CN117279954A - 抗人cxcr5抗体及其用途 - Google Patents

抗人cxcr5抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117279954A
CN117279954A CN202280030139.3A CN202280030139A CN117279954A CN 117279954 A CN117279954 A CN 117279954A CN 202280030139 A CN202280030139 A CN 202280030139A CN 117279954 A CN117279954 A CN 117279954A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
seq
antibody
amino acid
nos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280030139.3A
Other languages
English (en)
Inventor
良·施维泽
萨米·埃卢泽
埃林·科克·哈鲁诺瓦
斯蒂芬尼·贝奇
尼古拉·阿图罗·奥尔多·贝尔特拉米内尔
章乾
弗朗西斯科·艾德里安
Y-Y·陆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gaocheng Biomedical Hong Kong Co ltd
Original Assignee
Gaocheng Biomedical Hong Kong Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/CN2021/111049 external-priority patent/WO2023010483A1/en
Application filed by Gaocheng Biomedical Hong Kong Co ltd filed Critical Gaocheng Biomedical Hong Kong Co ltd
Publication of CN117279954A publication Critical patent/CN117279954A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了对于(人)CXCR5是特异性的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及使用所述单克隆抗体及其抗原结合片段治疗干燥综合征、某些癌症和自身免疫性病症的方法，包括组合疗法。

Description

抗人CXCR5抗体及其用途
相关申请的引用
本申请要求2023年3月9日提交的美国临时专利申请号63/158,462和2021年8月5日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/111049的优先权，上述参考申请中的每一个的全部内容，包括任何附图和序列表，通过引用并入本文。
背景技术
C-X-C趋化因子受体5型(CXC-R5)，也称为CD185(分化簇185)或伯基特淋巴瘤受体1(BLR1)，是趋化因子CXCL13(也称为BLC)的一种G蛋白偶联的七次跨膜受体，属于CXC趋化因子受体家族。在人类中，CXC-R5蛋白由CXCR5基因编码，其使T细胞能够迁移到淋巴结B细胞区。
BLR1/CXCR5基因在伯基特淋巴瘤和淋巴组织中特异性表达，如淋巴结以及脾脏中的卵泡。该基因在B细胞迁移中起着重要作用。通过CXCL13的分泌，B细胞能够定位淋巴结。此外，最近的一些研究表明，CXCL13通过CXCR5能够募集造血前体细胞(CD3-CD4+)，这将导致淋巴结和派伊尔结的发育。
在另一方面，如果没有CXCR5表达，T细胞就无法进入B细胞滤泡。这是产生高亲和力抗体的关键步骤，因为B细胞和T细胞需要相互作用才能激活Ig类别转换。
因此，CXCR5已被证明在成熟的静息B细胞、扁桃体B细胞、CD4和CD8 T细胞上表达，尽管其通常被认为是确定T滤泡辅助细胞(Tfh)的标志物。
乳腺癌患者中CXCR5过表达与淋巴结转移高度相关。此外，在缺乏功能性p53蛋白的乳腺肿瘤中，CXCR5表达升高可能导致异常细胞存活和迁移。SNP rs630923的微小等位基因位于CXCR5基因启动子区域，且与多发性硬化的风险相关，是MEF2C结合位点出现的原因，导致B细胞激活过程中CXCR5启动子活性降低，这可能导致自身免疫应答降低。
CXCR5也与前列腺癌的转移性进展有关—已发现前列腺癌组织以及细胞系表达较高的非基础水平的CXCR5。此外，还发现CXCR5的表达水平与Gleason评分之间存在相关性。
CXCR5是GC(生发中心，Forster等，1996–Allen等，2004)的极化/组织所需要的。CXCR5及其配体CXCL13是在B/T边界区的B/T细胞迁移到次级淋巴器官GC所必需的(Allen等，2004–Relf等，2012)。B/T区的B/T细胞相互作用是BCR亲和力成熟和B细胞扩增所必需的(Breitfield等，2000)。
已知大部分趋化因子一种以上受体结合。然而，CXCR5和CXCL13的相互作用似乎是独特的，因为没有其他配体结合CXCR5，也没有其他受体结合CXCL13，尽管CXCR3是最接近的同源物，与CXCR5共享约38.5％的氨基酸序列同一性或51.5％的相似性。
干燥综合征(SjS，SS)是一种长期的自身免疫性疾病，其影响身体的水分产生腺体。该疾病以在1933年对其进行描述的Henrik 命名。SS的主要症状包括口干和眼干。其他症状可以包括皮肤干燥、阴道干燥、慢性咳嗽、手脚麻木、感到疲劳、肌肉和关节疼痛以及甲状腺问题。那些受影响的人患淋巴瘤的风险也增加了(5％)。
0.2％至1.2％的人群受到SS的影响，其中一半是原发性SS(独立于其他健康问题发生)，一半是继发性SS(由另一种结缔组织病症引起)。女性受到影响是男性的约十倍；且其通常在中年开始；但任何人均可受影响。在那些没有其他自身免疫性病症的患者中，预期寿命不会改变。
虽然SS的确切原因尚不清楚，但据信其涉及遗传和环境触发因素的结合，如接触病毒或细菌。由此产生的炎症会逐渐损害腺体。
目前SS的治疗是针对症状的。干眼治疗包括人工泪液、减少炎症的药物、泪点堵塞或关闭泪管的手术。对于口干，可以使用口香糖(优选无糖的)、喝水或唾液替代物。对于关节或肌肉疼痛的患者，可以使用布洛芬。也可以停止使用可能导致干燥的药物，如抗组胺药。
因此，需要开发治疗干燥综合征以及其他机制相关疾病或适应症的治疗试剂。
发明内容
本文所述的本发明提供了拮抗性抗hCXCR5抗体，该抗体还通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)选择性地消耗CXCR5+细胞，其不仅抑制Tfh和B细胞的迁移，而且消除已经存在的CXCR5+细胞，从而减少组织损伤和致病性抗体的产生。
因此，本文所述的本发明提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对于人CXCR5(hCXCR5)是特异性的，和其中所述单克隆抗体包含：(1)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列；其中所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含表A、表B和表D中的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列中的任一个；任选地，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含表A、表B和表D中的任一单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列；和/或(2)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列；其中所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含表A、表C和表D中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列中的任一个；任选地，所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含表A、表C和表D中的任一单克隆抗体的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:17、18和19的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:41、42和43的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和65的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:76、77和78的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VLCDR3序列分别包含SEQ ID NO:149、150和151的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:114、115和116的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是小鼠-人嵌合抗体，所述嵌合抗体包含人抗体(如hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4)的恒定区序列，其中所述VH序列是SEQ ID NO:8、24、40、56、65或75中的任一项或者与SEQ ID NO:8、24、40、56、65或75的氨基酸序列中的任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和/或其中所述VL序列是SEQ ID NO:16、32、48、63、68或83中的任一项或者与SEQ ID NO:16、32、48、63、68或83的氨基酸序列中的任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:8或者与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:16或者与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:24或者与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:32或者与SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:40或者与SEQ ID NO:40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:48或者与SEQ ID NO:48具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:56或者与SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:63或者与SEQ ID NO:63具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:65或者与SEQ ID NO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:68或者与SEQ ID NO:68具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述VH序列是SEQ ID NO:75或者与SEQ ID NO:75具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQID NO:83或者与SEQ ID NO:83具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，任选地，其中所述人源化抗体包含：(1)表B、表D和表E中的任一单克隆抗体的VH序列或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列；和/或表C、表D和表E中的任一单克隆抗体的VL序列或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；(2)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:112的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；(3)SEQ ID NO:113的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:112的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；(4)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:101的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；(5)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:109的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列。
在一些实施方式中，所述人源化抗体包含：表B和表D中的任一抗体的VH框架区序列VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4，
在一些实施方式中，所述VH框架区序列VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4序列包含(i)分别与SEQ ID NO:84、85、86和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(ii)分别与SEQ ID NO:89、90、91和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(iii)分别与SEQ ID NO:93、94、95和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(iv)分别与SEQ ID NO:132、85、133和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(v)分别与SEQ IDNO:93、126、127和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(vi)分别与SEQ ID NO:132、133、134和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(vii)分别与SEQ ID NO:138、94、139和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(viii)分别与SEQ ID NO:141、142、143和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述人源化抗体包含：表C和表D中的任一抗体的VL框架区序列VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4，
在一些实施方式中，所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4序列包含(i)分别与SEQID NO:97、98、99和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(ii)分别与SEQ ID NO:97、102、99和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(iii)分别与SEQ ID NO:103、104、105和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(iv)分别与SEQ ID NO:103、107、108和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(v)分别与SEQ ID NO:134、135、136和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(vi)分别与SEQ ID NO:128、129、130和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(vii)分别与SEQ ID NO:145、146、147和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；(viii)分别与SEQ ID NO:97、98、152和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；或者(ix)分别与SEQ IDNO:154、102、99和47基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4序列分别包含(i)SEQID NO:93、94、95和87；(ii)SEQ ID NO:132、85、133和87；(iii)SEQ ID NO:93、126、127和87；或者(iv)SEQ ID NO:132、133、134和87；和/或所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4序列分别包含(i)SEQ ID NO:134、135、136和131；或者(ii)SEQ ID NO:128、129、130和131。
在一些实施方式中，所述VH序列包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或者所述VH序列包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
在某个实施方式中，所述VH序列包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的(例如，Fc N-聚糖上不存在核心岩藻糖，因此，显示出对FcγRIIIa增加的IgG1 Fc结合亲和力)，并且包含VH序列，其包含SEQ ID NO:114-116的VH CDR1–CDR3氨基酸序列，和VL序列，其包含SEQ ID NO:120-122的VL CDR1-CDR3氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的(例如，Fc N-聚糖上不存在核心岩藻糖，因此，显示出对FcγRIIIa增加的IgG1 Fc结合亲和力)，并且包含VH序列，其包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列，和VL序列，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的(例如，Fc N-聚糖上不存在核心岩藻糖，因此，显示出对FcγRIIIa增加的IgG1 Fc结合亲和力)，并且包含VH序列，其包含HFB2-4hz42hG1的VH序列的VH CDR1-CDR3氨基酸序列，和VL序列，其包含HFB2-4hz42hG1的VL序列的VL CDR1-CDR3氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的(例如，Fc N-聚糖上不存在核心岩藻糖，因此，显示出对FcγRIIIa增加的IgG1 Fc结合亲和力)，并且包含VH序列，其包含HFB2-4hz42hG1的VH序列的氨基酸序列，和VL序列，其包含HFB2-4hz42hG1的VL的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含修饰的Fc区以增强ADCC。
在某些实施方式中，所述修饰的Fc区包含：(1)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变以增强FcγRIIIa结合；(2)S239D/I332E突变以增强FcγRIIIa结合；(3)S239D/I332E/A330L突变以同时增强FcγRIIIa结合和减少FcγRIIIb结合；(4)S298A/E333A/K334A突变以增强FcγRIIIa结合；和/或(5)在Fc区的非岩藻糖基化N297以增强FcγRIIIa结合。
在某些实施方式中，所述的其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab’)3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段针对ADCC活性具有低(例如，1-5或1-2)pM范围EC50值。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段针对表达表面hCXCR5的原代B细胞和/或表达表面hCXCR5的原代T细胞具有ADCC活性。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段不(或至多最低限度地)内化所述hCXCR5表面抗原。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制cAMP信号传导(例如，EC50小于1nM)。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制趋化性(例如，在约0.1-0.5nM或约0.1nM下具有～100％抑制)。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制hCXCL13诱导的B细胞迁移。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段基本上不与hCXCR3交叉反应。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与贴壁细胞系(如DX002)和/或悬浮细胞系(如M300-19)上表达的hCXCR5结合。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段不与或最低限度地与hCXCR5的食蟹猴或小鼠直系同源物交叉反应。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段降低受试者中记忆B细胞群的百分比。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以小于约25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、2nM或1nM或更小的Kd结合hCXCR5。
本发明的另一个方面提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与前述实施方式中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同表位。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗干燥综合征(SS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，所述方法缓解SS的至少一种症状。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗淋巴瘤或白血病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，所述淋巴瘤或白血病是B细胞淋巴瘤。
在某些实施方式中，所述B细胞淋巴瘤是CLL(B细胞慢性淋巴细胞性白血病)。
在某些实施方式中，所述淋巴瘤或白血病是非霍奇金氏淋巴瘤，如伯基特氏淋巴瘤。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗具有异位生发中心的疾病或适应症(包括自身免疫性疾病或病症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，所述疾病或适应症是类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、多发性硬化症(MS)、结节病、银屑病、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫氏病、动脉粥样硬化、结膜炎、胃炎、肝炎或皮炎。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗实体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)，其中所述实体癌症任选地是胃癌、乳腺癌、肠癌、肺癌或前列腺癌。
在某些实施方式中，治疗淋巴瘤或白血病的方法，和/或治疗实体癌症的方法进一步包括向患者施用化学治疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、免疫肿瘤剂和/或抗赘生物组合物。
本发明的另一个方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的重链或轻链或其抗原结合部分。
在某些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化以在人细胞中表达。
本发明的另一个方面提供了一种载体，其包含本发明所述的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
应当理解，本发明的任何一个实施方式，包括仅在实施方式或权利要求中描述的实施例，都可以与本发明的任意一个或多个附加实施方式相结合，除非明确否认或除非不适当。
附图说明
图1显示了人CXCR5与其最接近的旁系同源物CXCR3的序列比对，其具有低38.5％序列同一性和51.5％序列相似性。
图2A和图2B显示了各种经鉴定的小鼠抗CXCR5单克隆抗体的VH(图2A)和VL(图2B)区的IMGT序列比对。将VH和VL序列的CDR1-CDR3突出显示。所有抗体获自不同VDJ重组事件(不同家族)。尽管HFB2-3与VH4和VH5具有相似的VH序列，但CDR3更不同，因此赋予独特性质。HFB2-4&HFB2-5在CDR3区序列中的不同之处是1个氨基酸(a.a)。
图3显示了在野生型小鼠中嵌合抗CXCR5小鼠单克隆抗体HFB2-4hG1的药代动力学(PK)性质。
图4A和图4B分别显示了基于小鼠单克隆抗体HFB2-4的3个人源化VH区和4个人源化VL区的IMGT序列比对。
图5显示了本发明的若干嵌合单克隆抗体对贴壁细胞系上表达的hCXCR5抗原的亚nM EC50结合能力。
图6A显示了基于抗体交叉反应性评估，本发明的嵌合抗体与瞬时转染细胞上所表达的食蟹猴和小鼠CXCR5基本上没有交叉反应性。
图6B显示了本发明的嵌合抗体不与hCXCR5–hCXCR3的最接近的直系同源物结合。
图7显示了本发明所述的抗CXCR5抗体高效抑制配体(CXCL13)诱导的B细胞迁移。
图8显示了某些抗CXCR5单克隆抗体对胞内cAMP信号传导的效应。数据表明嵌合抗体中的两者在配体(CXCL13)活化后高效阻断cAMP信号传导。
图9A显示了对本发明的六种嵌合单克隆抗体的ADCC报告子生物测定的结果。数据表明本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可通过接合CD16触发ADCC，其中HFB2-4显示出最有效的CD16接合。
图9B显示了使用HFB2-4hG1和HFB2-4hG1DE抗体的ADCC报告子生物测定。测定中还包括抗CD20 IgG1(阳性对照)和同种型匹配的阴性对照IgG1抗体。图下的表中提供了代表性EC50值(不一定与图中的值匹配)。
图9C显示了与阳性对照利妥昔单抗和同种型对照(MGO53-hG1DE)相比，HFB2-4hG1DE介导的原代NK细胞对Raji细胞的ADCC裂解。
图9D显示了与阳性对照利妥昔单抗和同种型对照(MGO53-hG1DE)相比，HFB2-4hG1DE介导的原代NK细胞对原代B细胞的ADCC裂解。
图9E显示了与同种型对照(MGO53-hG1DE)和没有抗体(CD4+细胞+NK)相比，由HFB2-4hG1DE诱导的原代NK细胞对原代T细胞的ADCC介导的裂解。亦参见图9F。
图9F显示了在5:1的E:T比率下与利妥昔单抗(hG1)、同种型对照(MGO53-hG1)和没有抗体(CD4+细胞+NK)相比由非岩藻糖基化抗体AfuHFB2-4hG1诱导的原代NK细胞对原代T细胞的ADCC介导的裂解。利妥昔单抗靶向所有B细胞的表面所表达的CD20，并且因此利妥昔单抗预计不会靶向不表达CD20的T细胞。
图9G和图9H显示了在3:1的E:T比率下使用HFB2-4hG1DE、以hG1形式的利妥昔单抗(阳性对照)和DE同种型对照使用来自原发性干燥综合征(SS)患者(图9G)和淋巴增生性pSS患者(图9H)的B细胞作为靶细胞的ADCC报告子测定的结果。顶部图：ADCC报告子测定的发光读取(RLU)。底部图：诱导倍数，计算为RLU(具有抗体-背景)/RLU(单独细胞-背景)。在底部图中，左侧柱：HFB2-4hG1DE，中间柱：阳性对照，右侧柱：同种型对照。
图10A和图10B显示了通过两者不同方案进行的抗体内化的测量。结果表明与阳性对照(CD71)抗体相比，HFB2-4hz9-hG1DE和HFB2-4hz12-hG1DE(两者均为基于HFB2-4嵌合抗体的人源化抗体)均不内化。
图11A和图11B显示了使用所选择的人源化变体抗体的ADCC报告子生物测定的结果。
图12显示了由所选择的人源化变体的趋化性抑制。
图13显示了使用原代B细胞的ADCC报告子生物测定。
图14显示了靶向结合不同癌细胞系。
图15显示了对B细胞淋巴瘤细胞系的ADCC报告子测定。
图16显示了HFB2-4-hG1的抗肿瘤体内有效性研究的结果。与对照(PBS或同种型匹配的MGO53-hG1抗体)相比，HFB2-4hG1和阳性对照均为统计学显著性的(p<0.00001****)。
图17显示了本发明所述的抗体对干燥综合征患者的B细胞的ADCC活性。
图18显示了pSS患者的样品中记忆B细胞群的百分比因本发明所述的抗体而降低。
图19A和图19B显示了HFB2-4hG1的其他人源化变体(HFB2-4hz-hG1)与Raji细胞的结合。箭头表示具有排名最靠前的结合性质的人源化变体。
图20显示了排名前九名的人源化HFB2-4hz-hG1变体的药代动力学性质。
图21显示了排名前6名的HFB2-4hz-hG1变体与CXCR5+Raji细胞的结合(左侧图)和报告子系统中用于接合CD16的ADCC活性。
图22显示了以hG1DE形式的HFB2-4hz变体与表达CXCR5的贴壁DX002细胞的结合。
图23显示了以亲本hG1形式(左侧图)和hG1DE形式(右侧图)的排名前四名的人源化HFB2-4hz的药代动力学性质。
图24A显示了非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)、非岩藻糖基化亲本HFB2-4hG1(afu-HFB2-4hG1)、非岩藻糖基化基准hG1抗体和同种型对照(MGO53-hG1)与表达CXCR5的DX002细胞的结合。
图24B显示了afu-HFB2-4hz42-hG1、afu-HFB2-4hG1、非岩藻糖基化基准hG1抗体和同种型对照(MGO53-hG1)的通过ADCC报告子测定确定的CD16接合。
图25显示了与基准和同种型对照(MGO53-hG1)抗体相比，由非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)介导的原代NK细胞对来自健康供体的原代B细胞的ADCC介导的裂解。
图26显示了与基准和同种型对照(MGO53-hG1)抗体相比，由非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)介导的原代NK细胞对来自SS患者的B细胞的ADCC介导的溶解。
图27A和图27B显示了非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)、非岩藻糖基化亲本HFB2-4hG1(afu-HFB2-4hG1)、以hG1形式的利妥昔单抗(阳性对照)和同种型对照MGO53-hG1的针对补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的测试的结果。使用血清来提供补体细胞。在图27B中，测试两种不同血清。
图28A显示了在野生型小鼠(n＝1)中非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)、非岩藻糖基化亲本HFB2-4hG1(afu-HFB2-4hG1)和基准抗体的药代动力学性质。
图28B显示了在1只雄性和2只雌性食蟹猴中非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)的药代动力学性质。
具体实施方式
1.概述
根据本文所描述的发明，使用多种免疫策略将小鼠用重组人CXCR5免疫。结合申请人专有的基于单细胞的抗体筛选技术，从三个独立的筛选中鉴定出六种高亲和力抗CXCR5小鼠单克隆抗体，HFB2-1至HBF2-6。
针对所需功能特征对这些抗体进行进一步测试，包括特异性(例如，与hCXCR3几乎没有交叉反应性)、对细胞系(例如，贴壁细胞系如DX002和悬浮细胞系如M300-19)上表达的CXCR5的结合亲和力、交叉反应性(例如，hCXCR5的食蟹猴或小鼠的直系同源物)、对B细胞迁移的影响(趋化性)、对细胞内cAMP水平的影响、ADCC报告子测定、使用稳定表达CXCR5的细胞系的内化测定和在小鼠中的PK性质等。
例如，FACS(流式细胞术)分析表明，除了一种外全部先导候选抗体针对表达hCXCR5的CHO细胞显示出亚nM EC50值，且没有先导抗体与食蟹猴或小鼠CXCR5直系同源物交叉反应。此外，先导抗体均不与hCXCR3旁系同源物结合，证实其特异性。先导抗体还高效阻断hCXCL13诱导的B细胞迁移，并且HFB2-4嵌合抗体抑制趋化性是最高效的。HFB2-4&HFB2-5高效阻断hCXCL13诱导的cAMP信号传导，并且优于基准抗体。ADCC报告子测定(Promega)表明抗hCXCR5 mAb(特别是HFB2-4)接合CD16。
基于这些测试，在6种单位数纳摩亲和力抗体中，HFB2-4被选为功能测定中效力最高、效果最大的一个，并进一步分析了其在野生型小鼠中的PK性质。结果表明，HFB2-4在小鼠中表现出良好的PK性质。
在小鼠Raji肿瘤模型中测试HFB2-4的抗肿瘤功效的初步结果也显示出有希望的抗肿瘤效果，这与作为阳性对照的利妥昔单抗不相上下。
基于其总体优越的生物学性质，HFB2-4被选为进一步测试和人源化的先导抗体。
已通过将3个VH和4个VL区CDR序列组合(VH1与VL1-VL4的每一个，VH2与VL1-VL4的每一个以及VH3与VL1-VL4的每一个)产生了至少12种人源化变体(全部具有S239D/I332E突变)，并且进行表征；以及进一步合成了另外13种变体。值的注意的是，根据IMGT系统，所有人源化(Hz)变体均具有人种系序列的第一匹配。这些人源化变体的大部分保留其物理化学活性(对靶点的亲和力、稳定性、溶解度等)和/或生物活性(阻断或刺激靶点，ADCC等)。
针对所需功能性特征对这些人源化变体抗体进行进一步测试，包括特异性(例如，与hCXCR3几乎没有交叉反应性)、对细胞系(例如，贴壁细胞系如DX002和悬浮细胞系如M300-19)上所表达的CXCR5的结合亲和力、交叉反应性(例如，hCXCR5的食蟹猴或小鼠的直系同源物)、对B细胞迁移的影响(趋化性)、对细胞内cAMP水平的影响、使用稳定表达CXCR5的细胞系的内化测定、ADCC报告子测定、和在小鼠中的PK性质等。
结果表明，12种HFB2-4hz变体中的10种显示出与亲本抗体HFB2-4类似的与hCXCR5的结合；12种HFB2-4hz变体中的9种阻断cAMP信号传导；Hz变体有效抑制趋化性，其中HFB2-4hz12是最有效的(在0.1nM下约100％)，且HFB2-4hz9中效应相当；并且有效阻断hCXCL13诱导的B细胞迁移。
基于其总体优良的生物学性质，将HFB2-4hz12选择作为ADCC检测的先导候选物。结果表明HFB2-4hz12hG1DE以及HFB2-4hz9hG1DE具有达到低pM范围(1-2pM)EC50的有效ADCC活性。数据进一步表明人源化过程不改变候选抗体(例如，HFB2-4DE抗体)的高ADCC效能。另外，HFB2-4hz12hG1DE对表达hCXCR5的原代B细胞显示出ADCC活性。
内化研究表明HFB2-4hz12-hG1DE和HFB2-4hz9-hG1DE Hz变体不(或至多最低限度地)内化hCXCR5表面抗原。
PK性质表明与亲本抗体HFB2-4hG1(109h)相比，HFB2-4hz12-hG1DE在血浆中具有更短的半衰期(4.5h)。
还针对很多可开发性测定对包括HFB2-4hz2hG1、HFB2-4hz9hG1DE、HFB2-4hz10hG1DE、HFB2-4hz11hG1DE和HFB2-4hz12hG1DE的所选择的Hz抗体进行测试，所述可开发性测定包括在25和40℃下持续长达14天的加速稳定性研究；在25℃下在100mM乙酸盐(pH3.5)中长达6小时的强制降解研究；以及在PBS(pH 7.4)中至多三个冻融循环(均为2mg/mL抗体浓度)。结果表明，通过SDS-PAGE凝胶HFB2-4hz12hG1DE具有最稳定的性质。总的来说，HFB2-4hz9hG1DE and HFB2-4hz12hG1DE在所检测的抗体中显示出最有利的性质，并且选择用于产生基于其的其他Hz变体。
产生并选择了很多其他的第二轮人源化抗体。此类第二轮人源化(Hz)变体列于下表中。所测试的所有此类人源化变体均以亚nM EC50值结合hCXCR5。所有此类Hz变体以亚nMEC50结合hCXCR5。在亲本抗体和人源化变体抗体中发现了类似的结合性质，包括对hCXCR5的结合亲和力和接合CD16以诱导ADCC。
在这些次级Hz变体中，选择HFB2-4hz14-hG1DE和HFB2-4hz15-hG1DE进行进一步的可开发性评估(参见上述测定)。结果表明，当在20mM乙酸盐(pH 6.0)中配制时，Hz14和Hz15DE变体在25和40℃下未显示出不稳定性。此外，在冻融循环和低pH应力处理(pH3.5可达6小时)后，通常保持稳定性。总体来说，HFB2-4的人源化变体，包括HFB2-4hz9-hG1DE、HFB2-4hz12-hG1DE、HFB2-4hz14-hG1DE和HFB2-4hz15-hG1DE，全部显示出有利的可开发性质。选择这些先导化合物之一HFB2-4hz12-hG1DE用于进一步开发。
基于HFB2-4hG1(HFB2-4hz-hG1)产生其他基于HFB2-4的人源化变体，包括HFB2-4hz37-hG1和HFB2-4hz42-hG1。参见实施例5以及特别是表4。
因此，本文所述的本发明提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对于人CXCR5(hCXCR5)是特异性的，并且其中所述单克隆抗体包含：(1)重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含分别为图2A的单克隆抗体(例如，HFB2-1、HFB2-2、HFB2-3、HFB2-4、HFB2-5和HFB2-6)的任一HCVR CDR1、CDR2和CDR3序列的HCVR CDR1序列、HCVR CDR2序列和HCVR CDR3序列；和(2)轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含分别为图2B中的单克隆抗体(例如，HFB2-1、HFB2-2、HFB2-3、HFB2-4、HFB2-5和HFB2-6)的任一LCVR CDR1、CDR2和CDR3序列的LCVR CDR1序列、LCVR CDR2序列和LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体包含(1)图2A中的HFB2-4的HCVR CDR1序列、HCVR CDR2序列和HCVR CDR3序列；和(2)图2B中的HFB2-4的(对应)LCVR CDR1序列、LCVRCDR2序列和LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体是小鼠-人嵌合抗体，其包含人抗体(如ashIgG1或hIgG2)的恒定区序列，以及图2A中的单克隆抗体(例如，HFB2-1、HFB2-2、HFB2-3、HFB2-4、HFB2-5和HFB2-6)的任一HCVR序列的HCVR；以及图2B中的单克隆抗体(例如，HFB2-1、HFB2-2、HFB2-3、HFB2-4、HFB2-5和HFB2-6)的(对应)任一LCVR序列的LCVR。
在某些实施方式中，小鼠-人嵌合抗体包含图2A中的HFB2-4的HCVR序列和图2B中的HFB2-4的LCVR序列。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体是人源化抗体。
在某些实施方式中，所述人源化抗体包含：(1)图4A中的单克隆抗体的HCVR CDR1序列、HCVR CDR2序列和HCVR CDR3序列；和(2)图4B中的单克隆抗体的LCVR CDR1序列、LCVRCDR2序列和LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，所述人源化抗体包含：(1)图4A中的VH1、VH2和VH3序列的任一HCVR序列的框架区序列，和/或(2)图4B中的VL1、VL2、VL3和VL4序列的任一LCVR序列的框架区序列。
在某些实施方式中，所述人源化抗体包含：(1)图4A中的VH3的框架区序列，和/或(2)图4B中的VL1的框架区序列。
在某些实施方式中，所述人源化抗体包含：(1)图4A中的VH3的框架区序列，和/或(2)图4B中的VL4的框架区序列。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体具有修饰的Fc区以增强ADCC。例如，在某些实施方式中，本发明所述的抗体包含F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变以增强FcγRIIIa结合。在某些实施方式中，本发明所述的抗体包含S239D/I332E突变以增强FcγRIIIa结合(本文中的hIgG1-DE)。在某些实施方式中，本发明所述的抗体包含S239D/I332E/A330L突变以同时增强FcγRIIIa结合和减少FcγRIIIb结合。在某些实施方式中，本发明所述的抗体包含S298A/E333A/K334A突变以增强FcγRIIIa结合。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体是人源化单克隆抗体，任选地，抗体包含S239D/I332E突变以增强FcγRIIIa结合(hIgG1-DE)。例如，人源化单克隆抗体可以通过将小鼠单克隆抗体的CDR区CDR移植到人框架区中来产生。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体针对ADCC活性具有低(例如，1-5或1-2)pM范围EC50值。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体针对表达表面hCXCR5的原代B细胞具有ADCC活性。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体不(或至多最低限度地)内化hCXCR5表面抗原。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体抑制cAMP信号传导。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体抑制趋化性(例如，在约0.1-0.5nM或约0.1nM下具有～100％抑制)。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体抑制hCXCL13诱导的B细胞迁移。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体对于hCXCR5是特异性的(例如，与hCXCR3没有或几乎没有交叉反应性)。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体与贴壁细胞系(如DX002)和/或悬浮细胞系(如M300-19)上表达的hCXCR5结合。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体不与或最低限度地与hCXCR5的食蟹猴或小鼠直系同源物交叉反应。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体降低受试者中记忆B细胞群的百分比。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗干燥综合征(SS)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
约25％的干燥综合征患者显示出异位生发中心(GC)，其中CXCR5+细胞高度浸润唾液腺，SS患者中的GC富集在产生CXCL13的Tfh细胞中，其将CXCR5+B细胞招募并分化至产生抗体的细胞中。已在小鼠SS模型中和在人疾病中发现CXCL13水平升高。此外，在干燥综合征的动物模型中已发现CXCL13中和具有保护性。
在某些实施方式中，所述方法患者SS的至少一种症状。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗淋巴瘤或白血病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，白血病或淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
在某些实施方式中，B细胞淋巴瘤是CLL(B细胞慢性淋巴细胞性白血病)。
在某些实施方式中，淋巴瘤或白血病是非霍奇金氏淋巴瘤，如伯基特氏淋巴瘤。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗具有异位生发中心的疾病或适应症(包括自身免疫性疾病或病症)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，所述疾病或适应症是类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、多发性硬化症(MS)、结节病、银屑病、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫氏病、动脉粥样硬化、结膜炎、胃炎、肝炎或皮炎。
本发明的另一个方面提供了一种在有此需要的受试者中治疗实体癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体(例如，本发明所述的人源化抗体)。
在某些实施方式中，所述实体癌症是胃癌、乳腺癌、肠癌、肺癌或前列腺癌。
本发明的详细方面进一步并且单独描述于下文各个部分中。然而，应理解，本发明的任一实施方式(包括仅在实施例或图式中描述的实施方式和仅在下文一个部分下描述的实施方式)可与本发明的任何其他实施方式组合。
2.定义
术语“抗体”在最广泛意义上涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。术语“抗体”还可广泛地指包含重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够与抗原结合。术语“抗体”还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体和多个物种(例如小鼠、人类、食蟹猴等)的抗体。
然而，在较狭窄意义上，“抗体”是指各种单克隆抗体，包括嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和人类单克隆抗体，尤其本发明所述的人源化单克隆抗体。
在一些实施方式中，抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。在一些实施方式中，抗体包含含有重链可变区和重链恒定区的至少一部分的至少一条重链(HC)，和含有轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分的至少一条轻链(LC)。在一些实施方式中，抗体包含两条重链，其中每一重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分，和两条轻链，其中每一轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。
如本文所用，单链Fv(scFv)或包含例如含有所有六个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单一多肽链的任何其他抗体被视为具有重链和轻链。在一些此类实施方式中，重链是抗体中包含三个重链CDR的区域并且轻链是抗体中包含三个轻链CDR的区域。
如本文所用，术语“重链可变区(HCVR)”是指至少包含重链CDR1(CDR-H1)、框架2(HFR2)、CDR2(CDR-H2)、FR3(HFR3)和CDR3(CDR-H3)的区域。在一些实施方式中，重链可变区还包含FR1(HFR1)的至少一部分(例如，全部)，其为CDR-H1的N端，和/或FR4(HFR4)的至少一部分(例如，全部)，其为CDR-H3的C端。
如本文所用，术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区还包括ε和μ。每一重链恒定区对应于抗体同种型。举例说来，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体，并且包含μ恒定区的抗体是IgM抗体。
某些同种型可进一步细分成子类别。举例说来，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1(包含μ1恒定区)和IgM2(包含μ2恒定区)。
如本文所用，术语“重链”是指包含至少重链可变区的多肽，具有或不具有前导序列。在一些实施方式中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列，并且具有或不具有C端赖氨酸。
如本文所用，术语“轻链可变区(LCVR)”是指包含轻链CDR1(CDR-L1)、框架(FR)2(LFR2)、CDR2(CDR-L2)、FR3(LFR3)和CDR3(CDR-L3)的区域。在一些实施方式中，轻链可变区还包含FR1(LFR1)的至少一部分(例如，全部)和/或FR4(LFR4)的至少一部分(例如，全部)。
如本文所用，术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。
如本文所用，术语“轻链”是指包含至少轻链可变区的多肽，具有或不具有前导序列。在一些实施方式中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列。
术语“抗体片段”或(抗体的)“抗原结合部分”包括但不限于能够结合抗原的片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。在某些实施方式中，抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
术语“Fab”是指分子质量为约50,000道尔顿的抗体片段，并且具有与抗原结合的活性。其包含通过二硫桥连结的约一半的重链N端侧和整个轻链。Fab尤其可通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白来获得。
术语“F(ab’)2”表示具有约100,000道尔顿和具有与抗原结合的活性的片段。这一片段稍大于经由铰链区中的二硫桥连结的两个Fab片段。这些片段是通过用蛋白酶胃蛋白酶处理免疫球蛋白来获得。Fab片段可通过裂解铰链区的二硫桥从F(ab’)2片段获得。
单一Fv链“scFv”对应于使用编码VL和VH结构域的基因和编码意图结合这些结构域的肽的序列合成的VH：VL多肽。根据本发明所述的scFv包括例如使用基因重组技术维持在适当构象中的CDR。
“scFv”的二聚体对应于通过肽键连结在一起的两个scFv分子。这一Fv链通常是包括编码通过编码肽的接头序列连结的VH和VL的基因的融合基因的表达结果。人类scFv片段可包括优选借助于使用基因重组技术维持在适当构象中的CDR区。
“dsFv”片段是通过二硫桥稳定化的VH-VL异二聚体；其可为二价(dsFV2)。二价Sc(Fv)2或多价抗体的片段可通过单价scFv的缔合自发形成或通过利用肽结合序列连结scFv片段来产生。
Fc片段是抗体的生物性质、尤其其由免疫效应物识别或活化补体的能力的支撑。其由重链中超出铰链区的恒定片段组成。
术语“双功能抗体”表示具有两个抗原固定位点的小抗体片段。这些片段在同一VH-VL多肽链中包含连结至可变轻链结构域VL的可变重链结构域VH。使用因太短以致于无法匹配同一链的两个结构域的结合序列，必然与另一链的两个互补结构域匹配并且因此产生两个抗原固定位点。
“结合至与参考抗体相同的表位的抗体”可通过抗体竞争分析来确定。其是指在竞争分析中阻断50％或更多的参考抗体与其抗原的结合的抗体，反之，参考抗体在竞争分析中阻断50％或更多的抗体与其抗原的结合。术语“竞争”在用于竞争同一表位的抗体的上下文中时意指，抗体之间的竞争是通过其中所测试抗体防止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的分析来确定。
可使用多种类型的竞争性结合分析，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland等，1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心测定(参见，例如，Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press)；使用I125标记的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung,等，1990,Virology 176:546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等，1990,Scand.J.Immunol.)。
通常，此类分析涉及使用与带有这些(未标记的测试抗原结合蛋白和经标记的参考抗体)中的任一者的固体表面或细胞结合的纯化的抗原。通过测定在测试抗体存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体过量存在。通过竞争分析鉴别的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和结合至相邻表位的抗体，所述相邻表位足够靠近参考抗体结合的表位以发生空间位阻。在一些实施方式中，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的参考抗体与共同抗原的特异性结合。在一些情况下，抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多的结合。
术语“抗原”是指能够由选择性结合剂(如抗体或其免疫功能片段)结合并且另外能够用于哺乳动物中以产生能够与该抗原结合的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个能够与抗体相互作用的表位。
术语“表位”是抗原分子中由选择性结合剂(如抗体或其片段)结合的部分。所述术语包括能够与抗体特异性结合的任何决定簇。表位可为邻接或非邻接的(如在多肽中，在多肽序列中未彼此邻接但在所述分子的背景下由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在一些实施方式中，表位可为模拟的，因为其包含与用于产生抗体的表位相似的三维结构，但不包含或仅包含在用于产生抗体的表位中发现的一些氨基酸残基。表位决定簇可包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。
在一些实施方式中，“表位”是通过用于测定表位的方法来定义。举例说来，在一些实施方式中，如果抗体与参考抗体结合至抗原的同一区域，那么抗体结合至与参考抗体相同的表位，如通过氢-氘交换(HDX)所测定。
在某些实施方式中，如果抗体与参考抗体结合至抗原的同一区域，那么抗体结合至与参考抗体相同的表位，如通过X射线结晶学所测定。
如本文所用，“嵌合抗体”是指抗体包含至少一个来自第一物种(例如，小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(例如，人类、食蟹猴、鸡等)的恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体的所有可变区是来自第一物种并且嵌合抗体的所有恒定区是来自第二物种。
如本文所用，“人源化抗体”是指其中非人类可变区(例如，小鼠、大鼠、食蟹猴、鸡等)的框架区中的至少一个氨基酸已由来自人类可变区的相应氨基酸置换的抗体。在一些实施方式中，人源化抗体包含至少一个人类恒定区或其片段。在一些实施方式中，人源化抗体片段是Fab、scFv、(Fab’)2等。
如本文所用，“CDR移植抗体”是指其中第一(非人类)物种的一个或多个互补决定区(CDR)已移植至第二(人类)物种的框架区(FR)上的人源化抗体。
如本文所用，“人类抗体”是指在人类中产生的抗体、在包含人类免疫球蛋白基因的非人类动物(如)中产生的抗体和使用体外方法(如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体库是基于人类免疫球蛋白序列。
具有“增强的ADCC活性”的抗体包括与对照或亲本抗体相比在体外或体内更有效介导ADCC的抗体，其中抗体和对照/亲本抗体在至少一个结构方面不同，并且当在测定中使用的此类抗体和控制/亲本抗体的量基本相同时。在一些实施方式中，抗体和对照/亲本抗体具有相同氨基酸序列，但是抗体是非岩藻糖基化的，而亲本抗体是岩藻糖基化的。ADCC活性可以使用任何现有技术认可的方法来确定。在一些实施方式中，ADCC活性是使用本文公开的体外ADCC测定法确定的，但也可考虑用于确定ADCC活性的其他测定法或方法，例如，在动物模型中等。在一些实施方式中，具有增强的ADCC活性的抗体针对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施方式中，具有增强的ADCC活性的抗体针对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施方式中，具有增强的ADCC活性的抗体针对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。
与对照/亲本抗体相比，具有“改变”的FcR结合亲和力或ADCC活性的抗体是具有增强或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性的抗体，其中抗体和亲本抗体在至少一个结构方面是不同的。
与FcR“显示出增加的结合”的抗体以比亲本抗体更好的亲和力结合至少一个FcR。
与FcR“显示出减少的结合”的抗体以比亲本抗体更低的亲和力结合至少一个FcR。与天然序列IgG Fc区相比，这种显示出与FcR结合降低的抗体可能具有很少或没有明显的与FcR-结合，例如与FcR0-20％的结合。
“对FcγRIIIA的亲和力增强”是指对FcγRIIIA(在一些情况下也称为CD 16a)的亲和力高于对照/亲本抗体的抗体，其中抗体和亲本抗体在至少一个结构方面不同。在一些实施方式中，抗体和对照/亲本抗体具有相同氨基酸序列，但是抗体是非岩藻糖基化的，而对照/亲本抗体是岩藻糖基化的。可以使用任何适宜的方法来确定对FcγRIIIA的亲和力。在一些实施方式中，通过本文所述的方法确定针对FcγRIIIA的亲和力。在一些实施方式中，对FcγRIIIA具有增强的亲和力的抗体具有增强的ADCC活性。在一些实施方式中，对FcγRIIIA具有增强的亲和力的抗体对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施方式中，对FcγRIIIA具有增强的亲和力的抗体对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下对靶细胞的裂解。经典补体途径的活化是由补体系统的第一组分(Clq)与同其同源抗原结合的抗体(适当亚类)的结合启动的。为评估补体活化，可进行例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163,1996中所描述的CDC测定。具有改变的Fc区氨基酸序列以及增加或降低的Clq结合能力的抗体描述在例如美国专利号6,194,551Bl、美国专利号7,923,538、美国专利号7,994,290和WO 1999/51642中。
“宿主细胞”是指可为或已为载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，例如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，例如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、细胞(Crucell)以及293和CHO细胞和其衍生物，分别如293-6E和DG44细胞。
如本文所用，术语“分离的”是指分子已与至少一些通常在自然界中一起发现的组分分离，或已从至少一些通常产生其的组分分离。举例说来，当多肽从至少一些产生其的细胞组分分离时，所述多肽被称为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，以物理方式从产生其的细胞分离含有所述多肽的上清液被视为“分离”多肽。同样，当多核苷酸并非通常在自然界中含有其的较大多核苷酸(例如，在DNA多核苷酸的情形下，基因组DNA或线粒体DNA)的一部分或从至少一些产生其的细胞组分分离(例如，在RNA多核苷酸的情形下)时，多核苷酸被称为“分离的”。因此，含于宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可称为“分离的”，只要在自然界中在所述载体中未发现所述多核苷酸即可。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，例如人类。在一些实施方式中，还提供治疗其他非人类哺乳动物的方法，所述其他非人类哺乳动物包括但不限于啮齿动物、猿猴、猫、狗、马、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动场动物和哺乳动物宠物。在一些情况下，“受试者”或“患者”是指需要治疗疾病或病症的(人类)受试者或患者。
如本文所用，术语“样品”或“患者样品”是指从含有例如打算基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征进行表征和/或鉴别的细胞和/或其他分子实体的所关注受试者获得或衍生而来的材料。举例说来，措辞“疾病样品”和其变化形式是指从将预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体的所关注受试者获得的任何样品。
“组织或细胞样品”意指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可为固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品或活检或抽吸物；血液或任何血液成分；体液，例如痰、脑脊液、羊水、腹膜液或间隙液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可为原代或经培养细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品是从疾病组织/器官获得。组织样品可含有不与自然界中的组织自然混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
如本文所用，“参考样品”、“参考细胞”或“参考组织”是指从已知或认为未患使用本发明所述的方法或组合物鉴别的疾病或疾患的来源获得的样品、细胞或组织。在一个实施方式中，参考样品、参考细胞或参考组织是从使用本发明所述的组合物或方法鉴别疾病或疾患的同一受试者或患者的身体的健康部分获得。在一个实施方式中，参考样品、参考细胞或参考组织是从至少一个受试者的身体的健康部分获得，所述至少一个受试者不为使用本发明所述的组合物或方法鉴别疾病或疾患的受试者或患者。在一些实施方式中，参考样品、参考细胞或参考组织是先前在发展疾病或疾患之前或在疾病或疾患的早期从患者获得。
“病症”或“疾病”是将受益于用本发明的一种或多种Gal-9拮抗剂治疗的任一疾患。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理学疾患。本文待治疗的病症的非限制性实例包括癌症。
术语“癌症”在本文中用于指展现异常高的增殖和生长水平的细胞群。癌症可为良性(还称为良性肿瘤)、癌前或恶性。癌细胞可为实体癌细胞(即，形成实体肿瘤)或白血病癌细胞。术语“癌症生长”在本文中用于指包含癌症的一个或多个细胞的增殖或生长，引起癌症的尺寸或程度的相应增加。
癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆道癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌。
在某些实施方式中，如本文所用的癌症包括血液癌(如淋巴瘤或白血病，包括CLL、伯基特氏淋巴瘤)或实体肿瘤(如乳腺癌、肺癌和前列腺癌)。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括但不限于烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)和乌得哌(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲基二氯乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ和卡奇霉素ω(参见例如Agnew,Chemlntl.Ed.Engl,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatinchromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、/>多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、泛艾霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺醣苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；美得眠(mopidanmol)；尼曲吖啶；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；/>多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2”,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；类紫杉醇(taxoid)，例如，太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、不含Cremophor的白蛋白工程改造的太平洋紫杉醇纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和/>多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；/>吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；/>长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；胺喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲磺酰亚胺(DMFO)；类视色素，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib)/>)和VEGF-A的抑制剂，以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其他非限制性示例性化学治疗剂包括用于调控或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和/>托瑞米芬(toremifene)；抑制调控肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、/>乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、/>依西美坦(exemestane)、福美坦(foxxxrmestanie)、法曲唑(fadrozole)、/>伏氯唑(vorozole)、/>来曲唑(letrozole)和/>阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳培林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制参与异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如，PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的那些寡核苷酸；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法疫苗，例如疫苗、/>疫苗和/>疫苗；/>rIL-2；/>拓朴异构酶1抑制剂；/>rmRH；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”是指直接或间接抑制血管生成、血管发生或不期望的血管渗透性的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。应理解，抗血管生成剂包括结合血管生成因子或其受体并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些剂。举例说来，抗血管生成剂是针对血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如针对VEGF-A的抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab))或针对VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体；抗PDGFR抑制剂，例如/>(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))；阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、/>/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706或例如国际专利申请WO 2004/113304中所述的那些小分子)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑素、内皮抑素等。参见例如Klagsbrun和D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit和Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如，表3列出恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini等，(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如，表2列出已知的抗血管生成因子)；和Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如，表1列出用于临床试验的抗血管生成剂)。
如本文所用，“生长抑制剂”是指抑制体外或体内细胞(例如表达VEGF的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可为显著减小S期细胞(例如表达VEGF的细胞)的百分比的剂。生长抑制剂的实例包括但不限于阻断细胞周期进展(处于S期以外的时期)的剂，例如诱导G1阻滞和M期阻滞的剂。经典M期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春碱)、紫杉烷(taxane)和拓朴异构酶II抑制剂(例如多柔比星、泛艾霉素、道诺霉素、依托泊苷和博来霉素)。使G1阻滞的那些剂还溢出进入S期阻滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫昔芬、普赖松(prednisone)、达喀尔巴嗪、甲基二氯乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara C。其他信息可见于Mendelsohn和Israel编辑，The Molecular Basis of Cancer,第1章,标题为“Cellcycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等(W.B.Saunders,Philadelphia,1995)，例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇和多西他赛)是衍生自紫杉的抗癌药物。多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)衍生自欧洲紫杉，是太平洋紫杉醇的半合成类似物(/>Bristol-Myers Squibb)。太平洋紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体组装微管，并且通过防止解聚使微管稳定化，这可抑制细胞中的有丝分裂。
术语“抗赘瘤组合物”是指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂。治疗剂的实例包括但不限于例如化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法中的剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂(还称为肿瘤免疫剂)、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其他剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼血小板源性生长因子抑制剂(例如，/>(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、干扰素、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA抗体伊匹单抗(ipilimumab))、PD-1抑制剂(例如抗PDl抗体，BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如抗PDL1抗体，MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如抗PDL2抗体)、VISTA抑制剂(例如抗VISTA抗体)、细胞因子、与以下靶中的一者或多者结合的拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4、VISTA或VEGF受体、TRAIL/Apo2，以及其他生物活性和有机化学剂等。本发明还包括其组合。
“治疗”是指治疗性疗法，例如其中目标是减慢(减轻)所靶向的病理学疾患或病症，以及例如其中目标是抑制疾患或病症的复发。“治疗”涵盖用于哺乳动物(包括人类)的疾病(在本文中还称为“病症”或“疾患”)的治疗剂的任何施用或施加，并且包括抑制疾病或疾病的进展，抑制或减缓疾病或其进展，阻滞其发展，部分或完全缓解疾病，部分或完全缓解疾病的一种或多种症状，或恢复或修复损失、丢失或缺陷性功能；或刺激无效过程。术语“治疗”还包括减轻任何表型特征的严重程度和/或降低所述特征的发生率、程度或可能性。需要治疗的那些包括已患有病症的那些以及具有病症复发风险的那些或待预防或减慢病症复发的那些。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指可有效地治疗受试者的疾病或病症的药物量。在一些实施方式中，有效量是指在所需剂量和时间段下可有效地达成期望的治疗或预防结果的量。本发明抗体的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及拮抗剂引发个体的期望反应的能力的因素变化。治疗有效量涵盖其中治疗有益效应超过本发明抗体的任何毒性或有害效应的量。
“预防有效量”是指在所需剂量和时间段下可有效地达成期望的预防结果的量。通常但非必需，由于个体在疾病之前或早期使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
“药学上可接受的载体”是指与共同构成用于施用于受试者的“药物组合物”的治疗剂一起使用的本领域中常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料、配制助剂或载体。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与制剂的其他成分可相容。药学上可接受的载体适用于所用制剂。举例说来，如果待口服施用治疗剂，那么载体可为凝胶胶囊。如果待皮下施用治疗剂，那么载体理想地不会刺激皮肤并且不会引起注射位点反应。
“制品”是任何制造物(例如包装或容器)或试剂盒，其包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症的药剂，或用于特异性检测本文所述的生物标记物的探针。在一些实施方式中，制造物或试剂盒是作为用于执行本文所述的方法的单元来推广、分配或销售。
3.使用方法，如治疗癌症的方法
本文所述的本发明提供了用于治疗人类和其他非人哺乳动物的方法的抗CXCR5抗体。
在一些实施方式中，提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括向需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明所述的抗CXCR5抗体或其抗原结合片段中的任一者。
在一些实施方式中，提供了治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患有癌症的受试者施用抗CXCR5抗体或其抗原结合片段中的任一者。
可通过本发明所述的方法/用途治疗的癌症包括本文/上文所述的任何癌症。
本文提供了可以用本发明的任何抗CXCR5抗体或其抗原结合片段治疗的非限制性示例性癌症，包括癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的非限制性实例包括黑色素瘤、宫颈癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管细胞癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤以及各种类型的头颈癌。
在某个实施方式中，癌症是黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(NSCLC)、卵巢癌、皮肤癌(例如，鳞状细胞癌或基底细胞癌)、淋巴瘤或白血病。
在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5抗体可以单独使用，或者与已知能够治疗疾病或适应症的任何其他适宜的化合物(例如，抗癌剂)组合使用。
也就是说，当用途是治疗癌症时，抗体可以与已知的针对癌症的疗法组合使用，例如手术、放疗、化疗或其组合。例如，抗体可以与过继免疫疗法组合使用，过继免疫疗法包括针对肿瘤抗原，特别是EBV抗原的效应淋巴细胞的一次或多次注射。根据一些方面，与根据本发明所述的针对CXCR5的抗体组合用于癌症治疗的其他抗癌剂包括抗血管生成剂。根据某些方面，抗体可以与细胞因子(例如刺激抗肿瘤免疫应答的细胞因子)共同施用。
在此类组合疗法中，本发明所述的抗体可以在第二种治疗剂之前、之后或与之同时使用。关于组合疗法参见以下其他部分。
本发明的相关方面提供了一种降低CXCR5活性的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
本发明的相关方面提供了一种治疗炎性疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
本发明的相关方面提供了一种治疗需要免疫抑制的受试者的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
本发明的相关方面提供了一种治疗自身免疫性疾病、病症或病况的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
本发明的相关方面提供了一种在有此需要的受试者中降低表达CXCR5的细胞数量的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
在某些实施方式中，细胞在其表面上表达CXCR5。在某些实施方式中，细胞是B细胞和Tfh样细胞。
在某些实施方式中，受试者是人类。
在某些实施方式中，所述方法包括静脉内或皮下施用抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段或者药物组合物是约每周两次、每周一次、每两周一次，每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次进行施用。
本发明的相关方面提供了一种降低样品中的CXCR5+细胞的数量的方法，所述方法包括将所述细胞与本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物接触。
本发明的相关方面提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物，其用作药物。
本发明的相关方面提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物，其用于在受试者中降低CXCR5的活性。
本发明的相关方面提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物，其用于治疗需要免疫抑制的受试者。
本发明的相关方面提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物，其用于在受试者中治疗自身免疫性疾病、病症或病况。
本发明的相关方面提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗免疫疾病、病症或病况的药物中的用途。
本发明的相关方面提供了本发明所述的药物组合物在制备用于治疗免疫疾病、病症或病况的药物中的用途。
本发明的相关方面提供了一种治疗医学病况的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
在某些实施方式中，所述病况选自以下：炎性应答，如炎性皮肤疾病，包括银屑病和皮炎(例如，特应性皮炎)；皮肌炎；系统性硬皮病和硬化；与炎性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)相关的应答；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；胃炎；肾小球肾炎；过敏性病况，如湿疹和哮喘以及涉及T细胞浸润的其他病况和慢性炎性应答；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自身免疫性甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；干燥综合征；幼发型糖尿病；和与由典型地存在于结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发过敏性相关的免疫应答；韦格纳氏病；恶性贫血(爱迪生氏病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷夫斯氏病；兰伯特-伊顿肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺病；白癜风；莱特尔氏病；僵人综合征；白塞氏病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病变；免疫血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫血小板减少症和自身免疫溶血性疾病；桥本氏甲状腺炎；自身免疫性干眼；自身免疫性血友病；自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)；自身免疫性葡萄膜炎；格林-巴利综合征；古德帕斯特综合征；混合结缔组织病；自身免疫相关不孕症；多发性结节性动脉炎；斑秃；自发性粘液性水肿；移植物抗宿主病；肌营养不良(杜兴氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、肌强直性肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、Emery-Dreifuss型肌营养不良)以及控制表达CXCR5的癌细胞(如胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、T细胞白血病和B细胞白血病)的增殖。在某些实施方式中，疾病是SLE或类风湿性关节炎。
在某些实施方式中，疾病是干燥综合征。
本发明的相关方面提供了一种使用本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者其药物组合物在样品、组织或细胞中检测CXCR5的方法，包括将样品、组织或细胞与抗体接触并检测抗体。
本发明的相关方面提供了一种使用本发明所述的抗体或其抗原结合片段在样品、组织或细胞中检测CXCR5方法，包括将样品、组织或细胞与抗体接触并检测抗体。
本发明的相关方面提供了一种在有此需要的受试者中抑制体液免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者其药物组合物。
在某些实施方式中，抗体介导选自以下的至少一种表达CXCR5的细胞耗竭：在脾脏中的Tfh细胞、在外周血中的B细胞和在外周血中的Tfh样细胞。
4.施用途径和载体
在各种实施方式中，可以皮下或静脉内施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体。为简洁起见，“本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体”指本发明所述的小鼠-人嵌合抗CXCR5抗体及其人源化变体。
在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可在体内通过多种途径，包括但不限于口服、动脉内、肠胃外、鼻内、肌内、心内、室内、气管内、经颊、直肠、腹膜内、通过吸入、真皮内、表面、经皮和鞘内或以其他方式(例如通过植入)施用。
在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可经由i.v.或s.c.施用。
本发明抗体组合物可配制为呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射液、吸入剂和气溶胶。
在各种实施方式中，包含本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体的组合物是以与多种药学上可接受的载体的制剂形式提供(参见，例如，Gennaro,Remington:The Science andPractice of Pharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus，第20版(2003)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等，Handbook of PharmaceuticalExcipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。可获得多种药学上可接受的载体，其包括媒剂、佐剂和稀释剂。另外，还可获得多种药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等。非限制性示例性载体包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
在各种实施方式中，包含本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体的组合物可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其他油、合成脂肪酸甘油酯、较高脂肪酸的酯或丙二醇)中；并且必要时，与常规添加剂(例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起配制用于注射，包括皮下施用。
在各种实施方式中，所述组合物可例如使用加压可接受的推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等)配制用于吸入。
在各种实施方式中，所述组合物还可配制为例如含有生物可降解或生物不可降解聚合物的持续释放微胶囊。非限制性示例性生物可降解制剂包括聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物。非限制性示例性生物不可降解制剂包括聚甘油脂肪酸酯。某些制造此类制剂的方法描述于例如EP 1125584A1中。
还提供药物剂量包，其包含各自含有一个或多个剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体的一个或多个容器。在一些实施方式中，提供单位剂量，其中所述单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体，具有或不具有一种或多种额外剂。在一些实施方式中，此类单位剂量是在一次性注射用预填充注射器中供应。在多个实施方式中，含于单位剂量中的组合物可包含生理盐水、蔗糖等；缓冲剂，例如磷酸盐等；和/或在稳定和有效的pH范围内配制。或者，在一些实施方式中，所述组合物可提供为可在添加适当液体(例如无菌水)后复原的冻干粉末。在一些实施方式中，所述组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。在一些实施方式中，本发明组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
药物组合物是以有效地治疗或预防具体适应症的量施用。治疗有效量通常取决于所治疗受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的疾患的广泛性或所治疗受试者的年龄。
在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约50μg/kg体重至约50mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约100μg/kg体重至约50mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。
在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约10mg至约1,000mg范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约500mg范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约300mg范围内的量施用。在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可以介于每个剂量约20mg至约200mg范围内的量施用。
本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合物可视需要施用于受试者。在一些实施方式中，向受试者施用一次或多次有效剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体。在多个实施方式中，每月一次、小于每月一次(例如每两个月、每三个月或每六个月)向受试者施用有效剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体。在其他实施方式中，大于每月一次(例如每两周、每周、每周两次、每周三次、每天或每天多次)施用有效剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体。向受试者施用至少一次有效剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体。在一些实施方式中，可多次施用有效剂量的本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时段。在一些实施方式中，视需要将本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体施用于受试者以缓和疾患的一种或多种症状。
5.组合疗法
本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体(包括其功能片段)可与其他生物活性物质或其他治疗程序组合施用于有需要的受试者来治疗疾病。举例说来，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可单独施用或与其他治疗模式一起施用。其可在其他治疗模式(例如放射疗法)之前、与其大体上同时或在其之后提供。
为治疗癌症，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可与一种或多种抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂、化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂或抗赘瘤组合物)联合施用。
在某些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体特异性结合至CXCR5(“CXCR5结合拮抗剂”)，例如CXCR5拮抗剂抗体或其抗原结合片段，与第二拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂，例如PD-1或PD-L1途径的抑制剂)一起施用于患有其中刺激免疫系统将有益的疾病(例如癌症或传染病)的受试者。可同时或连续施用两种拮抗剂，例如，如下文针对本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体与肿瘤免疫剂的组合所述。可将一种或多种额外治疗剂(例如检查点调节剂)添加至使用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体的治疗来治疗癌症或自身免疫疾病。
在某些实施方式中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体与另一治疗同时或连续施用于受试者，例如患有癌症的受试者。举例说来，本发明所述的抗CXCR5克隆抗体可与以下一者或多者一起施用：放射疗法、手术或化学疗法，例如靶向化学疗法或免疫疗法。
在某些实施方式中，治疗患有癌症的受试者的方法包括向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和一种或多种肿瘤免疫剂，例如免疫检查点抑制剂。
免疫疗法(例如使用肿瘤免疫剂的疗法)可有效地增强、刺激和/或上调受试者的免疫反应。一方面，施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)在治疗癌症方面，例如在抑制肿瘤生长方面具有协同效应。
一方面，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体是在施用肿瘤免疫剂之前依序施用。一方面，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体是与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)同时施用。另一方面，本发明抗TNFR2单克隆抗体是在施用肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)之后依序施用。两种剂的施用可在例如间隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周时开始，或可在已施用第一剂后例如30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周开始施用第二剂。
在某些方面中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)同时施用于患者，例如同时输注至患者，例如在30或60分钟的时段内。本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可与肿瘤免疫剂(例如PD-1抑制剂)共配制。
肿瘤免疫剂包括例如小分子药物、抗体或其片段，或其他生物或小分子。生物肿瘤免疫剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、疫苗和细胞因子。一方面，抗体是单克隆抗体。在某些方面，单克隆抗体是人源化或人类抗体。
在一个方面中，免疫肿瘤剂是(i)刺激(包括共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂，或者(ii)免疫细胞(例如，T细胞)上的抑制(包括共抑制)分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，这两者使得放大抗原特异性T细胞应答。在某些方面中，免疫肿瘤剂是(i)刺激(包括共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂，或者(ii)参与先天性免疫的细胞(例如，NK细胞)上的抑制(包括共抑制)分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，并且其中免疫肿瘤剂增强先天性免疫。此类免疫肿瘤剂常常称为免疫检查点调节剂，例如，免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。
在某些实施方式中，肿瘤免疫剂可为靶向(或特异性结合至)B7膜结合配体家族的成员或特异性结合至B7家族成员的共刺激或共抑制受体的剂，所述B7膜结合配体家族包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5和B7-H6。肿瘤免疫剂可为靶向TNF膜结合配体家族的成员或与其特异性结合的共刺激或共抑制受体(例如TNF受体家族成员)的剂。可由肿瘤免疫剂靶向的示例性TNF和TNFR家族成员包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、GITR、GITRL、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTfiR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNPβ、TNFR2、TNFa、LTfiR、淋巴毒素a 1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR。可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合使用来治疗癌症的肿瘤免疫剂可为靶向B7家族成员、B7受体家族成员、TNF家族成员或TNFR家族成员(例如上文所述的那些家族成员)的剂，例如抗体。
在一个方面中，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体与以下一者或多者一起施用：(i)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂)，所述蛋白质是例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM3、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PDIH、LAIR1、TIM-1、TIM-4和PSGL-1，和(ii)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，所述蛋白质是例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、CD40L、DR3和CD28H。
在一个方面中，肿瘤免疫剂是抑制(即拮抗)抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF和其他免疫抑制细胞因子)的剂，或是刺激T细胞活化并且刺激免疫反应的细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和IFNα)的激动剂(例如细胞因子本身)。
可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合来刺激免疫系统(例如治疗癌症和传染病)的其他剂包括NK细胞上的抑制受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的激动剂。举例说来，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可与KIR的拮抗剂组合。
用于组合疗法的其他剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核球的剂，包括但不限于CSF-IR拮抗剂，例如CSF-IR拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
肿瘤免疫剂还包括抑制TGF-β信号传导的剂
可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合的额外剂包括增强肿瘤抗原呈递的剂，例如树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸和咪喹莫特(imiquimod)，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)。
可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合的其他疗法包括耗竭或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合至CD25的剂。
可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合的另一疗法是抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法。
可使用的另一类剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的剂。
可与本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体组合来治疗癌症的其他疗法包括逆转/预防T细胞无能或耗竭的疗法和触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或炎症的疗法。
本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可与一种以上的肿瘤免疫剂(例如免疫检查点抑制剂)组合，并且可与例如靶向免疫途径的多个元件的组合方法组合，所述组合方法是例如以下一者或多者：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗竭或阻断Treg或其他免疫抑制细胞抑制负免疫调控的疗法；例如用刺激CD-137、OX-40和/或GITR途径和/或刺激T细胞效应功能的激动剂刺激正免疫调控的疗法；增加全身抗肿瘤T细胞频率的疗法；例如使用CD25拮抗剂(例如达克珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠粒耗竭来耗竭或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法；影响肿瘤中的抑制性骨髓细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)；过继性T细胞或NK细胞转移，包括经遗传修饰的细胞，例如经嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；逆转/预防T细胞无能或耗竭的疗法；触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或发炎的疗法；施用免疫刺激细胞因子或阻断免疫阻抑细胞因子。
举例说来，本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体可与以下各物一起使用：一种或多种接合阳性共刺激受体的激动剂；一种或多种减弱通过抑制受体的信号传导的拮抗剂(阻断剂)，例如克服肿瘤微环境内的不同免疫抑制途径(例如阻断PD-L1/PD-1/PD-L2相互作用)的拮抗剂；一种或多种增加全身抗肿瘤免疫细胞(例如T细胞)的频率、耗竭或抑制Treg(例如通过抑制CD25)的剂；一种或多种抑制代谢酶(例如IDO)的剂；一种或多种逆转/预防T细胞无能或耗竭的剂；和一种或多种触发肿瘤位点的先天免疫活化和/或炎症的药剂。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CTLA-4拮抗剂，例如拮抗性CTLA-4抗体。合适的CTLA-4抗体包括例如YERVOY(伊匹单抗)或曲美木单抗(tremelimumab)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是PD-1拮抗剂，例如拮抗性PD-1抗体。合适的PD-1抗体包括例如OPDIVO(纳武单抗)、KEYTRUDA(派姆单抗)或MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)。肿瘤免疫剂还可包括匹地利珠单抗(pidilizumab，CT-011)。靶向PD-1受体的另一方法是由PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域融合至IgG1的Fc部分构成的重组蛋白，称为AMP-224。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是PD-L1拮抗剂，例如拮抗性PD-L1抗体。合适的PD-L1抗体包括例如MPDL3280A(RG7446；WO2010/077634)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是LAG-3拮抗剂，例如拮抗性LAG-3抗体。合适的LAG3抗体包括例如BMS-986016(WO10/19570、WO14/08218)或IMP-731或IMP-321(WO08/132601、WO09/44273)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD137(4-1BB)激动剂，例如激动性CD137抗体。合适的CD137抗体包括例如乌瑞鲁单抗(urelumab)或PF-05082566(WO12/32433)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是GITR激动剂，例如激动性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)、MK-4166(WO 11/028683)或WO2015/031667中所公开的GITR抗体。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是OX40激动剂，例如激动性OX40抗体。合适的OX40抗体包括例如MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD40激动剂，例如激动性CD40抗体。在某些实施方式中，肿瘤免疫剂是CD40拮抗剂，例如拮抗性CD40抗体。合适的CD40抗体包括例如鲁卡木单抗(lucatumumab，HCD122)、达西组单抗(dacetuzumab，SGN-40)，CP-870,893或Chi Lob 7/4。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是CD27激动剂，例如激动性CD27抗体。合适的CD27抗体包括例如瓦利珠单抗(varlilumab，CDX-1127)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是MGA271(针对B7H3)(WO1 1/109400)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是KIR拮抗剂，例如利瑞鲁单抗(lirilumab)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚莫德(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)或F001287。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是Toll样受体激动剂，例如TLR2/4激动剂(例如卡介苗)；TLR7激动剂(例如Hiltonol或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激动剂(例如CpG7909)。
在一个实施方式中，患有可受益于刺激免疫系统的疾病(例如癌症或传染病)的受试者是通过向受试者施用本发明所述的抗CXCR5单克隆抗体和肿瘤免疫剂来治疗，其中肿瘤免疫剂是TGF-β抑制剂，例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1。
6.示例性抗CXCR5单克隆抗体
本文所述的本发明提供了对于CXCR5是特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段。
因此，本发明的一个方面提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其与本文所描述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一者竞争结合hCXCR5，或结合由HFB2-4或其Hz变体结合的表位。
在某个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-小鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面修饰抗体。
在一些实施方式中，所述的其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微小抗体、F(ab’)3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段具有增强ADCC的工程化Fc区，如本文/上文所描述的那些，包括双突变hG1DE。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段对于人CXCR5是特异性的，例如，基本上不与CXCR3交叉反应，和/或基本上不与小鼠或食蟹猴CXCR5交叉反应。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段针对hCXCR5具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤25nM、≤20nM、≤15nM、≤10nM、≤5nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在某个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段结合至由HFB2-4或其Hz变体(如Hz9、Hz12、Hz14、Hz15、Hz37、Hz38、Hz39、Hz40、Hz41和Hz42)结合的表位。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以EC50为约0.4至4nM(如约0.9nM或约1.2nM)的表观亲和力结合细胞上所表达的hCXCR5。
在某些实施方式中，在cAMP报告子测定中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以约0.5至3.5nM(如约0.49nM)的EC50拮抗CXCR5-CXCL13信号传导。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段针对表达hCXCR5的细胞显示EC50小于0.1nM(例如，0.001至0.1nM，如约0.002nM)的ADCC活性。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段介导NK细胞以小于0.1fM.或约0.3aM至0.8pM的EC50杀死表达hCXCR5的人B细胞。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段结合hCXCR5，但并不可检测地结合人趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CMKLR1、CXCR3R1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CXCR7和XCR1。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段耗竭外周血中的B细胞，任选地可逆地耗竭外周血中的B细胞。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段耗竭外周血和/或脾脏中的Tfh样细胞。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制CXCR5与CXCL13的结合。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制CXCL13对细胞中以其他方式由弗斯可林(forskolin)触发而产生cAMP的抑制作用，从而使得cAMP水平与不存在抗体或其抗原结合片段情况下的cAMP水平相比有所增加(例如以约0.4至3.5nM(诸如约0.49nM)的EC50抑制CXCL13对产生cAMP的抑制作用)。任选地，对CXCL13抑制的最大抑制为至少约60％、70％或80％。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在人供体外周血单核细胞(PBMC)中触发表达CXCR5的细胞的ADCC。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合hCXCR5并与本发明所述的抗体或其抗原结合片段中的任一者竞争。
表A：示例性抗人CXCR5抗体的CDR、框架(FR)、可变重链和可变轻链
/>
/>
/>
在一些实施方式中，本发明所述的抗人CXCR5抗体或其抗原结合片段包含表A和表B中所列的任一抗体的至少一个、两个或三个(例如，所有三个)的相应VH CDR。
在一些实施方式中，本发明所述的抗人CXCR5抗体或其抗原结合片段包含表A和表C中所列的任一抗体的至少一个、两个或三个(例如，所有三个)的相应VL CDR。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNO:9、10和11的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:17、18和19的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:25、26和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:41、42和43的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:57、58和59的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:33、49和65的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:57、58和59的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:76、77和78的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQID NO:149、150和151的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:114、115和116的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在本发明所述的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的任何一个或多个中包含至多1、2、3、4或5个(例如，至多1、2或3个)氨基酸残基改变(例如，缺失、插入或取代(例如，保守性取代))；和/或在本发明所述的抗体的VL CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的任何一个或多个中包含1、2、3、4或5个(例如，至多1、2或3个)氨基酸残基改变(例如，缺失、插入或取代(例如，保守性取代))。
根据本发明所述的抗人CXCR5抗体或其抗原结合片段可使用如表A中所描述的氨基酸序列的框架区(FR)中的任一个，或者与如表A中所描述的FR氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列来制备。在某些实施方式中，重链FR区全部来自本文的相同示例性抗体。在某些实施方式中，轻链FR区全部来自本文的相同示例性抗体。在某些实施方式中，重链和轻链两者的FR区全部来自本文的相同示例性抗体。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段具有重链可变区(VH)，所述重链可变区包含表A中所列的任一抗体的对应重链框架区的重链框架区1(VHFR1)、重链框架区2(VH FR2)、重链框架区3(VH FR3)和/或重链框架区4(VH FR4)中的一个、两个、三个或全部(即，四个)，或者VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4包含与如表A中所描述的任一抗体的对应VH FR氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4、20、36、52或72的VH FR1，或与SEQ ID NO:4、20、36、52或72基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5、21、37、53或73的VH FR2，或与SEQ ID NO:5、21、37、53或73基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:6、22、38、54、64或74的VH FR3，或与SEQ ID NO:6、22、38、54、64或74基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7、23、39或55的VH FR4，或与SEQ ID NO:7、23、39或55基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段具有轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含表A中所列的任一抗体的对应轻链框架区的轻链框架区1(VLFR1)、轻链框架区2(VL FR2)、轻链框架区3(VL FR3)和/或轻链框架区4(VL FR4)中的一个、两个、三个或全部(即，四个)，或者VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4包含与如表A中所描述的任一抗体的对应VL FR氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:12、28、44、60、66或79的VL FR1，或与SEQ ID NO:12、28、44、60、66或79基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13、29、45、61、67或80的VL FR2，或与SEQ ID NO:13、29、45、61、67或80基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14、30、46、62或81的VL FR3，或与SEQ ID NO:14、30、46、62或81基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15、31、47或82的VL FR4，或与SEQ ID NO:15、31、47或82基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VL框架序列或VH框架序列的一个或两个与衍生出其的人种系序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且其中衍生出VL框架序列的人种系VL序列选自以下：V1-22、Vλ共有序列、Vλ1共有序列、Vλ3共有序列、Vκ共有序列、Vκ1共有序列、Vκ2共有序列和Vκ3，并且其中衍生出VH框架序列的人种系VH序列选自以下：VH3、VH5、VH1和VH4。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VL框架序列和/或VH框架序列中的一个或两个与衍生出其的人种系序列具有至少66％、76％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VL框架序列或VH框架序列中的一个或两个与衍生出其的人种系序列具有同一性。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段显示出增强的ADCC。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含衍生自人VH3种系序列的框架VH序列。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域，如IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgM或IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc结构域。在某些实施方式中，Fc结构域是IgG的Fc结构域，如(人)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段是Fc融合蛋白、单抗体、大抗体、双功能性抗体、scFab、scFv、肽体。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以约为或小于选自以下的值的KD结合人CXCR5：约10nM、5nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM和1pM。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在人类中具有约一(1)天至七(7)天的预测半衰期。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段(包括人源化单克隆抗体或其抗原结合片段)具有良好的可开发性性质，包括在高温(例如，25℃或40℃)、低pH条件(例如，pH3.5，约室温)下和/或在若干轮冻融循环之后是稳定的。
在某些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段(包括人源化单克隆抗体或其抗原结合片段)在氨基酸序列中包括经设计以改良抗体的可开发性的一个或多个点突变。例如，Raybould等(Five computational developability guidelines fortherapeutic antibody profiling,PNAS 116(10):4025-4030,2019)描述了治疗性抗体分析器(TAP)，其是构建可变结构域序列的可下载同源模型、针对五个可开发性指导原则对其进行测试并报告潜在序列倾向及典型形式的计算工具。作者进一步使TAP在opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/TAP.php可自由获得。
除了实现对抗原的所需亲和力以外，治疗性mAb开发仍存在很多障碍。这些包括固有免疫原性、化学和构象不稳定性、自我缔合、高粘度、多特异性和低表达。例如，特别是在高度可变的互补决定区(CDR)中的高水平的疏水性重复地与聚集性、粘度和多特异性相关。重链和轻链可变结构域的净电荷的不对称性亦与高浓度下的自我缔合和粘度相关。CDR中的正电荷和负电荷补丁(patche)与高清除率和低表达水平有关。产物的异质性(例如，通过氧化、异构化或糖基化)通常由易于翻译后或共翻译修饰的特定序列基序引起。计算工具可用于促进序列倾向的鉴定。Warszawski等(Optimizing antibody affinity andstability by the automated design of the variable light-heavy chaininterfaces.PLoS Comput Biol 15(8):e1007207.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007207)还描述了通过可变轻重链界面的自动化设计来优化抗体亲和力和稳定性的方法。可获得用于鉴定候选抗体的潜在可开发性问题的其他方法，并且在本发明所述的优选实施方式中，可以通过常规方法将一个或多个点突变引入候选抗体以解决这些问题，从而产生本发明所述的优化的治疗性抗体。
7.人源化抗体
在一些实施方式中，本发明所述的抗体是人源化抗体。人源化抗体适合作为治疗剂分子，因为人源化抗体降低或消除人类对非人抗体的免疫应答(如人抗小鼠抗体(HAMA)应答)，人类对非人抗体的免疫应答可产生对抗体治疗剂的免疫应答，并降低治疗剂的有效性。
可以通过任何标准方法将抗体人源化。人源化的非限制性示例性方法包括描述在例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370；Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-27(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-36(1988)；以及美国公开号US2009/0136500中的方法。所有均通过引用并入。
人源化抗体是其中非人可变区的框架区中至少一个氨基酸已经来自人框架区中对应位置的氨基酸置换的抗体。在一些实施方式中，非人可变区的框架区中至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个或至少20个氨基酸经来自一个或多个人框架区中的一个或多个对应位置的氨基酸置换。
在一些实施方式中，用于取代的一些相应的人氨基酸来自不同人免疫球蛋白基因的框架区。也就是说，在一些此类实施方式中，非人氨基酸中的一个或多个可经来自第一人抗体的人框架区的对应氨基酸置换或由第一人免疫球蛋白基因编码，非人氨基酸中的一个或多个可经来自第二人抗体的人框架区的对应氨基酸置换或由第二人免疫球蛋白基因编码，非人氨基酸中的一个或多个可经来自第三人抗体的人框架区的对应氨基酸置换或由第三人免疫球蛋白基因编码等等。此外，在一些实施方式中，单个框架区(例如，FR2)中用于取代的所有对应人氨基酸不需要来自相同人框架。然而，在一些实施方式中，用于取代的所有对应人氨基酸来自相同人抗体或由相同人免疫球蛋白基因编码。
在一些实施方式中，通过将一个或多个整个框架区用对应人框架区置换来对抗体进行人源化。在一些实施方式中，选择与所置换的非人框架区具有最高同源性水平的人框架区。在一些实施方式中，此类人源化抗体是CDR移植的抗体。
在一些实施方式中，在CDR移植之后，一个或多个框架氨基酸变回小鼠框架区中的对应氨基酸。在一些实施方式中，进行此类“反突变”以保留似乎有助于CDR中的一个或多个的结构和/或可参与抗原接触和/或似乎与抗体的总结构完整性有关的一个或多个小鼠框架氨基酸。在一些实施方式中，在CDR移植后，抗体的框架区发生10个或更少的、9个或更少的、8个或更少的、7个或更少的、6个或更少的、5个或更少的、4个或更少的、3个或更少的、2个或更少的、1个或0个反向突变。
表B：衍生自HFB2-4的示例性人源化VH序列
/>
/>
表C：衍生自HFB2-4的示例性人源化VL序列
/>
/>
表D：衍生自HFB2-4的示例性人源化抗体
/>
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段具有重链可变区(VH)，所述重链可变区包含表B中所列的任一抗体的对应重链框架区的重链框架区1(VHFR1)、重链框架区2(VH FR2)、重链框架区3(VH FR3)和/或重链框架区4(VH FR4)中的一个、两个、三个或全部(即，四个)，或者VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4序列包含与如表B和表D中所描述的任一抗体的对应VH FR氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:84、85、86和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:89、90、91和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:93、94、95和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:138、94、139和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:141、142、143和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:132、85、133和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VHFR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:93、126、127和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列，所述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4序列分别包含与SEQ ID NO:132、133、134和87的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段具有轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含表C中所列的任一抗体的对应轻链框架区的轻链框架区1(VLFR1)、轻链框架区2(VL FR2)、轻链框架区3(VL FR3)和/或轻链框架区4(VL FR4)中的一个、两个、三个或全部(即，四个)，或者VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4序列包含与如表C和表D中所描述的任一抗体的对应VL FR氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:97、98、99和100的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:97、102、99和100的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:103、104、105和100的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:103、107、108和100的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:134、135、136和131的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:128、129、130和131的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:145、146、147和131的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:97、98、152和100的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含VL FR1、VLFR2、VLFR3和VL FR4序列，所述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4序列分别包含与SEQ ID NO:154、102、99和47的氨基酸序列基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
表E：衍生自HFB2-4的选定的人源化抗体
/>
在一些实施方式中，人源化抗体还包含人重链恒定区和/或人轻链恒定区。
8.人抗体
在一些实施方式中，本发明所述的抗体是人抗体。人抗体可以通过任何适宜方法制备。非限制性实例方法包括在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人抗体。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-55(1993)；Jakobovits等，Nature 362:255-8(1993)；onberg等，Nature 368:856-9(1994)；以及美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299；和5,545,806。
非限制性示例性方法还包括使用噬菌体展示文库制备人抗体。参见，例如，Hoogenboom等，J.Mol.Biol.227:381-8(1992)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-97(1991)；和PCT公开号WO 99/10494。
抗体恒定区
在一些实施方式中，本文描述的人源化、嵌合的或人抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方式中，人重链恒定区是选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方式中，人轻链恒定区是选自K和λ的同种型。在一些实施方式中，本文所述的抗体包含人IgG恒定区，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，抗体或Fc融合伴侣包含C237S突变，例如，在IgG1恒定区中。在一些实施方式中，本文所述的抗体包含人IgG2重链恒定区。在一些此类实施方式中，IgG2恒定区包含P331S突变，如在美国专利号6,900,292中描述的。在一些实施方式中，本文所述的抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些此类实施方式中，本文所述的抗体包含在人IgG4恒定区中的S241P突变。参见，例如，Angal等，Mol.Immunol.30(1):105-108(1993)。在一些实施方式中，本文所述的抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
重链恒定区的选择可决定抗体是否将具有体内效应功能。在一些实施方式中，此类效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可杀伤抗体结合的细胞。通常，包含人类IgG1或IgG3重链的抗体具有效应功能。
在一些实施方式中，效应功能并非合意的。举例说来，在一些实施方式中，效应功能可能在治疗炎性病况和/或自身免疫病症方面并非合意的。在一些此类实施方式中，选择或工程改造人类IgG4或IgG2重链恒定区。在一些实施方式中，IgG4恒定区包含S241P突变。
本文所述的任何抗体可通过任何合适方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用色谱。合适的亲和配体包括抗体结合的抗原和/或表位，和结合抗体恒定区的配体。举例说来，可使用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱来结合恒定区并纯化抗体。
在一些实施方式中，还使用疏水性相互作用色谱(HIC)(例如丁基或苯基柱)来纯化一些多肽。很多纯化多肽的方法为本领域中已知的。
或者，在一些实施方式中，本文所述的抗体是在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
9.抗体岩藻糖基化和非岩藻糖基化
本发明的一个方面提供了结合CXCR5的岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗体，和包含此类抗体的组合物以及此类抗体的用途，包括治疗性和医药用途。
或者，本发明提供了显示出改变的效应功能的抗CXCR5抗体。在一些实施方式中，改变的效应功能是增加的ADCC。在一些实施方式中，抗体缺乏或含有可检测的降低水平(例如，<10％、<5％、<2％)的岩藻糖(即，其为非盐藻糖基化的)。
在一些实施方式中，提供能够形成结合CXCR5的抗体的非盐藻糖基化抗体重链和轻链。在一些实施方式中，提供了包含一种或多种特定互补性决定区(CDR)的非岩藻糖基化抗体重链和轻链。在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体具有改变的效应功能。在一些实施方式中，相对于以其他方式相同的本发明所述的岩藻糖基化抗CXCR5抗体，本发明所述的抗体具有增强的ADCC活性。
L-岩藻糖(或6-脱氧-L-半乳糖)是一种单糖，是动物中一些N-和O-连接的聚糖和糖脂的成分(Becker和Lowe,Glycobiology13:41R-51R,2003，通过引用并入)。岩藻糖通常作为聚糖的末端修饰添加，包括附接在血型抗原、选择素和抗体上的聚糖。海藻糖可通过特定海藻糖基转移酶通过α(1,2)-、α(1,3)-、α(1,4)-和α(1,6)-连接附接至聚糖。α(1,2)-岩藻糖连接通常与H血型抗原相关。α(1,3)-和α(1,4)-岩藻糖连接与LewisX抗原的修饰相同。α(1,6)-岩藻糖连接与N-连接GlcNAc分子(如抗体上的那些)相关。
本发明所述的“非岩藻糖基化”抗体包括缺乏岩藻糖的抗体，例如，在其恒定区糖基化中缺乏岩藻糖的IgG1或IgG3同种型抗体。人IgGl或IgG3的糖基化发生在Asn297，因为核心岩藻糖基化双触角复合寡糖糖基化在多达2个Gal残基的情况下终止。
存在于IgG的CH2结构域中的复合物寡糖结构的主要类型或“糖型”描述在99/22764中(以引用方式并入，参见第7页)。在此，G0指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的双触角结构，G1指具有一个Gal而没有NeuAc的双触角结构，且G2指具有两个末端Gal而没有NeuAc的双触角结构。
在一些实施方式中，本发明所述的岩藻糖基化抗体在Asn297处缺乏岩藻糖。这些结构视末端Gal残基的量而命名为G0、G1(1,6或1,3)或G2聚糖残基。参见，例如，Raju,BioProcess Int.1:44-53(2003)。抗体Fc的CHO型糖基化描述在例如Routier,Glycoconjugate J.14:201-207(1997)中。
在一些实施方式中，如本文中可互换使用的“非岩藻糖基”或“非岩藻糖基化”抗体指已经糖工程改造从而缺乏核心岩藻糖的抗体。在聚糖部分中具有降低的岩藻糖含量的抗体对FcγRIIIa(CD16)具有增加的亲和力，并且因此具有增强的活性依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
可以使用CHOK1SV细胞系(Lonza Biologics)产生非岩藻糖基抗体，其缺乏负责岩藻糖添加的基因(α1,6-岩藻糖基转移酶)的两个等位基因。非岩藻糖基或岩藻糖减少的抗体亦可通过以各种方式修改寡糖生物合成活性来产生。例如，N-乙酰葡糖胺-转移酶III(GnTIII)在制备细胞系的高尔基体中的过表达产生与抗体的Fc恒定区相关的双触角寡糖结构并且抑制岩藻糖基化。在这种表达系统中，GnTIII表达水平与非岩藻糖基化IgG1糖型和所得增强的ADCC活性的产生有关。
还可以通过使用糖类似物(比如但不限如2012/019165中所描述的岩藻糖类似物)降低细胞培养物中的岩藻糖基化。因此，可以使用本领域公知的多种方法来产生非岩藻糖基化或还原岩藻糖的抗体。
在一些实施方式中，本发明所述的非岩藻糖基化抗体对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施方式中，本发明所述的非岩藻糖基化抗体对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施方式中，本发明所述的非岩藻糖基化抗体对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。
“糖型”指包含各种碳水化合物单元的连接的复合寡糖结构。此类结构描述在例如Essentials of Glycobiology Varki等编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1999)中，其也提供了标准糖生物学命名法的综述。此类糖型包括但不限于G2、G1、G0、G-1和G-2(参见，例如，国际专利公开号WO 99/22764)。
“糖基化模式”定义为碳水化合物单元共价连接至蛋白(例如，糖型)以及糖型共价连接至蛋白的肽骨架(更特定而言连接至免疫球蛋白)的位点的模式。
在一些实施方式中，非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的一批抗体中至少85％在Asn297处是岩藻糖基化的。
当提及包含多个抗体的组合物时，如果组合物中的抗体中不到约5％在至少一个Asn297处包含岩藻糖，则将抗体视为非岩藻糖基化的。
在某些实施方式中，非岩藻糖基化的水平是约100％，即使用用于测量抗体的岩藻糖基化的标准方法在任一重链Asn297糖型上均未检测到岩藻糖。
测量岩藻糖的方法包括本领域公知的任何方法，包括本文所述的方法。在一些实施方式中，岩藻糖在包含多个非岩藻糖基化抗体的组合物中是不可检测的。在一些实施方式中，非岩藻糖基化的抗体具有增强的ADCC活性。
在一些实施方式中，提供具有缺乏附接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体(即，非岩藻糖基化抗体)。例如，在包含多种此类抗体的组合物中岩藻糖的量可以是0-30％、0-20％、0-15％、1-10％或0-5％。
在一些实施方式中，包含多种本发明所述的抗体的组合物包含>80％、85％、90％、95％、97％、99％或>99.5％的非岩藻糖基化抗体。在一些实施方式中，抗体在检测限内是100％非盐藻糖基化的(即，岩藻糖是使用本领域公认的检测抗体中岩藻糖的方法(如本文所述的方法)在Asn297处不可检测/未被检测的)。可以通过相对于附接至Asn297的所有糖结构(例如，复合物、杂合物和高甘露糖结构)的综合计算糖链内在Asn297处的岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量。
在一些实施方式中，岩藻糖基化的水平不超过0.5％，这是基于测试方法的定量限(LOQ)的。因此，在一些实施方式中，非岩藻糖基化的水平大于或等于99.5％。
N-连接寡糖分析法可用于确定样品中岩藻糖基化、唾液酸化、甘露糖基化和末端半乳糖基化的水平。N-连接寡糖法可用于评价N-连接聚糖。简言之，使用肽-N-糖苷酶F使N-连接聚糖从蛋白质酶促释放。然后，通过荧光剂对聚糖进行衍生化，并使用亲水性相互作用液相色谱和荧光检测进行分析。接着将色谱图与参考材料进行比较。该方法和本领域中公知的很多其他方法均可以用于评估抗体的岩藻糖基化程度，并且可用于确定本发明所述的抗体中存在的岩藻糖基化水平。
检测抗体中的岩藻糖的非限制性示例性方法包括MALDI-TOF质谱法(参见，例如，WO 2008/077546)，所释放的荧光标记寡糖的HPLC测量(参见，例如，Schneider等，N-Glycananalysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC withfluorescence detection,Agilent Technologies,Inc.(2012)；Lines,J.Pharm.Biomed.Analysis 14:601-608(1996)；Takahasi,J.Chrom.720:217-225(1996))、所释放的荧光标记寡糖的毛细管电泳测量(参见，例如，Ma等，Anal.Chem.,71:5185-5192(1999))以及使用脉冲电流检测来测量单糖组成的HPLC(参见，例如，Hardy等，AnalyticalBiochem.170:54-62(1988))。
Asn297指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，Asn297亦可因抗体中的微小序列变异而位于位置297上游或下游约加上或减去3个氨基酸处，即，在位置294和200之间。在本文所描述的CXCR5抗体中，Asn297可见于序列基序QYNST中。
岩藻糖基化变体可以具有改进的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108和US2004/0093621。与“非岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体有关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)(全部通过引用并入本文)。
能够产生非岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986))；US 2003/0157108 Al；和WO 2004/056312(参见实施例11)；以及敲除细胞系，如缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的细胞系，例如，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等，Biotechnol.Bioeng,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体具有双触角寡糖，例如，其中附接至抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc二等分。此类抗体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体的实例描述在例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US2005/0123546中。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基。此类抗体可以具有改进的CDC功能。此类抗体描述在例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中(全部通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，本发明所述的非岩藻糖基化抗体在存在人效应细胞的情况下比包含岩藻糖的对照/亲本抗体更有效地介导ADCC。通常，可以使用如本文所公开的体外ADCC测定来确定ADCC活性，但涵盖其他用于确定ADCC活性的测定或方法(例如，在动物模型中等)。
在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体具有增强的体外和/或体内ADCC活性。在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体具有增强的体外ADCC活性。在一些实施方式中，通过本文所述的方法确定体外ADCC活性。简言之，将抗CXCR5抗体或同种型对照的连续稀释液与来自健康人供体或食蟹猴的外周血单核细胞(PBMC)一起孵育。在该测定中，PBMC是自然杀伤(NK)效应细胞和目标CXCR5+B和Tfh样细胞的来源。使用流式细胞术来定量约20hr后剩余的B和Tfh样细胞的数量。通过将抗原结合群的细胞毒性百分比针对PF-06835375抗体浓度的对数进行绘图来产生细胞毒性滴定曲线。使用GraphPad Prism(6.0版，GraphPad Software,Inc,San Diego,CA)非线性回归曲线拟合和激动剂剂量-应答模型的S形对数根据以下方程来确定EC50值：
Log(激动剂)对比应答-可变斜率(四参数)
Y＝底部+(顶部–底部/(1+10^((LogEC50-X)*Hill斜率))
其中Y是细胞毒性的百分比，X是抗体浓度，顶部是对应于S形曲线的上部平台的最大Y值，底部是对应于S形曲线的下部平台的最小Y值(限定至0)，且LogEC50是曲线拐点处的抗体浓度的对数。
在实验中使用平均值和标准偏差(STDEV)概述EC50值。
在一些实施方式中，使用从扁桃体单核细胞分离的CD4+T细胞并添加从PBMC分离的NK细胞类似地评估人源化mAb诱导来自人扁桃体的真正Tfh细胞的ADCC的能力。
在一些实施方式中，将表达CXCR5的Ba/F3细胞作为靶细胞。在一些实施方式中，通过使用CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)定量LDH释放来确定细胞毒性。
在一些实施方式中，使用5％Triton X-100来确定最大裂解并且在不存在抗体的情况下确定自发释放。在一些实施方式中，可以使用下式来确定特异性裂解的百分比：(实验-自发释放)/(最大-自发释放)x 100＝特异性裂解百分比。
在一些实施方式中，在所测试的至少一种抗体浓度下，与使用相同量的岩藻糖基化抗体的特异性裂解相比，具有增强的ADCC活性的非岩藻糖基化抗CXCR5抗体产生大至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少65、至少70或至少75个百分点的特异性裂解。
在一些实施方式中，与使用岩藻糖基化抗体的特异性裂解相比，具有增强的ADCC活性的非岩藻糖基化抗CXCR5抗体产生大至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少65、至少70或至少75个百分点的特异性裂解，其中各抗体在0.01至1微克/ml之间的浓度下并且靶细胞为表达CXCR5的Ba/F3细胞。
在一些实施方式中，在0.000005微克/ml至5微克/ml范围内的浓度下对抗体进行测试。
在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。在一些实施方式中，抗体对FcγRIIIA的亲和力使用表面等离子体共振和/或如下来确定，其参考FcγRIIIA(V158)进行描述，但其亦适合确定对FcγRIIIA(F158)的亲和力。
简言之，在一些实施方式中，将岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗CXCR5抗体捕获在蛋白A包被的右旋糖酐芯片上。以各种浓度注射FcγRIIIA(V158)(可购自例如R and DSystems)。岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗CXCR5抗体的结合常数、解离常数和FcγRIIIA(V158)亲和力可例如使用与表面等离子体共振系统一起提供的软件(例如，Biacore T200评价软件1:1结合模型)来确定。
在一些实施方式中，非岩藻糖基化抗CXCR5抗体可对FcγRIIIA(如FcγRIIIA(V158)或FcγRIIIA(F158))具有增强的亲和力，并且可以比岩藻糖基化抗CXCR5抗体大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍、20倍、30倍、50倍、100倍、500倍或至少1000倍的亲和力与FcγRIIIA结合。
10.编码本发明抗体的核酸分子
本发明还提供核酸分子，所述核酸分子包含编码本文所述抗体的一条或多条链的多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子包含编码本文所述抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子包含编码本文所述抗体的重链的多核苷酸和编码本文所述抗体的轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些此类实施方式中，重链和轻链是由一个核酸分子表达，或由两个单独核酸分子表达为两个单独多肽。在一些实施方式中，例如当抗体是scFv时，单一多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单一多肽。
在一些实施方式中，编码本文所述抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在翻译时位于重链或轻链的N端。如上文所论述，前导序列可为天然重链或轻链前导序列，或可为另一异源前导序列。
核酸分子可使用本领域中常规的重组DNA技术来构建。在一些实施方式中，核酸分子是适于在所选宿主细胞(如哺乳动物细胞)中表达的表达载体。
11.载体
提供载体，所述载体包含编码本文所述抗体的重链和/或轻链的多核苷酸。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、反转录病毒载体等。在一些实施方式中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方式中，重链和轻链由载体表达为两个单独多肽。在一些实施方式中，重链和轻链表达为单一多肽的一部分，例如在抗体是scFv时。
在一些实施方式中，第一载体包含编码重链的多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，第一载体和第二载体以相似的量(例如相似的摩尔量或相似的质量量)转染至宿主细胞中。在一些实施方式中，将摩尔比或质量比介于5:1与1:5之间的第一载体和第二载体转染至宿主细胞中。在一些实施方式中，使用质量比介于1:1与1:5之间的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方式中，使用质量比为1:2的编码重链的载体和编码轻链的载体。
在一些实施方式中，选择经优化以在CHO或CHO源性细胞或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性此类载体描述于例如Running Deer等，Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。在一些实施方式中，选择用于在动物(包括人类)中体内表达本发明抗体的载体。在一些此类实施方式中，在一个或多个以组织特异性方式起作用的启动子控制下表达一种或多种多肽。举例说来，肝特异性启动子描述于例如PCT公开号WO 2006/076288中。
12.宿主细胞
本发明的另一个方面提供了一种宿主细胞，其包含编码本发明所述的抗CXCR5抗体中的任一者的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体。.
在各种实施方式中，本文所述的抗体的重链和/或轻链可在原核细胞，如细菌细胞中；或真核细胞，如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。此类表达可以例如根据本领域公知的程序来进行。
可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；细胞(Crucell)；和NSO细胞。/>
在某些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、细胞或Sp2.0细胞。在某些实施方式中，宿主细胞缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)。在某些实施方式中，宿主细胞不表达功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶。在某些实施方式中，细胞缺乏编码功能性酶的FUT8基因。在某些实施方式中，宿主细胞缺乏编码功能性FUT8基因的基因。在某些实施方式中，宿主细胞是CHOK1SV细胞或Lec13 CHO细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是CHOK1SV细胞。
在一些实施方式中，本文所述的抗体的重链和/或轻链可以在酵母中表达。参见，例如，美国公开号US 2006/0270045 Al。在一些实施方式中，基于对CXCR5抗体的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力选择特定真核宿主细胞。例如，在一些实施方式中，CHO细胞产生比293细胞中所产生的相同多肽相比具有更高水平的唾液酸化的多肽。
将一种或多种核酸引入所需宿主细胞中可通过任何方法来实现，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述在例如Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。可以根据任何适宜的方法将核酸在所需宿主细胞中瞬时或稳定转染。
在一些实施方式中，可以在动物体内生产一种或多种多肽，所述动物已根据任何适宜的方法工程改造或用一个或多个编码多肽的核酸分子转染。
因此，本发明的另一个相关方面提供了一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将本文所描述的本发明的宿主细胞(例如，包含本发明所述的抗体或其功能性抗原结合片段中的任一者的多核苷酸编码序列的那些宿主细胞)在其中所述抗体或抗原结合片段由所述宿主细胞表达的条件下进行培养。
在某些实施方式中，所述方法还包括分离所述抗体或其抗原结合片段。
在一个相关的方面中，本发明提供了一种制备非海藻糖基化抗CXCR5抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养包含本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体的宿主细胞，其中宿主细胞缺乏功能性FUT8。
在某些实施方式中，宿主细胞是CHOK1SV细胞。
本发明的另一个相关方面提供了一种使用本发明所述的方法生产的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本发明所述的分离的抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
在某些实施方式中，与岩藻糖基化的以其他方式相同的抗体或其抗原结合片段相比，非岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段显示出增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在某些实施方式中，非岩藻糖基化抗体或抗原结合片段显示比岩藻糖基化的以其他方式相同的抗体或其抗原结合片段约2倍、约5倍、约7倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约110倍、约120倍、约130倍、约140倍和约143倍的ADCC。
本发明的另一个相关方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
实施例
实施例1：嵌合抗CXCR5单克隆抗体的鉴定和初步表征
使用不同设计进行三个免疫周期，其产生共计185个候选小鼠单克隆抗体，其中54个经证实是CXCR5的结合剂。经验证的结合剂中有六个具有高结合亲和力，经表征为MFI>50％的基准抗体信号，和>80％的阳性细胞。
然后基于小鼠抗体的可变(VH和VL)区和人IgG1的hIgG1支架/恒定区产生嵌合单克隆抗体。以与使用同种型对照获得的百分比相比>1个对数的阳性细胞的百分比的形式对特异性抗体进行表征。
使用体外测定选择候选嵌合抗体
接着对嵌合抗体进行一系列体外表征将这些抗体按优先顺序列出。特别地，六种强结合剂的表征是基于与在表达相关靶点的细胞上的结合、特异性测定和通过流式细胞术进行的交叉反应性测定不同的关键体外测定。建立若干二阶测定以基于对B细胞迁移的功能效应、酶促细胞内激动活性和受体内化对强结合剂进行排序。最重要的是，接着在抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)报告子测定中对强候选物进行表征，因为ADCC是强候选抗体的所需作用模式。ADCC报告子测定的读数是来自驱动萤火虫荧光素酶表达的NFAT应答元件的发光信号。
为测试对CXCR5的结合能力，在结合测定中使用表达靶抗原hCXCR5的贴壁稳定细胞系对六种嵌合单克隆抗体进行测试。结果表明，所有六种嵌合抗体均以不同结合特性与表达靶抗原的细胞结合。其中，与HFB2-1-hG1和HFB2-2-hG1相比，嵌合抗体HFB2-3-hG1、HFB2-4-hG1、HFB2-5-hG1和HFB2-6-hG1显示更高的结合能力。除一种外所有嵌合抗体均显示亚nM EC50值。参见图5。
接下来，交叉反应性结合评估表明，与测定中所包括的阳性对照相比，嵌合单克隆抗体均不与猴或小鼠CXCR5直系同源物交叉反应。参见图6A。另外，抗hCXCR5嵌合抗体均不与hCXCR5直系同源物hCXCR3结合，因此证实其特异性。参见图6B。
由于靶抗原CXCR5是参与趋化性的GPCR，因此进行实验以证实本发明抗体抑制体外B细胞迁移的能力。作为特异性抗体排列测定之一，B细胞迁移测定使用表达CXCR5靶抗原的M300.19悬浮细胞来测试所有抗体候选物以及基准/对照抗体。如下计算该测定中的抑制程度：抑制％＝(1-迁移％/无抗体情况下的迁移％的平均值)*100。
为进行测定，制备一式三份的10nM至0.1nM的三种抗体稀释液，用于在37℃下进行6hr孵育。在Cytoflex上对细胞进行计数，对表达CXCR5靶抗原的M300.19细胞重复两次(n＝2)。
结果表明，候选抗体显示不同抑制性质，并且至少其中一些能够抑制配体(CXCL13)诱导的趋化性。抑制此类趋化性最有效的抗体候选物是嵌合抗体HFB2-4-hG1，其在约1nM下实现100％抑制。参见图7。
此外，在cAMP测定中对强结合剂进行测试以证实其激动/拮抗性质。评估候选抗体在由CXCL13配体活化后是否可以阻断细胞内cAMP水平。测定是基于以下原理：可测量的化学发光信号与细胞中的cAMP的量成正比。在用Gαi路径中的配体活化后，预期cAMP降低。化学发光信号增加与cAMP水平负相关。
cAMP测定显示了6种候选抗体的不同功能性质。特别地，与其他4种候选抗体相比，HFB2-4-hG1和HFB2-5高效地阻断CXCL13诱导的细胞内cAMP信号传导，并且两者均优于基准抗体。图8。
由于所需的本发明抗体的目标产物性质，还在ADCC报告子生物测定中测试了六种强嵌合结合剂。
ASCC是使带有的Fc受体效应细胞可识别和杀死抗体(Ab)包被的在表面表达抗原的靶细胞的免疫机制。ADCC由抗原结合的Ab与免疫效应细胞表面的Fc受体CD16A之间的交联触发。这些相互作用诱导细胞内钙浓度增加、钙调神经磷酸酶/钙调素介导的NFAT去磷酸化，从而允许其核转位并结合至ADCC相关基因的启动子区。最终，效应细胞释放杀死靶细胞的细胞毒性颗粒。在报告子生物测定中，将效应细胞设计为效应报告细胞，因为这些细胞在融合至多个NFAT应答元件的最小启动子控制下稳定表达报告基因，如荧光素酶报告基因。在该系统中，将ADCC诱导测量为在由抗原结合的抗体活化CD16A信号传导后并且在添加适当检测试剂后由荧光素酶产生的生物发光信号。
具有已知作用模式的抗CD20抗体在该测定中用作阳性对照。虽然不同候选抗体显示明显不同的ADCC能力，但HFB2-4-hG1显示在CD16接合中具有最佳效能。图9A。
总之，从54种特异性抗CXCR5抗体中鉴定了6种单位数纳摩尔亲和力嵌合结合剂(即，HFB2-1-hG1、HFB2-2-hG1、HFB2-3-hG1、HFB2-4-hG1、HFB2-5-hG1、HFB2-6-hG1)。这六种强结合剂的鉴定显示了各种性质。均不与CXCR5的小鼠或猴直系同源物交叉反应。其全部是靶点特异性的，并且不识别最接近的同源物CXCR3。
HFB2-4hG1的药代动力学(PK)评价
基于如cAMP、趋化性和ADCC的三种不同功能测试，HFB2-4hG1似乎是最有前途和有效的候选物，并且选择用于PK评价。参见在小鼠中HFB2-4hG1嵌合抗体的有利PK性质(图3)。
在8-10周龄野生型(wt)C57BL/6J小鼠中进行HFB2-4-hG1的药代动力学(PK)研究。通过尾静脉以如1mg/kg和10mg/kg的两种不同浓度静脉内施用HFB2-4-hG1。在8个不同时间点(在1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h和7d时)从各小鼠收集约50μL的血浆样品。使用内部优化的标准方案通过ELISA定量各样品中的人IgG水平。结果表明HFB2-4-hG1显示出有利的PK性质(t1/2＝158hr)。
DE突变对HFB2-4hG1的ADCC活性的影响
鉴于HFB2-4hG1抗体在其他5种强hCXCR5结合剂中显示出最佳CD16接合的事实，选择在DE支架(S239D/I332E)中产生HFB2-4hG1抗体以增强ADCC活性。在包括抗CD20阳性对照抗体的ADCC报告子生物测定中对HFB2-4-hG1和HFB2-4-hG1DE抗体两者进行测试。正如所预期的，结果清楚地证实，HFB2-4诱导比对照抗CD20抗体更高程度的CD16接合，并且表明DE支架进一步增加抗体的ADCC性质(在E最大和EC50两者中)，并且活性比阳性对照抗体抗CD20更佳。图9B。
接下来，通过使用从表达靶点的健康供体外周血单核细胞(PBMC)分离的原代NK细胞(效应细胞)和Raji细胞(靶细胞)测试HFB2-4hG1DE的ADCC活性。数据表明，HFB2-4hG1DE介导原代NK细胞以0.76pM EC50值裂解Raji细胞，这比利妥昔单抗阳性对照抗体更有效。参见图9C。
此外，通过使用表达靶点的原代NK细胞(效应细胞)和原代B细胞(靶细胞)针对ADCC活性进一步测试HFB2-4hG1DE的ADCC活性；两种原代细胞群是从不同健康供体的PBMC分离的。HFB2-4hG1DE诱导原代NK细胞以0.44fM EC50值裂解外周B细胞，其也比利妥昔单抗阳性对照抗体更有效。参见图9D。还进行了类似实验以检查HFB2-4hG1DE关于裂解人原代T细胞的ADCC活性，并且发现HFB2-4hG1DE还诱导hCXCR5+CD4+原代T细胞的强NK介导的裂解。参见图9E。
进行另一项类似实验以检查非岩藻糖基化HFB2-4hG1(无DE突变)单颗粒抗体(AfuHFB2-4hG1)关于裂解人原代T细胞的ADCC活性。发现与无抗体对照(单独CD4+细胞，在存在或不存在NK细胞的情况下)相比，AfuHFB2-4hG1还在极广泛范围的抗体浓度内以剂量依赖性方式诱导hCXCR5+CD4+原代T细胞的强NK介导的裂解(参见图9F)，而利妥昔单抗(hG1)(其靶向表达CD20表面抗原的B细胞)和同种型对照抗体MGO53-hG1在广泛范围的抗体浓度内基本上没有影响。参见图9F。
HFB2-4hG1的体内抗肿瘤活性
在基于癌细胞系(Raji和Daudi细胞)获得结合数据之后，仅使用基于Raji细胞的肿瘤模型在CB17-SCID免疫缺陷小鼠中进行体内研究。简言之，在6-8周龄CB-17SCID小鼠中皮下接种Raji细胞。研究中包括四个不同组；同种型对照(MGO53-hG1)、PBS对照、阳性对照(HFB2-利妥昔单抗-hG1)和先导候选物组(HFB2-4-hG1)。处理由每三天以10mg/kg腹腔内(i.p.)施用抗体中的一者持续21天构成。每三天对各小鼠的肿瘤生长和体重进行测量。
在类似于利妥昔单抗对照的Raji异种移植模型中，施用HFB2-4hG1(10mg/kg，BIWx7，i.p.)产生有效抗肿瘤活性。参见图16。
总之，HFB2-4(hG1和hG1DE)嵌合抗hCXCR5抗体显示与表达CXCR5的细胞的强结合，有效抑制配体诱导的迁移和信号传导，在小鼠中显示有利的PK性质，在Raji异种移植小鼠模型研究中显示抗肿瘤活性，介导关于原代NK细胞针对Raji B细胞淋巴瘤细胞系与原代B细胞两者的强ADCC。基于体外和e中产生的数据，证实先导抗体系列HFB2-4(hG1和hG1DE)是最适合于人源化的候选物。
实施例2：人源化抗体的表征
基于HFB2-4-hG1，使用CDR移植，通过选择来自小鼠抗体序列的负责抗体的抗原识别的互补性决定区(CDR)并将其移植到hIgG1的人框架区(FR)中来产生人源化抗hCXCR5单克隆抗体。
总的来说，使用CDR移植产生共计25种人源化变体。与亲本嵌合抗体相比，那些变体大部分保留其物理化学活性(对靶点的亲和力、稳定性、溶解度)和/或生物活性(阻断或刺激靶点、ADCC)。
简言之，12种基于HFB2-4的人源化抗体变体(即，HFB2-4hz)种的10种显示与亲本嵌合抗体HFB2-4类似的与hCXCR5的结合。此外，12种HFB2-4hz变体种的9种阻断cAMP信号传导，这些结果与结合结构一致。此外，观察到由人源化变体引起的有效趋化性抑制，其中HFB2-4hz12是最有效的(在0.1nM下约100％)。在随后实验中，在HFB2-4Hz9和HFB2-4Hz12之间也发现类似效能。
依照用于嵌合单克隆抗体的体外表征的相同程序(参见实施例1)对人源化抗hCXCR5单克隆抗体进一步表征。除关键和2阶表征测定以外，人源化变体表征中还包括可开发性评估测试。
抗体内化的评估
通过Incucyte抗体内化和pHAb活性染料(Promega)测定对由表达相关抗原(例如，CXCR5)的细胞引起的抗体内化进行评估。
抗原介导的抗体内化在若干基于抗体的治疗剂中起重要作用。视所需作用模式而定，可能需要具有在结合细胞表面抗原优先内化至靶细胞中的抗体(如高毒性药物通过抗体药物缀合物(ADC)递送至癌细胞，以及从癌细胞表面受体(即，EGFR)去除或降解)，或者优先保持结合至细胞表面的抗体(如针对免疫细胞杀伤作用(即，ADCC或ADCP)对肿瘤细胞进行鉴定)。此外，测量和优化对抗体的功能应答(如抗体清除)是极其重要的。例如，胞饮作用是抗体的主要消除途径之一，在抗体开发期间需要针对定性药代动力学测量进行抗体优化。由于各种方法需要一系列抗体特征，例如，已实现维持在细胞表面以便鉴定肿瘤细胞或当递送ADC时快速内化，重要的是理解抗体候选物的摄入性质和清除，以便获得最佳抗体工程化改造和内化性质。
FabFluor抗体标记试剂是与pH敏感性荧光探针结合的Fc区靶向Fab片段。这些试剂使所有同种型匹配的含有Fc的测试抗体能够使用通用一步无洗涤标记方案。在pH 7.0下，Fab-Ab复合物几乎没有荧光。当将标记抗体添加至细胞中时，在Fab-Ab复合物内化并通过酸性(pH 4.5-5.5)溶酶体和内涵体加工时观察到荧光信号。内化的整个时间过程可目测观察并且使用实时活细胞分析进行自动定量。
pHAb染料使pH传感器染料，其在pH>7下具有极低的荧光，并且随着溶液的pH变为酸性，荧光显著增加。pH Ab染料具有532nm的最大激发(Ex)波长和560nm的最大发射(Em)波长。pH Ab染料经设计特定而言用于标记抗体。例如，pH Ab胺活性染料(a)具有与在抗体上的赖氨酸氨基酸上可获得的伯胺反应的琥珀酰亚胺基酯基。
从两种分析获得的结果表明，与阳性对照(CD71)抗体相比，HFB2-4hz9-hG1DE和HFB2-4hz12-hG1DE均不内化。图10A-10B。
人源化变体的ADCC活性
人源化抗体种的两者HFB2-4hz9-hG1DE和HFB2-4hz12-hG1DE显示与亲本嵌合抗体HFB2-4-hG1DE相同程度的有效ADCC活性。与预期的一致，与人源化变体相比，hG1支架中的HFB2-4和基准抗体具有更低的ADCC活性。如此前在HFB2-4hz9-hG1DE和HFB2-4hz12-hG1DE情况下所显示，两种其他人源化变体HFB2-4hz14-hG1DE和HFB2-4hz15-hG1DE的结果也显示高效接合CD16从而诱导ADCC。参见图11A和图11B。
为优化涵盖基于干燥综合征患者样品的ADCC活性的测定条件，使用从来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)分离的原代B细胞。特别地，基于流式细胞术分析针对原代B细胞上的靶抗原CXCR5表达对若干健康供体进行筛查。使用具有高原代B细胞CXCR5表达的供体对ADCC报告子生物测定的条件(如效应物靶点比率)进行优化。Jurkat细胞(Promega)用作报告效应细胞，用于测量由其由CD16介导的归因于ADCC的信号传导活化的报告荧光素酶发射的荧光信号。
结果表明，亲本嵌合抗体以及其人源化变体针对原代B细胞显示出ADCC活性。参见图13，其显示了人源化变体中的一者(HFB2-4Hz12-hG1DE)的ADCC报告子测定的结果。人源化抗体针对表达CXCR5的原代B细胞显示出ADCC效应。
人源化变体的体内抗肿瘤活性
在体内静脉内Raji异种移植模型中评估HFB2-4hz42(在小鼠IgG2a形式中)诱导抗肿瘤活性的能力。用Raji细胞接种每组8只小鼠，并将小鼠用HFB2-4hz42或小鼠IgG2a形式中的同种型或作为阳性对照的利妥昔单抗(hG1形式)处理。另外，还包括未处理的一组初始(naive)小鼠。每三天为小鼠腹腔注射10mg/kg的测试抗体持续15天。如以下结果表格中所示，与用同种型对照抗体处理的小鼠相比，施用HFB2-4hz42mIgG2使得存活显著增加。
实施例3：人源化抗体的癌症靶点的鉴定
在体内功效模型选择之前，选择8种不同癌细胞系进行筛选以证实体外靶CXCR5表达。
通过流式细胞术进行的结合评估证实HFB2-4hz12-hG1DE以类似于利妥昔单抗(用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的抗CD20单克隆抗体)的程度结合至Raji和Daudi细胞，但不大量结合至任何其他所选择的癌细胞系。参见图14。
然后，在不同效应物：靶点比率(1:1和3:1)下，基于B细胞淋巴瘤细胞系(Raji和Daudi细胞)对该人源化抗体的ADCC活性进行评估。如前所述，在ADCC报告子测定中使用Raji细胞使用已经设定的实验条件进行嵌合和人源化变体抗体的体外表征，并在ADCC报告子测定中仅测试Daudi细胞。数据表明HFB2-4hz12-hG1DE针对Daudi细胞具有大于由对照抗CD20抗体显示的ADCC活性的ADCC活性。参见图15。
实施例4：对干燥综合征患者的B细胞的ADCC活性
为了证实本发明抗体在治疗干燥综合征(SS)中的潜在功效，使用ADCC报告子测定来显示本发明所述的人源化单克隆抗体HFB2-4hz12hIgDE可高效地接合CD16，从而诱导对从获自经处理的SS患者的冷冻材料分离的B细胞的ADCC效应。参见图17。
特别地，从获自2个此前经处理的SS患者的冷冻PBMC样品分离B细胞，并用于如上文所描述的ADCC报告子测定。实验中使用各抗体的11nM-0.005nM的三倍连续稀释液。结果表明HFB2-4hz12hIgDE高效地接合CD16从而诱导ADCC。
其他数据表明，HFB2-4hz12-hG1降低SS患者的样品中记忆B细胞群的百分比。参见图18。
如此前所描述的，还基于来自SSR患者的B细胞使用ADCC报告子测定(Promega)对HFB2-4hG1DE进行测试。观察到与呈hG1形式的利妥昔单抗相比，HFB2-4hG1DE具有更高的CD16接合并且诱导强得多的ADCC读取。(图9B-9C)。
总之，迄今为止获得的结果表明人源化抗hCXCR5 IgG1抗体对人CXCR5具有nM亲和力，并且在表达hCXCR5的B细胞、干燥综合征(SS)患者的生发中心中的潜在滤泡辅助T细胞/B细胞中诱导ADCC。
实施例5：其他系列的人源化变体的产生和表征
通过将不同可变重链和可变轻链组合，基于HFB2-4hG1(HFB2-4hz-hG1)产生36种其他人源化变体。使用类似于实施例1或如实施例1中所描述的方法对这些抗体进行表征。
在两种不同浓度1nM和0.1nM下在对Raji细胞的结合测定中测试该36种人源化变体的结合性质。36种人源化变体全部对Raji细胞显示出显著的结合性质。参见图19A和图19B。
在8至10周龄野生型C57BL/6J小鼠中对排名最靠前的九种人源化变体进行药代动力学研究(各人源化变体n＝3)。以10mg/kg的浓度以单一剂量由尾部静脉内(i.v.)施用各人源化变体mAb。在如1h、24h、96h，包括时间0时的处理前剂量的四个不同时间点，从各小鼠收集50μL的血浆样品。使用内部优化的标准方案通过ELISA定量各样品中的人IgG水平。九种人源化变体全部显示出与亲本HFB2-4hG1类似的PK性质。参见图20。选择表2中所列的排名最靠前的六种人源化变体用于进一步体外和体内表征。
排名最靠前的6种HFB2-4hz-hG1变体全部显示出类似的对Raji细胞的结合性质和在报告子系统中接合CD16的ADCC活性。参见图21。
值的注意的是，在排名最靠前的6种候选物中，HFB2-4hz41hG1和HFB2-4hz45hG1显示较低的人源化水平。因此，将这两种变体排除在列表外，留下4种变体用于进一步表征。
为增强最佳的四种人源化变体的ADCC活性，以hG1DE形式产生这些变体。针对与表达靶CXCR5的贴壁细胞DX002-CHOK1的结合对呈hG1DE形式的排名最靠前的四种人源化变体进行测试。人源化变体显示出类似于HFB2-4hG1DE亲本抗体的效能。参见图22。
为研究DE形式是否影响抗体的药代动力学(PK)性质，在8至10周龄野生型C57BL/6J小鼠中在hG1和hG1DE支架中的人源化变体中进行snapshot PK研究(各人源化变体n＝1).以10mg/kg的浓度以单一剂量由尾部静脉内施用各人源化变体抗体。在如1h、24h、96h，包括时间0时的处理前剂量的四个不同时间点从各小鼠收集50μL血浆样品。使用内部优化的标准方案通过ELISA定量各样品中的人IgG水平。人源化变体显示类似于具有相同形式的亲本抗体的PK性质。
总结
总之，产生了36种人源化变体并进行了测试。保留HFB2-4hz37hG1、HFB2-4hz38hG1、HFB2-4hz39hG1和HFB2-4hz42hG1用于鉴定先导候选抗体。四种人源化变体具有与具有类似体外结合和生物性质的HFB2-4hG1-DE非常类似的性质。
然而，在PK分析中，HFB2-4hz39hG1具有较短的半衰期。关于可开发性性质，HFB2-4hz42hG1表现得略微更好。关于cIEF性质，HFB2-4hz42hG1和HFB2-4hz37hG1显示出最适宜的性质。参见表3。
因此，选择HFB2-4hz42hG1和HFB2-4hz37hG1作为先导和备用抗体并将针对体内功效研究进行进一步测试。其VH和VL链的序列显示在表4中。
/>
实施例6：非岩藻糖基化抗CXCR5抗体的产生和表征
产生用于增加与FcγRIIIa的结合并增强抗体效应功能的HFB2-4hG1和HFB2-4hz42-hG1的非岩藻糖基化形式，用于使用类似于此前所描述的测定进行检测。结果总结如下。
非岩藻糖基化HFB2-4hG1(afu-HFB2-4hG1)和HFB2-4hz42-hG1(afu-HFB2-4hz42-hG1)以亚nM亲和力结合至DX002细胞上的人CXCR5并显示出彼此类似的结合性质。参见图24A。
通过ADCC报告子测定确定的CD16接合还表明afu-HFB2-4hz42-hG1显示出类似于afu-HFB2-4hG1亲本抗体的接合CD16的效能。参见图24B。
此外，NK细胞通过由afu-HFB2-4hz42-hG1诱导的ADCC体外杀死Raji细胞(数据未显示)和从健康供体分离的B细胞(图25)类似于基准抗体。关于表达CXCR5的T滤泡辅助细胞(Tfh)的ADCC杀伤作用的初始数据还表明afu-HFB2-4hz42-hG1还可以诱导NK介导的从人中分离的CD4+CXCR5+原代T细胞的裂解(数据未显示)。
使用非岩藻糖基化抗体检查NK对来自SS患者的B细胞的杀伤作用。如图26中所示，非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1以类似于基准抗体的程度诱导B细胞裂解。
此外，针对补体依赖性细胞毒性(CDC)对非岩藻糖基化抗体进行测试。使用已知具有CDC活性的利妥昔单抗(hIgG1形式)作为阳性对照。使用血清来提供实验中补体系统的组分。利妥昔单抗在100nM下实现～70-80％的细胞裂解，但在非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1和非岩藻糖基化HFB2-4hG1中未观察到CDC活性。参见图27A-27B。
在野生型小鼠和食蟹猴中检查非岩藻糖基化抗体的药代动力学。在野生型C57BL/6J小鼠中，以10mg/kg剂量以单一剂量由尾部静脉注射非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1、HFB2-4hG1和基准抗体，并且在注射后0.5、6、24、96和168小时收集血浆以测定抗体浓度。afu-HFB2-4hz42-hG1的半衰期是114小时，PK性质类似于亲本和基准抗体。参见图28A。
在食蟹猴(1雄性，2雌性)中，静脉内输注1mg/kg的单一剂量的抗体，并且在注射后2周期间对血液中的抗体浓度进行确定。在所测试的猴中，afu-HFB2-4hz42-hG1具有3-6.5天的半衰期。参见图28B。
对非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1进行多个稳定性测试：在25℃和40℃下热处理长达30天，在3.5的低pH下经受应力长达6小时以及多达5个冻融循环。结果表明，非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1在这些测试条件下总体上是稳定的(数据未显示)。
总之，非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1针对来自健康供体与SS患者的原代B细胞类似于亲本抗体在pM浓度下显示出极大的结合和体外ADCC活性，不诱导补体依赖性细胞毒性，显示有利的药代动力学性质和高稳定性。因此，非岩藻糖基化HFB2-4hz42-hG1具有极大的在临床治疗中使用的潜力。
参考文献
本文讨论的所有参考文献均通过引用并入本文。
R,Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor5,Localize to B Cell Follicles,and Support Immunoglobulin Production,J ExpMed.2000.
Allen CD,Germinal center dark and light zone organization is mediatedby CXCR4 and CXCR5,Nat Immunol.2004.
R,A Putative Chemokine Receptor,BLR1,Directs B Cell Migrationto Defined Lymphoid Organs and Specific Anatomic Compartments of the Spleen,Cell,1996.
Reif K,Balanced responsiveness to chemoattractants from adjacentzones determines B-cell position,Nature,2002.
Aqrawi L,Diminished CXCR5 expression in peripheral blood of patientswith syndrome may relate to both genotype and salivary glandhoming.Clinic Exp Immunol,2018.
Szabo K,The Histopathology of Labial Salivary Glands in PrimarySyndrome:Focusing on Follicular Helper T Cells in the InflammatoryInfiltrates,Mediators Inflamm.2014.
Kramer JM,CXCL13 is elevated insyndrome in mice and humansand is implicated in disease pathogenesis,J Leukoc Biol,2013.
Sharma A,Early BAFF receptor blockade mitigates murinesyndrome:Concomitant targeting of CXCL13 and the BAFF receptor preventssalivary hypofunction,Clin Immunol,2016./>

Claims (38)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段对于人CXCR5是特异性的，和其中所述单克隆抗体包含：
(1)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列；其中所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含表A、表B和表D中的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列中的任一个；
任选地，所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含表A、表B和表D中的任一单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列；和/或
(2)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列；其中所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含表A、表C和表D中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列中的任一个；
任选地，所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含表A、表C和表D中的任一单克隆抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQID NO:9、10和11的氨基酸序列；
(2)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:17、18和19的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列；
(3)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:41、42和43的氨基酸序列；
(4)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列；
(5)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和65的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列；
(6)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:76、77和78的氨基酸序列；
(7)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、49和51的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:149、150和151的氨基酸序列；或者
(8)所述VH CDR1序列、所述VH CDR2序列和所述VH CDR3序列分别包含SEQ ID NO:114、115和116的氨基酸序列，和所述VL CDR1序列、所述VL CDR2序列和所述VL CDR3序列分别包含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是小鼠-人嵌合抗体，所述嵌合抗体包含人抗体(如hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4)的恒定区序列，其中所述VH序列是SEQ ID NO:8、24、40、56、65或75中的任一项或者与SEQ ID NO:8、24、40、56、65或75的氨基酸序列中的任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和/或其中所述VL序列是SEQ ID NO:16、32、48、63、68或83中的任一项或者与SEQ ID NO:16、32、48、63、68或83的氨基酸序列中的任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
4.根据权利要求3所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH序列是SEQ ID NO:8或者与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:16或者与SEQID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
(2)所述VH序列是SEQ ID NO:24或者与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:32或者与SEQID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
(3)所述VH序列是SEQ ID NO:40或者与SEQ ID NO:40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:48或者与SEQID NO:48具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
(4)所述VH序列是SEQ ID NO:56或者与SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:63或者与SEQID NO:63具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
(5)所述VH序列是SEQ ID NO:65或者与SEQ ID NO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:68或者与SEQID NO:68具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；或者
(6)所述VH序列是SEQ ID NO:75或者与SEQ ID NO:75具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，和所述VL序列是SEQ ID NO:83或者与SEQID NO:83具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化抗体，
任选地，所述人源化抗体包含：
(1)表B、表D和表E中的任一单克隆抗体的VH序列或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列；和/或表C、表D和表E中的任一单克隆抗体的VL序列或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；
(2)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:112的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；
(3)SEQ ID NO:113的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:112的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；
(4)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ ID NO:101的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列；
(5)SEQ ID NO:96的VH序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VH序列，和SEQ IDNO:109的VL序列，或与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的VL序列。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：
(1)以下的VH框架区序列VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4：
(i)其是表B和表D中的任一抗体的，
(ii)其分别包含与SEQ ID NO:84、85、86和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(iii)其分别包含与SEQ ID NO:89、90、91和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(iv)其分别包含与SEQ ID NO:93、94、95和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(v)其分别包含与SEQ ID NO:132、85、133和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(vi)其分别包含与SEQ ID NO:93、126、127和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(vii)其分别包含与SEQ ID NO:132、133、134和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(viii)其分别包含与SEQ ID NO:138、94、139和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；或者
(ix)其分别包含与SEQ ID NO:141、142、143和87基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；和/或
(2)以下的VL框架区序列VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4：
(i)其是表C和表D中的任一抗体的，
(ii)其分别包含与SEQ ID NO:97、98、99和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(iii)其分别包含与SEQ ID NO:97、102、99和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(iv)其分别包含与SEQ ID NO:103、104、105和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(v)其分别包含与SEQ ID NO:103、107、108和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(vi)其分别包含与SEQ ID NO:134、135、136和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(vii)其分别包含与SEQ ID NO:128、129、130和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(viii)其分别包含与SEQ ID NO:145、146、147和131基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；
(ix)其分别包含与SEQ ID NO:97、98、152和100基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列；或者
(x)其分别包含与SEQ ID NO:154、102、99和47基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)或相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4序列分别包含
(i)SEQ ID NO:93、94、95和87；
(ii)SEQ ID NO:132、85、133和87；
(iii)SEQ ID NO:93、126、127和87；或者
(iv)SEQ ID NO:132、133、134和87；和/或
(2)所述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4序列分别包含
(i)SEQ ID NO:134、135、136和131；或者
(ii)SEQ ID NO:128、129、130和131。
8.根据权利要求7所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中
(1)所述VH序列包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或者
(2)所述VH序列包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述VH序列包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列和所述VL序列包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含修饰的Fc区以增强ADCC。
11.根据权利要求10所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰的Fc区包含：
(1)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变以增强FcγRIIIa结合；
(2)S239D/I332E突变以增强FcγRIIIa结合；
(3)S239D/I332E/A330L突变以同时增强FcγRIIIa结合和减少FcγRIIIb结合；
(4)S298A/E333A/K334A突变以增强FcγRIIIa结合；和/或
(5)在Fc区的非岩藻糖基化N297以增强FcγRIIIa结合。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述的其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab’)3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其ADCC活性具有低(例如，1-5或1-2)pM范围EC50值。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其针对表达表面hCXCR5的原代B细胞和/或表达表面hCXCR5的原代T细胞具有ADCC活性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其不(或至多最低限度地)内化所述hCXCR5表面抗原。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制cAMP信号传导(例如，EC50小于1nM)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制趋化性(例如，在约0.1-0.5nM或约0.1nM下具有～100％抑制)。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制hCXCL13诱导的B细胞迁移。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其基本上不与hCXCR3交叉反应。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与贴壁细胞系(如DX002)和/或悬浮细胞系(如M300-19)上表达的hCXCR5结合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其不与或最低限度地与hCXCR5的食蟹猴或小鼠直系同源物交叉反应。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其降低受试者中记忆B细胞群的百分比。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其以小于约25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、2nM或1nM或更小的Kd结合hCXCR5。
24.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求1-23中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同表位。
25.一种在有此需要的受试者中治疗干燥综合征(SS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的抗体。
26.根据权利要求25所述的方法，其缓解SS的至少一种症状。
27.一种在有此需要的受试者中治疗具有异位生发中心(GC)的疾病或适应症(包括自身免疫性疾病或病症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病或适应症是类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、多发性硬化症(MS)、结节病、银屑病、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫氏病、动脉粥样硬化、结膜炎、胃炎、肝炎或皮炎。
29.一种在有此需要的受试者中治疗淋巴瘤或白血病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的抗体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述淋巴瘤或白血病是B细胞淋巴瘤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是CLL(B细胞慢性淋巴细胞性白血病)。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述淋巴瘤或白血病是非霍奇金氏淋巴瘤，如伯基特氏淋巴瘤。
33.一种在有此需要的受试者中治疗实体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的抗体，其中所述实体癌症是胃癌、乳腺癌、肠癌、肺癌或前列腺癌。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用化学治疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、免疫肿瘤剂和/或抗赘生物组合物。
35.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-24中任一项所述的重链或轻链或其抗原结合部分。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其经密码子优化以在人细胞中表达。
37.一种载体，其包含根据权利要求35或权利要求36所述的多核苷酸。
38.根据权利要求37所述的载体，其是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
CN202280030139.3A 2021-03-09 2022-03-09 抗人cxcr5抗体及其用途 Pending CN117279954A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163158462P 2021-03-09 2021-03-09
US63/158,462 2021-03-09
CNPCT/CN2021/111049 2021-08-05
PCT/CN2021/111049 WO2023010483A1 (en) 2021-08-05 2021-08-05 Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
PCT/US2022/019587 WO2022192423A1 (en) 2021-03-09 2022-03-09 Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117279954A true CN117279954A (zh) 2023-12-22

Family

ID=83228276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280030139.3A Pending CN117279954A (zh) 2021-03-09 2022-03-09 抗人cxcr5抗体及其用途

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240158517A1 (zh)
EP (1) EP4305073A1 (zh)
JP (1) JP2024509946A (zh)
KR (1) KR20230154981A (zh)
CN (1) CN117279954A (zh)
AU (1) AU2022234328A1 (zh)
BR (1) BR112023018224A2 (zh)
CA (1) CA3211179A1 (zh)
TW (1) TW202304984A (zh)
WO (1) WO2022192423A1 (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO2195023T3 (zh) * 2007-08-29 2018-08-04
KR102262720B1 (ko) * 2014-04-28 2021-06-08 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA3211179A1 (en) 2022-09-15
WO2022192423A1 (en) 2022-09-15
TW202304984A (zh) 2023-02-01
US20240158517A1 (en) 2024-05-16
BR112023018224A2 (pt) 2024-01-30
EP4305073A1 (en) 2024-01-17
JP2024509946A (ja) 2024-03-05
AU2022234328A1 (en) 2023-09-28
KR20230154981A (ko) 2023-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7450592B2 (ja) 癌治療におけるｆｇｆｒ２阻害剤単独または免疫刺激剤との組み合わせ
RU2725811C1 (ru) Антитела против 4-1bb человека и их применение
KR20210013165A (ko) GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도
CN114728065A (zh) 针对cd3和bcma的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白
KR20230093010A (ko) 신규 항-lilrb2 항체 및 유도체 생성물
WO2021139682A1 (en) Anti-galectin-9 antibody and uses thereof
TW202143993A (zh) 抗tnfr2抗體及其用途
CN114616245B (zh) 一种抗cd38的抗体及其用途
CN117980336A (zh) 抗tnfr2抗体及其用途
WO2023010483A1 (en) Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
US20240158517A1 (en) Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
WO2023143478A1 (en) Novel anti-cd4 and anti-pd-l1 bispecific antibodies
WO2024109657A1 (zh) 抗ccr8抗体及其用途
RU2777573C2 (ru) Антитела против 4-1bb человека и их применение
WO2024040216A2 (en) Anti-ccr8 antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination