。
图4B示出人类-小鼠嵌合抗体HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18对His标记的重组人类TNFR2的Kd、k缔合和k解离值。
图5示出TNFR2在肿瘤浸润淋巴球中的T细胞亚型、尤其耗竭的CD8 T细胞上的表达。
图6示出TCR活化(底部图)和非TCR活化(顶部图)的原代Treg、CD8和CD4 Tconv上抗TNFR2嵌合单克隆抗体的细胞结合。HFB3抗体可优先识别由CD3/CD28共刺激活化(TCR活化)的原代T细胞。
图7示出，本发明的某些HFB3抗体(包括HFB3-1、HFB3-14、HFB3-18、HFB3-23、HFB3-24和HFB3-25)触发NFκB信号传导，并且在TNFα配体存在下可增强所述效应。
图8示出，某些本发明单克隆抗体(包括HFB3-1、HFB3-14、HFB3-18和HFB3-25)和CD3/CD28的共刺激引起CD8和CD4 Tconv以剂量依赖性方式增殖。
图9示出，本发明的抗TNFR2单克隆抗体(例如HFB3-1hz6-hG1AA，它是HFB3-1的人源化形式)在Treg存在下以剂量依赖性方式促进效应T细胞(CD8和CD4 Tconv)的细胞增殖。
图10示出本发明抗TNFR2抗体缺乏ADCC效应。
图11A和图11B示出TNFR2(称为HFB2003)的His标记的细胞外结构域(ECD)的多个特征(包括TNFα结合位点)，以及单克隆抗体HFB3-1和HFB3-14以及HFB3-18(图11A)或HFB3-6(图11B)的表位定位的结果。这些抗体是具有人类IgG1 Fc区的小鼠嵌合抗体，并且因此还分别称为HFB3-1-hG1、HFB3-14-hG1、HFB3-18-hG1或HFB3-6-hG1。图11B还包括基准抗体SBT-1和SBT-4(基准1和2)的表位定位数据。HFB3-1抗体结合至ECD的CRD2区，HFB3-14和HFB3-6结合至ECD的CRD3区，而HFB3-18结合至ECD的CRD1区。
图11C提供3-D模型，示出TNFR2-TNFα复合物上HFB3-1、HFB3-14、HFB3-6以及HFB-3-18的结合位点。
图12A示出嵌合单克隆抗体HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18的人源化变体与表达人类TNFR2的CHO细胞(CHO.hTNFR2)结合，但不与亲本CHO细胞结合。
图12B示出所选人源化抗TNFR2单克隆抗体的结合亲和力。针对表达人类TNFR2的CHO细胞(CHO.hHFB3)测量测试人源化抗体和亲本嵌合抗体的EC50值。
图13示出所选人源化抗TNFR2单克隆抗体的结合亲和力。针对表达恒河猴TNFR2的CHO细胞(CHO.mkHFB3)测量测试人源化抗体和亲本嵌合抗体的EC50值。
图14A示出在ELISA分析中，人源化抗TNFR2抗体与重组人类和食蟹猴TNFR2结合，但不与重组人类TNFR1结合。
图14B示出基于AHC(抗人类IgG Fc捕获)生物传感器测量，人源化变体和亲本嵌合单克隆抗体HFB3-1和HFB3-14对重组人类TNFR2的结合亲和力的结果。值是从不同的两天获得的两次实验的平均值。
图15示出人源化抗TNFR2单克隆抗体与TCR活化的CD8 T细胞的细胞结合。
图16示出人源化抗TNFR2单克隆抗体使TCR活化的CD4 T细胞增殖的共刺激效应。
图17示出，使用某些人源化变体抗TNFR2抗体和TNFα共刺激Treg会引起NFκB下游信号传导。
图18示出，本发明人源化变体抗TNFR2抗体在存储时是稳定的。
图19示出抗TNFR2单克隆抗体HFB3-18(而非HFB3-1和HFB3-14)在共刺激原代T细胞时的FcγR交联依赖性。
图20示出所选人源化抗TNFR2抗体在TNFα存在或不存在下使CD8 T细胞增殖的确认的共刺激效应。
图21示出，在人源化TNFR2敲入CD8和CD4 Tconv细胞中在CD3/CD28介导的TCR活化和25ng/mL TNFα存在下，本发明抗TNFR2单克隆抗体离体共刺激下游NFκB信号传导。
图22示出在用可溶性IL-2(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)刺激后，人源化HFB3-1hz6-hG1抗体和亲本HFB3-1-hG1抗体对分离的自然杀手(NK)细胞的离体活化。顶部图示出实验的时间线。CD107α和TNFR2表达由HFB3-1hz6-hG1和HFB3-1-hG1以剂量依赖性方式上调，但同型对照和抗OX40抗体(BMS)无法触发短期NK活化。
图23示出在用板结合的抗CD3(1μg/mL)和可溶性抗CD28(1μg/mL)刺激后，HFB3-1hz6-hG1和亲本小鼠HFB3-1-hG1对全外周血单核细胞部分中的自然杀手(NK)细胞的离体活化。顶部图示出实验的时间线。在CD3-/CD56+细胞中，CD107α表达由HFB3-1hz6-hG1和HFB3-1-hG1以剂量依赖性方式上调，但对照抗OX40抗体(MBS)无法触发短期NK活化。
图24A示出小鼠MC38肿瘤模型中药效学实验的时间线。间隔3天腹膜内施用2个剂量的HFB3-1-hG1(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg剂量)或10mg/kg的同型匹配的对照抗体(TT)。
图24B示出抗体施用对MC38肿瘤中的总免疫细胞计数的体内影响。施用10mg/kg的HFB3-1-hG1增加CD45+细胞的绝对细胞数。基于单因子ANOVA测试，p值<0.05(*)。
图24C示出对MC38肿瘤中不同免疫细胞的细胞计数的体内影响。施用10mg/kg的HFB3-1-hG1增加肿瘤微环境中CD8+、常规CD4+T和NK细胞的绝对细胞数，但不会改变T调控细胞的数目。基于单因子ANOVA测试，*p值<0.05。
图25A示出肿瘤浸润白血球上由0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg剂量的所注射抗体HFB3-1-hG1或10mg/kg的对照抗体占据的TNFR2受体的百分比。仅10mg/kg剂量的HFB3-1-hG1产生药物受体占据。基于单因子ANOVA测试，p值<0.05(*)、0.01(**)或0.001(***)。
图25B示出所选外周血细胞上由0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg剂量的所注射抗体HFB3-1-hG1或10mg/kg的对照抗体占据的TNFR2受体的百分比。10mg/kg和1mg/kg剂量的HFB3-1-hG1产生相当的药物受体占据。基于单因子ANOVA测试，p值<0.05(*)、0.01(**)或0.001(***)。
图26A示出在图24A中的实验的第4天血液中的抗体浓度。在血液中可检测到10mg/kg和1mg/kg剂量的HFB3-1-hG1。基于单因子ANOVA测试，p值<0.001(***)或0.0001(****)。
图26B示出在图24A中的实验的第4天血液中的可溶性TNFR2。施用10mg/kg和1mg/kg的HFB3-1-hG1增加可在血液中检测到的TNFR2的量。基于单因子ANOVA测试，p值<0.001(***)或0.0001(****)。
图27A和图27B示出，人源化单克隆抗体(例如HFB3-1hz6和HFB3-18hz1)具有与大鼠抗mPD-1单克隆抗体相比相似的治疗功效。
图28示出，人源化HFB3-1hz6单克隆抗体具有治疗功效，与小鼠抗mPD-1单克隆抗体一样。
图29示出，在两种不同剂量(3mg/kg和10mg/kg)下，人源化HFB3-1hz6单克隆抗体抑制肿瘤生长并且增加带有肿瘤的小鼠的寿命，并且与单独使用抗mPD-1的治疗相比，使用HFB3-1hz6和抗mPD-1抗体的组合治疗更佳地延长存活。
图30示出，人源化HFB3-1hz6单克隆抗体随时间从食蟹猴体内消除，并且与从≤3mg/kg的CD3×CD20双特异性IgG报告的数据(虚线)相比，在注射15mg/kg、50mg/kg或150mg/kg的HFB3-1hz6-hG1后未观察到细胞因子升高。
图31示出与正常猴的历史数据范围(每一个图中的左线和右线)相比，注射15mg/kg、50mg/kg或150mg/kg的HFB3-1hz6-hG1后的细胞计数分析。
具体实施方式
1.概述
TNFR2最近已成为肿瘤免疫学的有前景的治疗靶。肿瘤微环境(TME)中调控和效应T细胞上的TNFR2表达与T细胞耗竭和对免疫检查点阻断的抗性相关。本文所述的发明提供针对人类TNFR2的抗体，其可用作抗癌剂。尽管不希望受限于任何特定理论，但认为用本发明抗TNFR2抗体共刺激效应T细胞会增强效应T细胞的抗肿瘤活性。
根据本文所述的发明，用人类TNFR2(rhTNFR2)的重组细胞外结构域(ECD)使小鼠免疫以产生一系列不同的抗体，所述抗体经表征用于结合、交叉反应性、选择性和功能活性。所述抗体是针对其在Treg细胞存在下诱导CD8+和CD4+效应T细胞增殖的能力和针对增加的NFkB信号传导来选择。所选抗体还合意地显示对rhTNFR2的猴直系同源物的交叉反应性，这将为有益于人类治疗剂在动物中的毒性研究的特征。其他期望特征包括本发明抗体增强人类重组TNFα与TNFR2的结合的能力。
最初选择对人类TNFR2具有亚纳摩尔浓度或一位数的纳摩尔浓度的结合亲和力的两种小鼠抗体HFB3-1和HFB3-14来用于进一步表征和人源化。表位定位实验显示，这两种抗体识别TNFR2的不同结构域，其中HFB3-1结合至CRD2结构域内的区域，并且HFB3-14在CRD3区内结合。然而，尽管其结合位点不同，但两种抗体对TNFR2具有选择性，与食蟹猴和恒河猴直系同源物交叉反应，并且增强人类重组TNFα与TNFR2的结合，以及刺激CD8和常规CD4 T细胞(Tconv)。
这些小鼠抗体的数种人源化变体(包括HFB3-1hz6和HFB3-14hz1c)保留其各别亲本抗体的结合和交叉反应性特征。与未刺激的T细胞相比，人源化抗体优先结合至TCR活化的原代CD8和CD4 T细胞，并且增强CD3/CD28诱导的T细胞活化和增殖。这一共刺激作用机制不依赖于交联，并且与抗体增强NFκB信号传导并诱导NFκB下游靶基因上调的能力一致。
另外，两种人源化抗体(HFB3-1hz6和HFB3-14hz1c)展示良好的可开发性特征并且在高温、低pH条件下和数个冷冻/解冻周期后稳定。还在小鼠模型中观察到先导抗体的良好血浆暴露。进行小鼠肿瘤模型中这些抗体的体内功效评估以及初始毒性分析。
还鉴别出第三种小鼠单克隆抗体HFB3-18，其具有稍低(两位数nM)的结合亲和力，但与抗mPD-1单克隆抗体相比抑制体内肿瘤生长的能力相同(如果非较佳)，并且产生其人源化形式。
这些抗体的功能特征以及其有利的可开发性和药物动力学特征支持其开发为癌症患者的潜在新颖免疫治疗选择。
本发明的详细方面进一步并且单独描述于下文各个部分中。然而，应理解，本发明的任一实施方案(包括仅在实施例或图式中描述的实施方案和仅在下文一个部分下描述的实施方案)可与本发明的任何其他实施方案组合。
2.定义
术语“抗体”在最广泛意义上涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。术语“抗体”还可广泛地指包含重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够结合至抗原。术语“抗体”还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体和多个物种(例如小鼠、人类、食蟹猴等)的抗体。
然而，在较狭窄意义上，“抗体”是指各种单克隆抗体，包括嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和人类单克隆抗体，尤其本发明的人源化单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。在一些实施方案中，抗体包含含有重链可变区和重链恒定区的至少一部分的至少一条重链(HC)，和含有轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分的至少一条轻链(LC)。在一些实施方案中，抗体包含两条重链，其中每一重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分，和两条轻链，其中每一轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。
如本文所用，单链Fv(scFv)或包含例如含有所有六个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单一多肽链的任何其他抗体被视为具有重链和轻链。在一些此类实施方案中，重链是抗体中包含三个重链CDR的区域并且轻链是抗体中包含三个轻链CDR的区域。
如本文所用，术语“重链可变区(HCVR)”是指至少包含重链CDR1(CDR-H1)、框架2(HFR2)、CDR2(CDR-H2)、FR3(HFR3)和CDR3(CDR-H3)的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1(HFR1)的至少一部分(例如全部)，其为CDR-H1的N端，和/或FR4(HFR4)的至少一部分(例如全部)，其为CDR-H3的C端。
如本文所用，术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区还包括ε和μ。每一重链恒定区对应于抗体同型。举例说来，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体，并且包含μ恒定区的抗体是IgM抗体。
某些同型可进一步细分成子类。举例说来，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1(包含μ1恒定区)和IgM2(包含μ2恒定区)。
如本文所用，术语“重链”是指包含至少重链可变区的多肽，具有或不具有前导序列。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列，并且具有或不具有C端赖氨酸。
如本文所用，术语“轻链可变区(LCVR)”是指包含轻链CDR1(CDR-L1)、框架(FR)2(LFR2)、CDR2(CDR-L2)、FR3(LFR3)和CDR3(CDR-L3)的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1(LFR1)的至少一部分(例如全部)和/或FR4(LFR4)的至少一部分(例如全部)。
如本文所用，术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。
如本文所用，术语“轻链”是指包含至少轻链可变区的多肽，具有或不具有前导序列。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列。
术语“抗体片段”或(抗体的)“抗原结合部分”包括但不限于能够结合抗原的片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。在某些实施方案中，抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
术语“Fab”是指分子质量为约50,000道尔顿的抗体片段，并且具有结合至抗原的活性。它包含通过二硫桥连结的约一半的重链N端侧和整个轻链。Fab尤其可通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白来获得。
术语“F(ab’)2”表示具有约100,000道尔顿和结合至抗原的活性的片段。这一片段稍大于经由铰链区中的二硫桥连结的两个Fab片段。这些片段是通过用蛋白酶胃蛋白酶处理免疫球蛋白来获得。Fab片段可通过裂解铰链区的二硫桥从F(ab')2片段获得。
单一Fv链“scFv”对应于使用编码VL和VH结构域的基因和编码意图结合这些结构域的肽的序列合成的VH:VL多肽。根据本发明的scFv包括例如使用基因重组技术维持在适当构象中的CDR。
“scFv”的二聚体对应于通过肽键连结在一起的两个scFv分子。这一Fv链通常是包括编码通过编码肽的接头序列连结的VH和VL的基因的融合基因的表达结果。人类scFv片段可包括优选借助于使用基因重组技术维持在适当构象中的CDR区。
“dsFv”片段是通过二硫桥稳定化的VH-VL异二聚体；它可为二价(dsFV2)。二价Sc(Fv)2或多价抗体的片段可通过单价scFv的缔合自发形成或通过利用肽结合序列连结scFv片段来产生。
Fc片段是抗体的生物性质、尤其它由免疫效应物识别或活化补体的能力的支撑。它由重链中超出铰链区的恒定片段组成。
术语“双功能抗体”表示具有两个抗原固定位点的小抗体片段。这些片段在同一VH-VL多肽链中包含连结至可变轻链结构域VL的可变重链结构域VH。使用因太短以致于无法匹配同一链的两个结构域的结合序列，必然与另一链的两个互补结构域匹配并且因此产生两个抗原固定位点。
“结合至与参考抗体相同的表位的抗体”可通过抗体竞争分析来确定。它是指在竞争分析中阻断50％或更多的参考抗体与其抗原的结合的抗体，反之，参考抗体在竞争分析中阻断50％或更多的抗体与其抗原的结合。术语“竞争”在用于竞争同一表位的抗体的上下文中时意指，抗体之间的竞争是通过其中所测试抗体防止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的分析来确定。
可使用多种类型的竞争性结合分析，例如：固相直接或间接放射性免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见例如Stahli等人,1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记分析；固相直接标记夹心分析(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press)；使用I125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等人,1990,Virology 176:546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.)。
通常，此类分析涉及使用结合至带有这些(未标记的测试抗原结合蛋白和经标记的参考抗体)中的任一者的固体表面或细胞的纯化的抗原。通过测定在测试抗体存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体过量存在。通过竞争分析鉴别的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和结合至相邻表位的抗体，所述相邻表位足够靠近参考抗体结合的表位以发生空间位阻。在一些实施方案中，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的参考抗体与共同抗原的特异性结合。在一些情况下，抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多的结合。
术语“抗原”是指能够由选择性结合剂(例如抗体或其免疫功能片段)结合并且另外能够用于哺乳动物中以产生能够结合至所述抗原的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个能够与抗体相互作用的表位。
术语“表位”是抗原分子中由选择性结合剂(例如抗体或其片段)结合的部分。所述术语包括能够特异性结合至抗体的任何决定簇。表位可为邻接或非邻接的(例如在多肽中，在多肽序列中未彼此邻接但在所述分子的背景下由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在一些实施方案中，表位可为模拟的，因为其包含与用于产生抗体的表位相似的三维结构，但不包含或仅包含在用于产生抗体的所述表位中发现的一些氨基酸残基。表位决定簇可包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。
在一些实施方案中，“表位”是通过用于测定表位的方法来定义。举例说来，在一些实施方案中，如果抗体与参考抗体结合至抗原的同一区域，那么抗体结合至与参考抗体相同的表位，如通过氢-氘交换(HDX)所测定。
在某些实施方案中，如果抗体与参考抗体结合至抗原的同一区域，那么抗体结合至与参考抗体相同的表位，如通过X射线结晶学所测定。
如本文所用，“嵌合抗体”是指抗体包含至少一个来自第一物种(例如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(例如人类、食蟹猴、鸡等)的恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区是来自第一物种并且嵌合抗体的所有恒定区是来自第二物种。
如本文所用，“人源化抗体”是指其中非人类可变区(例如小鼠、大鼠、食蟹猴、鸡等)的框架区中的至少一个氨基酸已由来自人类可变区的相应氨基酸置换的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人类恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体片段是Fab、scFv、(Fab’)2等。
如本文所用，“CDR移植抗体”是指其中第一(非人类)物种的一个或多个互补决定区(CDR)已移植至第二(人类)物种的框架区(FR)上的人源化抗体。
如本文所用，“人类抗体”是指在人类中产生的抗体、在包含人类免疫球蛋白基因的非人类动物(例如
Figure BDA0003834245140000211
)中产生的抗体和使用体外方法(例如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体谱是基于人类免疫球蛋白序列。
“宿主细胞”是指可为或已为载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，例如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，例如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、
Figure BDA0003834245140000212
细胞(Crucell)以及293和CHO细胞和其衍生物，分别如293-6E和DG44细胞。
如本文所用，术语“分离的”是指分子已与至少一些通常在自然界中一起发现的组分分离，或已从至少一些通常产生它的组分分离。举例说来，当多肽从至少一些产生它的细胞组分分离时，所述多肽被称为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，以物理方式从产生它的细胞分离含有所述多肽的上清液被视为“分离”多肽。同样，当多核苷酸并非通常在自然界中含有它的较大多核苷酸(例如在DNA多核苷酸的情形下，基因组DNA或线粒体DNA)的一部分或从至少一些产生它的细胞组分分离(例如在RNA多核苷酸的情形下)时，多核苷酸被称为“分离的”。因此，含于宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可称为“分离的”，只要在自然界中在所述载体中未发现所述多核苷酸即可。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，例如人类。在一些实施方案中，还提供治疗其他非人类哺乳动物的方法，所述其他非人类哺乳动物包括但不限于啮齿动物、猿猴、猫、狗、马、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动场动物和哺乳动物宠物。在一些情况下，“受试者”或“患者”是指需要治疗疾病或病症的(人类)受试者或患者。
如本文所用，术语“样品”或“患者样品”是指从含有例如打算基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征进行表征和/或鉴别的细胞和/或其他分子实体的所关注受试者获得或衍生而来的材料。举例说来，措辞“疾病样品”和其变化形式是指从将预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体的所关注受试者获得的任何样品。
“组织或细胞样品”意指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可为固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品或活检或抽吸物；血液或任何血液成分；体液，例如痰、脑脊液、羊水、腹膜液或间隙液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可为原代或经培养细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品是从疾病组织/器官获得。组织样品可含有不与自然界中的组织自然混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
如本文所用，“参考样品”、“参考细胞”或“参考组织”是指从已知或认为未患使用本发明的方法或组合物鉴别的疾病或疾患的来源获得的样品、细胞或组织。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织是从使用本发明的组合物或方法鉴别疾病或疾患的同一受试者或患者的身体的健康部分获得。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织是从至少一个受试者的身体的健康部分获得，所述至少一个受试者不为使用本发明的组合物或方法鉴别疾病或疾患的受试者或患者。在一些实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织是先前在发展疾病或疾患之前或在疾病或疾患的早期从患者获得。
“病症”或“疾病”是将受益于用本发明的一种或多种Gal-9拮抗剂治疗的任一疾患。它包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理学疾患。本文待治疗的病症的非限制性实例包括癌症。
“与调控T淋巴球的抑制活性相关的疾病”意指其中调控T淋巴球的抑制活性尤其通过促进疾病的发展或持久性起作用的任一疾病(非自身免疫)。尤其，已证实调控T淋巴球的抑制活性促进肿瘤的发展。因此，本发明更具体地针对其中T淋巴球的抑制活性起作用的癌症。
术语“癌症”在本文中用于指展现异常高的增殖和生长水平的细胞群。癌症可为良性(还称为良性肿瘤)、癌前或恶性。癌细胞可为实体癌细胞(即形成实体肿瘤)或白血病癌细胞。术语“癌症生长”在本文中用于指包含癌症的一个或多个细胞的增殖或生长，引起癌症的大小或程度的相应增加。
癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆道癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌。
在某些实施方案中，如本文所用的癌症包括血液癌(例如AML和DLBCL)或实体肿瘤(例如乳癌、头颈癌、肺癌、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤)、结肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌和前列腺癌)。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括但不限于烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)和
Figure BDA0003834245140000231
环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)和乌得哌(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲基二氯乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ和卡奇霉素ω(参见例如Agnew,Chemlntl.Ed.Engl,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatinchromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、
Figure BDA0003834245140000241
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、泛艾霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺醣苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；美得眠(mopidanmol)；尼曲吖啶；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0003834245140000251
多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素e(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；类紫杉醇(taxoid)，例如，
Figure BDA0003834245140000261
太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、
Figure BDA0003834245140000262
不含Cremophor的白蛋白工程改造的太平洋紫杉醇纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和
Figure BDA0003834245140000265
多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；
Figure BDA0003834245140000266
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；
Figure BDA0003834245140000263
长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；胺喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲磺酰亚胺(DMFO)；类视色素，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib)
Figure BDA0003834245140000264
)和VEGF-A的抑制剂，以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其他非限制性示例性化学治疗剂包括用于调控或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure BDA0003834245140000267
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
Figure BDA0003834245140000268
托瑞米芬(toremifene)；抑制调控肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA00038342451400002610
乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure BDA0003834245140000269
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、
Figure BDA00038342451400002612
伏氯唑(vorozole)、
Figure BDA00038342451400002611
来曲唑(letrozole)和
Figure BDA00038342451400002613
阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳培林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制参与异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的那些寡核苷酸；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，
Figure BDA0003834245140000271
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法疫苗，例如
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疫苗、
Figure BDA0003834245140000275
疫苗和
Figure BDA0003834245140000274
疫苗；
Figure BDA0003834245140000273
rIL-2；
Figure BDA0003834245140000276
拓朴异构酶1抑制剂；
Figure BDA0003834245140000277
rmRH；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”是指直接或间接抑制血管生成、血管发生或不期望的血管渗透性的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。应理解，抗血管生成剂包括结合血管生成因子或其受体并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些剂。举例说来，抗血管生成剂是针对血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如针对VEGF-A的抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab)
Figure BDA0003834245140000278
)或针对VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体；抗PDGFR抑制剂，例如
Figure BDA00038342451400002710
(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))；阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、
Figure BDA0003834245140000279
/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706或例如国际专利申请WO 2004/113304中所述的那些小分子)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑素、内皮抑素等。参见例如Klagsbrun和D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit和Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如，表3列出恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；Ferrara和Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini等人(2003)Oncogene22:6549-6556(例如，表2列出已知的抗血管生成因子)；和Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如，表1列出用于临床试验的抗血管生成剂)。
如本文所用，“生长抑制剂”是指抑制体外或体内细胞(例如表达VEGF的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可为显著减小S期细胞(例如表达VEGF的细胞)的百分比的剂。生长抑制剂的实例包括但不限于阻断细胞周期进展(处于S期以外的时期)的剂，例如诱导G1阻滞和M期阻滞的剂。经典M期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春碱)、紫杉烷(taxane)和拓朴异构酶II抑制剂(例如多柔比星、泛艾霉素、道诺霉素、依托泊苷和博来霉素)。使G1阻滞的那些剂还溢出进入S期阻滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫昔芬、普赖松(prednisone)、达喀尔巴嗪、甲基二氯乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其他信息可见于Mendelsohn和Israel编辑,The Molecular Basis of Cancer,第1章,标题为“Cellcycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”,Murakami等人(W.B.Saunders,Philadelphia,1995)，例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇和多西他赛)是衍生自紫杉的抗癌药物。多西他赛(
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Rhone-Poulenc Rorer)衍生自欧洲紫杉，是太平洋紫杉醇的半合成类似物(
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Bristol-Myers Squibb)。太平洋紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体组装微管，并且通过防止解聚使微管稳定化，这可抑制细胞中的有丝分裂。
术语“抗赘瘤组合物”是指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂。治疗剂的实例包括但不限于例如化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法中的剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂(还称为肿瘤免疫剂)、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其他剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼
Figure BDA0003834245140000281
血小板源性生长因子抑制剂(例如，
Figure BDA0003834245140000282
(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、干扰素、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA抗体伊匹单抗(ipilimumab)
Figure BDA0003834245140000283
PD-1抑制剂(例如抗PDl抗体，BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如抗PDL1抗体，MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如抗PDL2抗体)、VISTA抑制剂(例如抗VISTA抗体)、细胞因子、结合至以下靶中的一者或多者的拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4、VISTA或VEGF受体、TRAIL/Apo2，以及其他生物活性和有机化学剂等。本发明还包括其组合。
“治疗”是指治疗性治疗，例如其中目标是减慢(减轻)所靶向的病理学疾患或病症，以及例如其中目标是抑制疾患或病症的复发。“治疗”涵盖用于哺乳动物(包括人类)的疾病(在本文中还称为“病症”或“疾患”)的治疗剂的任何施用或施加，并且包括抑制疾病或疾病的进展，抑制或减缓疾病或其进展，阻滞其发展，部分或完全缓解疾病，部分或完全缓解疾病的一种或多种症状，或恢复或修复损失、丢失或缺陷性功能；或刺激无效过程。术语“治疗”还包括减轻任何表型特征的严重程度和/或降低所述特征的发生率、程度或可能性。需要治疗的那些包括已患有病症的那些以及具有病症复发风险的那些或待预防或减慢病症复发的那些。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指可有效地治疗受试者的疾病或病症的药物量。在一些实施方案中，有效量是指在所需剂量和时间段下可有效地达成期望的治疗或预防结果的量。本发明抗体的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及拮抗剂引发个体的期望反应的能力的因素变化。治疗有效量涵盖其中治疗有益效应超过本发明抗体的任何毒性或有害效应的量。
“预防有效量”是指在所需剂量和时间段下可有效地达成期望的预防结果的量。通常但非必需，由于个体在疾病之前或早期使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
“药学上可接受的载体”是指与共同构成用于施用于受试者的“药物组合物”的治疗剂一起使用的本领域中常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料、配制助剂或载体。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与制剂的其他成分可相容。药学上可接受的载体适用于所用制剂。举例说来，如果待口服施用治疗剂，那么载体可为凝胶胶囊。如果待皮下施用治疗剂，那么载体理想地不会刺激皮肤并且不会引起注射位点反应。
“制品”是任何制造物(例如包装或容器)或试剂盒，其包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症的药剂，或用于特异性检测本文所述的生物标记物的探针。在一些实施方案中，制造物或试剂盒是作为用于执行本文所述的方法的单元来推广、分配或销售。
3.治疗癌症的方法
本文所述的发明提供用于治疗人类和其他非人类哺乳动物的方法中的抗TNFR2抗体。
在病理学情形下，Treg可产生不适当的免疫抑制，其可例如促进肿瘤生长。Treg与减少抗肿瘤免疫反应相关，尤其通过不适当地抑制效应T淋巴球的活性，因此促进多种癌症类型的发展。
在一些实施方案中，提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用有效量的任一本发明抗TNFR2抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患有癌症的受试者施用任一本发明抗TNFR2抗体或其抗原结合片段。
可通过本发明的方法/用途治疗的癌症包括其中调控T淋巴球发挥其抑制活性的那些癌症，例如其中肿瘤组织或循环中存在相对较大量的调控T淋巴球的那些癌症。调控T淋巴球的扩增(其可通过Treg的频率来测量)通常与Treg活化增加相关联。调控T淋巴球的频率可通过本领域中已知的任一方法，例如通过肿瘤内淋巴球或循环淋巴球的流式细胞术(FACS)分析，或通过肿瘤组织的免疫组织学染色来评价。
本文提供可用任一本发明抗TNFR2抗体或其抗原结合片段治疗的非限制性示例性癌症，包括癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定非限制性实例包括黑色素瘤、子宫颈癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆道癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌。
在某一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、乳癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(NSCLC)、卵巢癌、皮肤癌(例如鳞状细胞癌或基底细胞癌)、淋巴瘤或白血病。
在某一实施方案中，所述癌症具有高TNFR2指数，定义为(a)肿瘤样品中的总CD8 T细胞数×CD8 T细胞上的TNFR2表达；与(b)肿瘤样品中的总Treg细胞数×Treg上的TNFR2表达之间的比率。
在某一实施方案中，所述癌症具有大于1、例如大于1.5、大于2、大于3、大于4或大于5的TNFR2指数。举例说来，某些癌症的代表性TNFR2指数包括：4.57(黑色素瘤)，1.67(乳癌)，1.05(NSCLC)，1.03(SCC)，0.78(BCC)，并且0.46(HCC)。
在某一实施方案中，所述癌症具有约0.5-约1的TNFR2指数。
在某一实施方案中，所述癌症具有高比例的CD8 TIL(肿瘤浸润淋巴球)，例如肿瘤中超过20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的T细胞是CD8 T细胞。
在某一实施方案中，所述癌症在肿瘤细胞上具有低TNFR2表达水平。
在某一实施方案中，已知癌症对免疫疗法较为敏感(例如发炎)，例如黑色素瘤、NSCLC、肾细胞癌、胃癌、结肠直肠癌、尿路上皮癌、HCC、头颈癌和霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)。
在某一实施方案中，所述癌症在肿瘤内耗竭的T细胞(例如耗竭的CD8 T细胞)上具有高TNFR2表达水平。此类癌症可用具有例如PD-1/PD-L1途径的拮抗剂、例如任一抗PD-1或抗PD-L1抗体(例如本文特定描述或本领域中已知)的组合疗法来治疗。
在某一实施方案中，本发明的方法/用途可用于治疗其中存在已知高水平的调控T淋巴球的癌症，和/或与不良预后明显相关的癌症/肿瘤，包括：慢性骨髓性白血病(CML)、结肠癌、黑色素瘤、子宫癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、卵巢癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、霍奇金氏淋巴瘤或肝细胞癌。
在一些实施方案中，所述癌症是血液癌(例如AML和DLBCL)或实体肿瘤(例如乳癌、头颈癌、肺癌、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤)、结肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌和前列腺癌)。
在一些实施方案中，所述癌症是BCC、SCC、黑色素瘤、结肠直肠癌或NSCLC。
在某一实施方案中，本发明的方法/用途可用于治疗源自C型肝炎的纤维化的复发，因为也已证实，增加调控T淋巴球的频率是预测此类纤维化的复发的因子。
在一些实施方案中，本发明的抗TNFR2抗体可单独使用，或替代地与已知能够治疗疾病或适应症的任何其他合适化合物组合使用。
因此，根据本发明的一个特点实施方案，如先前所定义针对TNFR2并且抑制调控T淋巴球的抑制活性的抗体是与第二治疗剂组合使用来治疗与调控T淋巴球的抑制活性相关的疾病，例如抗癌剂。
也就是说，当用途是治疗癌症时，抗体可与针对癌症的已知疗法(例如手术、放射疗法、化学疗法或其组合)组合使用。举例说来，抗体可与过继性免疫疗法组合使用，所述过继性免疫疗法是由一次或多次针对肿瘤抗原、尤其EBV抗原的效应淋巴球的注射组成。根据一些方面，与根据本发明的针对TNFR2的抗体组合用于癌症疗法的其他抗癌剂包括抗血管生成剂。根据某些方面，抗体可与细胞因子(例如刺激抗肿瘤免疫反应的细胞因子)共施用。
在此类组合疗法中，本发明的抗体可在第二治疗剂之前、之后或与其同时使用。关于组合疗法，参见下文的其他部分。
4.施用途径和载体
在多个实施方案中，可皮下或静脉内施用本发明抗TNFR2单克隆抗体。为简洁起见，“本发明抗TNFR2单克隆抗体”是指本发明的小鼠-人类嵌合抗TNFR2抗体和其人源化变体。
在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可在体内通过多种途径，包括但不限于口服、动脉内、肠胃外、鼻内、肌内、心内、室内、气管内、经颊、直肠、腹膜内、通过吸入、真皮内、表面、经皮和鞘内或以其他方式(例如通过植入)施用。
在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可经由i.v.或s.c.施用。
本发明抗体组合物可配制为呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射液、吸入剂和气溶胶。
在多个实施方案中，包含本发明抗TNFR2单克隆抗体的组合物是以与多种药学上可接受的载体的制剂形式提供(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,LippencottWilliams and Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000))。可获得多种药学上可接受的载体，其包括媒剂、佐剂和稀释剂。另外，还可获得多种药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等。非限制性示例性载体包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和其组合。
在多个实施方案中，包含本发明抗TNFR2单克隆抗体的组合物可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其他油、合成脂肪酸甘油酯、较高脂肪酸的酯或丙二醇)中；并且必要时，与常规添加剂(例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起配制用于注射，包括皮下施用。
在多个实施方案中，所述组合物可例如使用加压可接受的推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等)配制用于吸入。
在多个实施方案中，所述组合物还可配制为例如含有生物可降解或生物不可降解聚合物的持续释放微胶囊。非限制性示例性生物可降解制剂包括聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物。非限制性示例性生物不可降解制剂包括聚甘油脂肪酸酯。某些制造此类制剂的方法描述于例如EP 1125584A1中。
还提供药物剂量包，其包含各自含有一个或多个剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体的一个或多个容器。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中所述单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含本发明抗TNFR2单克隆抗体，具有或不具有一种或多种额外剂。在一些实施方案中，此类单位剂量是在一次性注射用预填充注射器中供应。在多个实施方案中，含于单位剂量中的组合物可包含生理盐水、蔗糖等；缓冲剂，例如磷酸盐等；和/或在稳定和有效的pH范围内配制。或者，在一些实施方案中，所述组合物可提供为可在添加适当液体(例如无菌水)后复原的冻干粉末。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，本发明组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
药物组合物是以有效地治疗或预防具体适应症的量施用。治疗有效量通常取决于所治疗受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的疾患的广泛性或所治疗受试者的年龄。
在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约50μg/kg体重至约50mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约100μg/kg体重至约50mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。
在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约10mg至约1,000mg范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约500mg范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约300mg范围内的量施用。在一些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约200mg范围内的量施用。
本发明抗TNFR2单克隆抗体组合物可视需要施用于受试者。在一些实施方案中，向受试者施用一次或多次有效剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体。在多个实施方案中，每月一次、小于每月一次(例如每两个月、每三个月或每六个月)向受试者施用有效剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体。在其他实施方案中，大于每月一次(例如每两周、每周、每周两次、每周三次、每天或每天多次)施用有效剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体。向受试者施用至少一次有效剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体。在一些实施方案中，可多次施用有效剂量的本发明抗TNFR2单克隆抗体，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时段。在一些实施方案中，视需要将本发明抗TNFR2单克隆抗体施用于受试者以缓和疾患的一种或多种症状。
5.组合疗法
本发明的本发明抗TNFR2单克隆抗体(包括其功能片段)可与其他生物活性物质或其他治疗程序组合施用于有需要的受试者来治疗疾病。举例说来，本发明抗TNFR2单克隆抗体可单独施用或与其他治疗模式一起施用。其可在其他治疗模式(例如放射疗法)之前、与其大体上同时或在其之后提供。
为治疗癌症，本发明抗TNFR2单克隆抗体可与一种或多种抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂、化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂或抗赘瘤组合物)联合施用。
在某些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体特异性结合至TNFR2(“TNFR2结合拮抗剂”)，例如TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段，与第二拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂，例如PD-1或PD-L1途径的抑制剂)一起施用于患有其中刺激免疫系统将有益的疾病(例如癌症或传染病)的受试者。可同时或连续施用两种拮抗剂，例如，如下文针对本发明抗TNFR2单克隆抗体与肿瘤免疫剂的组合所述。可将一种或多种额外治疗剂(例如检查点调节剂)添加至使用本发明抗TNFR2单克隆抗体的治疗来治疗癌症或自身免疫疾病。
在某些实施方案中，本发明抗TNFR2单克隆抗体与另一治疗同时或连续施用于受试者，例如患有癌症的受试者。举例说来，本发明抗TNFR2单克隆抗体可与以下一者或多者一起施用：放射疗法、手术或化学疗法，例如靶向化学疗法或免疫疗法。
在某些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法包括向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和一种或多种肿瘤免疫剂，例如免疫检查点抑制剂。
免疫疗法(例如使用肿瘤免疫剂的疗法)可有效地增强、刺激和/或上调受试者的免疫反应。一方面，施用本发明抗TNFR2单克隆抗体与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)在治疗癌症方面，例如在抑制肿瘤生长方面具有协同效应。
一方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体是在施用肿瘤免疫剂之前依序施用。一方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体是与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)同时施用。另一方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体是在施用肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)之后依序施用。两种剂的施用可在例如间隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周时开始，或可在已施用第一剂后例如30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周开始施用第二剂。
在某些方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)同时施用于患者，例如同时输注至患者，例如在30或60分钟的时段内。本发明抗TNFR2单克隆抗体可与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)共配制。
肿瘤免疫剂包括例如小分子药物、抗体或其片段，或其他生物或小分子。生物肿瘤免疫剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、疫苗和细胞因子。一方面，抗体是单克隆抗体。在某些方面，单克隆抗体是人源化或人类抗体。
一方面，肿瘤免疫剂是免疫细胞(例如T细胞)上的(i)刺激(包括共刺激)分子(例如受体或配体)的激动剂，或(ii)抑制(包括共抑制)分子(例如受体或配体)的拮抗剂，其均会扩增抗原特异性T细胞反应。在某些方面，肿瘤免疫剂是参与先天免疫的细胞(例如NK细胞)上的(i)刺激(包括共刺激)分子(例如受体或配体)的激动剂，或(ii)抑制(包括共抑制)分子(例如受体或配体)的拮抗剂，并且其中肿瘤免疫剂增强先天免疫。此类肿瘤免疫剂通常被称为免疫检查点调控剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激物。
在某些实施方案中，肿瘤免疫剂可为靶向(或特异性结合至)B7膜结合配体家族的成员或特异性结合至B7家族成员的共刺激或共抑制受体的剂，所述B7膜结合配体家族包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5和B7-H6。肿瘤免疫剂可为靶向TNF膜结合配体家族的成员或与其特异性结合的共刺激或共抑制受体(例如TNF受体家族成员)的剂。可由肿瘤免疫剂靶向的示例性TNF和TNFR家族成员包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、GITR、GITRL、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTfiR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNPβ、TNFR2、TNFa、LTfiR、淋巴毒素a 1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR。可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合使用来治疗癌症的肿瘤免疫剂可为靶向B7家族成员、B7受体家族成员、TNF家族成员或TNFR家族成员(例如上文所述的那些家族成员)的剂，例如抗体。
一方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体与以下一者或多者一起施用：(i)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂)，所述蛋白质是例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM3、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PDIH、LAIR1、TIM-1、TIM-4和PSGL-1，和(ii)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，所述蛋白质是例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、CD40L、DR3和CD28H。
一方面，肿瘤免疫剂是抑制(即拮抗)抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF和其他免疫抑制细胞因子)的剂，或是刺激T细胞活化并且刺激免疫反应的细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和IFNα)的激动剂(例如细胞因子本身)。
可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合来刺激免疫系统(例如治疗癌症和传染病)的其他剂包括NK细胞上的抑制受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的激动剂。举例说来，本发明抗TNFR2单克隆抗体可与KIR的拮抗剂组合。
用于组合疗法的其他剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核球的剂，包括但不限于CSF-IR拮抗剂，例如CSF-IR拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
肿瘤免疫剂还包括抑制TGF-β信号传导的剂。
可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合的额外剂包括增强肿瘤抗原呈递的剂，例如树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸和咪喹莫特(imiquimod)，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)。
可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合的其他疗法包括耗竭或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合至CD25的剂。
可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合的另一疗法是抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法。
可使用的另一类剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的剂。
可与本发明抗TNFR2单克隆抗体组合来治疗癌症的其他疗法包括逆转/预防T细胞无能或耗竭的疗法和触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或发炎的疗法。
本发明抗TNFR2单克隆抗体可与一种以上的肿瘤免疫剂(例如免疫检查点抑制剂)组合，并且可与例如靶向免疫途径的多个元件的组合方法组合，所述组合方法是例如以下一者或多者：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗竭或阻断Treg或其他免疫抑制细胞抑制负免疫调控的疗法；例如用刺激CD-137、OX-40和/或GITR途径和/或刺激T细胞效应功能的激动剂刺激正免疫调控的疗法；增加全身抗肿瘤T细胞频率的疗法；例如使用CD25拮抗剂(例如达克珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠粒耗竭来耗竭或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法；影响肿瘤中的抑制性骨髓细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)；过继性T细胞或NK细胞转移，包括经遗传修饰的细胞，例如经嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；逆转/预防T细胞无能或耗竭的疗法；触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或发炎的疗法；施用免疫刺激细胞因子或阻断免疫阻抑细胞因子。
举例说来，本发明抗TNFR2单克隆抗体可与以下各物一起使用：一种或多种接合阳性共刺激受体的激动剂；一种或多种减弱通过抑制受体的信号传导的拮抗剂(阻断剂)，例如克服肿瘤微环境内的不同免疫抑制途径(例如阻断PD-L1/PD-1/PD-L2相互作用)的拮抗剂；一种或多种增加全身抗肿瘤免疫细胞(例如T细胞)的频率、耗竭或抑制Treg(例如通过抑制CD25)的剂；一种或多种抑制代谢酶(例如IDO)的剂；一种或多种逆转/预防T细胞无能或耗竭的剂；和一种或多种触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或发炎的剂。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CTLA-4拮抗剂，例如拮抗性CTLA-4抗体。合适的CTLA-4抗体包括例如YERVOY(伊匹单抗)或曲美木单抗(tremelimumab)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是PD-1拮抗剂，例如拮抗性PD-1抗体。合适的PD-1抗体包括例如OPDIVO(纳武单抗)、KEYTRUDA(派姆单抗)或MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)。肿瘤免疫剂还可包括匹地利珠单抗(pidilizumab，CT-011)。靶向PD-1受体的另一方法是由PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域融合至IgG1的Fc部分构成的重组蛋白，称为AMP-224。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是PD-L1拮抗剂，例如拮抗性PD-L1抗体。合适的PD-L1抗体包括例如MPDL3280A(RG7446；WO2010/077634)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是LAG-3拮抗剂，例如拮抗性LAG-3抗体。合适的LAG3抗体包括例如BMS-986016(WO10/19570、WO14/08218)或IMP-731或IMP-321(WO08/132601、WO09/44273)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD137(4-1BB)激动剂，例如激动性CD137抗体。合适的CD137抗体包括例如乌瑞鲁单抗(urelumab)或PF-05082566(WO12/32433)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是GITR激动剂，例如激动性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)、MK-4166(WO 11/028683)或WO2015/031667中所公开的GITR抗体。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是OX40激动剂，例如激动性OX40抗体。合适的OX40抗体包括例如MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD40激动剂，例如激动性CD40抗体。在某些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD40拮抗剂，例如拮抗性CD40抗体。合适的CD40抗体包括例如鲁卡木单抗(lucatumumab，HCD122)、达西组单抗(dacetuzumab，SGN-40)，CP-870,893或Chi Lob 7/4。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD27激动剂，例如激动性CD27抗体。合适的CD27抗体包括例如瓦利珠单抗(varlilumab，CDX-1127)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是MGA271(针对B7H3)(WO1 1/109400)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是KIR拮抗剂，例如利瑞鲁单抗(lirilumab)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚莫德(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO 12/142237)或F001287。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是Toll样受体激动剂，例如TLR2/4激动剂(例如卡介苗)；TLR7激动剂(例如Hiltonol或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激动剂(例如CpG7909)。
在一个实施方案中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明的抗TNFR2单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是TGF-β抑制剂，例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1。
6.示例性抗TNFR2单克隆抗体
本文所述的发明提供对TNFR2具特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段。
因此，本发明的一个方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与本文所述的任一分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合至SEQ ID NO:13或38的表位，或竞争结合至由HFB3-18结合的表位。
本发明的一个相关方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合至SEQ ID NO:13或38的表位或由HFB3-18结合的表位。
本发明的另一相关方面提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对人类TNFR2具特异性，并且其中所述单克隆抗体包含：(1a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVR CDR2序列和SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；和(1b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:4的LCVRCDR1序列、SEQ ID NO:5的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:6的LCVR CDR3序列；或(2a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:14的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:15的HCVR CDR2序列和SEQID NO:16的HCVR CDR3序列；和(2b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:17的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:18的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:19的LCVR CDR3序列；或(3a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:26的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:27的HCVR CDR2序列和SEQID NO:28的HCVR CDR3序列；和(3b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:29的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:30的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:31的LCVR CDR3序列；或(4a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:39的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:40的HCVR CDR2序列和SEQID NO:41的HCVR CDR3序列；和(4b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:42的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:43的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:44的LCVR CDR3序列；或(5a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:51的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:52的HCVR CDR2序列和SEQID NO:53的HCVR CDR3序列；和(5b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:54的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:55的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:56的LCVR CDR3序列；或(6a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:63的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:64的HCVR CDR2序列和SEQID NO:65的HCVR CDR3序列；和(6b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:66的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:67的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:68的LCVR CDR3序列。
对于上文所述的本发明的任一方面，在一些实施方案中，在分离的单克隆抗体或其抗原结合片段中：(1A)HCVR序列是SEQ ID NO:7；和/或(1B)LCVR序列是SEQ ID NO:8，或(2A)HCVR序列是SEQ ID NO:20；和/或(2B)LCVR序列是SEQ ID NO:21，或(3A)HCVR序列是SEQ ID NO:32；和/或(3B)LCVR序列是SEQ ID NO:33，或(4A)HCVR序列是SEQ ID NO:45；和/或(4B)LCVR序列是SEQ ID NO:46，或(5A)HCVR序列是SEQ ID NO:57；和/或(5B)LCVR序列是SEQ ID NO:58，或(6A)HCVR序列是SEQ ID NO:69；和/或(6B)LCVR序列是SEQ ID NO:70。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段具有：(1a)SEQ ID NO:9的重链序列；和/或(1b)SEQ ID NO:10的轻链序列，或(2a)SEQ ID NO:22的重链序列；和/或(2b)SEQ ID NO:23的轻链序列，或(3a)SEQ ID NO:34的重链序列；和/或(3b)SEQ ID NO:35的轻链序列，或(4a)SEQ ID NO:47的重链序列；和/或(4b)SEQ ID NO:48的轻链序列，或(5a)SEQ ID NO:59的重链序列；和/或(5b)SEQ ID NO:60的轻链序列，或(6a)SEQ ID NO:71的重链序列；和/或(6b)SEQ ID NO:72的轻链序列。
下文提供本发明抗体的一些序列。
HFB3-1-hG1(小鼠单克隆抗体)
CDR-H1：SYSFTDYN(SEQ ID NO:1)
CDR-H2：IFPKYGTTSYNQKFKG(SEQ ID NO:2)
CDR-H3：ATDGGTWYFDV(SEQ ID NO:3)
CDR-L1：SSVTY(SEQ ID NO:4)
CDR-L2：LTSNLASGVPA(SEQ ID NO:5)
CDR-L3：QQWSSNPPT(SEQ ID NO:6)
HCVR是SEQ ID NO:7，并且LCVR是SEQ ID NO:8。
HC：EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASSYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGIIFPKYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCATDGGTWYFDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)
LC：QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVTYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:10)
GAATTTCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAGCTGGTTAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCAGCTACAGCTTCACCGACTACAACATGAACTGGGTCAAGCAGAGCAACGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCATCATCTTCCCTAAGTACGGCACCACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACCGTGGACCAGAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTACAGATGGCGGCACCTGGTACTTCGATGTGTGGGGCACTGGCACCACCGTGACAGTTAGTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:11)
CAGATTGTGCTGACACAGTCTCCCGCTCTGATGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAAGTGACCATGACATGTAGCGCCAGCAGCAGCGTGACCTACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCAGAAGCAGCCCCAAGCCTTGGATCTACCTGACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCTGCCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACAAGCTACAGCCTGACAATCAGCAGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAATCCTCCTACATTTGGCTCCGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:12)
SCEDSTYTQLWNWVPECLS(SEQ ID NO:13)
HFB3-1hz6-hG1(人源化单克隆抗体)
CDR-H1：SYSFTDYN(SEQ ID NO:14)
CDR-H2：IFPKYGTTSYAQKLQG(SEQ ID NO:15)
CDR-H3：ATDGGTWYFDV(SEQ ID NO:16)
CDR-L1：SSVTY(SEQ ID NO:17)
CDR-L2：LTSNLASGVPS(SEQ ID NO:18)
CDR-L3：QQWSSNPPT(SEQ ID NO:19)
HCVR是SEQ ID NO:20，并且LCVR是SEQ ID NO:21。
HC：QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASSYSFTDYNMNWVRQAPGQSLEWMGIIFPKYGTTSYAQKLQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATDGGTWYFDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:22)
LC：DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASSSVTYMYWYQQKPGKAPKPWIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:23)
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAGCTGAAAAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCAGCTACAGCTTCACCGACTACAACATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAGTCTCTTGAGTGGATGGGCATCATCTTCCCTAAGTACGGCACCACCAGCTACGCCCAGAAACTGCAGGGAAGAGTGACCCTGACCACCGACACCAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGATCCGATGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACAGATGGCGGCACCTGGTACTTCGATGTGTGGGGCACTGGCACCACCGTGACAGTCTCTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:24)
GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCAAGCTTTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATTACATGTAGAGCCAGCAGCAGCGTGACCTATATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCCTTGGATCTACCTGACCAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGAGTACACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGATGCCGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGTCCAGCAATCCTCCTACCTTTGGCTCCGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:25)
HFB3-14-hG1(小鼠单克隆抗体)
CDR-H1：GYTFTDYY(SEQ ID NO:26)
CDR-H2：INPNDGGTTYSQKFKG(SEQ ID NO:27)
CDR-H3：AREGNYYAYDVRVWYFDV(SEQ ID NO:28)
CDR-L1：QDIITY(SEQ ID NO:29)
CDR-L2：STSSLNSGVPS(SEQ ID NO:30)
CDR-L3：QQYSELPYT(SEQ ID NO:31)
HCVR是SEQ ID NO:32，并且LCVR是SEQ ID NO:33。
HC：EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNDGGTTYSQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAREGNYYAYDVRVWYFDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:34)
LC：DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRSSENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:35)
GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCCGAGCTGGTTAAGCCTGGCGCCTCTGTCAGAATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGACATCAACCCCAATGATGGCGGCACCACCTACAGCCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGAAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGAGAGGGCAACTACTACGCCTACGACGTCCGCGTGTGGTACTTCGATGTGTGGGGCACAGGCACCACCGTGACAGTTAGTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:36)
GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCCAGCCTGTCCGTGTCTGTGGGAGAGACAGTGACCATCACCTGTCGGAGCAGCGAGAACATCTACAGCAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCAGGGCAAGTCTCCTCAGCTGCTGGTGTACGCCGCCACCAATCTTGCTGATGGCGTGCCCAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACACAGTACAGCCTGAAGATCAACAGCCTGCAGAGCGAGGACTTCGGCAGCTACTACTGCCAGCACTTTTGGGGCACCCCTTGGACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:37)
CAPLRKCRPGFGVARPGTETSD(SEQ ID NO:38)
HFB3-14hz1c-hG1(人源化单克隆抗体)
CDR-H1：GYTFTDYY(SEQ ID NO:39)
CDR-H2：INPNDGGTTYAQKFQG(SEQ ID NO:40)
CDR-H3：AREGNYYAYDVRVWYFDV(SEQ ID NO:41)
CDR-L1：QDIITY(SEQ ID NO:42)
CDR-L2：STSSLNSGVPS(SEQ ID NO:43)
CDR-L3：QQYSELPYT(SEQ ID NO:44)
HCVR是SEQ ID NO:45，并且LCVR是SEQ ID NO:46。
HC：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPNDGGTTYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGNYYAYDVRVWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:47)
LC：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASQDIITYLNWYQQKPGKAVKLLIYSTSSLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSELPYTFGGGTKVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:48)
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACTACATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGACATCAACCCCAACGACGGCGGCACAACATACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGTCTACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAGAGGGCAACTACTACGCCTACGACGTCCGCGTGTGGTACTTCGATGTTTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCTCTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:49)
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATTACATGTGGCGCCAGCCAGGACATCATCACCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCGTGAAGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAGCCTGAATAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCGAGCTGCCCTACACATTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAACTGAAGCGTACGGTTGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGTTAG(SEQ ID NO:50)
HFB3-18-hG1(小鼠单克隆抗体)
CDR-H1：GFTFSDAW(SEQ ID NO:51)
CDR-H2：VRNKANNHATYYAESVKG(SEQ ID NO:52)
CDR-H3：TRSVGGYGTTYWYFDV(SEQ ID NO:53)
CDR-L1：QNLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:54)
CDR-L2：GASTRESGVPD(SEQ ID NO:55)
CDR-L3：QSEHSYPYT(SEQ ID NO:56)
HCVR是SEQ ID NO:57，并且LCVR是SEQ ID NO:58。
HC：EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEVRNKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTRSVGGYGTTYWYFDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:59)
LC：DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQSEHSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:60)
GAAGTGAAGCTGGAAGAATCTGGCGGCGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTATGAAGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGACAGTCTCCTGAGAAAGGCCTGGAATGGGTTGCCGAAGTGCGGAACAAGGCCAACAACCACGCCACCTACTACGCCGAGTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACAAGAAGCGTTGGCGGCTACGGCACCACCTACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCACCGGCACCACAGTGACCGTTAGTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:61)
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGTGTCTGCCGGCGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAACCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTTTGGAGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTACAGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGTTCTGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGTCAGAGCGAGCACAGCTACCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:62)
HFB3-18hz1-hG1(人源化单克隆抗体)
CDR-H1：GFTFSDAW(SEQ ID NO:63)
CDR-H2：VRNKANNHATYYAASVKG(SEQ ID NO:64)
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HCVR是SEQ ID NO:69，并且LCVR是SEQ ID NO:70。
HC：EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQASGKGLEWVGEVRNKANNHATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRSVGGYGTTYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:71)
LC：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSEHSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:72)
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAAGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCCGACGCTTGGATGGACTGGGTCCGACAGGCCTCTGGCAAAGGCCTTGAGTGGGTTGGAGAAGTGCGGAACAAGGCCAACAACCACGCCACCTACTATGCCGCCTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGATCTGTTGGCGGCTACGGCACCACCTACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTTTCTTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:73)
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAACCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTTTGGAGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGAGCGAGCACAGCTACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:74)
RPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSD(SEQ ID NO:75)
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段是人类-小鼠嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、CDR移植抗体或表面重塑抗体。
在一些实施方案中，其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段具有消除免疫效应功能的工程改造的Fc区。举例说来，本发明抗体的工程改造的Fc区可具有“LALA”双重突变(Leu234A1a以及Leu235A1a)，并且因此具有降低的效应功能。此类抗体可因在IgG1上具有LALA双重突变而具有名称G1AA。
本领域中已知其他重组人类IgG抗体(hIgG)部分或完全不与Fcγ受体(FcγR)和补体蛋白C1q结合并且因此具有消除的免疫效应功能，并且用于多种治疗应用以降低FcγR活化和Fc介导的毒性。某些此类Fc经工程改造的抗体/片段部分地达成这一目标，而其他抗体/片段完全消除FcγR活化和Fc介导的毒性。在某些实施方案中，本发明的抗体/片段具有包含hIgG1-P329G LALA或hIgG4-P329G SPLE(IgG4的人类IgG4 S228P/L235E变体)突变的工程改造的hIgG Fc结构域，并完全消除FcγR和C1q相互作用，并且不影响FcRn相互作用和Fc稳定性。P329G Fc突变破坏脯氨酸与FcγR的夹心基序的形成。由于这一基序存在于所有IgG Fc/FcγR复合物的界面中，可将其破坏应用于所有人类和大多数其他哺乳动物IgG子类以产生效应物沉默的IgG分子。因此，在某些实施方案中，本发明抗体/片段具有含此类效应物沉默的Fc突变的任一IgG子类。
在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段对人类TNFR2具特异性，例如大体上不与TNFR1交叉反应，和/或大体上不与小鼠TNFR2交叉反应。在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与猴TNFR2(例如食蟹猴或恒河猴TNFR2)交叉反应。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段对rhTNFR2的解离常数(Kd)为≤1μΜ、≤100nM、≤50nM、≤25nM、≤20nM、≤15nM、≤10nM、≤5nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至TNFR2的CRD2结构域内的区域。在某一实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至由HFB3-1结合的表位。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至TNFR2的CRD3结构域内的区域。在某一实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至由HFB3-14结合的表位。
在某一实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至由HFB3-18结合的表位。
在某一实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:13或38的表位。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段增强人类重组TNFα与TNFR2的结合。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段阻断人类重组TNFα与TNFR2的结合。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段大体上不影响人类重组TNFα与TNFR2的结合。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制TNFα介导的信号传导(例如NFκB信号传导)，和/或诱导NFκB下游靶基因下调。然而，在其他实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段促进TNFα介导的信号传导(例如NFκB信号传导)，和/或诱导NFκB下游靶基因上调。
在一些实施方案中，NFκB信号传导在效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)中受刺激。在一些其他实施方案中，NFκB信号传导在效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)中受抑制。
在一些实施方案中，NFκB信号传导在Treg中受刺激。在一些其他实施方案中，NFκB信号传导在Treg中受抑制。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段刺激CD8和/或常规CD4 T细胞增殖，任选地具有或不具有CD3/CD28的共刺激，和/或任选地具有或不具有TNFα共刺激。
在一些实施方案中，与未刺激的原代CD8和/或CD4 T细胞相比，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、尤其人源化单克隆抗体或其抗原结合片段优先结合至(CD3/CD28)TCR活化的原代CD8和/或CD4 T细胞。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、尤其人源化单克隆抗体或其抗原结合片段增强CD3/CD28诱导的活化和/或增殖，例如CD3/CD28诱导的原代CD8和/或CD4 T细胞的活化和/或增殖，包括在Treg存在下原代CD8和/或CD4 T细胞的活化和/或增殖。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、尤其人源化单克隆抗体或其抗原结合片段以交联独立性方式共刺激原代CD8和/或CD4 T细胞的活化和/或增殖。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、尤其人源化单克隆抗体或其抗原结合片段以交联依赖性方式共刺激原代CD8和/或CD4 T细胞的活化和/或增殖。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段增强TNFα与TNFR2之间的结合；增强TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 TconvT细胞中)；和/或在Treg存在下促进TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段增强Treg上TNFα介导的CD25表达。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段(包括人源化单克隆抗体或其抗原结合片段)具有良好的可开发性特征，包括在高温(例如25℃或40℃)、低pH条件(例如约室温的pH3.5)下和/或在数轮冷冻/解冻周期后稳定。
在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段(包括人源化单克隆抗体或其抗原结合片段)包括氨基酸序列中经设计以改进抗体的可开发性的一个或多个点突变。举例说来，Raybould等人(Five computational developability guidelines fortherapeutic antibody profiling,PNAS 116(10):4025-4030,2019)描述治疗抗体剖析仪(Therapeutic Antibody Profiler，TAP)，它是构建可变结构域序列的可下载同源模型、针对五个可开发性指南对它们进行测试并报告潜在序列不稳定性和规范形式的计算工具。作者还提供可在opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/TAP.php上自由获得的TAP。
除了达成对抗原的期望亲和力外，治疗性mAb开发还有许多障碍。这些障碍包括固有免疫原性、化学和构象不稳定性、自缔合、高粘度、多特异性和不良表达。举例说来，高水平的疏水性(尤其在高度可变的互补决定区(CDR)中)已反复涉及聚集、粘度和多特异性。重链和轻链可变结构域的净电荷的不对称性还与高浓度下的自缔合和粘度相关。CDR中正电荷和负电荷的补丁与高清除率和不良表达水平相关。产物异质性(例如，通过氧化、异构化或糖基化)通常由易于翻译后或共翻译修饰的特定序列基序引起。计算工具可用于促进序列不稳定性的鉴别。Warszawski等人(Optimizing antibody affinity and stability bythe automated design of the variable light-heavy chain interfaces.PLoS ComputBiol 15(8):e1007207.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007207)还描述通过可变轻链-重链界面的自动化设计来优化抗体亲和力和稳定性的方法。额外方法可用于鉴别候选抗体的潜在可开发性问题，并且在本发明的优选实施方案中，可经由常规方法将一个或多个点突变引入候选抗体以解决此类问题来产生本发明的优化的治疗抗体。
7.人源化抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。人源化抗体可用作治疗分子，因为人源化抗体降低或消除人类对非人类抗体的免疫反应(例如人类抗小鼠抗体(HAMA)反应)，这可引起对抗体治疗剂的免疫反应，并且降低治疗剂的有效性。
抗体可通过任何标准方法人源化。非限制性示例性人源化方法包括例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370；Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-27(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-36(1988)；和美国公布号US 2009/0136500中所述的方法。所有文献均以引用的方式并入。
人源化抗体是其中非人类可变区的框架区中的至少一个氨基酸已用人类框架区中的相应位置的氨基酸置换的抗体。在一些实施方案中，非人类可变区的框架区中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个或至少20个氨基酸已用一个或多个人类框架区中的一个或多个相应位置的氨基酸置换。
在一些实施方案中，用于取代的一些相应人类氨基酸是来自不同人类免疫球蛋白基因的框架区。也就是说，在一些此类实施方案中，一个或多个非人类氨基酸可用第一人类抗体的人类框架区的相应氨基酸置换或由第一人类免疫球蛋白基因编码，一个或多个非人类氨基酸可用第二人类抗体的人类框架区的相应氨基酸置换或由第二人类免疫球蛋白基因编码，一个或多个非人类氨基酸可用第三人类抗体的人类框架区的相应氨基酸置换或由第三人类免疫球蛋白基因编码等。另外，在一些实施方案中，用于单一框架区(例如FR2)中的取代的所有相应人类氨基酸无需来自同一人类框架。然而，在一些实施方案中，用于取代的所有相应人类氨基酸是来自相同的人类抗体或由相同的人类免疫球蛋白基因编码。
在一些实施方案中，通过用相应人类框架区置换一个或多个完整框架区使抗体人源化。在一些实施方案中，选择与被置换的非人类框架区具有最高同源水平的人类框架区。在一些实施方案中，此类人源化抗体是CDR移植抗体。
在一些实施方案中，在CDR移植后，一个或多个框架氨基酸变回小鼠框架区中的相应氨基酸。在一些实施方案中，制造此类“回复突变(back mutation)”以保留一个或多个小鼠框架氨基酸，所述一个或多个小鼠框架氨基酸似乎有助于一个或多个CDR的结构和/或可参与抗原接触和/或似乎参与抗体的总体结构完整性。在一些实施方案中，在CDR移植后对抗体的框架区制造10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1个或0个回复突变。
在一些实施方案中，人源化抗体还包含人类重链恒定区和/或人类轻链恒定区。
8.人类抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是人类抗体。人类抗体可通过任何合适方法来制造。非限制性示例性方法包括在包含人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造人类抗体。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-55(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-8(1993)；onberg等人,Nature 368:856-9(1994)；和美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299；和5,545,806。
非限制性示例性方法还包括使用噬菌体展示文库制造人类抗体。参见例如Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.227:381-8(1992)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-97(1991)；和PCT公布号WO 99/10494。
抗体恒定区
在一些实施方案中，本文所述的人源化、嵌合或人类抗体包含一个或多个人类恒定区。在一些实施方案中，人类重链恒定区属于选自IgA、IgG和IgD的同型。在一些实施方案中，人类轻链恒定区属于选自K和λ的同型。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人类IgG恒定区，例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体或Fc融合搭配物包含C237S突变，例如在IgG1恒定区中。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人类IgG2重链恒定区。在一些此类实施方案中，IgG2恒定区包含P331S突变，如美国专利号6,900,292中所述。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人类IgG4重链恒定区。在一些此类实施方案中，本文所述的抗体包含人类IgG4恒定区中的S241P突变。参见例如Angal等人,Mol.Immunol.30(1):105-108(1993)。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人类IgG4恒定区和人类κ轻链。
重链恒定区的选择可决定抗体是否将具有体内效应功能。在一些实施方案中，此类效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可杀伤抗体结合的细胞。通常，包含人类IgG1或IgG3重链的抗体具有效应功能。
在一些实施方案中，效应功能并非合意的。举例说来，在一些实施方案中，效应功能可能在治疗发炎性疾患和/或自身免疫病症方面并非合意的。在一些此类实施方案中，选择或工程改造人类IgG4或IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，IgG4恒定区包含S241P突变。
本文所述的任何抗体可通过任何合适方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用色谱。合适的亲和配体包括抗体结合的抗原和/或表位，和结合抗体恒定区的配体。举例说来，可使用蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和柱来结合恒定区并纯化抗体。
在一些实施方案中，还使用疏水性相互作用色谱(HIC)(例如丁基或苯基柱)来纯化一些多肽。许多纯化多肽的方法为本领域中已知的。
或者，在一些实施方案中，本文所述的抗体是在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。
9.编码本发明抗体的核酸分子
本发明还提供核酸分子，所述核酸分子包含编码本文所述抗体的一条或多条链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码本文所述抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码本文所述抗体的重链的多核苷酸和编码本文所述抗体的轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些此类实施方案中，重链和轻链是由一个核酸分子表达，或由两个单独核酸分子表达为两个单独多肽。在一些实施方案中，例如当抗体是scFv时，单一多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单一多肽。
在一些实施方案中，编码本文所述抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在翻译时位于重链或轻链的N端。如上文所论述，前导序列可为天然重链或轻链前导序列，或可为另一异源前导序列。
核酸分子可使用本领域中常规的重组DNA技术来构建。在一些实施方案中，核酸分子是适于在所选宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中表达的表达载体。
10.载体
提供载体，所述载体包含编码本文所述抗体的重链和/或轻链的多核苷酸。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、反转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链和轻链由载体表达为两个单独多肽。在一些实施方案中，重链和轻链表达为单一多肽的一部分，例如在抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似的量(例如相似的摩尔量或相似的质量量)转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比介于5:1与1:5之间的第一载体和第二载体转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，使用质量比介于1:1与1:5之间的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，使用质量比为1:2的编码重链的载体和编码轻链的载体。
在一些实施方案中，选择经优化以在CHO或CHO源性细胞或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性此类载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。在一些实施方案中，选择用于在动物(包括人类)中体内表达本发明抗体的载体。在一些此类实施方案中，在一个或多个以组织特异性方式起作用的启动子控制下表达一种或多种多肽。举例说来，肝特异性启动子描述于例如PCT公布号WO 2006/076288中。
11.宿主细胞
在多个实施方案中，本文所述抗体的重链和/或轻链可在原核细胞(例如细菌细胞)中；或在真核细胞(例如真菌细胞，例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。此类表达可例如根据本领域中已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；
Figure BDA0003834245140000711
细胞(Crucell)；和NSO细胞。在一些实施方案中，本文所述抗体的重链和/或轻链可在酵母中表达。参见例如美国公布号US 2006/0270045 A1。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞是基于它对TNFR2抗体的重链和/或轻链制造期望的翻译后修饰的能力来选择。举例说来，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中产生的相同多肽的唾液酸化水平。
将一个或多个核酸引入期望的宿主细胞中可通过任何方法来实现，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。核酸可根据任何合适方法瞬时或稳定转染于期望的宿主细胞中。
在一些实施方案中，一种或多种多肽可根据任何合适方法在已经工程改造或转染有一个或多个编码所述多肽的核酸分子的动物的体内产生。
实施例
实施例1对人类和猴TNFR2具特异性的单克隆抗体
为产生与猴直系同源物TNFR2具有交叉反应性的对人类TNFR2具特异性的单克隆抗体，使用标准程序用人类TNFR2(rhTNFR2)的重组细胞外结构域(ECD)使小鼠免疫以产生一系列不同的人类-小鼠嵌合单克隆抗体。
产生至少25种此类单克隆抗体，比对所选抗体的VH和VL序列，并且获得共有序列，如图1中所示。H-CDR3和L-CDR3区由加框序列标记。
然后测试这些单克隆抗体结合由CHO细胞(分别为CHO.hHFB3和CHO.mkHFB3细胞)表达的人类和猴TNFR2的能力。简单地说，将约40,000个CHO.hHFB3或CHO.mkHFB3细胞接种于组织培养孔中，并且将每一测试抗体的连续1:3稀释液(其中开始(最高)浓度为约66nM抗体)添加至每一细胞类型中并孵育约1小时。通过使用由AF647(ALEXSA
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647荧光染料)标记的17nM抗人类Fc抗体来检测结合至细胞的抗体。在这一分析中还使用同型匹配的阴性对照抗体。数据(包括每一抗体的EC50值和Emax)在图2A中编译。
十一(11)种测试抗体显示针对CHO细胞上表达的hTNFR2的亚nM或一位数的nM水平的亲和力(EC50)。这些抗体还显示对CHO细胞上表达的TNFR2的恒河猴直系同源物的交叉反应性，其中结合亲和力具有与hTNFR2结合大体上相同的趋势。参见图2A。
有趣的是，一些抗体(例如HFB3-1和HFB3-14)促进TNFα与TNFR2的结合，其他抗体(例如HFB3-18)抑制TNFα与TNFR2的结合，并且其他抗体(例如HFB3-6)表观上对TNFα与TNFR2的结合无影响。参见图2B。特别地，在将CHO细胞与各别抗体预孵育约1小时后，测量25ng/mL TNFα与CHO.hHFB3细胞的结合。然后针对递增浓度的抗体对与TNFα(标记为HFB2003L)结合的细胞的百分比绘图。
还设置相同实验以对测试抗体结合表达小鼠TNFR2的CHO细胞和亲本CHO细胞系(其可或可不表达仓鼠TNFR2)的能力进行测试。两种单克隆抗体(HFB3-18和HFB3-19)展现边缘水平的小鼠直系同源物结合，而其他抗体不具有可检测水平的小鼠TNFR2结合。作为阳性对照，使用对小鼠TNFR2具特异性的HM102单克隆抗体来显示与表达小鼠TNFR2的CHO细胞的阳性结合，而同型匹配的对照抗体不结合(图3)。
对亲本CHO细胞系未观察到结合(图3)。
还使用重组人类TNFR2和TNFR1蛋白来验证针对人类TNFR2(对相关TNFR1受体)的结合特异性。
简单地说，在4℃下用0.1μg/mL的His标记的重组人类TNFR2或TNFR1涂布组织培养板过夜。然后将经涂布的板与每一测试抗体的1:3连续稀释液在冰上一起孵育约1小时，其中开始(最高)浓度为约66nM抗体。通过使用HRP标记的抗人类Fc抗体的1:5000稀释液和TMB底物来检测结合至细胞的抗体。还在这一分析中使用同型匹配的阴性对照抗体F3，以及对rhTNFR2具特异性的MR2-1阳性对照抗体和对rhTNFR1具特异性的阳性对照抗体。数据(包括每一抗体的EC50值)在图4A中编译。
11种所测试抗体中的6种(即HFB3-1、HFB3-14、HFB3-21、HFB3-23、HFB3-24和HFB3-25)对His标记的单体rhTNFR2显示亚nM亲和力(EC50)，而另外4种抗体(HFB-3、HFB-6、HFB-19和HFB-22)对相同抗原显示一位数的nM亲和力。HFB3-18显示相对最弱的与单体rhTNFR2的结合，具有两位数的nM亲和力。然而，11种抗体对His标记的TNFR1受体均不显示任何可检测水平的结合，证实对TNFR2的结合特异性。
使用抗人类IgG Fc捕获(AHC)生物传感器来验证人类-小鼠嵌合抗体HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18与重组人类TNFR2蛋白的结合亲和力。AHC生物传感器使得能够对含人类Fc的蛋白质(例如本发明抗体)与靶分析物(例如重组人类TNFR2)之间的巨分子相互作用进行动力学表征。通过工厂固定的抗人类Fc特异性抗体来实现含人类Fc的蛋白质的固定，所述工厂固定的抗人类Fc特异性抗体对人类Fc结构域的高亲和力会提供苛刻的动力学应用所需的稳定基线。在这一具体实验中，将测试抗体(人源化\以20μg/mL的浓度装载于分析缓冲液(PBS(pH 7.4)、0.1％BSA、0.1％Tween20)中。分析物是500nM、167nM或55.7nM的His标记的重组人类TNFR2。在25℃下运行捕获分析。所测试抗体的Kd在nM范围内(参见图4B)。
HFB3-1-hG1、HFB3-14-hG1、HFB3-6-hG1和HFB3-18-hG1抗体的表位定位实验显示这些抗体识别TNFR2的不同结构域。HFB3-1-hG1结合至CRD2结构域内的区域，而HFB3-18-hG1结合至CDR1内的构象表位。HFB3-6-hG1结合至CRD3内的区域，并且HFB3-14-hG1还结合至CRD3区域内的表位，所述表位小于HFB3-6-hG1的表位(参见图11B)。其表位在TNFR2-TNFα复合物的3D模型上的位置可在图11C中可视化。
实施例2TNFR2在T细胞亚型中的表达
这一实验证实，在多种癌症类型中，TNFR2主要在Treg以及CD4+和CD8+ T细胞上表达。
从多个肿瘤样品分离T细胞亚型(包括Treg和CD4+和CD8+ T细胞)，并且使用RNA序列分析来测定肿瘤样品中T细胞亚型的相对百分比，以及T细胞亚型中TNRF2的平均相对表达水平(2-8级)。结果编译于图5中。
在所分析的每一肿瘤样品(包括BCC或基底细胞癌、SCC或鳞状细胞癌、黑色素瘤和NSCLC或非小细胞肺癌)中，TNFR2主要并且最频繁发现于Treg以及CD4+和CD8+ T细胞中。另外，还在Treg中发现最高相对表达水平。参见图5左图。数据表明TNFR2是癌症疗法的有吸引力的靶。
还联合数种免疫检查点基因(例如PD-1、TIM3、CTLA4和4-1BB)的表达来进行SCC癌症样品中TNFR2的额外表达分析。发现在耗竭的CD8+ T细胞中，TNFR2的表达与这些免疫检查点基因的表达一致(图5右图)，表明使用抗TNFR2抗体和这些免疫检查点基因的抑制剂的组合疗法在治疗上将是有益的。
实施例3抗TNFR2单克隆抗体与原代Treg、CD8和CD4 Tconv细胞的结合
鉴于TNFR2在T细胞亚型上的表达模式(参见实施例2)，这一实验证实本发明抗TNFR2单克隆抗体可优先于活化的T细胞结合至原代T细胞亚型。
简单地说，在4℃下用10nM的抗CD3抗体涂布平底96孔板过夜。同时，从人类PBMC分离T细胞亚型，包括Treg、CD8或CD4常规T细胞(Tconv)。在6.6nM的抗CD28抗体存在下以约50,000个细胞/孔的密度接种分离的T细胞亚型，以共刺激原代T细胞持续约3天。然后在冰上用不同浓度的本发明抗TNFR2人类-小鼠嵌合单克隆抗体的1:3连续稀释液处理受刺激的原代T细胞持续1小时，其中最高浓度为66nM。通过添加17nM由AF647染料标记的抗hFc抗体并在冰上孵育1小时，然后通过FACS分析检测AF647信号来检测结合的嵌合抗体。
图6顶部图显示，CD4 Tconv是最丰富的T细胞亚型，占总hPBMC的约30％，其次为10％的CD8 T细胞和约1％的Treg。然而，未检测到非TCR活化的原代T细胞结合本发明抗TNFR2抗体，在原代Treg中出现相对较低的结合水平除外。总之，受体占据Emax在Treg中最高，其次为CD8，再次为CD4 Tconv。鉴于Treg与CD8和CD4 Tconv相比相对较低的丰度，以每个细胞计，Treg上TNFR2的表达比CD8和CD4 T细胞上TNFR2的表达高得多。
然而，在TCR活化的T细胞中，在Treg中观察到一些抗TNFR2抗体的结合显著增加5-6倍，而在CD8和CD4 Tconv中还观察到大体上更高的结合(图6下部图)。
在所测试抗体中，HFB3-1、HFB3-6、HFB3-24、HFB3-25和SBT1(阳性对照)展现亚nM水平的高亲和力，而HFB3-14和HFB3-19展现一位数的nM亲和力。HFB3-18、HFB3-21和HFB3-22具有两位数的nM亲和力。
实施例4某些抗TNFR2单克隆抗体与原代CD8和CD4 Tconv细胞的结合共刺激NFκB信号传导
这一实验展示，本发明的抗TNFR2单克隆抗体共刺激TNFα介导的NFκB信号传导，如通过NFκB信号传导途径基因的QPCR定量所证实。
简单地说，使用标准技术和市售试剂盒从hPBMC分离CD4Tconv(CD4+CD25-)或CD8+T细胞。将分离的T细胞与10μg/mL(66nM)的各种本发明测试单克隆抗体或适当的阳性或阴性对照以及25ng/mL(1.5nM)的TNFα一起孵育约24小时。然后收获受刺激的T细胞，并且分离它们的mRNA，反转录，并对所选NFκB信号传导途径基因(例如CD25、Foxp3、NFκB2、RelB和LTA)进行QPCR分析。在图7的条形图中比较这些基因在本发明抗体的共刺激存在和不存在下的表达水平。结果呈现为与无刺激对照(1×)相比的倍数变化。
结果显示，某些本发明抗体(包括HFB3-1、HFB3-14、HFB3-23、HFB3-24和HFB3-25)诱导NFκB信号传导。应注意，HFB3-1和HFB3-14而非HFB3-18不时诱导NFκB信号传导，尤其在NFκB2、RelB和LTA中。
实施例5抗TNFR2单克隆抗体的共刺激效应与分离的原代CD8和CD4 Tconv细胞的增殖相关
在这一实验中，在4℃下用10nM抗CD3单克隆抗体以及20nM或100nM的本发明抗TNFR2抗体涂布平底96孔板过夜。同时，如所述从hPBMC分离CD8和CD4 Tconv细胞，并用2μM的CTV(来自Invitrogen的CELLTRACETM紫细胞增殖试剂盒)标记以追踪T细胞增殖。CELLTRACETM紫染料易于扩散至细胞中，其中所述染料由细胞内酯酶裂解以产生高度荧光化合物，所述高度荧光化合物随后共价结合至细胞内胺，从而产生稳定的充分保留的荧光染色，所述荧光染色可用醛固定剂固定。过量未缀合的试剂被动扩散至细胞外培养基，其中所述未缀合的试剂可用完全培养基淬灭并洗掉。
然后在6.6nM抗CD28抗体存在下将经标记的T细胞以约50,000个细胞/孔的密度接种于经涂布的96孔板中，以共刺激约3天。然后将所述细胞固定用于荧光信号的FACS分析。
图8中的数据显示，某些本发明抗TNFR2抗体甚至在较低的20nM浓度下仍共刺激CD8和CD4 Tconv增殖。基准阳性对照抗体SBT-1和SBT-4在相同条件下还共刺激T细胞增殖，但程度低于HFB3-1、HFB3-14、HFB3-18和HFB3-25。
另外的实验显示，对于某些单克隆抗体(例如HFB3-18)，原代T细胞增殖的此类共刺激可依赖于FcγR交联，而对其他抗体(例如HFB3-1和HFB3-14)无可辨别的交联依赖性。
特别地，从供体KP59095分离CD8和CD4 Tconv，并且在25ng/mL重组人类TNFα(rhTNFα)存在或不存在下，通过CD3/CD28TCR活化以及本发明抗TNFR2单克隆抗体HFB3-1、HFB3-14或HFB3-18来刺激分离的原代T细胞。所述抗TNFR2抗体为板结合的，或以存在于结合混合物中的可溶性抗体供应。
在25ng/mL rhTNFα存在下，所有三种板结合的抗TNFR2抗体(HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18)均刺激CD8 T细胞增殖(参见图19左下角图)。然而，仅可溶性HFB3-1和HFB3-14(而非可溶性HFB3-18)能够刺激CD8 T细胞增殖(图19右下角图)，表明FcγR交联可能为HFB3-18介导的CD8 T细胞增殖所需的，但可能不为HFB3-1和HFB3-14介导的CD8 T细胞增殖所需的(即交联独立性)。
对相似条件下的CD4 Tconv增殖也获得相似结果(数据未显示)。
实施例6在Treg存在下抗TNFR2单克隆抗体有利于Teff细胞末端(CD8和CD4Tconv)的细胞增殖
这一实验证实，在Treg存在下，本发明抗TNFR2单克隆抗体可与CD3/CD28介导的TCR活化一起共刺激Teff细胞(CD8和CD4Tconv)增殖。
简单地说，从人类PBMC分离CD3+ T细胞(包括CD8和CD4Tconv效应T细胞)以及Treg，并且通过CD3/CD28介导的TCR活化和本发明抗TNFR2单克隆抗体共刺激约4天，大体上如上文所述。在Treg存在下总CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖是使用来自Invitrogen的CELLTRACETM紫细胞增殖试剂盒(CTV)来测定。CD4+ T细胞CD8+ T细胞的活化也通过测量各别T细胞群体中的CD25+ T细胞百分比来确定。
图9中的结果显示，本发明的抗TNFR2单克隆抗体(例如HFB3-1hz6-hG1AA，它是HFB3-1的人源化形式，参见下文)甚至在Treg存在下仍有利于效应T细胞(CD8和CD4 Tconv)的细胞增殖。
实施例7抗TNFR2单克隆抗体对HH淋巴瘤细胞具有可忽略的ADCC效应
这一实验证实，本发明抗TNFR2单克隆抗体对T细胞淋巴瘤具有可忽略的ADCC效应，表明此类抗体适于用作T细胞共刺激剂。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是细胞介导的免疫防御的机制，由此免疫系统的效应细胞主动溶解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已由特异性抗体结合。它是抗体作为体液免疫反应的一部分可用于限制并抑制感染的一种机制。ADCC需要效应细胞，其类别已知为通常与IgG抗体相互作用的自然杀手(NK)细胞。
在这一实验中，使用Jurkat.CD16V/NFAT/luc细胞作为效应细胞，而HH淋巴瘤细胞是靶细胞。效应细胞对靶细胞的比率为约6:1。使共培养的效应细胞和靶细胞在0nM、0.0066nM、0.66nM或66nM浓度的本发明抗TNFR2单克隆抗体(例如HFB3-1、HFB3-14或HFB3-18)或同型匹配的对照(hIgG1)存在下孵育过夜。使用抗体莫格利珠单抗(moganulizumab)作为ADCC的阳性对照。
图10中的结果显示，阳性对照抗体莫格利珠单抗对靶细胞的ADCC效应比任何所测试的抗TNFR2单克隆抗体强至少120倍。数据证实，本发明抗TNFR2抗体因其对T细胞的低/无ADCC效应而适于用作T细胞共刺激剂。
实施例8人源化抗TNFR2单克隆抗体与TNFR2的结合
产生HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18的多种人源化单克隆抗体，包括HFB3-1的至少20种，HFB3-14的16种，以及HFB3-18的一种(这归因于所选人类生殖系高度类似于亲本HFB3-18单克隆抗体编码序列)。大体上如实施例1中所述，测定这些人源化单克隆抗体结合CHO细胞上表达的人类TNFR2的能力。
图12A显示，人源化HFB3-1hz6、HFB3-14hz1c和HFB3-18hz1与表达人类TNFR2的CHO细胞(CHO.hTNFR)结合，但不与亲本CHO细胞结合。图12B显示，至少7种人源化HFB3-1抗体(即HFB3-1hz6、HFB3-1hz8、HFB3-1hz9、HFB3-1hz10、HFB3-1hz11、HFB3-1hz12和HFB3-1hz14)和至少8种人源化HFB3-14抗体(即HFB3-14hz1c、HFB3-14hz2c、HFB3-14hz3c、HFB3-14hz4c、HFB3-14hz6c、HFB3-14hz7c、HFB3-14hz12c和HFB3-14hz14c)保留与各别亲本嵌合抗体大致相同(如果非较佳)水平的对表达TNFR2的CHO细胞(CHO.hHFB3)的结合亲和力。
替代地使用表达TNFR2的恒河猴直系同源物的CHO细胞(CHO.mkHFB3)，重复相似实验。图13显示，对表达猴TNFR2的CHO细胞的结合的一般趋势与CHO.hTNFR2匹配。然而，对于基于HFB3-14的两种人源化变体(即HFB3-14hz2c和HFB3-14hz3c)，观察到稍不稳定的结合。
人源化抗TNFR2抗体的结合对TNFR2具特异性并且对TNFR1不具特异性。图14A中的ELISA分析证实，人源化单克隆抗体HFB3-1hz6、HFB3-14hz1c和HFB3-18hz1与重组人类和食蟹猴TNFR2(分别为hTNFR2-His和cynoTNFR2-His)结合，而不识别重组人类TNFR1(hTNFR1-His)。另外，这些人源化抗TNFR2抗体与重组人类和食蟹猴TNFR2的结合EC50介于亚nM至一位数nM的范围内。
还使用重组人类TNFR2蛋白和AHC生物传感器来验证人源化变体对人类TNFR2的结合亲和力。抗人类IgG Fc捕获(AHC)生物传感器使得能够对含人类Fc的蛋白质(例如本发明抗体)与靶分析物(例如重组人类TNFR2)之间的巨分子相互作用进行动力学表征。经由工厂固定的抗人类Fc特异性抗体来实现含人类Fc的蛋白质的固定，所述工厂固定的抗人类Fc特异性抗体对人类Fc结构域的高亲和力会提供苛刻的动力学应用所需的稳定基线。在这一具体实验中，将测试抗体(人源化对亲本嵌合抗体)以20μg/mL的浓度装载于分析缓冲液(PBS,pH 7.4、0.1％BSA、0.1％Tween20)中。分析物是500nM、167nM或55.7nM的His标记的重组人类TNFR2。在25℃下运行捕获分析。
如图14B中所示，根据对重组人类TNFR2的亲和力，区分人源化变体与其各别嵌合亲本抗体并无主要差异。
实施例3显示，嵌合抗TNFR2抗体与TCR活化的T细胞结合。对人源化变体运行大体上相同的实验，并且结果显示于图15中。
特别地，根据与TCR活化的CD8细胞的结合，大多数人源化HFB3-1抗体展现亚nM水平的亲和力，似乎不结合TCR活化的CD8细胞的两种变体(HFB3-1hz5和HFB3-1hz7)除外。同时，所有人源化HFB3-14变体均对TCR活化的CD8 T细胞展现一位数的nM亲和力。区分不同变体并无主要差异。应注意，阳性对照抗体SBT-2和SBT-3并非原代CD8细胞的良好结合剂。
实施例9人源化抗TNFR2单克隆抗体使TCR活化的CD4和CD8 T细胞增殖的共刺激效应
实施例5显示，嵌合抗TNFR2单克隆抗体的共刺激效应使分离的人类原代CD8和CD4Tconv细胞增殖。这一实验证实，使用HFB3-1和HFB3-14的人源化变体在TCR活化的CD4 T细胞中相同。
特别地，图16显示，基于CTV增殖分析(参见上文)，人源化变体HFB3-1hz5、HFB3-1hz6、HFB3-1hz8、HFB3-1hz10、HFB3-1hz11和HFB3-1hz12强烈地刺激TCR活化的CD4 T细胞，各自的程度大于亲本HFB3-1嵌合抗体。对HFB3-14hz1c和HFB3-14hz3c变体重复相同过程。
同样，还对上述变体确认基于CD25+ T细胞群体的百分比的T细胞活化。
还获得HFB3-1hz6-hG1、HFB3-14hz1c-hG1和HFB3-18hz1-hG1的确认的共刺激数据以显示，这些变体具有使TCR活化的CD8 T细胞(通过CD3/CD28刺激活化)增殖的共刺激效应。特别地，亲本嵌合抗体和所选人源化变体均增强通过CD3/CD28 TCR活化刺激的CD8T细胞增殖。另外，TNFα的协作(右图)进一步增强抗TNFR2抗体介导的CD8增殖。参见图20。
实施例10某些人源化抗TNFR2单克隆抗体诱导Treg中的NFκB信号传导
实施例4显示某些嵌合抗TNFR2单克隆抗体与原代CD8和CD4Tconv细胞的结合共刺激NFκB信号传导。此处的相似实验展示，某些人源化变体抗TNFR2抗体诱导Treg中的NFκB信号传导。
特别地，图17显示，使用某些人源化变体抗TNFR2抗体和TNFα共刺激Treg会产生LTA、TNF和TNF AIP3中的NFκB下游信号传导。变体HFB3-1hz6、HFB3-1hz9、HFB3-1hz10和HFB3-1hz11比亲本嵌合抗体HFB3-1在更大程度上促进NFκB信号传导。同时，变体HFB3-14hz1c、HFB3-14hz2c、HFB3-14hz3c和HFB3-14hz4c(尤其HFB3-14hz1c和HFB3-14hz3c)还比亲本嵌合抗体HFB3-14在更大程度上促进NFκB信号传导。
实施例11抗TNFR2抗体是稳定的
为了确认本发明人源化抗TNFR2抗体在存储时是稳定的并因此适于进一步开发为治疗剂，对所选人源化抗体运行多种可开发性分析。
在第一实验中，将所选本发明人源化抗体存储在25℃或40℃的PBS(pH7.4)中，并且在第7天和第14天测定各个抗体的稳定性。图18中的结果展示，除1种变体HFB3-14hz4c-hG1AA外，所有所测试抗体在所测试条件下均是稳定的。
在第二实验中，测试相同抗体在低pH条件(100mM AcH,pH3.5,25℃)下持续0小时、3小时和6小时的稳定性。图18中的结果再次展示，除1种变体HFB3-14hz4c-hG1AA外，所有所测试抗体在所测试条件下均是稳定的。
在第三实验中，使相同抗体经受1个、2个或3个冷冻-解冻周期。图18中的结果再次展示，除2种变体(HFB3-1hz6-hG1AA和HFB3-1hz10-hG1AA)外，所有所测试抗体在所测试条件下均是稳定的。
对HFB3-1hz6-hG1、HFB3-14hz1c-hG1和HFB3-18hz1-hG1重复相似的实验。所有三种变体在上文所概述的三种测试下通常是稳定的，除了HFB3-1hz6-hG1和HFB3-18hz1-hG1在14天后开始降解。
总之，数据表明，这些本发明变体人源化抗TNFR2单克隆抗体不具重要的可开发性问题，并且适于用作治疗抗体。
实施例12人源化TNFR2敲入(KI)小鼠中的抗TNFR2抗体和其对T细胞的影响
为了更好地展示本发明抗TNFR2抗体的治疗功效，在C57BL/6小鼠背景下通过商业服务(Biocytogen,Wakefield,MA)产生人源化TNFR2敲入(KI)小鼠。
在第一系列的实验中，分析在1μg/mL CD28和0.2μg/mL或1μg/mL CD3的共刺激下所选人源化抗TNFR2抗体与KI小鼠CD3 T细胞(TNFR2 KI CD3 T细胞)之间的离体结合。结果显示KI小鼠的1μg/mL CD3活化脾细胞优于0.2μg/mL CD3。可检测KI CD3+ T细胞上人类TNFR2的表达，所述表达/检测可通过TNFα和在轻度(0.2μg/mL)CD3刺激下增强。另外，单剂量的200nM的6种抗TNFR2抗体中的每一者(即HFB3-1、HFB3-14和HFB3-18以及其人源化变体HFB3-1hz6、HFB3-14hz1c和HFB3-18hz1)不显示TNFR2结合的可辨别的差异，这可能归因于饱和结合水平。数据未显示。
还对从TNFR2 KI小鼠分离的CD8 T细胞重复相同的离体结合实验。此处，可在强CD3(1μg/mL)刺激下观察到抗TNFR2单克隆抗体(其嵌合和人源化形式)与TNFR2的结合。同时，TNFα在轻度CD3(0.2μg/mL)刺激下增强TNFR2结合。数据未显示。
然后，检查本发明抗TNFR2抗体(嵌合和人源化)在经由CD3/CD28实现的TCR活化存在下以及在TNFα存在下离体共刺激TNFR2 KI CD8和CD4 Tconc细胞中的下游NFκB信号传导的能力。
尽管来自hTNFR2敲入(KI)小鼠T细胞的信号反应不如来自人类T细胞的信号反应显著，但HFB3-1-hG1和其人源化变体HFB3-1hz6-hG1确实诱导大于其他抗体的反应(参见图21)。应注意，预期缺乏来自HFB3-18系列的信号诱导。
检查C57BL/6小鼠中本发明人源化抗TNFR2单克隆抗体(HFB3-1hz6-hG1、HFB3-141c-hG1和HFB3-18hz1-hG1)的药物动力学(PK)特征。所有三种人源化单克隆抗体展现与对表现良好的抗体预期相一致的T1/2。参见下文。
Figure BDA0003834245140000841
Figure BDA0003834245140000851
实施例13人源化HFB3-1hz6-hG1对自然杀手(NK)细胞离体活化的影响
这一实验展示，本发明人源化HFB3-1hz6-hG1抗体在通过IL-2/IL-15或经由CD3/CD28实现的NK细胞活化存在下共刺激自然杀手(NK)细胞。
在一个实验中，使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从两个人类患者供给的外周血单核细胞(PBMC)分离NK细胞。首先通过可溶性IL-2(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)将NK细胞刺激24小时，并且接着用同型对照抗体、小鼠HFB3-1-hG1、人源化HFB3-1-hz6-hG1或抗OX40对照抗体(BMS)(分别为22nM、66nM或200nM)处理16小时。在实验结束时，通过FACS测量NK细胞表面上代表NK细胞脱粒和活化的CD107α表达以及TNFR2表达。
小鼠HFB3-1-hG1和人源化HFB3-1-hz6-hG1均以剂量依赖性方式显著增加NK细胞活化。抗OX40抗体无法促进NK短期活化(自从IL-2/IL-15刺激后40小时)，这可能归因于不充分的OX40表达。
在另一实验中，通过板结合的抗CD3(1μg/mL)和可溶性抗CD28(1μg/mL)将两个人类患者供给的全PBMC共刺激48小时，并且接着用同型对照抗体、小鼠HFB3-1-hG1、人源化HFB3-1-hz6-hG1或抗OX40抗体(BMS)(分别为22nM、66nM或200nM)处理16小时。针对CD3阴性/CD56阳性(即NK细胞)测定CD107α表达。参见图23。
同样，HFB3-1-hG1和HFB3-1-hz6-hG1以剂量依赖性方式显著增加CD107α表达，指示这些抗体可促进全PBMC中的NK细胞活化。在长期活化(自从抗CD3/CD28刺激后64小时)下，抗OX40抗体能够活化NK细胞。
这些数据显示，人源化HFB3-1-hz6-hG1和亲本小鼠HFB3-1-hG1均可促进NK细胞活化。
实施例14MC38肿瘤模型中人源化HFB3-1hz6-hG1的药效学
在人源化TNFR2-KI小鼠中使用MC38结肠直肠癌肿瘤模型来检查HFB-1-hG1的药效学(参见图24A)。简单地说，向8周龄的人源化TNFR2 KI小鼠的右前侧腹中接种约5×105个MC38肿瘤细胞/小鼠。将小鼠随机化并且7天后，在第0天，向小鼠(每组n＝5)腹膜内注射10mg/kg、1mg/kg或0.1mg/kg的HFB3-1-hG1或10mg/kg的同型对照抗体。在第3天，再次施用相同的治疗。在第4天，对小鼠实施安乐死并且对肿瘤和血液样品进行药效学读数。使用FACS来分选肿瘤浸润白血球和外周白血球，并测定抗体对受体的占据。
在第0天和第3天仅2个剂量的治疗后，治疗之间肿瘤重量无显著差异(图24B左上图)。施用10mg/kg的HFB3-1-hG1会增加存在于肿瘤中的CD45+细胞的绝对数(图24B左下图)，但活肿瘤细胞中CD45+的百分比未显著升高(图24B右下图)。10mg/kg的HFB3-1-hG1的治疗还增加肿瘤微环境中CD8+、常规CD4+ T和NK细胞的绝对细胞数，但并未改变T调控细胞的数目(图24C)。施用其他较低剂量的HFB3-1-hG1并未产生任何可观察到的效应。
测定肿瘤和外周血中的CD8 T细胞、常规CD4 T细胞、T调控细胞和NK细胞的TNFR2受体占据。在肿瘤中，仅10mg/kg剂量的HFB3-1-hG1对肿瘤中的T细胞产生药物受体占据；对1mg/kg和0.1mg/kg剂量未观察到占据(参见图25A)。然而，在1mg/kg和10mg/kg下，在肿瘤NK细胞中观察到受体占据。在外周血中，10mg/kg和1mg/kg剂量的HFB3-1-hG1产生可相当的药物受体占据，并且在0.1mg/kg剂量下未观察到显著占据。
在实验终止时测定HFB3-1-hG1的药物动力学。在第4天在血液中可检测到1mg/kg和10mg/kg剂量的HFB3-1-hG1施用。应注意，10mg/kg剂量的HFB3-1-hG1的滞留水平远高于相同剂量的同型对照(参见图26A)。有趣的是，施用10mg/kg和1mg/kg的HFB3-1-hG1还增加血液中可检测到的TNFR2的量(参见图26B)。推测血液中的TNFR2归因于受体脱落。
总之，关于用HFB3-1-hG1短期治疗小鼠的数据高度表明，HFB3-1-hG1具有刺激免疫细胞的活化和增殖、与免疫细胞上的TNFR2受体有效结合并在血液中具有体内良好滞留的潜力。
实施例15与抗PD-1抗体的协同抗肿瘤功效
在广泛使用的小鼠结肠直肠癌模型中，在人源化TNFR2 KI小鼠背景下展示本发明人源化抗TNFR2单克隆抗体的抗肿瘤功效。
特别地，向8周龄的人源化TNFR2 KI小鼠接种约5×105个MC38肿瘤细胞(其衍生自C57BL6鼠类结肠腺癌)/小鼠。约7天后，在第0天，小鼠中的平均肿瘤大小达到约89mm3(介于74-98mm3之间)。然后将小鼠随机化成5个实验组(n＝8/组)，以施用以下一者：(1)同型匹配的对照(TT-hG1AA)；(2)抗mPD-1(RMP-1-14)；(3)HFB3-1hz6-hG1；(4)HFB3-14hz1c-hG1；和(5)HFB3-18hz1-hG1。在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天以约10mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)注射抗体，持续总共7个剂量(Q3D，×7)。在研究过程内测量实验组的肿瘤体积。在第21天或约第21天，同型对照组的平均肿瘤体积达到>2000mm3，并且终止实验并杀死所有小鼠。各个组随时间变化的肿瘤体积绘图于图27A和图27B中。截至第21天，在接受HFB3-1hz6、HFB3-18hz1和抗PD-1(RMP-14)的小鼠的组中实现肿瘤生长抑制(TGI)的统计学显著性(图27B)。
结果显示，人源化抗体HFB3-1hz6-hG1和HFB3-18hz1-hG1对肿瘤生长的抑制与抗mPD-1抗体一样强效(如果非较佳)，而另一人源化抗体同样有效，但程度稍低。在不同实验小鼠组中未观察到表观体重差异。
在仅使用抗mPD-1和HFB3-1hz6-hG1以及同型对照(4只小鼠/组)，Q3d×3(每三天一次，持续总共三个剂量，i.p.注射10mg/kg)的另一实验中也获得相似的结果。在第6天(抗体的最后一个剂量)，同型对照组与抗mPD-1组和HFB3-1hz6-hG1组之间肿瘤体积在统计学上显著不同(基于2因子ANOVA测试)。参见图28。
另外，在MC38肿瘤模型中，HFB3-1hz6-hG1和抗PD-1抗体协同地抑制肿瘤生长并且增加小鼠的寿命。特别地，在第-7天，向人源化TNRF2 KI小鼠接种MC38癌细胞。从第0天，每3天向小鼠腹膜内注射单独或组合的同型对照、HFB3-1hz6-hG1或抗mPD-1抗体(n＝8/组)。与用同型对照治疗相比，每3天用3mg/kg和10mg/kg HFB3-1hz6-hG1治疗持续总共7个剂量(Q3d×7)和每3天用10mg/kg抗PD-1(RMP-14)治疗持续总共4个剂量(Q3d×4)会显著抑制肿瘤生长并且延长小鼠的寿命。另外，HFB3-1hz6-hG1(10mg/kg,Q3d×7)和抗PD-1抗体(10mg/kg,Q3d×4)的组合治疗产生优于用单独抗PD-1抗体治疗的存活。参见图29。使用比较治疗组与同型对照的ANOVA来分析数据。
实施例14非人类灵长类动物中抗TNFR2抗体的毒物学评估
使用非人类灵长类动物模型来检查人源化抗TNFR2抗体的毒物学。向每组两只食蟹猴注射单个剂量的15mg/kg(低)、50mg/kg(中等)和150mg/kg(高)的人源化HFB3-1hz6-hG1单克隆抗体，然后在不同时间点收集血浆直至336h(第14天)。
HFB3-1hz6-hG1的毒物代谢动力学分析显示抗体随时间消除。在注射15mg/kg、50mg/kg或150mg/kg的HFB3-1hz6-hG1后，与≤3mg/kg的CD3×CD20双特异性IgG的所报告数据(虚线)相比，未观察到细胞因子IL-6、IL-2、IFN-γ和TNF-α升高(图30)。
在注射15mg/kg、50mg/kg或150mg/kg的HFB3-1hz6-hG1后，与正常猴的历史数据范围相比，未发现白血球、红血球、血小板、嗜中性球和淋巴球的数目的异常(图31)。
毒物学评估迄今未显示用剂量高达150mg/kg的HFB3-1hz6-hG1治疗非人类灵长类动物受试者所引起的可辨别的毒性效应。

Claims (31)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对人类TNFR2具特异性，并且其中所述单克隆抗体包含：
(1a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；和
(1b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:4的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:5的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:6的LCVR CDR3序列；或
(2a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:14的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:15的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:16的HCVR CDR3序列；和
(2b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:17的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:18的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:19的LCVR CDR3序列；或
(3a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:26的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:27的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:28的HCVR CDR3序列；和
(3b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:29的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:30的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:31的LCVR CDR3序列；或
(4a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:39的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:40的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:41的HCVR CDR3序列；和
(4b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:42的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:43的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:44的LCVR CDR3序列；或
(5a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:51的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:52的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:53的HCVR CDR3序列；和
(5b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:54的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:55的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:56的LCVR CDR3序列；或
(6a)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:63的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:64的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:65的HCVR CDR3序列；和
(6b)轻链可变区(LCVR)，其包含SEQ ID NO:66的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:67的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:68的LCVR CDR3序列。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(1A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:7；和/或
(1B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:8，或
(2A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:20；和/或
(2B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:21，或
(3A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:32；和/或
(3B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:33，或
(4A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:45；和/或
(4B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:46，或
(5A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:57；和/或
(5B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:58，或
(6A)所述HCVR序列是SEQ ID NO:69；和/或
(6B)所述LCVR序列是SEQ ID NO:70。
3.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体具有：
(1a)SEQ ID NO:9的重链序列；和/或
(1b)SEQ ID NO:10的轻链序列，或
(2a)SEQ ID NO:22的重链序列；和/或
(2b)SEQ ID NO:23的轻链序列，或
(3a)SEQ ID NO:34的重链序列；和/或
(3b)SEQ ID NO:35的轻链序列，或
(4a)SEQ ID NO:47的重链序列；和/或
(4b)SEQ ID NO:48的轻链序列，或
(5a)SEQ ID NO:59的重链序列；和/或
(5b)SEQ ID NO:60的轻链序列，或
(6a)SEQ ID NO:71的重链序列；和/或
(6b)SEQ ID NO:72的轻链序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是小鼠抗体、人类-小鼠嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、CDR移植抗体或表面重塑抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与恒河猴TNFR2交叉反应，但大体上不与小鼠TNFR2交叉反应。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段大体上不与TNFR1交叉反应。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段以小于约25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、2nM或1nM的Kd结合TNFα。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段增强TNFα与TNFR2之间的结合；增强TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下促进TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段增强Treg上TNFα介导的CD25表达。
11.如权利要求1-10中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:13的表位。
12.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与如权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合至所述SEQID NO:13的表位。
13.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合至所述SEQ ID NO:13的表位。
14.如权利要求13所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段增强TNFα与TNFR2之间的结合；增强TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下促进TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
15.如权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段抑制TNFα与TNFR2之间的结合；抑制TNFα介导或共刺激的NFκB信号传导(例如在TCR活化的CD8和/或CD4 Tconv T细胞中)；和/或在Treg存在下抑制TCR活化的效应T细胞(例如CD8和/或CD4 Tconv T细胞)增殖。
16.如权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段促进Treg扩增。
17.如权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段促进自然杀手细胞活化。
18.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与如权利要求1-8和15-16中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合至所述同一表位。
19.一种治疗有需要的患者的癌症或自身免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如权利要求1-18中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
20.如权利要求19所述的方法，所述方法用于治疗癌症，其中所述方法还包括施用免疫检查点的拮抗剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述免疫检查点是PD-1/PD-L1免疫检查点。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述免疫检查点的所述拮抗剂是对PD-1或PD-L1具特异性的抗体或其抗原结合片段。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体是抗PD-1抗体，例如西米普利单抗(cemiplimab)、纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体是抗PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、KN035或CK-301。
25.如权利要求20或21所述的方法，其中所述免疫检查点的所述拮抗剂是PD-1/PD-L1的(非抗体)肽抑制剂，例如AUNP12；PD-L1的小分子抑制剂，例如CA-170，或大环肽，例如BMS-986189。
26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、乳癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(NSCLC)、卵巢癌、皮肤癌(例如鳞状细胞癌或基底细胞癌)、淋巴瘤或白血病。
27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用化学治疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、肿瘤免疫剂和/或抗赘瘤组合物。
28.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1-18中任一项所述的重链或轻链或其抗原结合部分。
29.如权利要求28所述的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化以在人类细胞中表达。
30.一种载体，所述载体包含如权利要求28或29所述的多核苷酸。
31.如权利要求30所述的载体，所述载体是表达载体(例如哺乳动物、酵母、昆虫或细菌表达载体)。
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