CN108025018B - 用于治疗癌症的pd-1拮抗剂和cpg-c型寡核苷酸的组合产品 - Google Patents

Abstract

本公开内容描述了包含程序性死亡1受体(PD‑1)拮抗剂和Toll‑样受体9(TLR9)激动剂（其为CpG‑C型寡核苷酸）的联合治疗，和所述联合治疗用于治疗癌症的用途。

Description

用于治疗癌症的PD-1拮抗剂和CPG-C型寡核苷酸的组合产品

技术领域

本发明涉及可用于治疗癌症的联合治疗。具体地，本发明涉及包含程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂和CpG-C型寡核苷酸的联合治疗，所述CpG-C型寡核苷酸是Toll-样受体9(TLR9)激动剂。

背景技术

PD-1被视作在免疫调节以及在外周耐受性的维持中的重要分子。PD-1在原初T、B和NKT细胞上适度表达，并通过淋巴细胞、单核细胞和髓系细胞上的T/B细胞受体信号传递上调(1)。

PD-1、PD-L1 (B7-H1)和PD-L2 (B7-DC)的两种已知配体在起源于不同组织的人癌症中表达。在例如卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑素瘤等大量样品集合中，证实了PD-L1表达与不良预后和减少的总存活率（不论后续治疗）相关(2-13)。类似地，发现在肿瘤浸润性淋巴细胞上的PD-1表达会标志着乳腺癌和黑素瘤中的功能障碍性T细胞(14-15)并与肾癌中的不良预后有关(16)。因而，已经提出，表达PD-L1的肿瘤细胞会与表达PD-1的T细胞相互作用以减弱T细胞活化和免疫监视的逃避，由此导致针对肿瘤的受损的免疫应答。

几种抑制PD-1及其配体PD-L1和PD-L2中的一个或两个之间的相互作用的单克隆抗体正处于用于治疗癌症的临床开发中。已经提出，如果与其它经批准的或实验性的癌症治疗（例如，辐射、外科手术、化学治疗剂、靶向治疗、抑制在肿瘤中失调的其它信号传递途径的试剂和其它免疫增强剂）联合施用，可能增强这样的抗体的效力。

某些DNA序列(通常称作免疫刺激性序列)的施用会诱导偏向于Th1-型的免疫应答，如Th1-相关的细胞因子的分泌所指示的。免疫刺激性多核苷酸与抗原一起的施用会导致针对所施用的抗原的Th1-型免疫应答。Roman等人(1997) Nature Med. 3:849-854。例如，真皮内地注射了在盐水或佐剂明矾中的大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(β-Gal)的小鼠通过产生特异性的IgG1和IgE抗体以及分泌IL-4和IL-5、但是不分泌IFN-γ的CD4⁺ 细胞而做出应答，从而证实所述T细胞主要属于Th2子集。但是，真皮内地注射(或用tyne 皮肤划伤涂药器（tyne skin scratch applicator）)编码β-Gal并含有免疫刺激性序列的质粒DNA(在盐水中)的小鼠通过产生IgG2a抗体和分泌IFN-γ、但是不分泌IL-4和IL-5的CD4⁺细胞而做出应答，从而证实所述T细胞主要属于Th1子集。此外，注射了质粒DNA的小鼠的特异性IgE产生降低了66-75％。Raz等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145。一般而言，针对裸露DNA免疫接种的应答的特征在于抗原刺激的CD4⁺T细胞的IL-2、TNFα和IFN-γ产生，这指示Th1-型应答。这在变应性和哮喘的治疗中是特别重要的，如减少的IgE产生所表明的。已经用细菌抗原、病毒抗原和变应原证实了免疫刺激性多核苷酸的刺激Th1-型免疫应答的能力(参见，例如，WO 98/55495)。

本领域中需要改善癌症免疫治疗的效力。因此，需要探索PD-1拮抗剂和免疫刺激性寡核苷酸序列的联合治疗。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用包含PD-1拮抗剂和TLR9激动剂的联合治疗，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含PD-1拮抗剂的药物，其用于与TLR9激动剂联合用于治疗癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含TLR9激动剂的药物，其用于与PD-1拮抗剂联合用于治疗癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

其它实施方案提供了PD-1拮抗剂在药物制备中的用途，所述药物当与TLR9激动剂联合施用时用于治疗个体中的癌症，和TLR9激动剂在药物制备中的用途，所述药物当与PD-1拮抗剂联合施用时用于治疗个体中的癌症。在这样的实施方案中，所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了PD-1拮抗剂和TLR9激动剂在药物制备中的用途，所述药物用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。在某些实施方案中，所述药物包含试剂盒，且所述试剂盒也包含包装说明书，所述包装说明书包含关于与TLR9激动剂联合使用PD-1拮抗剂治疗个体中的癌症的说明。

在另一个实施方案中，上面讨论的方法、药物或试剂盒的联合治疗还包含抗-IL-10抗体。

附图简述

图1显示了可用于本发明的一种示例性抗-PD-1单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-6)。

图2显示了可用于本发明的另一种示例性抗-PD-1单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:7-12)。

图3显示了可用于本发明的一种示例性抗-PD-1单克隆抗体的重链可变区和全长重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14)。

图4显示了可用于本发明的一种示例性抗-PD-1单克隆抗体的替代轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15-17)。

图5显示了可用于本发明的一种示例性抗-PD-1单克隆抗体的替代轻链的氨基酸序列，其中图5A显示了K09A-L-11和K09A-L-16轻链的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO: 18和19)，且图5B显示了K09A-L-17轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)。

图6显示了派姆单抗（pembrolizumab）的重链和轻链的氨基酸序列(分别是SEQ IDNO: 21和22)。

图7显示了纳武单抗（nivolumab）的重链和轻链的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:23和24)。

图8显示了抗-IL-10 hum12G8的氨基酸序列，其具有SEQ ID NO: 35的轻链序列和SEQ ID NO: 34的重链序列。

图9显示了抗-IL-10 TC40.11D8的氨基酸序列，其具有SEQ ID NO: 37的轻链序列和SEQ ID NO: 36的重链序列。

图10显示了在小鼠TC-1两侧肿瘤模型中的注射肿瘤的肿瘤生长。图表A显示了各个动物的注射肿瘤的体积和每组的完全消退(CR)的数目。图表B显示了注射肿瘤的中位体积，误差棒指示68%置信区间。图表C按天对比了治疗组之间的注射肿瘤体积。图表D显示了用于对比治疗之间的注射肿瘤体积的未调节的和多次调节的P-值。未调节的p值表示基于针对右删失数据的Gehan-Breslow非参数检验统计的Peto & Peto形式的双侧p-值。从进行对比的两种治疗之间的20,000次动物随机再分配估计P-值。多次调节的p-值表示这样的p-值：其经过调节以控制对于给定的治疗对在所有时间点之间的按家族差错率。调节是通过将Westfall和Young的maxT程序应用于排列分布。

图11显示了在小鼠TC-1两侧肿瘤模型中的非注射肿瘤的肿瘤生长。图表A显示了各个动物的非注射肿瘤的体积和每组的完全消退(CR)的数目。图表B显示了非注射肿瘤的中位体积，误差棒指示68%置信区间。图表C按天对比了治疗组之间的非注射肿瘤体积。图表D显示了用于对比治疗之间的非注射肿瘤体积的未调节的和多次调节的P-值。未调节的p值表示基于针对右删失数据的Gehan-Breslow非参数检验统计的Peto & Peto形式的双侧p-值。从进行对比的两种治疗之间的20,000次动物随机再分配估计P-值。多次调节的p-值表示这样的p-值：其经过调节以控制对于给定的治疗对在所有时间点之间的按家族差错率。调节是通过将Westfall和Young的maxT程序应用于排列分布。

图12显示了用C59-08处理24小时的人PBMC (2个供体)中的IFNα2a和IL-10的诱导。

图13显示了用C59-08处理24小时以后在人肾细胞癌组织培养物中的IFNα-可诱导的基因(图表A)、细胞因子(图表B)和免疫活化标志物(图表C)的mRNA表达的诱导。

图14A显示了注射了CT-26结肠癌细胞的小鼠中的肿瘤结节大小的分布。图14B显示了每克肿瘤组织的肿瘤浸润性白细胞(TIL)的数目。使用Prism GraphPad软件使用不成对检验计算显著性。图14C显示了T细胞浸润和活化的不同标志物的基因表达水平，而图14D显示了相对于肿瘤大小的肿瘤组织中的各种I型干扰素(IFN)应答标志物的基因表达水平。

图15A显示了平均肿瘤大小，图15B显示了存活百分比，且图15C显示了治疗的和未治疗的小鼠的不同组的存活百分比，所述小鼠移植了CT-26结肠癌细胞。

图16显示了移植了CT-26结肠癌细胞的小鼠的存活百分比，所述小鼠在有或没有CD4或CD8细胞存在下接受抗-PD-1 Ab（全身性地）和C59-08（肿瘤内地），或者保持不治疗。

图17显示了在两侧移植了CT-26结肠癌细胞的小鼠的存活百分比，所述小鼠接受抗-PD-1 Ab（全身性地）和C59-08（肿瘤内地），或保持不治疗。

图18A显示了相对于对照寡核苷酸治疗的小鼠的平均肿瘤体积，接受各种治疗的、移植了CT-26结肠癌细胞的小鼠的肿瘤体积。图18 B显示了CD45+ 肿瘤浸润性白细胞之间的CD8+ T细胞百分比和每克肿瘤组织的CD8+ T细胞的总数。图18C和图18D显示了如通过细胞内染色和在CD8+ T细胞上门控的流式细胞计量术测量的，在有BFA存在下用PMA和离子霉素(分散的短线条)或用单独的BFA(稠密的短线条)刺激3小时以后，150,000个肿瘤浸润性白细胞的TNF-α和IFN-γ生产水平。对于图18C，在Y轴上标记的数字从底部至顶部分别是-10³、0、10³、10⁴、10^5，且在X轴上标记的数字从从左至右分别是-10³、0、10³、10⁴、10⁵。

图19A显示了移植了CT-26结肠癌细胞的小鼠的肿瘤生长曲线，所述小鼠接受C59-08（肿瘤内地）或对照寡核苷酸（肿瘤内地）。图19B显示了用C59-08或对照寡核苷酸治疗的小鼠的肿瘤浸润性白细胞对各种I型干扰素应答基因的表达水平。将数据表示为目标基因相对于持家基因泛素的相对阈值周期(CT)。

发明详述

缩写. 贯穿本发明的详细描述和实施例，将使用以下缩写：

BOR 最佳总应答

BID 每天2次各一剂

CBR 临床受益率

CDR 互补性决定区

CHO 中国仓鼠卵巢

CR 完全应答

DCR 疾病控制率

DFS 无疾病存活

DLT 剂量限制毒性

DOR 应答的持续时间

DSDR 持久的稳定疾病率

FFPE 福尔马林固定的、石蜡包埋的

FR 框架区

IgG 免疫球蛋白G

IHC 免疫组织化学或免疫组织化学的

irRC 免疫有关的应答标准

IV 静脉内的

MTD 最大耐受剂量

NCBI 美国国家生物技术信息中心

NCI 美国国立癌症研究所

ORR 目标应答率

OS 总存活

PD 进行性疾病

PD-1 程序性死亡1

PD-L1 程序性细胞死亡1配体1

PD-L2 程序性细胞死亡1配体2

PFS 无进展存活

PR 部分应答

Q2W 每2周一剂

Q3W 每3周一剂

QD 每天一剂

RECIST 在实体瘤中的应答评价标准

SD 稳定疾病

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区。

I. 定义

为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文件别处特别地定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文（包括所附权利要求书）中使用的，词语的单数形式诸如“一个/种”和“所述”包括它们的相应复数形式，除非上下文另外清楚地指明。

当应用于动物、人、实验主体、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”表示外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、主体、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞发生接触。术语”主体”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，且最优选人。

本文中使用的术语“抗体”表示表现出期望的生物活性或结合活性的抗体的任意形式。因而，它以最宽的含义使用，并具体地涵盖，但不限于，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化的单结构域抗体。“亲本抗体”是为了预期用途修饰抗体（诸如用于用作人治疗剂的抗体的人源化）之前将免疫系统暴露于抗原而得到的抗体。

一般而言，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每个对具有一个“轻”链(约25 kDa)和一个“重”链(约50-70 kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，将人轻链分类为κ和λ轻链。此外，通常将人重链分类为 μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区域连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区域。通常参见Fundamental Immunology第7章(Paul, W., 编, 第2版Raven Press, N.Y. (1989)。

每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因而，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能的或双特异性的抗体中以外，所述两个结合位点一般而言是相同的。

通常，重链和轻链的可变结构域包含位于相对保守的框架区(FR)内的三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)。所述CDR经常通过框架区对齐，从而能够结合至特定表位。一般而言，从N-端至C-端，轻链和重链可变结构域都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸向每个结构域的分配通常是根据以下定义：Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, 等人.; National Institutes of Health,Bethesda, Md.；第5版；NIH公开号91-3242 (1991)；Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, 等人, (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, 等人, (1987)J Mol. Biol. 196:901-917或Chothia, 等人, (1989) Nature 342:878-883。

如本文中使用的，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”表示抗体的抗原结合片段，即保留特异性地结合被全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区域的片段。抗体结合片段的例子包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；直链抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体（nanobodies）和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。

“特异性地结合”特定靶蛋白的抗体是这样的抗体：与其它蛋白相比，其表现出优先结合该靶标，但是该特异性不需要绝对结合特异性。如果抗体结合会确定靶蛋白在样品中的存在，例如，不产生不希望的结果诸如假阳性，那么该抗体被认为对其预定靶标是“特异性的”。可用于本发明的抗体或其结合片段将以比与非靶蛋白的亲和力大至少2倍、优选地大至少10倍、更优选地大至少20倍和最优选地大至少100倍的亲和力结合靶蛋白。如本文中使用的，在以下情况下，就说抗体特异性地结合包含给定氨基酸序列（例如成熟的人PD-1或人PD-L1分子的氨基酸序列）的多肽：所述抗体结合包含该序列的多肽，但是不结合缺乏该序列的蛋白。

“嵌合抗体”表示这样的抗体：其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种(例如，人)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种(例如，小鼠)或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这样抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可。

“人抗体”表示仅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生的话，人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”表示分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。

“人源化抗体”表示含有来自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc) (通常为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。当必要时，将前缀“hum”、“hu”或“h”添加至抗体克隆名称，以将人源化抗体与亲本啮齿动物抗体区分看。啮齿动物抗体的人源化形式通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，尽管为了增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性或为了其它原因可以包括某些氨基酸置换。

当提及用治疗方案（诸如本文描述的联合治疗）治疗的癌症患者时，“抗肿瘤应答”是指至少一种积极的治疗效果，例如，减少的癌细胞数目、减小的肿瘤大小、减小的癌细胞浸润进周围器官中的速率、减小的肿瘤转移或肿瘤生长速率或无进展存活。可以以许多方式测量癌症中的积极治疗效果(参见，W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S-10S (2009)；Eisenhauer等人, 出处同上)。在某些实施方案中，使用RECIST 1.1标准、二维irRC或单维irRC，评估对本文描述的联合治疗的抗肿瘤应答。在某些实施方案中，抗肿瘤应答是SD、PR、CR、PFS或DFS中的任一种。

“二维irRC”表示在Wolchok JD, 等人. Guidelines for the evaluation ofimmune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria.Clin Cancer Res. 2009;15(23):7412-7420中描述的标准集合。这些标准利用靶病灶的二维肿瘤测量结果，它们通过将每个病灶的最长直径乘以最长垂直直径(cm²)而得到。

“生物治疗剂”是指一种生物分子，诸如抗体或融合蛋白，其阻断任何生物学通路中的配体/受体信号传递，这样的信号传递支持肿瘤维持和/或生长或抑制抗肿瘤免疫应答。生物治疗剂的类别包括、但不限于针对VEGF、EGFR、Her2/neu、其它生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体。

术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”表示或描述哺乳动物中通常以失调的细胞生长为特征的生理情况。癌症的例子包括、但不限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌肉瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管原癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠：食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠多肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)结肠直肠；泌尿生殖道：肾(腺癌、威尔曼瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：头盖骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、许旺细胞瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌、粘液囊腺癌、未分类的癌]、粒膜膜细胞肿瘤、塞尔托利-莱迪希细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎型横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)、乳房；血液学：血液(髓样白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、胎块发育异常痣（moles dysplastic nevi）、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、银屑病；和肾上腺：神经母细胞瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是癌、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。这样的癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。癌症的另一个特定例子包括肾细胞癌。癌症的另一个特定例子是非霍奇金淋巴瘤或皮肤的T-细胞淋巴瘤。癌症的另一个特定例子是急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征。根据本发明可以治疗的癌症包括以在测试的组织样品中PD-L1和PD-L2中的一种或两种的升高表达为特征的那些。

“CpG-C ON”或“CpG-C型寡核苷酸”是12-100个碱基长度的寡核苷酸，其具有一个或多个5’-TCG三核苷酸，其中5’-T距离所述寡核苷酸的5’-末端0、1、2或3个碱基，且至少一个至少8个碱基长度的回文序列包含一个或多个未甲基化的CG二核苷酸。所述一个或多个5’-TCG三核苷酸序列可以与所述回文序列的5’-末端被0、1或2个碱基隔开，或所述回文序列可以含有所述一个或多个5’-TCG三核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是寡脱氧核苷酸(ODN)。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是2’-寡脱氧核苷酸。CpG-C ODN具有刺激B细胞、诱导浆细胞样树突细胞(PDC)成熟和造成高水平的I型干扰素(例如，IFN-α、IFN-γ等)的分泌的能力。在某些实施方案中，所述CpG-C ODN是12-100个碱基长度，优选地12-50个碱基长度，优选地12-40个碱基长度，或优选地12-30个碱基长度。在某些实施方案中，所述ODN是至少(下限) 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、50、60、70、80或90个碱基长度。在某些实施方案中，所述ODN是至多(上限) 100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个碱基长度。在某些实施方案中，所述至少一个回文序列是8-97个碱基长度，优选地8-50个碱基长度，或优选地8-32个碱基长度。在某些实施方案中，所述至少一个回文序列是至少(下限) 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个碱基长度。在某些实施方案中，所述至少一个回文序列是至多(上限) 50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12或10个碱基长度。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是寡脱氧核苷酸。在一个实施方案中，所述CpG-C ODN的核苷酸间键中的一个或多个是经修饰的键。在一个实施方案中，CpG-C ODN的核苷酸间键中的一个或多个是硫代磷酸酯(PS)键。在一个实施方案中，CpG-C ODN的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯(PS)键。硫代磷酸酯主链表示CpG-C ODN的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯(PS)键。

本文中讨论的CpG-C型ODN和SEQ ID NO: 38-51是呈它们的药学上可接受的盐形式，除非另外指出。示例性的碱盐包括：铵盐，碱金属盐，例如钠、锂和钾盐，碱土金属盐，例如钙和镁盐，锌盐，与有机碱(例如，有机胺)诸如N-Me-D-还原葡糖胺、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、胆碱、氨丁三醇、二环己胺、叔丁基胺形成的盐，和与氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。在一个实施方案中，所述CpG-C型ODN是呈铵、钠、锂或钾盐形式。在一个优选的实施方案中，所述CpG-C型ODN是呈钠盐形式。可以将CpG-C ODN提供在包含药学上可接受的赋形剂的药物溶液中。可替换地，可以将CpG-C ODN提供为冻干的固体，随后在施用之前将其在无菌水、盐水或药学上可接受的缓冲液中重构。

本发明的药学上可接受的赋形剂包括例如，溶剂、填充剂、缓冲剂、张度调节剂和防腐剂(参见，例如，Pramanick等人, Pharma Times, 45:65-77, 2013)。在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含作为溶剂、填充剂、缓冲剂和张度调节剂中的一种或多种起作用的赋形剂(例如，盐水中的氯化钠可以充当水性媒介物和张度调节剂)。本发明的药物组合物适合用于胃肠外施用。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含水性媒介物作为溶剂。合适的媒介物包括例如无菌水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和林格氏溶液。在某些实施方案中，所述组合物是等渗的。

所述药物组合物可以包含填充剂。当所述药物组合物要在施用之前冻干时，填充剂是特别有用的。在某些实施方案中，所述填充剂是在冷冻或喷雾干燥过程中和/或在贮存过程中辅助稳定活性剂和阻止活性剂降解的保护剂。合适的填充剂是糖(单糖、二糖和多糖)诸如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖和棉子糖。

所述药物组合物可以包含缓冲剂。缓冲剂在加工、贮存和任选的重构过程中控制pH以抑制活性剂的降解。合适的缓冲剂包括例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐在内的盐。其它合适的缓冲剂包括例如氨基酸诸如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。所述缓冲剂还可以包含盐酸或氢氧化钠。在某些实施方案中，所述缓冲剂将所述组合物的pH维持在4-9的范围内。在某些实施方案中，所述pH是大于(下限) 4、5、6、7或8。在某些实施方案中，所述pH是小于(上限) 9、8、7、6或5。也就是说，所述pH是在约4-9的范围内，其中下限小于上限。

所述药物组合物可以包含张度调节剂。合适的张度调节剂包括例如右旋糖、甘油、氯化钠、甘油和甘露醇。

所述药物组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物剂。但是，在优选的实施方案中，所述药物组合物在无菌条件下制备且是在一次性使用容器中，且因而不需要包含防腐剂。

术语“回文序列”或“回文对称”表示反向重复的核酸序列，例如，ABCDD’C’B’A’，其中碱基（例如，A和A’、B和B’、C和C’、D和D’）能够形成沃森-克里克碱基对。这样的序列可以是单链的，或可以形成双链结构，或可以在某些条件下形成发夹环结构。例如，本文中使用的“8碱基回文对称”表示这样的核酸序列：其中回文序列是8个碱基长度，诸如ABCDD’C’B’A’。回文序列可以是也含有非回文序列的寡核苷酸的部分。寡核苷酸可以含有一个或多个回文序列部分和一个或多个非回文序列部分。可替换地，寡核苷酸序列可以是完全回文的。在具有超过一个回文序列部分的寡核苷酸中，所述回文序列部分可以与或不与彼此重叠。

在一个实施方案中，本发明的CpG-C ODN包含：(a) 5’-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z,N_v (SEQ ID NO:38)，其中N是核苷，x = 0、1、2或3，y = 1、2、3或4，w = 0、1或2，p= 0或1，q = 0、1或2，v= 0-89且z = 1-20，X₁和X₁’是自互补的核苷，X₂和X₂’是自互补的核苷，且其中(TCG(N_q))_y序列的5’-T距离所述寡核苷酸的5’末端0-3个碱基；和(b)至少8个碱基长度的回文序列，其中所述回文序列包含(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z (SEQ ID NO: 56)序列的第一(X₁X₂CGX₂’X₁’) (SEQ ID NO:55)，其中所述ODN是12-100个碱基长度。在某些实施方案中，x = 0，y = 1，w = 0，p= 0或1，q = 0、1或2，v=0-20且z = 1、2、3或4。在某些实施方案中，X₁和X₂各自是A或T。在某些实施方案中，所述回文序列具有超过1/3的A和T的碱基组成。在某些实施方案中，所述CpG-C ODN包含选自SEQ ID NO:38-51的序列。

在某些实施方案中，本发明的CpG-C ODN由TCGN_q(X₁X₂CGX₂'X₁'CG)_zN_v (SEQ IDNO:39)组成，其中N是核苷，q = 0、1、2、3、4或5，v=0-20，z= 1-4，X₁和X₁’是自互补的核苷，X₂和X₂’是自互补的核苷，且其中所述ODN是至少12个碱基长度。在某些实施方案中，所述CpG-C ODN由选自SEQ ID NO:38-51的序列组成。

在某些实施方案中，本发明的CpG-C ODN由5’-TCGN_qTTCGAACGTTCGAACGTTN_s-3’(SEQ ID NO:40)组成，其中N是核苷，q = 0、1、2、3、4或5，s = 0-20，且其中所述ODN是至少12个碱基长度。在一个实施方案中，s = 0、1、2、3、4或5。在某些实施方案中，所述CpG-C ODN由选自以下的序列组成：5’-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3’(SEQ ID NO: 42) q = 0且s= 4, 5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTT-3’(SEQ ID NO: 43) q = 4且s = 0, 5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO: 45) q = 4且s = 5, 5’-TCGTAACGTTCGAACGTTCGAACGTTA-3’(SEQ ID NO: 46) q = 5且s = 1, 和5’-TCGTAACGTTCGAACGTTCGAACGTT-3’(SEQ ID NO: 47) q = 5且s = 0。

在一个实施方案中，所述TLR9激动剂是由序列5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)组成的CpG-C ODN。在另一个实施方案中，所述CpG-C ODN是5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)的钠盐。在另一个实施方案中，所述CpG-C型寡核苷酸具有由5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3'(SEQ ID NO:42)组成的序列。在另一个实施方案中，所述CpG-C型寡核苷酸是5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (SEQ ID NO:42)的钠盐。

在另一个实施方案中，所述TLR9激动剂CpG-C型寡核苷酸选自：

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表1 CpG-C型寡核苷酸的基序和序列

应当理解，就本文描述的式或序列基序而言，独立地选择任何和所有参数。例如，如果x=0-2，y可以独立地选择，不论x的值(或式中的任意其它可选择的参数)，只要满足总寡核苷酸长度限制即可。

具有本发明的基序所包括的序列的另外CpG-C寡核苷酸适合用于用在本文中公开的方法和药物中。具有本发明的基序所包括的序列的多个另外CpG-C寡核苷酸描述在Dynavax Technologies Corporation的美国专利号7,745,606、8,158,768和8,871,732中。这些序列特此通过引用并入。

在本领域中已经描述了CpG寡核苷酸，且使用标准测定可以容易地确定它们的活性，所述测定测量免疫应答的不同方面(例如，细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞活化、B细胞增殖、T细胞增殖等)。示例性的方法描述在以下文献中：WO 97/28259; WO 98/16247; WO99/11275, WO 98/55495和WO 00/61151, 以及Dynavax Technologies Corporation的美国专利号7,745,606、8,158,768和8,871,732。因此，这些和其它方法可以用于检测和量化CpG寡核苷酸的免疫调节活性。

CpG-C寡核苷酸可以含有修饰。合适的修饰包括、但不限于：3’OH或5’OH基团的修饰，核苷酸碱基的修饰，糖组分的修饰，和磷酸酯基团的修饰。可以在回文序列中包括经修饰的碱基，只要所述经修饰的碱基通过沃森-克里克碱基配对维持对它的天然互补物的相同特异性(例如，CpG-C寡核苷酸的回文部分保持自互补)。

CpG-C寡核苷酸可以是直链的，可以是环状的，或包括环状部分和/或发夹环。CpG-C寡核苷酸可以是单链的或双链的。CpG-C寡核苷酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。

CpG-C寡核苷酸可以含有天然存在的或经修饰的非天然存在的碱基，且可以含有经修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例如，除了磷酸二酯键以外，磷酸酯修饰包括、但不限于：膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，且可以以任意组合使用。在某些实施方案中，CpG-C寡核苷酸具有仅硫代磷酸酯键、仅磷酸二酯键、或磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。

也可以做出本领域中已知的糖修饰，诸如2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体和本文描述的其它，并与任意磷酸酯修饰组合。碱基修饰的例子包括、但不限于：吸电子部分向CpG-C寡核苷酸的胞嘧啶(例如，5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)的C-5和/或C-6和CpG-C寡核苷酸的尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶)的C-5和/或C-6的添加。如上面所指出的，碱基修饰在CpG-C寡核苷酸的回文序列中的应用不应当干扰在沃森-克里克碱基配对中涉及的碱基的自身互补性。但是，在回文序列之外，可以没有该限制地使用经修饰的碱基。例如，可以在回文序列之外使用2’-O-甲基-尿苷和2’-O-甲基-胞苷，然而，可以在回文序列内部和外部使用5-溴-2’-脱氧胞苷。可以在回文序列内部和外部采用的其它经修饰的核苷酸包括7-脱氮-8-氮杂-dG、2-氨基-dA和2-硫-dT。

大多数寡核苷酸的双链体(即，双链)和发夹形式是处于动态平衡中，其中低寡核苷酸浓度和较高温度通常有利于发夹形成。共价链间或链内交联会增加双链体或发夹分别对热-、离子-、pH-和浓度诱导的构象变化的稳定性。可以使用化学交联将多核苷酸锁定在双链体或发夹形式用于物理化学和生物表征。在构象上同质且“锁定”在它们的最高活性形式(双链体或发夹形式)的交联寡核苷酸可能比它们的未交联的相应物更有活性。因此，本发明的一些CpG-C寡核苷酸含有共价链间和/或链内交联。

化学交联双链体DNA的多种方式是本领域已知的。可以使用任何交联方法，只要交联的多核苷酸产物具有期望的免疫调节活性。例如，一种方法导致在双链体或发夹的末端处的两个相对胸苷之间的二硫键。对于该交联方法，用5’-DMT-N3-(tBu-SS-乙基)胸苷-3’-氨基亚磷酸酯(“T*”)合成目标寡核苷酸。为了形成二硫键，将混合的二硫键还原，将寡核苷酸纯化，使链杂交，并将化合物空气氧化以形成链内交联（在发夹形式的情况下）或链间交联（在双链体形式的情况下）。可替换地，可以将寡核苷酸首先杂交，并然后还原、纯化和空气氧化。在本领域中描述了这样的方法和其它方法(参见，例如，Glick等人, J Org Chem,56:6746-6747, 1991, Glick等人, J Am Chem Soc, 114:5447-5448, 1992, Goodwin等人, Tetrahedron Letters 35:1647-1650, 1994, Wang等人, J Am Chem Soc, 117:2981-2991, 1995, Osborne等人, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6:2339-2342, 1996和Osborne等人, J Am Chem Soc, 118:11993-12003, 1996)。

另一种交联方法形成双链体或发夹结构中的偏离残基(offset residues)之间的二硫键。对于该交联方法，用可转化的核苷(可商购得自例如Glen Research)合成目标寡核苷酸。该方法利用，例如，A-A二硫键或C-A二硫键，并且通过其它碱基的连接也是可能的。为了形成二硫键修饰的多核苷酸，使含有可转化的核苷的多核苷酸与胱胺(或其它含有二硫键的胺)反应。为了形成二硫键，将混合的二硫键还原，将寡核苷酸纯化，使链杂交，并将化合物空气氧化以形成链内交联（在发夹形式的情况下）或链间交联（在双链体形式的情况下）。可替换地，可以将寡核苷酸首先杂交，并然后还原、纯化和空气氧化。在本领域中描述了这样的方法(参见，例如，Ferentz等人, J Am Chem Soc, 113:4000-4002, 1991,和Ferentz等人, J Am Chem Soc, 115:9006-9014, 1993)。

用于制备多核苷酸和修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。通常如下合成含有磷酸二酯键的天然存在的DNA或RNA：将适当的核苷氨基亚磷酸酯依次偶联至在3′-端连接至固体支持物上的、生长中的寡核苷酸的5′-羟基，然后将中间体亚磷酸三酯氧化为磷酸三酯。一旦已经合成期望的多核苷酸序列，就从所述支持物除下多核苷酸，将磷酸三酯基团去保护成磷酸二酯，并将核苷碱基用氨水或其它碱去保护(参见，例如，Beaucage“Oligodeoxyribonucleotide Synthesis”，见Protocols for Oligonucleotides andAnalogs, Synthesis and Properties (Agrawal, 编) Humana Press, Totowa, NJ,1993; Warner等人, DNA 3:401, 1984和美国专利号4,458,066)。

CpG-C寡核苷酸可以含有磷酸酯修饰的寡核苷酸，已知其中一些会稳定所述寡核苷酸。因此，一些实施方案包括稳定化的CpG-C寡核苷酸。含有经修饰的磷酸酯键或非-磷酸键的寡核苷酸的合成也是本领域已知的(参见，例如，Matteucci“OligonucleotideAnalogs: an Overview”，见Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J.Chadwick和G. Cardew, 编) John Wiley and Sons, New York, NY, 1997)。可与寡核苷酸中的糖或糖类似物部分连接的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。已经充分描述了上面指出的磷酸酯类似物的制备和它们在核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中的掺入本身(参见，例如，Peyrottes等人, Nucleic Acids Res, 24:1841-1848, 1996; Chaturvedi等人, Nucleic Acids Res, 24:2318-2323, 1996；和Schultz等人, Nucleic Acids Res,24:2966-2973, 1996)。例如，除了氧化步骤用硫化步骤替换以外，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成类似于上面关于天然存在的寡核苷酸描述的合成(Zon“OligonucleosidePhosphorothioates”，见Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesisand Properties (Agrawal, 编) Humana Press, 第165-190页, 1993)。

CpG-C寡核苷酸可以包含一个或多个核糖核苷酸(含有核糖作为唯一或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(含有脱氧核糖作为主要的糖组分)、经修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖外，糖部分还可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖类似物环戊基。所述糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。在CpG-C寡核苷酸中，所述糖部分优选地是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-0-烷基核糖的呋喃糖苷，且所述糖可以连接至处于端基异构构型的各种杂环碱基。糖修饰包括、但不限于：2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，在CpG-C寡核苷酸中的糖修饰包括、但不限于2’-O-甲基-尿苷和2’-O-甲基-胞苷。这些糖或糖类似物以及各各种核苷(其中这样的糖或类似物连接至杂环碱基(核酸碱基))的制备本身是公知的，因此无需在此描述。在CpG-C寡核苷酸的制备中也可以做出糖修饰并与任何磷酸酯修饰组合。

掺入CpG-C寡核苷酸中的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，如上所述)，以及所述主要碱基的天然存在的和合成的修饰。因而，CpG-C寡核苷酸可以包括肌苷、2’-脱氧尿苷和2-氨基-2’-脱氧腺苷中的一个或多个。

“CBR”或“临床受益率”是指CR + PR + 持久的SD。

本文中使用的“CDR”或“CDR”是指，除非另外指出，使用Kabat编号系统定义的免疫球蛋白可变区中的互补性决定区。

“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的种类包括、但不限于：烷化剂、抗代谢药、激酶抑制剂、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性的/抗肿瘤的抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)、抗-黄体酮、雌激素受体下调剂(ERD)、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗雄激素类、芳香酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、和抑制在异常细胞增殖或肿瘤生长中涉及的基因的表达的反义寡核苷酸。可用于本发明的治疗方法的化学治疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。

本文中使用的“Chothia”是指在Al-Lazikani等人,JMB 273:927-948 (1997)中描述的抗体编号系统。

“包含”或变体诸如“包括”、“含有”在本说明书和权利要求中以包含性含义使用，即，指示所述特征的存在，但是不排除可能实质上增强本发明的任何实施方案的运行或效用的其它特征的存在或添加，除非由于表达语言或必要的暗示上下文另外要求。

“保守修饰变体”或“保守置换”表示用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚度等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得所述变化可以经常做出，而不改变蛋白的生物活性或其它期望的特性，诸如抗原亲和力和/或特异性。本领域技术人员公知，一般而言，在多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换不会实质上改变生物活性(参见，例如，Watson等人(1987) Molecular Biology of the Gene, TheBenjamin/Cummings Pub. Co., 第224页(第4版))。另外，在结构上或在功能上类似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守置换阐述在下面表2中。

表2. 示例性的保守氨基酸置换

原始残基	保守置换
		Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys; His
		Asn (N)	Gln; His
Asp (D)	Glu; Asn
		Cys (C)	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn
		Glu (E)	Asp; Gln
Gly (G)	Ala
		His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
		Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; His
		Met (M)	Leu; Ile; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
		Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
		Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
		Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

如贯穿说明书和权利要求书所用的，“基本上由……组成”和变体诸如“基本上由……组成”指示包括任何列举的要素或要素集合，并任选地包括具有与列举的要素类似或不同的性质的其它要素，所述其它要素不会实质上改变指定的剂量方案、方法或组合物的基本或新的特性。作为一个非限制性例子，基本上由列举的氨基酸序列组成的PD-1拮抗剂还可以包括不会实质上影响结合化合物的特性的一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的置换。

“DCR”或“疾病控制率”是指CR + PR + SD。

“诊断性抗-PD-L单克隆抗体”是指特异性地结合在某些哺乳动物细胞的表面上表达的指定PD-L (PD-L1或PDL2)的成熟形式的mAb。成熟的PD-L缺乏分泌前前导序列，也被称作前导肽。术语“PD-L”和“成熟的PD-L”在本文中可互换地使用，且应当被理解为是指相同的分子，除非另外指出或从上下文容易明白。

本文中使用的诊断性抗-人PD-L1 mAb或抗-hPD-L1 mAb表示特异性地结合成熟的人PD-L1的单克隆抗体。成熟的人PD-L1分子由下述序列的氨基酸19-290组成：

。

可用作诊断性mAb用于免疫组织化学(IHC)检测在福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织切片中的PD-L1表达的诊断性抗-人PD-L1 mAb的具体例子是抗体20C3和抗体22C3，其描述于2013年12月18日提交并在2014年6月26日公开为WO2014/100079的共同未决的国际专利申请PCT/US13/075932中。已经报道可用于IHC检测FFPE组织切片中的PD-L1表达(Chen, B.J. 等人, Clin Cancer Res 19: 3462-3473 (2013))的另一种抗-人PD-L1mAb是可从Sino Biological, Inc. (Beijing, P.R. China；目录号10084-R015)公开获得的兔抗-人PD-L1 mAb。

“抗-IL-10抗体”是指结合IL-10以抑制IL-10的活性的拮抗剂抗体。IL-10的替代名称或同义词包括：白介素-10、细胞因子合成抑制剂因子或CSIF。人IL-10氨基酸序列可以参见美国专利6217857。成熟的人IL-10蛋白的氨基酸序列是

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在本发明的治疗方法、药物和用途中的任一种中有用的抗-IL-10抗体包括特异性地结合IL-10、且优选地特异性地结合人IL-10的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。所述mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，且可以包括人恒定区。在某些实施方案中，所述人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，且在优选的实施方案中，所述人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’-SH、F(ab’)₂、scFv和Fv片段。

在本发明的治疗方法、药物和用途的某些优选实施方案中，所述抗-IL-10抗体是包含以下区域的单克隆抗体或其抗原结合片段：(a)抗-IL-10 hum12G8的SEQ ID NO: 26、27和28的轻链CDR和SEQ ID NO: 29、30和31的重链CDR。

在本发明的治疗方法、药物和用途的其它优选实施方案中，所述抗-IL-10抗体是特异性地结合人IL-10且包含以下区域的单克隆抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQ IDNO:32或其变体的重链可变区，和(b)包含选自SEQ ID NO:33或其变体的氨基酸序列的轻链可变区。除了具有在框架区中(即，在CDR外面)的至多17个保守氨基酸置换且优选地具有在框架区中的小于10、9、8、7、6或5个保守氨基酸置换以外，重链可变区序列的变体与参照序列相同。除了具有在框架区中(即，在CDR外面)的至多5个保守氨基酸置换且优选地具有在框架区中的小于4、3或2个保守氨基酸置换以外，轻链可变区序列的变体与参照序列相同。

下面表3提供了用于用在本发明的治疗方法、药物和用途中的示例性抗-IL-10mAb的氨基酸序列的列表，且将所述序列显示在图8-9中。

本文中使用的“抗-IL-10 hum 12G8变体”是指这样的单克隆抗体：除了具有在位于轻链CDR外面的位置处的3、2或1个保守氨基酸置换和在位于重链CDR外面的位置处的6、5、4、3、2或1个保守氨基酸置换以外，所述单克隆抗体包含与抗-IL-10 hum 12G8中的那些相同的重链和轻链序列，例如，所述变体位置是位于FR区域或恒定区中。换而言之，抗-IL-10 hum 12G8和抗-IL-10 hum 12G8变体包含相同的CDR序列，但是由于具有分别在它们的全长轻链和重链序列中的不超过3个或6个其它位置处的保守氨基酸置换而彼此不同。抗-IL-10 hum 12G8变体就以下性质而言与抗-IL-10 hum 12G8基本上相同：对IL-10的结合亲和力和体内中和效应。

“DSDR”或“持久的稳定疾病率”是指≥23周的SD。

本文中使用的“框架区”或“FR”是指不包括CDR区域的免疫球蛋白可变区。

本文中使用的“Kabat”是指由Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md.)倡导的免疫球蛋白比对和编号系统。

本文中使用的“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”表示基本上均一的抗体的群体，即，除了可能以小量存在的可能的天然存在的突变外，构成所述群体的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括许多在它们的可变结构域（特别是它们的CDR）中具有不同氨基酸序列的不同抗体，它们经常对不同表位是特异性的。修饰词“单克隆的”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人(1975)Nature 256: 495首次描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。也使用在例如Clackson等人(1991) Nature 352: 624-628和Marks等人(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。也参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731。

当提及对使用本文描述的联合治疗的治疗的特异性抗肿瘤应答时，“非应答者患者”是指，所述患者没有表现出抗肿瘤应答。

“ORR”或“目标应答率”在某些实施方案中表示CR + PR，且ORR_(第24周)表示用CpG-C型寡核苷酸与派姆单抗的组合治疗24周以后使用irRECIST在组群中的每位患者中测得的CR和PR。

“患者”或”主体”表示需要治疗或正在参与临床试验、流行病学研究或用作对照的任何单个主体，包括人类和哺乳动物兽医学患者诸如牛、马、狗和猫。

“PD-1拮抗剂”是指阻断在癌细胞上表达的PD-L1与在免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1的结合并且还优选地阻断在癌细胞上表达的PD-L2与免疫-细胞表达的PD-1的结合的任何化学化合物或生物学分子。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：对于PD-1，PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；对于PD-L1，PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；和对于PD-L2，PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在其中正在治疗人个体的本发明的治疗方法、药物和用途中的任一个中，PD-1拮抗剂阻断人PD-L1与人PD-1的结合，且优选地阻断人PD-L1和PD-L2与人PD-1的结合。可以在NCBI基因座编号NP_005009中发现人PD-1氨基酸序列。可以分别在NCBI基因座编号NP_054862和NP_079515中发现人PD-L1和PD-L2氨基酸序列。

可用于本发明的治疗方法、药物和用途中的任一个的PD-1拮抗剂包括特异性地结合PD-1或PD-L1、且优选地特异性地结合人PD-1或人PD-L1的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。所述mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，且可以包括人恒定区。在某些实施方案中，所述人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，且在优选的实施方案中，所述人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’-SH、F(ab’)₂、scFv和Fv片段。

结合人PD-1并且可用于本发明的治疗方法、药物和用途的mAb的例子描述在US7488802、US7521051、US8008449、US8354509、US8168757、WO2004/004771、WO2004/072286、WO2004/056875和US2011/0271358中。在本发明的治疗方法、药物和用途中可用作PD-1拮抗剂的具体抗-人PD-1 mAb包括：派姆单抗(也被称作MK-3475)、人源化的IgG4 mAb（其具有在WHO Drug Information, 第27卷, 第2期, 第161-162页(2013)中描述的结构，且其包含图6所示的重链和轻链氨基酸序列）、纳武单抗(BMS-936558)、人IgG4 mAb（其具有在WHO Drug Information, 第27卷, 第1期, 第68-69页(2013)中描述的结构，且其包含图7所示的重链和轻链氨基酸序列）、人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17（它们描述在WO2008/156712和AMP-514中，它们正在由MedImmune开发）。

结合人PD-L1且可用于本发明的治疗方法、药物和用途中的mAb的例子描述在WO2013/019906、W02010/077634 A1和US8383796中。可用作本发明的治疗方法、药物和用途中的PD-1拮抗剂的具体抗-人PD-L1 mAb包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C和分别包含WO2013/019906的SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 21的重链和轻链可变区的抗体。

可用在本发明的治疗方法、药物和用途中的其它PD-1拮抗剂包括特异性地结合PD-1或PD-L1、且优选地特异性地结合人PD-1或人PD-L1的免疫粘附素，例如，含有与恒定区（诸如免疫球蛋白分子的Fc区）融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的融合蛋白。特异性地结合PD-1的免疫粘附分子的例子描述在WO2010/027827和WO2011/066342中。可用作本发明的治疗方法、药物和用途中的PD-1拮抗剂的具体融合蛋白包括AMP-224 (也被称作B7-DCIg)，其为PD-L2-FC融合蛋白且结合人PD-1。

在本发明的治疗方法、药物和用途的某些优选实施方案中，所述PD-1拮抗剂是包含以下序列的单克隆抗体或其抗原结合片段：(a)轻链CDR SEQ ID NO: 1、2和3和重链CDRSEQ ID NO: 4、5和6；或(b)轻链CDR SEQ ID NO: 7、8和9和重链CDR SEQ ID NO: 10、11和12。

在本发明的治疗方法、药物和用途的其它优选实施方案中，所述PD-1拮抗剂是特异性地结合人PD-1且包含以下区域的单克隆抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQ ID NO:13或其变体的重链可变区，和(b)包含选自SEQ ID NO: 15或其变体；SEQ ID NO: 16或其变体；和SEQ ID NO: 17或其变体的氨基酸序列的轻链可变区。除了具有在框架区中(即，在CDR的外面)的至多17个保守氨基酸置换且优选地具有在框架区中的小于10、9、8、7、6或5个保守氨基酸置换以外，重链可变区序列的变体与参照序列相同。除了具有在框架区中(即，在CDR的外面)的至多5个保守氨基酸置换且优选地具有在框架区中的小于4、3或2个保守氨基酸置换以外，轻链可变区序列的变体与参照序列相同。

在本发明的治疗方法、药物和用途的另一个优选实施方案中，所述PD-1拮抗剂是特异性地结合人PD-1且包含以下链的单克隆抗体：(a)包含SEQ ID NO: 14的重链，和(b)包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20的轻链。

在本发明的治疗方法、药物和用途的另一个优选实施方案中，所述PD-1拮抗剂是特异性地结合人PD-1且包含以下链的单克隆抗体：(a)包含SEQ ID NO: 14的重链和(b)包含SEQ ID NO: 18的轻链。

在所有以上治疗方法、药物和用途中，所述PD-1拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合，且优选地也抑制PD-L2与PD-1的结合。在以上治疗方法、药物和用途的某些实施方案中，所述PD-1拮抗剂是特异性地结合PD-1或PD-L1并阻断PD-L1与PD-1的结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗-PD-1抗体，且其中所述重链和轻链包含图6中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)。

下面表4提供了用于用在本发明的治疗方法、药物和用途中的示例性抗-PD-1 mAb的氨基酸序列的列表，且所述序列显示在图1-5中。

表5提供了序列表中的PD-1拮抗剂序列的简要描述。

SEQ ID NO:	描述
		1	hPD-1.08A轻链CDR1
2	hPD-1.08A轻链CDR2
		3	hPD-1-08A轻链CDR3
4	hPD-1.08A重链CDR1
		5	hPD-1.08A重链CDR2
6	hPD-1.08A重链CDR3
		7	hPD-1.09A轻链CDR1
8	hPD-1.09A轻链CDR2
		9	hPD-1.09A轻链CDR3
10	hPD-1.09A重链CDR1
		11	hPD-1.09A重链CDR2
12	hPD-1.09A重链CDR3
		13	109A-H重链可变区
14	409A-H重链全长
		15	K09A-L-11轻链可变区
16	K09A-L-16轻链可变区
		17	K09A-L-17轻链可变区
18	K09A-L-11轻链全长
		19	K09A-L-16轻链全长
20	K09A-L-17轻链全长
		21	派姆单抗重链
22	派姆单抗轻链
		23	纳武单抗重链
24	纳武单抗轻链

本文中使用的“PD-L1”或“PD-L2”表述是指指定的PD-L蛋白在细胞表面上或指定的PD-L mRNA在细胞或组织内的任何可检测的表达水平。在肿瘤组织切片的IHC测定中用诊断性PD-L抗体或通过流式细胞计量术，可以检测PD-L蛋白表达。可替换地，通过PET成像，使用特异性地结合期望的PD-L靶标（例如，PD-L1或PD-L2）的结合剂(例如，抗体片段、亲和体（affibody）等)，可以检测肿瘤细胞的PD-L蛋白表达。用于检测和测量PD-L mRNA表达的技术包括RT-PCR和实时定量RT-PCR。

已经描述了几个用于在肿瘤组织切片的IHC测定中量化PD-L1蛋白表达的方案。参见，例如，Thompson, R. H., 等人, PNAS 101 (49): 17174-17179 (2004); Thompson,R. H. 等人, Cancer Res. 66: 3381-3385 (2006); Gadiot, J., 等人, Cancer 117:2192-2201 (2011); Taube, J. M. 等人, Sci Transl Med 4, 127ra37 (2012)；和Toplian, S. L. 等人, New Eng. J Med. 366 (26): 2443-2454 (2012)。

一个方案采用PD-L1表达阳性或阴性的简单二进制端点，其中阳性结果以表现出细胞-表面膜染色的组织学证据的肿瘤细胞百分比的方式来定义。被计数为PD-L1表达阳性的肿瘤组织切片是总肿瘤细胞的至少1%，并优选5%。

在另一个方案中，在肿瘤细胞中以及在浸润性免疫细胞(其主要包含淋巴细胞)中量化肿瘤组织切片中的PD-L1表达。表现出膜染色的肿瘤细胞和浸润性免疫细胞的百分比被分别量化为< 5%、5-9%，然后以10%增量直到100%。对于肿瘤细胞，如果评分< 5%评分，则PD-L1表达被计数为阴性，如果评分≥5%，则为阳性。在免疫浸润中的PD-L1表达被报告为称作经调整的炎症评分(AIS)的半定量测量，其通过将膜染色细胞的百分比乘以浸润的强度来确定，所述炎症评分被分级为无(0)、轻度(评分为1，很少的淋巴细胞)、中度(评分为2，淋巴组织细胞聚集体对肿瘤的局部浸润)或严重(评分为3，弥漫性浸润)。如果AIS≥5，将肿瘤组织切片通过免疫浸润计数为PD-L1表达阳性。

可以将PD-L mRNA表达的水平与频繁地用在定量RT-PCR中的一种或多种参照基因（诸如泛素C）的mRNA表达水平进行对比。

在某些实施方案中，基于与适当对照的PD-L1表达(蛋白和/或mRNA)水平的对比，将恶性细胞和/或肿瘤内的浸润性免疫细胞的PD-L1表达(蛋白和/或mRNA)的水平确定为“过表达的”或“升高的”。例如，对照PD-L1蛋白或mRNA表达水平可以是在相同类型的非恶性细胞中或在来自匹配的正常组织的切片中定量的水平。在某些优选的实施方案中，如果在样品中的PD-L1蛋白(和/或PD-L1 mRNA)比在对照中大至少10%、20%或30%，那么确定在肿瘤样品中的PD-L1表达是升高的。

本文中使用的“派姆单抗变体”是指这样的单克隆抗体：除了具有在位于轻链CDR之外的位置处的3、2、或1个保守氨基酸置换和位于重链CDR之外的6、5、4、3、2或1个保守氨基酸置换以外（例如，变体位置位于FR区或恒定区中），其包含与派姆单抗中的那些相同的重链和轻链序列。换而言之，派姆单抗和派姆单抗变体包含相同的CDR序列，但是由于分别在它们的全长轻链序列和重链序列的不超过3个或6个其它位置处具有保守氨基酸置换而彼此不同。派姆单抗变体就以下性能而言基本上与派姆单抗相同：对PD-1的结合亲和力，和阻断PD-L1和PD-L2中的每一种与PD-1的结合的能力。

本文中使用的“RECIST 1.1应答标准”是指在Eisenhauer等人, E.A. 等人, Eur. J. Cancer 45: 228-247 (2009)中关于靶病灶或非靶病灶阐述的定义，适当时基于在其中测量应答的上下文。

当提及对使用本文描述的联合治疗的治疗的具体抗肿瘤应答时，“应答者患者”是指表现出抗肿瘤应答的患者。

“持久应答”是指使用治疗剂或本文描述的联合治疗的治疗停止以后的持久治疗效果。在某些实施方案中，所述持久应答具有至少与治疗持续时间相同的持续时间，或至少是治疗持续时间的1.5、2.0、2.5或3倍。

“组织切片”表示组织样品的单个部分或碎片，例如，从正常组织或肿瘤的样品切下的组织薄片。

本文中使用的“治疗”癌症是指，给具有癌症或诊断出癌症的主体施用PD-1拮抗剂和CpG-C型寡核苷酸的联合治疗，以实现至少一种积极的治疗效果，例如，减少的癌细胞数目，减小的肿瘤大小，减小的癌细胞浸润进周围器官中的速率，或减小的肿瘤转移或肿瘤生长速率。可以以许多方式测量癌症中的积极治疗效果(参见，W. A. Weber, J. Nucl. Med.50:1S-10S (2009))。例如，就肿瘤生长抑制而言，根据NCI标准，T/C≦42%是最小抗肿瘤活性水平。T/C < 10%被视作高抗肿瘤活性水平，其中T/C (%) = 受治疗的中位肿瘤体积/对照的中位肿瘤体积×100。在某些实施方案中，使用RECIST 1.1标准或irRC (二维或单维)评估对本文描述的联合治疗的应答，并且通过本发明的组合实现的治疗是PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一种。PFS，也被称作“到肿瘤进展的时间”，指示在治疗过程中和治疗以后癌症没有生长的时间的长度，且包括患者已经经历CR或PR的时间的量，以及患者已经经历SD的时间的量。DFS表示在治疗过程中和治疗以后患者保持无疾病的时间的长度。OS表示与原初或未治疗的个体或患者相比预期寿命的延长。在某些实施方案中，对本发明的组合的应答是使用RECIST 1.1应答标准评估的PR、CR、PFS、DFS、OR和OS中的任一种。有效地治疗癌症患者的本发明的组合的治疗方案可以随诸如以下因素而变化：患者的疾病状态、年龄和重量，所述治疗在主体中引起抗癌应答的能力。尽管本发明的任意方面的一个实施方案不可能在每位主体中有效地实现积极的治疗效果，但是它将在统计上显著数目的主体中做到，如通过本领域已知的任何统计检验所确定的，诸如Student氏t-检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。

术语“治疗方案”、“给药协议”和“给药方案”互换使用以表示本发明的组合中的每种治疗剂的剂量和施用时机。

“肿瘤”当它应用于诊断出癌症或疑似具有癌症的主体时，表示恶性的或潜在地恶性的任何大小的肿瘤或组织团块，并包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是组织的异常生长或团块，通常不含有囊肿或液体区域。不同类型的实体瘤用形成它们的细胞的类型来命名。实体瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病（血液的癌症）通常不形成实体瘤（美国国立癌症研究所（National Cancer Institute）, 癌症术语词典（Dictionary of CancerTerms））。

“肿瘤负荷”也被称作“肿瘤负载”，表示遍布于体内的肿瘤物质的总量。肿瘤负荷表示整个体内（包括淋巴结和骨髓）的癌细胞的总数或肿瘤的总尺寸。通过本领域已知的多种方法，例如，通过在从主体取出后测量肿瘤的尺寸（例如，使用测径器），或当在体内时使用成像技术，例如，超声、骨扫描、计算机体层摄影术(CT)或磁共振成像(MRI)扫描，可以确定肿瘤负荷。

术语“肿瘤大小”表示可以测量为肿瘤的长度和宽度的肿瘤的总大小。通过本领域已知的多种方法，例如，通过在从主体取出后测量肿瘤的尺寸（例如，使用测径器），或当在体内时使用成像技术，例如，骨扫描、超声、CT或MRI扫描，可以确定肿瘤大小。

“单维irRC”表示在Nishino M, Giobbie-Hurder A, Gargano M, Suda M,Ramaiya NH, Hodi FS. Developing a Common Language for Tumor Response toImmunotherapy: Immune-related Response Criteria using Unidimensionalmeasurements. Clin Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943)中描述的标准集合。这些标准利用每个病灶的最长直径(cm)。

本文中使用的“可变区”或“V区”是指IgG链的片段，其在不同抗体之间在序列上是可变的。它延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。

在本发明的以上治疗方法、药物和用途的某些实施方案中，所述个体是人，且所述癌症是实体瘤，且在某些实施方案中，所述实体瘤是膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、头和颈的鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌(RCC)、小细胞肺癌(SCLC)或三重阴性的乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC、子宫内膜癌、泌尿道上皮癌、头和颈的鳞状细胞癌或黑素瘤。

在本发明的以上治疗方法、药物和用途的其它实施方案中，所述个体是人，且所述癌症是血红素恶性肿瘤，且在某些实施方案中，所述血红素恶性肿瘤是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、EBV-阳性的DLBCL、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、髓系细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。

并且，在以上治疗方法、药物和用途中的任一个的某些实施方案中，所述癌症就PD-L1和PD-L2中的一种或两种的表达而言被测试为阳性的。在其它实施方案中，所述癌症具有升高的PD-L1表达。

在以上治疗方法、药物和用途的一个实施方案中，所述个体是人，所述癌症被测试为人PD-L1阳性的，且选自NSCLC、子宫内膜癌、泌尿道上皮癌、头和颈的鳞状细胞癌或黑素瘤。在以上治疗方法、药物和用途的一个实施方案中，所述个体是人，所述癌症被测试为人PD-L1阳性的，且是晚期或转移性黑素瘤。

II. 方法、用途和药物

在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用包含PD-1拮抗剂和CpG-C型寡核苷酸的联合治疗。

所述联合治疗还可以包含一种或多种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂可以是，例如，除了CpG-C型寡核苷酸以外的化疗剂、生物治疗剂、免疫原性药剂（例如，减弱的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞诸如用肿瘤衍生的抗原或核酸刺激过的树突细胞、免疫刺激性细胞因子（例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF）和用编码免疫刺激性细胞因子（诸如但不限于GM-CSF）的基因转染的细胞）。所述另外的治疗剂的具体剂量和剂量计划可以进一步变化，且最佳剂量、给药计划和施用途径将基于正在使用的具体治疗剂而确定。在一个实施方案中，所述生物治疗剂是抗-IL-10抗体或其抗原结合片段。

化学治疗剂的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin) (尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素; callystatin; CC-1065 (包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素phiI1, 参见，例如，Agnew, Chem. Intl.Ed. Engl., 33:183-186 (1994)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2, 2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括其作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性的雌激素受体调节剂(SERM)，包括、例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

根据标准药学实践，在本发明的联合治疗中的每种治疗剂可以单独施用，或在包含所述治疗剂和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂的药物(在本文中也被称作药物组合物)中施用。

在本发明的联合治疗中的每种治疗剂可以同时地(即，在相同药物中)、并行地(即，在单独药物中，以任意次序施用一种以后适当地施用另一种)或以任意次序依次地施用。当所述联合治疗中的治疗剂呈不同剂型(一种药剂是片剂或胶囊且另一种药剂是无菌液体)和/或按不同定量给药计划施用（例如，至少每天施用化疗剂，以更低的频率施用生物治疗剂，诸如每周1次、每2周1次或每3周1次）时，依次施用是特别有用的。

在某些实施方案中，在施用PD-1拮抗剂之前施用CpG-C型寡核苷酸，而在其它实施方案中，在施用PD-1拮抗剂之后施用CpG-C型寡核苷酸。在另一个实施方案中，与PD-1拮抗剂并行地施用CpG-C型寡核苷酸。

在某些实施方案中，使用当将所述联合治疗中的至少一种治疗剂用作单一治疗用于治疗相同癌症时常用的相同剂量方案(剂量、频率和治疗持续时间)施用所述药剂。在其它共同实施方案中，与当将所述联合治疗中的至少一种治疗剂用作单一治疗时相比，所述患者接受更低总量的所述药剂，例如，更小的剂量、更低频率的给药和/或更短的治疗持续时间。

可以口服地或胃肠外地施用本发明的联合治疗中的每种小分子治疗剂，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、直肠、局部和透皮施用途径。

本发明的联合治疗可以在除去肿瘤的外科手术之前或之后使用，且可以在辐射治疗之前、过程中或之后使用。

在某些实施方案中，将本发明的联合治疗施用给以前没有用生物治疗剂或化学治疗剂治疗过的患者，即，是未治疗的。在其它实施方案中，将所述联合治疗施用给在使用生物治疗剂或化学治疗剂的先前治疗以后没有实现持久应答的患者，即，所述患者是经历过治疗的。

本发明的联合治疗通常用于治疗这样的肿瘤：其足够大以致于通过触诊或通过本领域众所周知的成像技术（诸如MRI、超声或CAT扫描）发现。

优选地将本发明的联合治疗施用给具有癌症的人患者，其就PD-L1表达而言测试为阳性的。在某些优选的实施方案中，在取自患者的肿瘤样品的FFPE或冷冻组织切片上在IHC测定中使用诊断性抗-人PD-L1抗体或其抗原结合片段检测PD-L1表达。通常，在使用PD-1拮抗剂和CpG-C型寡核苷酸的治疗开始之前，患者的医师将安排诊断测试来确定取自患者的肿瘤组织样品中的PD-L1表达，但是预见到，所述医师可以在治疗开始以后的任何时间（例如在治疗周期结束后）安排第一个或后续诊断测试。

用于本发明的联合治疗的剂量方案(在本文中也被称作施用方案)的选择取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、征状的水平、实体的免疫原性和正在治疗的个体中的靶细胞、组织或器官的可达性。优选地，剂量方案使递送给患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平一致。因此，所述组合中的每种生物治疗剂和化学治疗剂的剂量量和给药频率部分地取决于具体治疗剂、正在治疗的癌症的严重程度和患者特征。选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指导是可获得的。参见，例如，Wawrzynczak (1996)Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (编)(1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, NewYork, NY; Bach (编) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert等人(2003) New Engl. J. Med. 348: 601-608; Milgrom等人(1999) New Engl. J. Med. 341: 1966-1973;Slamon等人(2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniaminovitz等人(2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh等人(2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32;Lipsky等人(2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602; Physicians' Desk Reference2003 (Physicians' Desk Reference, 第57版); Medical Economics Company; ISBN:1563634457；第57版(2002年11月)。临床医师可以做出适当剂量方案的确定，例如，使用本领域中已知或疑似影响治疗或预测会影响治疗的参数或因素，且取决于，例如，患者的临床史(例如，以前的治疗)、要治疗的癌症的类型和阶段、和对联合治疗中的一种或多种治疗剂的应答的生物标志物。

通过连续输注，或通过定期给药，例如，每天、每2天、每周3次、或每周、每2周、每3周、每月、每2月1次等，可以施用本发明的联合治疗中的生物治疗剂。总每周剂量通常是至少0.05 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg体重或更多。参见，例如，Yang等人(2003)New Engl. J. Med. 349: 427-434; Herold等人(2002) New Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Liu等人(1999) J.Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji等人(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 133-144。

在采用抗-人PD-1 mAb作为联合治疗中的PD-1拮抗剂的某些实施方案中，给药方案将包含贯穿疗程：以约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)的间隔以1、2、3、5或10mg/kg的剂量施用抗-人PD-1 mAb。

在采用抗-人PD-1 mAb作为联合治疗中的PD-1拮抗剂的其它实施方案中，给药方案将包含：以约0.005 mg/kg至约10 mg/kg的剂量施用抗-人PD-1 mAb，患者内剂量递增。在其它递增剂量实施方案中，剂量之间的间隔将逐渐缩短，例如，第一剂和第二剂之间约30天(±2天)，第二剂和第三剂之间约14天(±2天)。在某些实施方案中，对于第二剂以后的剂量，所述给药间隔将是约14天(±2天)。

在某些实施方案中，将给主体施用包含本文描述的任意PD-1拮抗剂的药物的静脉内(IV)输注。

在本发明的一个优选实施方案中，所述联合治疗中的PD-1拮抗剂是纳武单抗，其以选自以下的剂量静脉内地施用：1 mg/kg Q2W、2 mg/kg Q2W、3 mg/kg Q2W、5 mg/kg Q2W、10 mg Q2W、1 mg/kg Q3W、2 mg/kg Q3W、3 mg/kg Q3W、5 mg/kg Q3W和10 mg Q3W。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述联合治疗中的PD-1拮抗剂是派姆单抗或派姆单抗变体，其以选自以下的剂量在液体药物中施用：1 mg/kg Q2W、2 mg/kg Q2W、3mg/kg Q2W、5 mg/kg Q2W、10 mg Q2W、1 mg/kg Q3W、2 mg/kg Q3W、3 mg/kg Q3W、5 mg/kgQ3W、10 mg Q3W，和这些剂量中的任一种的固定剂量（flat-dose）当量，即，诸如200 mgQ3W。在某些实施方案中，将派姆单抗提供为液体药物，所述液体药物包含在10 mM组氨酸缓冲液pH 5.5中的25 mg/ml派姆单抗、7%(w/v)蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨酯80。

在某些实施方案中，通过静脉内输注施用选定剂量的派姆单抗。在一个实施方案中，在25-40分钟之间或约30分钟的时间段内通过静脉内输注施用选定剂量的派姆单抗。

在本发明的一个实施方案中，所述联合治疗中的CpG-C型寡核苷酸具有SEQ IDNO: 45的序列。但是，具有本文描述的基序和序列的其它CpG-C型寡核苷酸也适合用于用在本发明的联合治疗中。因此，应当理解，关于包含SEQ ID NO:45的CpG-C型寡核苷酸的方法或药物的任何描述也可适用于其它CpG-C型寡核苷酸，特别是C59-01至C59-14 (SEQ IDNO: 38-51)。为了简洁，该理解将不再到处重复。在本发明的一个实施方案中，所述联合治疗中的CpG-C型寡核苷酸具有SEQ ID NO: 45的序列，并且在每周1次0.1-16.0 mg、优选地每周1次0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0 mg的剂量肿瘤内地施用。在本发明的另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在每周1次0.1-16.0 mg的剂量肿瘤内地施用持续4周，优选地在每周1次0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、7.0或8.0 mg施用4周。在本发明的另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在每3周1次0.1-16.0 mg、优选地每3周1次0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、7.0或8.0 mg的剂量肿瘤内地施用。在本发明的另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在每周1次2.0、4.0或8.0 mg的剂量肿瘤内地施用4周。在本发明的另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在每周1次2.0、4.0或8.0 mg的剂量肿瘤内地施用4周，随后每3周1次。在一个实施方案中，施用SEQ IDNO: 45的寡核苷酸直到进展或直到第一剂以后12-24周。在另一个实施方案中，将SEQ IDNO: 45的寡核苷酸施用共4、5、6、7或8剂。在某些实施方案中，每周2次、每周1次、每2周、每3周1次、每个月1次或每2个月施用SEQ ID NO:45的CpG-C型寡核苷酸。

通过这些药剂中的一种或两种的剂量递增或剂量递减，可以鉴别与CpG-C型寡核苷酸组合的派姆单抗的最佳剂量。在一个实施方案中，在200 mg Q3W施用派姆单抗，且在每周1次1-16 mg、优选地每周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ IDNO: 45的寡核苷酸。在一个实施方案中，将患者在第1天用200 mg派姆单抗Q3W治疗，并在第1天用1-16 mg剂量的肿瘤内地施用的SEQ ID NO: 45的寡核苷酸治疗，优选地在第1天1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg，每周1次持续4周，随后是1-16 mg的剂量，优选地每3周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg。在一个实施方案中，施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸直到进展或直到第一剂以后24周。在另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在第1天在1-16mg、优选地1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用，每周1次持续4周，随后是1-16mg的剂量，优选地每3周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg持续9周。在另一个实施方案中，施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸直到进展或直到第一剂以后24周。在一个实施方案中，当接受先前抗-PD-1治疗时，证实所述患者具有进行性疾病。在另一个实施方案中，将派姆单抗静脉内地施用且施用直到进展或直到45周。

在另一个实施方案中，将患者在第1天用200 mg派姆单抗Q3W治疗，并在第22天用1-16 mg、优选地1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用的SEQ ID NO: 45的寡核苷酸治疗，每周1次持续4周，随后是1-16 mg的剂量，优选地每3周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg。在另一个实施方案中，将SEQ ID NO: 45的寡核苷酸在第1天在1-16 mg、优选地1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用，每周1次持续4周，随后是1-16 mg的剂量，优选地每3周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg，持续9周。在一个实施方案中，所述患者是抗-PD-1/L1未治疗的。在另一个实施方案中，静脉内地施用派姆单抗。在另一个实施方案中，将派姆单抗静脉内地施用且施用直到进展或直到45周。

在某些实施方案中，将所述患者用联合治疗来治疗至少24周，例如，8个3-周循环。在某些实施方案中，使用联合治疗的治疗持续直到患者表现出PD或CR的迹象。

在本发明的另一个方面，包含PD-1拮抗剂和CpG-C型寡核苷酸的联合治疗还包含抗-IL-10抗体。在本发明的一个实施方案中，所述联合治疗中的抗-IL-10抗体是抗-IL 10hum 12G8，其在选自以下的剂量静脉内地施用：1 mg/kg Q3W、2 mg/kg Q3W、3 mg/kg Q3W、4mg/kg Q3W、5 mg/kg Q3W、6 mg/kg Q3W、7 mg/kg Q3W、8 mg/kg Q3W、9 mg/kg Q3W、10 mg/kg Q3W、11 mg/kg Q3W、12 mg/kg Q3W、13 mg/kg Q3W、14 mg/kg Q3W和15 mg/kg Q3W。在本发明的另一个实施方案中，所述联合治疗中的抗-IL-10抗体是抗-IL-10 hum 12G8，其在1mg/kg Q3W的剂量静脉内地施用。在本发明的另一个实施方案中，所述联合治疗中的抗-IL-10抗体是抗-IL 10 hum 12G8，其在3 mg/kg Q3W的剂量静脉内地施用。在本发明的另一个实施方案中，所述联合治疗中的抗-IL-10抗体是抗-IL 10 hum 12G8，其在10 mg/kg Q3W的剂量静脉内地施用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述联合治疗中的抗-IL-10抗体是抗-IL-10hum 12G8或抗-IL-10 hum 12G8变体，其在选自以下的剂量在液体药物中施用：1 mg/kgQ3W、2 mg/kg Q3W、3 mg/kg Q3W、4 mg/kg Q3W、5 mg/kg Q3W、6 mg/kg Q3W、7 mg/kg Q3W、8mg/kg Q3W、9 mg/kg Q3W、10 mg/kg Q3W、11 mg/kg Q3W、12 mg/kg Q3W、13 mg/kg Q3W、14mg/kg Q3W和15 mg/kg Q3W。

在某些实施方案中，如果患者已经被诊断出具有NSCLC、RCC、子宫内膜癌、泌尿道上皮癌、头和颈的鳞状细胞癌或黑素瘤，那么选择所述患者用于使用本发明的联合治疗进行治疗。

本发明也提供了一种药物，其包含如上所述的PD-1拮抗剂和药学上可接受的赋形剂。当所述PD-1拮抗剂是生物治疗剂（例如，mAb）时，可以使用常规细胞培养和回收/纯化技术可以在CHO细胞中生产所述拮抗剂。

在某些实施方案中，可以将包含抗-PD-1抗体作为PD-1拮抗剂的药物提供为液体制剂或通过在使用前用无菌注射用水重构冻干的粉末来制备。WO 2012/135408描述了适合用于用在本发明中的、包含派姆单抗的液体和冻干药物的制备。在某些实施方案中，将包含派姆单抗的药物提供在玻璃小瓶中，所述玻璃小瓶含有在4 ml溶液中的约100 mg派姆单抗。每1 mL溶液含有25 mg派姆单抗且在L-组氨酸(1.55 mg)、聚山梨酯80 (0.2 mg)、蔗糖(70 mg)和注射用水USP中配制。所述溶液需要稀释才能静脉内输注。

本发明也提供了一种包含TLR9激动剂和药学上可接受的赋形剂的药物，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。所述CpG-C型寡核苷酸可以在用于肿瘤内注射的生理学缓冲液中重构。

本文描述的药物可以作为试剂盒提供，所述试剂盒包含第一容器和第二容器和包装说明书。所述第一容器含有至少一剂包含PD-1拮抗剂的药物，所述第二容器含有至少一剂包含CpG-C型寡核苷酸的药物，且所述包装说明书或标签包含关于使用所述药物治疗患者的癌症的指导。所述第一容器和第二容器可以由相同的或不同的形状(例如，小瓶、注射器和瓶子)和/或材料(例如，塑料或玻璃)构成。所述试剂盒还可以包含在药物施用中可能有用的其它材料，诸如稀释剂、过滤器、IV袋和管线、针头和注射器。在所述试剂盒的某些优选实施方案中，所述PD-1拮抗剂是抗-PD-1抗体，并且所述指导阐明，所述药物意图用于治疗具有癌症的患者，所述患者通过IHC测定测试为PD-L1表达阳性。

从本文所含的教导会使本发明的这些和其它方面显而易见（包括下面列出的示例性具体实施方案）。

本发明的示例性具体实施方案

1. 一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用包含PD-1拮抗剂和TLR9激动剂的联合治疗，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

2. 一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用联合治疗，所述联合治疗包含PD-1拮抗剂、抗-IL-10抗体或其抗原结合片段和TLR9激动剂，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

3. 实施方案1或2的方法，其中所述PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。

4. 一种包含PD-1拮抗剂的药物，其用于与TLR9激动剂联合用于治疗个体中的癌症，其中所述PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，且所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸，且优选地，在所述TLR9激动剂之前施用所述PD-1拮抗剂。

5. 一种包含PD-1拮抗剂的药物，其用于与TLR9激动剂和抗-IL-10抗体或其抗原结合片段联合用于治疗个体中的癌症，其中所述PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，且所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

6. 一种包含TLR9激动剂的药物，其用于与PD-1拮抗剂联合用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

7. PD-1拮抗剂在药物制备中的用途，所述药物当与TLR9激动剂联合施用时用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

8. PD-1拮抗剂在药物制备中的用途，所述药物当与TLR9激动剂和抗-IL-10抗体或其抗原结合片段联合施用时用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

9. TLR9激动剂在药物制备中的用途，所述药物当与PD-1拮抗剂联合施用时用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

10. PD-1拮抗剂和TLR9激动剂在药物制备中的用途，所述药物用于治疗个体中的癌症，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

11. 一种试剂盒，其包含第一容器、第二容器和包装说明书，其中所述第一容器包含至少一剂含有抗-PD-1拮抗剂的药物，所述第二容器包含至少一剂含有TLR9激动剂的药物，且所述包装说明书包含关于使用所述药物治疗个体的癌症的指导，其中所述TLR9激动剂是CpG-C型寡核苷酸。

12. 实施方案11的试剂盒，其中所述指导阐明，所述药物意图用于治疗具有癌症的个体，所述个体通过免疫组织化学(IHC)测定测试为PD-L1表达阳性。

13. 实施方案1-12中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体是人，且所述PD-1拮抗剂是特异性地结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。

14. 实施方案1-12中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂是MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C或分别包含WO2013/019906的SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:21的重链和轻链可变区的单克隆抗体。

15. 实施方案1-12中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体是人，且所述PD-1拮抗剂是特异性地结合人PD-1并阻断人PD-L1与人PD-1的结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。

16. 实施方案15的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂也阻断人PD-L2与人PD-1的结合。

17. 实施方案15的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a) SEQ ID NO: 1、2和3的轻链CDR和SEQ ID NO: 4、5和6的重链CDR；或(b) SEQID NO: 7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO: 10、11和12的重链CDR。

18. 实施方案15的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO: 10、11和12的重链CDR。

19. 实施方案15的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗-PD-1单克隆抗体，且其中所述重链包含SEQ ID NO: 21，且所述轻链包含SEQ IDNO: 22。

20. 实施方案15的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗-PD-1单克隆抗体，且其中所述重链包含SEQ ID NO: 23，且所述轻链包含SEQ IDNO: 24。

21. 实施方案1-20中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗-IL-10抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的重链和轻链可变区。

22. 实施方案1-20中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗-IL-10抗体或其抗原结合片段包含：(a) SEQ ID NO: 26、27和28的轻链CDR和SEQ ID NO: 29、30和31的重链CDR。

23. 实施方案1-20中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗-IL-10抗体是包含重链和轻链的抗-IL-10单克隆抗体，且其中所述重链包含SEQ ID NO:34，且所述轻链包含SEQ ID NO:35。

24. 实施方案1-20中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗-IL-10抗体是抗-IL-10 hum 12G8或抗-IL-10 hum 12G8变体。

25. 实施方案1-24中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸由以下序列组成：(a) 5’-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z，N_v (SEQ ID NO：38)，其中N是核苷，x = 0、1、2或3，y = 1、2、3或4，w = 0、1或2，p= 0或1，q = 0、1或2，v= 0-89且z = 1-20，X₁和X₁’是自互补的核苷，且X₂和X₂’是自互补的核苷；和(b)至少8个碱基长度的回文序列，其中所述回文序列包含(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z序列的第一(X₁X₂CGX₂’X₁’)，其中所述寡核苷酸是12-100个碱基长度。

26. 实施方案25的方法、药物、用途或试剂盒,其中x = 0，y = 1，w = 0，p= 0或1，q = 0、1或2，v=0-20且z = 1、2、3或4。

27. 权利要求1-24中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸由TCGN_q(X₁X₂CGX₂'X₁'CG)_zN_v (SEQ ID NO:39)组成，其中N是核苷，q = 0、1、2、3、4或5，v=0-20，z= 1-4，X₁和X₁’是自互补的核苷，X₂和X₂’是自互补的核苷，且其中所述寡核苷酸是至少12个碱基长度。

28. 实施方案1-24中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸由5’-TCGN_qTTCGAACGTTCGAACGTTN_s-3’(SEQ ID NO:40)组成，其中N是核苷，q = 0、1、2、3、4或5，s = 0-20，且其中所述寡核苷酸是至少12个碱基长度。

29. 实施方案1-24中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸选自：

。

30. 实施方案1-24中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸具有由5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)组成的序列。

31. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是实体瘤。

32. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)或三重阴性的乳腺癌。

33. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是NSCLC、RCC、子宫内膜癌、泌尿道上皮癌、头和颈的鳞状细胞癌或黑素瘤。

34. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体以前没有针对NSCLC、RCC、子宫内膜癌、泌尿道上皮癌、头和颈的鳞状细胞癌或黑素瘤进行过治疗。

35. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤。

36. 实施方案1-30中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、髓系细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤T-细胞淋巴瘤或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。

37. 权利要求1-30中的任一项的方法或药物，其中所述癌症选自肾细胞癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和结直肠癌。

38. 实施方案1-37中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症被测试为人PD-L1阳性的。

39. 实施方案38的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述人PD-L1表达升高。

40. 实施方案38的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗、派姆单抗变体或纳武单抗。

41. 实施方案40的方法、药物、用途或试剂盒，其中将派姆单抗配制为包含在10mM组氨酸缓冲液pH 5.5中的25 mg/ml派姆单抗、7%(w/v)蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨酯80的液体药物。

42. 一种包含派姆单抗的药物，其用于与SEQ ID NO: 45的CpG-C型寡核苷酸联合用于通过特定方法治疗人个体中的癌症，所述方法包括首先给所述个体施用派姆单抗，随后从1-4周以后、优选地1、2或3周以后肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

43. 一种用于治疗诊断出癌症的人个体的方法，所述方法包括给所述个体施用联合治疗，所述联合治疗包含派姆单抗和SEQ ID NO: 45的CpG-C型寡核苷酸，且其中在200mg Q3W施用派姆单抗，且在每周1次1-16 mg的剂量、优选地在每周1次1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

44. 一种包含派姆单抗的药物，其用于与SEQ ID NO: 45的CpG-C型寡核苷酸联合用于通过特定方法治疗人个体中的癌症，所述方法包括在第1天开始给所述个体施用200mg派姆单抗Q3W和在第22天开始在1-16 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸，然后每周1次持续4周，随后是每3周1次1-16 mg的剂量，优选地其中在1.0、2.0、4.0、8.0或16.0 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

45. 一种包含派姆单抗的药物，其用于与SEQ ID NO: 45的CpG-C型寡核苷酸联合用于通过特定方法治疗人个体中的癌症，所述方法包括在第1天开始给所述个体施用200mg派姆单抗Q3W和在第1天开始在1-16 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸每周1次持续4周，随后是每3周1次1-16 mg的剂量，优选地其中在1.0、2.0、4.0、8.0或16.0mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

46. 一种包含派姆单抗的药物，其用于与SEQ ID NO: 45的CpG-C型寡核苷酸联合用于通过特定方法治疗人个体中的癌症，所述方法包括在第1天开始给所述个体施用200mg派姆单抗Q3W和在第22天开始在1-16 mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸每周1次持续4周，随后是每3周1次1-16 mg的剂量，优选地其中在1.0、2.0、4.0、8.0或16.0mg的剂量肿瘤内地施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

47. 实施方案42-44或46的方法或药物，其中所述个体以前没有用抗-PD-1或抗-PD-L1治疗进行过治疗。

48. 实施方案43或45的方法或药物，其中所述个体当接受先前抗-PD-1治疗时被证实是进行性的。

49. 实施方案42-48中的任一项的方法或药物，其中通过静脉内输注施用派姆单抗25-40分钟或约30分钟。

50. 实施方案42-49中的任一项的方法或药物，其中从所述联合治疗施用之前测试为PD-L1表达阳性的个体取出癌症的组织切片。

51. 实施方案50的方法或药物，其中所述组织切片中的至少50%的肿瘤细胞通过免疫组织化学(IHC)测定被测试为PD-L1表达阳性的。

52. 实施方案51的方法或药物，其中所述IHC测定采用抗体22C3来检测PD-L1表达。

53. 实施方案1-52中的任一个的方法或药物，其中所述CpG-C型寡核苷酸是5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO: 45)的序列的钠盐，且所述寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸。

54. 实施方案1-53中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸具有由5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (SEQ ID NO:42)组成的序列。

55. 实施方案1-53中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述CpG-C型寡核苷酸是5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3' (SEQ ID NO:42)的钠盐。

56. 实施方案42-55中的任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤。

57. 实施方案1的方法，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，且所述CpG-C型寡核苷酸具有由5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)组成的序列。

58. 实施方案1的方法，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，且所述CpG-C型寡核苷酸具有由5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)组成的序列，且所述寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸。

59. 实施方案57或58的方法，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤。

60. 实施方案1的方法，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，且所述CpG-C型寡核苷酸具有由5’-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA-3’(SEQ ID NO:42)组成的序列。

61. 实施方案1的方法，其中所述PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO: 7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO: 10、11和12的重链CDR，且所述CpG-C型寡核苷酸由以下序列组成：(a) 5’-N_x(TCG(N_q))_yN_w(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z,N_v (SEQ ID NO:38)，其中N是核苷，x = 0、1、2或3，y = 1、2、3或4，w = 0、1或2，p= 0或1，q = 0、1或2，v= 0-89且z = 1-20，X₁和X₁’是自互补的核苷，且X₂和X₂’是自互补的核苷；和(b)至少8个碱基长度的回文序列，其中所述回文序列包含(X₁X₂CGX₂’X₁’(CG)_p)_z(SEQ ID NO:56)序列的第一(X₁X₂CGX₂’X₁’) (SEQ ID NO:55)，其中所述寡核苷酸是12-100个碱基长度。

一般方法

分子生物学中的标准方法描述在Sambrook, Fritsch和Maniatis (1982和1989第2版, 2001第3版) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001)Molecular Cloning, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, 第217卷, Academic Press, San Diego,CA)。标准方法还出现在Ausbel, 等人(2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第1-4卷, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan,等人(2000) Current Protocols in Protein Science, 第1卷, John Wiley and Sons,Inc., New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白的糖基化(参见，例如，Coligan, 等人(2000) Current Protocols in Protein Science, 第2卷,John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, 等人(2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第3卷, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, 第16.0.5-16.22.17页; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St.Louis, MO；第45-89页; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory,Piscataway, N.J., 第384-391页)。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(Coligan, 等人(2001) Current Protcols in Immunology, 第1卷, John Wiley andSons, Inc., New York; Harlow和Lane (1999) Using Antibodies, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow和Lane, 出处同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可得到的(参见，例如，Coligan, 等人(2001)Current Protocols in Immunology, 第4卷, John Wiley, Inc., New York)。

可以制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见，例如，Sheperd和Dean(编) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY;Kontermann和Dubel (编) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, NewYork; Harlow和Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 第139-243页; Carpenter, 等人(2000)J. Immunol. 165:6205; He, 等人(1998) J. Immunol. 160:1029; Tang等人(1999) J.Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca等人(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684;Chothia等人(1989) Nature 342:877-883; Foote和Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499；美国专利号6,329,511)。

人源化的一个替代方案是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或在转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995)Nature Medicine 1:837-839; Mendez等人(1997) Nature Genetics 15:146-156;Hoogenboom和Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas等人(2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York; Kay等人(1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin等人(1999) Nature Biotechnol. 17:397-399)。

抗原的纯化并非抗体产生所必需的。可以用带有目标抗原的细胞免疫动物。然后可以从经免疫的动物分离脾细胞，且可以使所述脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如，Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290; Wright等人(2000) Immunity 13:233-242; Preston等人, 出处同上; Kaithamana等人(1999) J. Immunol. 163:5157-5164)。

可以使抗体与例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其它目的，且包括与例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如，胶体金)偶联的抗体(参见，例如，Le Doussal等人(1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini等人(1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing和Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts等人(2002) J. Immunol. 168:883-889)。

用于流式细胞计量术的方法，包括荧光活化细胞分选(FACS)，是可得到的(参见，例如，Owens, 等人(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 第2 版; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, JohnWiley and Sons, Hoboken, NJ)。适合用于修饰核酸（包括用作例如诊断试剂的核酸引物和探针、多肽和抗体）的荧光试剂是可得到的(Molecular Probesy (2003) Catalogue,Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St.Louis, MO)。

描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink (编)(1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York,NY; Hiatt, 等人(2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, andWilkins, Phila, PA; Louis, 等人(2002) Basic Histology: Text and Atlas,McGraw-Hill, New York, NY)。

用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可得到的(参见，例如，GenBank, Vector NTI®Suite (Informax,Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA);DeCypher®(TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, 等人(2000)Bioinformatics 16: 741-742; Menne, 等人(2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, 等人(2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690)。

实施例

实施例1：C59-08对人细胞的免疫调节

C59-08是具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO: 45)的钠盐。

使用标准分离方法用Ficoll-Paque™PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh, PA)从来自两个供体的血沉棕黄层分离人外周血单核细胞(PBMCs)。将分离的PBMC在含有2%胎牛血清(FBS)和2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤2次。将所述细胞再悬浮并在含有10%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640中以1×10⁶个细胞/孔在96-孔U-底平板中培养。将所述细胞在有0.016 μM至5 μM范围的剂量的C59-08或7 μM对照ODN 1040存在下在恒湿培养箱中以0.2 mL的终体积在37℃、5%CO₂下培养48小时。将上清液收获并使用Meso Scale Discovery人IFNα2a和人IL-10组织培养试剂盒(Rockville, MD)测定IFNα2a和IL-10。

结果显示在图12中。C59-08诱导人PBMC中的IFNα2a和IL-10产生，最佳浓度为0.2μM。

实施例2: C59-08对人肿瘤样本的免疫调节

人肿瘤组织培养物

从商业来源(Bio-Options、Folio、Coversant Bio和Boston BioSource)和罗彻斯特大学（University of Rochester）得到来自患者的人肿瘤样本。

在外科手术以后1小时内收集新鲜肿瘤组织并放在AQIX运输培养基(AQIX, UK)中。将组织在4℃过夜运输至Merck Research Laboratories, Palo Alto, CA。

将所述肿瘤包埋在UltraPure™低熔点琼脂糖(Invitrogen, Carlsbad, CA)中并用Mcllwain™Tissue Chopper (Stoelting Co., Wood Dale, IL)切成400 μm。首先将肿瘤切片固定在Millicell-CM细胞培养插入物(Millipore, Billerica, CA)上，并在恒湿培养箱中在37℃、5%CO₂下在空气和补充了4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠(Mediatech, Inc., Manassas, VA)、10%FBS (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas)、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的1 ml DMEM培养基的界面处培养。

将肿瘤切片在有0.1、0.5和1 μM C59-08或1 μM对照ODN 1040存在下培养24小时。将肿瘤样品在干冰中快速冷冻并在处理之前在37℃保存。

RNA分离和实时定量PCR

使用polytron匀浆器将总RNA通过匀浆化分离进RNA STAT-60 (Tel-Test,Friendswood, TX)中。根据生产商的方案提取总RNA。用异丙醇沉淀后，将总RNA使用相锁定光试管用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)重萃取。

根据生产商的方案使用QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen,Valencia, CA)，反转录DNA酶处理过的总RNA。从Life Technologies (Foster City, CA)商业得到引物。在Fluidigm Biomark序列检测系统(Fluidigm, Foster City, CA)上在TAQMAN™RTqPCR反应中使用各自900 nM的未标记的引物和250 nM FAM-标记的探针执行来自每个样品的10 ng cDNA的实时定量PCR。在一个单独反应中测量泛素的水平，并用于通过Δ-ΔCt方法将数据归一化。使用每个样品的泛素和目标基因的平均周期阈值(Ct)值，使用下述方程式得到归一化的值：1.8^{(Ct泛素- Ct目标基因)}×10⁴。

处理结果

在肾细胞癌(RC) (n = 5)、非小细胞肺癌(NSCLC) (n = 3)和膀胱癌(n = 1)和结肠直肠癌(n = 1)组织培养物中用C59-08诱导的IFNα-可诱导的基因(IFNα2、MCP1、MCP2、OAS2、IP-10、GBP1、ISG-54、MxB和TRAIL)、细胞因子(IFNβ、IL-10、IL-12、IL-6和TNFα)和免疫活化标志物(CD80、CD86、CD40、CD70和OX40L)进行人肿瘤的离体处理。使用来自RCC供体的样本的数据显示在图13中：(A) IFNα-可诱导的基因；(B)细胞因子；和(C)免疫活化标志物。

实施例3：抗-IL-10和肿瘤内C59-08的组合在动物模型中的抗肿瘤活性

TC40.11D8是靶向小鼠IL-10的小鼠IgG1/κ单克隆抗体。小鼠IgG1同种型对照是对腺病毒hexon25特异性的小鼠单克隆抗体。两种抗体都作为冷冻(-80℃)储备物得自内部来源。

抗体的制剂

制剂缓冲液是对每种抗体特异性的以稳定蛋白和防止沉淀。TC40.11D8和小鼠IgG1同种型对照的制剂是75 mM氯化钠, 10 mM磷酸钠, 3%蔗糖, pH7.3。

寡脱氧核苷酸

基于胞苷磷酸-鸟苷(CpG)的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ODN) CpG 1826 5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’(SEQ ID NO: 53) (InvivoGen, San Diego, CA)是小鼠TLR9特异性的激动剂。CpG 1826具有CpG- B型序列。基于CpG的硫代磷酸酯ODN C59-08 (Dynavax,Berkeley, CA)是活化人和小鼠TLR9的激动剂。C59-08具有CpG-C型序列:。5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:45)，其中所述5’和3’是OH基团。

对照ODN (Dynavax, Berkeley, CA)具有含硫代磷酸酯主链5'-TGA CTG TGA ACCTTA GAG ATG A-3’(SEQ ID NO:54)的非-CpG序列。

寡脱氧核苷酸的制剂

将CpG 1826在2 mg/mL的浓度在0.9%氯化钠中重构，等分，并在-20℃保存。将C59-08在4.53 mg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重构，等分，并在-20℃保存。将对照ODN在4.47 mg/mL的浓度在PBS中重构，等分，并在-20℃保存。

动物

大约7-8周龄雌性C57BL/6J小鼠得自Jackson Laboratory (Sacramento, CA)。任意获取常规动物食物和水。在研究开始之前将动物圈养1周。在研究开始(即肿瘤植入)时动物的平均重量是19克。

涉及研究中动物的护理和使用的程序经过Merck研究实验室（Merck ResearchLaboratories）的动物实验管理小组（Institutional Animal Care and Use Committee）审批和批准。在研究过程中，根据在Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care (AAALAC)、Animal Welfare Act、American VeterinaryMedical Association (AVMA) Euthanasia Panel on Euthanasia和Institute forLaboratory Animal Research (ILAR) Guide to the Care and Use of LaboratoryAnimals的指南中描述的原则，进行动物的护理和使用。

肿瘤细胞系制备和植入

由Johns Hopkins University (Baltimore, MD)提供的TC-1细胞系源自用人乳头瘤病毒(HPV-16) E6和E7和c-Ha.ras癌基因共转化的小鼠原代肺上皮细胞(Lin等人,Cancer Res., 56:21-6, 1996)。TC-1细胞是与C57BL6/J小鼠品系同基因的。

在补充了10%胎牛血清和0.4 mg/mL遗传霉素的DMEM中培养TC-1细胞。将亚汇合的TC-1细胞在0.1 mL无血清DMEM中皮下地(SC)注射进每只动物的腰部胁腹中(1×10⁵在右胁腹中和0.5×10⁵在左胁腹中)。首先将动物在用于植入的区域用电动剪切机剃毛。

肿瘤测量和体重

在第一剂的前一天和此后每周2次，测量肿瘤。使用电子测径器测量肿瘤长度和宽度，并使用以下公式确定肿瘤体积：体积(mm³) = 0.5×长度×宽度²，其中长度是较长尺寸。在第一剂的前一天和此后每周2次，将动物称重。为了防止偏差，除去重量或肿瘤体积的任何离群值，并将剩余的小鼠基于右胁腹中的肿瘤体积(被称作注射的肿瘤)分入各个治疗组。

给药溶液制备

将抗体的冷冻储备物融化并转移至湿冰。为了避免重复的冷冻融化，将每个小瓶储备物融化一次，并在足够一次使用的体积中制备等分试样。将聚丙烯低粘附试管用于此目的。将等分试样在-80℃保存。在每次给药之前，将一个等分试样融化并在适当的稀释剂中稀释至标称浓度。

在每次给药之前，将ODN (对照ODN、CpG 1826和C59-08)的等分试样融化并在0.9%氯化钠中稀释至标称浓度。

抗体和寡脱氧核苷酸的施用

在第0、4、8和12天以10 mg/kg腹膜内地(IP)施用同种型对照mIgG1和抗-IL-10mIgG1。在第0、4、8和12天仅在右肿瘤中肿瘤内地施用(IT)对照ODN (2.5 mg/kg)、CpG 1826(1 mg/kg)和C59-08 (2.5 mg/kg)。

统计方法

在随访的每天在治疗之间对比肿瘤体积。各个动物的随访可以因为过度肿瘤负荷或其它原因较早终止。取决于所述原因和在最后一次测量时的肿瘤大小，将最后一次观察到的肿瘤体积处理为该动物在所有以后天的体积下界(右删失数据)。

为了在给定的天对比两个治疗组，使用允许右删失数据的非参数的Mann-Whitney(或Wilcoxon秩总和)检验的泛化：Gehan-Breslow检验的Peto和Peto形式。从进行对比的两次治疗之间的20,000次动物随机再分配估计双侧p-值。为了控制给定的治疗对在所有时间点的按家族差错率，通过将Westfall和Young的maxT程序应用于排列分布来多次调节p-值。使用小于0.05的p-值来定义统计显著性。

为了描述目的，将每天和治疗组的体积按它们的中位值总结。为了允许删失，在对数标度上使用Greenwood氏公式通过Kaplan-Meier方法（具有置信带）估计每天和治疗组的分布函数。将中位值估计为分布函数的50%，具有通过反转置信带得到的置信区间。使用68%置信水平，以与用于总结数据的普通“平均值±SE”形式相当，因为后者是平均值的大约68%置信区间。

当动物的随访较早终止时，将原因分类并如下处理动物的数据：(1)肿瘤负荷：在最后一次测量值时的右删失；(2)肿瘤溃疡形成: 在最后一次测量值时的右删失，假设这超过阈值(1000 mm³)；否则在以后的时间忽略动物；(3)重量减轻/生病(包括发现死亡，有生病的迹象): 在以后的时间忽略动物；和(4)与治疗无关(例如，偶然发现死亡，没有生病的迹象，管理终止): 在最后一次测量值时的右删失，假设这超过阈值(1000 mm³)；否则在以后的时间忽略动物。

治疗结果

当在右胁腹上的肿瘤的平均体积达到大约60 mm³ (39 mm³ - 87 mm³)时，在第一剂前一天将携带TC-1肿瘤的C57BL/6J小鼠分入5个治疗组：(1) mIgG1同种型对照+ 对照ODN；(2) mIgG1同种型对照+ C59-08；(3)抗-IL-10 + CpG 1826；(4)抗-IL-10 + 对照ODN；和(5)抗-IL-10 + C59-08。在左侧的肿瘤体积的范围是0 mm³ - 113 mm³。将肿瘤的完全消退(CR)定义为，假定肿瘤在将动物分组那天是可测量的，在进行测量时没有可测量的肿瘤。

结果显示在图10和11中。与肿瘤内CpG 1826 (第3组)或C59-08 (第5组)组合的抗-IL-10导致至少3只动物中的注射肿瘤的CR (图10A)。但是，仅与C59-08组合的抗-IL-10(第5组)导致非注射肿瘤的CR (10只动物中的3只)(图11A)。包括C59-08单一治疗(第2组)在内的其它治疗没有导致注射或非注射肿瘤的CR。与对照治疗抗-IL-10单一治疗和C59-08单一治疗相比，与C59-08 (IT)组合的抗-IL-10的施用导致第6、9和12天显著减小的注射肿瘤体积(p < 0.05，在时间点之间多次调节) (图10B-D)。与对照治疗和抗-IL-10单一治疗相比，与C59-08 (IT)组合的抗-IL-10的施用导致第6、9和12天显著减小的非注射肿瘤体积(p < 0.05，在时间点之间多次调节)(图11B-D)。

实施例4: 全身抗-PD-1抗体和肿瘤内CpG-C寡核苷酸的组合的抗肿瘤活性

抗体.

使用两种抗-PD-1阻断抗体：29F.1A12在最初的研究中和RMP1-14在以后的研究中。每剂含有250 μg抗体/注射。29F.1A12是得自BioLegend (San Diego, CA)的经纯化的大鼠抗-小鼠PD-1抗体(目录号135202)。BioLegend抗-PD-1抗体是大鼠IgG2a，κ单克隆抗体。克隆RMP1-14是得自BioXCell Inc. (West Lebanon, NH)的经纯化的大鼠抗-小鼠PD-1抗体(目录号BE0146)。BioXCell抗-PD-1抗体是大鼠IgG2a单克隆抗体。

寡脱氧核苷酸.

非-CpG, 对照寡脱氧核苷酸(CTRL-ODN), 具有含硫代磷酸酯主链的序列5'-TGACTG TGA ACC TTA GAG ATG A-3’(SEQ ID NO:54)。每剂含有50 μg ODN/注射。

动物和细胞.

6-8周龄的雌性BALB/c小鼠得自Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)。CT26是得自美国典型培养物保藏中心(ATCC, Manassas, VA)的鼠成纤维细胞细胞系(CT26.WT, 目录号CRL-2638™)。CT26是经常用作模型来试验免疫治疗方案的、N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯诱导的未分化的结肠癌细胞系(Wang等人, J Immunol, 154: 4685-4692, 1995)。

单一治疗给药方案.

使用以前公布的方法(Brattain等人, Cancer Res, 40:2142-2146, 1980)，在第0天将约8 x 10⁴个CT26细胞皮下地(SC)注射进BALB/c小鼠(n = 5-6/组)的胁腹中。在第5、8、11、14和18天腹膜内地(IP)注射抗-PD-1阻断抗体。

联合治疗给药方案.

在第-7天将约8 x 10⁴个CT26细胞皮下地(SC)注射进BALB/c小鼠(n = 5-6/组)的胁腹中(Brattain等人, 出处同上，1980)。在研究第0天(肿瘤细胞植入以后7天；平均肿瘤长度5mm)开始治疗方案。小鼠保持不治疗或腹膜内地(IP)注射在200µL体积中的200微克小鼠抗-PD-1阻断抗体(由生产商提供的纯制剂)。在第0、3、7、10、14、18、21和25天施用抗-PD-1注射剂。几次抗-PD-1注射以后(第12天)，给小鼠肿瘤内地(IT)注射在150µL PBS体积中的50微克C59-08或CTRL-ODN。在第12、14、18、21、25和28天施用C59-08和CTRL-ODN注射。在两组中，如上所述继续抗-PD-1治疗。在没有抗-PD-1预处理存在下在第12、14、18、21、25和28天给一个具有类似大小肿瘤(在研究第0天注射肿瘤细胞)的单独小鼠组注射单独C59-08。

联合治疗给药和T细胞除去方案.

在第0天将约8 x 10⁴个CT-26肿瘤细胞皮下注射进小鼠的胁腹中(Brattain等人,出处同上，1980)。小鼠保持不治疗，或在第5、9、12、15、19、22、26和29天通过腹膜内注射用抗-PD-1治疗。几次抗-PD-1注射以后(第15天)，将小鼠在第15、19、22、26和29天通过肿瘤内注射用C59-08治疗，或保持不治疗。在第14、15、16、19、22、26和29天通过腹膜内注射将抗-CD8或抗-CD4除去抗体施用给抗-PD1/C59-08治疗组中的小鼠。抗-PD-1治疗的小鼠接受250μg/注射的BioXCellRMP1-14抗体。所述小鼠也接受50 μg/注射的C59-08。为了除去，小鼠接受250 μg/注射的抗-CD8 Ab (YTS 169.4)或抗-CD4 Ab (GK1.5)，二者得自BioXCell。

联合治疗给药对侧肿瘤排斥方案.

将约8 x 10⁴个CT-26细胞在第0天皮下注射进左胁腹并在第2天注射进右胁腹。将小鼠保持不治疗(n=18)，或在第5、7、11、14、21、23和26天注射抗-PD-1 Ab, IP (n=19)。几次抗-PD-1 Ab注射以后(第14天)，在第14、19、21、23和26天给抗-PD-1-治疗的小鼠在左肿瘤中注射C59-08。抗-PD-1 Ab治疗的小鼠接受250 μg/注射的BioXCellRMP1-14抗体和50 μg/注射的C59-08。

用于提取肿瘤浸润性白细胞的肿瘤处理.

将肿瘤使用镊子放在培养皿中，并加入5mL在RPMI培养基中的5%FCS。将肿瘤使用剪刀切成小块，并使用3mL注射器柱塞的底部进行切碎，直到可以用50mL吸管移走肿瘤组织。将肿瘤组织混悬液转移进50mL试管，并将培养皿使用5mL在RPMI培养基中的5%FCS冲洗2次。将组织混悬液在含有50 mg/mL胶原酶4 (来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）的Sigma-Aldrich C5138-100MG胶原酶)和2 mg/mL DNA酶I (来自牛胰腺的Sigma-Aldrich DN25-100MG脱氧核糖核酸酶I)的100X肿瘤消化酶混合物中消化。将试管在37℃温育20分钟，每3 min轻轻摇动。将样品穿过70µm过滤器过滤，并随后将过滤器用在RPMI中的5%FCS洗涤。将样品在室温在1400 rpm离心7分钟。将细胞再悬浮于1-5倍体积的在RPMI中的5%FCS中，取决于肿瘤大小。使用血球计数器计数得到的混悬液中的细胞。

从完整肿瘤提取RNA用于基因表达分析.

将完整肿瘤在得自Qiagen (Venlo, NL)的RNAlater (目录号76104)中冷冻。融化以后，根据生产商的说明书使用得自Qiagen的RNeasy Mini Kit (目录号74106)从30 mg总匀浆化的完整肿瘤分离总RNA。简而言之，将在RNAlater RNA稳定化试剂中储存的完整肿瘤融化，称重，并放在含有5mm不锈钢珠和含BME的RLT缓冲液的2mL PCRclean Safe-Lockeppendorf试管中(700 μL/30mg组织，直到每试管1mL RLT)。将试管放在TissueLyserAdapter Set 2x24中，将其在25Hz运行2次各2 min。将裂解物在13,500rpm离心3分钟。随后将上清液转移进新的15mL试管。根据需要加入RLT缓冲液以满足700 μL/30mg要求。使用约700 μL裂解物，并将剩余物在-80℃保存。将1体积的70%乙醇加入澄清的裂解物，并将700 μL样品在2mL收集试管中转移至RNeasy吸附柱，并在13,500 rpm离心1分钟。如果样品超过700 μL，将连续等分试样在相同RNeasy吸附柱中处理，并将穿流液抛弃。将350 μL缓冲液RW1加入RNeasy吸附柱，并将样品离心。将DNA酶I温育混合物(80 μL: 10 μL DNA酶I储备溶液+ 70 μL缓冲液RDD)直接加入RNeasy吸附柱，并在室温温育15分钟。加入350 μL缓冲液RW1，将试管离心，并将RNeasy吸附柱转移至新试管。将2体积的500 μL缓冲液RPE加入所述柱并离心1分钟以洗涤所述柱。将RNeasy吸附柱转移至新的2mL收集试管并在全速离心1min。将RNeasy吸附柱转移进新的1.5mL收集试管，并将45 μL无RNA酶的水(LifeTechnologies)加入所述柱并在13,500 rpm离心1 min以洗脱RNA。

定量实时反转录-聚合酶链式反应(TAQMAN)

使用MyiQ Real-Time PCR Machine (Bio-Rad)，使用5X第一链缓冲液(LifeTechnologies)、牛血清白蛋白(Life Technologies)、重组RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega, Madison, WI)、Oligo(dT)15 (Promega)、随机引物(Promega)、dNTP(Invitrogen, Carlsbad, CA)、DTT (Life Technologies)和SuperScript III逆转录酶(Life Technologies)，将五(5) μg洗脱的RNA逆转录。用在95℃15 min、继之以40轮的在95℃15秒和在60℃1 min的循环条件，将数据归一化至泛素表达。使用Power SYBR Green PCRMaster Mix (Life Technologies)，执行mRNA的定量。使用Applied Biosystems(Carlsbad, CA) StepOnePlus实时PCR系统使用StepOne v2.1软件执行所有定量和分析。使用下式计算相对基因表达水平：1.8^{(平均Ct 泛素- Ct 基因)}*100,000。

使用Lympholyte®-哺乳动物细胞分离介质的肿瘤细胞分离

使用该程序从肿瘤细胞分离肿瘤浸润性白细胞(TIL)。通过根据需要加入在RPMI中的5%FCS，使得自肿瘤的细胞混悬液达到7mL。将7mL Lympholyte®-哺乳动物细胞分离介质(Cedarlane, 目录号: CL5120)加入15mL圆锥形离心管中，并然后使7mL细胞混悬液小心地在顶部铺层。将细胞在没有制动下在室温在800 x g离心20 min。将形成的顶层转移进50mL试管中并填充在RPMI培养基中的5%FCS至50mL标志。将细胞在最大加速度和最大致动下在室温在1800 rpm沉淀7 min。将介质抽吸并将含有TIL的沉淀物再悬浮于1mL在RPMI培养基中的5%FCS中。将一部分细胞(150µL)放在96-孔U-底平板中，在2000 rpm沉淀3 min，然后用250µL RLT缓冲液重新悬浮用于基因表达测定。将剩余的细胞用于FACS分析，其中将约100-150µL TIL样品用于每个染色图表。

用于细胞因子生产的肿瘤浸润性白细胞的体外刺激.

将用Lymopholyte®哺乳动物细胞分离介质(Cedarlane, 目录号: CL5120)分离的约1.5x10⁵ TIL在37℃用含有得自BD Biosciences (目录号550583)的BD GolgiPlug(500X)的白细胞活化混合液刺激3小时，所述混合液含有佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、离子霉素和布雷菲德菌素A (BFA)或单独BFA (3 μg/mL终浓度)，终体积为200 μL。通过细胞内染色和流式细胞计量术针对细胞因子生产来分析样品。

细胞染色和荧光激活细胞分选术(FACS)分析

将所有试剂在4℃保存。所有洗涤包括将铺板的细胞混悬液上下抽吸3次，随后在4℃在1800 rpm离心3 min，并抛弃上清液。将细胞在刺激3小时以后沉淀，并将每个样品再悬浮于80 μL/孔的FACS缓冲液(PBS, 10%FBS, 0.1%叠氮化钠)中以建立混合液，每个样品包括2 μL Fc阻滞剂和0.5 μg/mL的每种目标抗体。将样品在4℃温育20 min，然后洗涤并重新悬浮在200 μL/孔FACS缓冲液中。为了固定细胞，将200 μL 1%低聚甲醛加入每个孔，并将平板在暗处在4℃温育20 min进行表面染色。然后将细胞洗涤，沉淀，并再悬浮于300 μl/孔FACS缓冲液中，并立即使用流式细胞计(来自BD Bioscience的LSRII)获取数据。

对于细胞内染色，将在4℃保存过夜的样品沉淀，并再悬浮于在PBS中的0.5%皂苷缓冲液中在室温保持10 min以渗透化处理细胞。另外的离心以后，将细胞用在0.5%皂苷缓冲液（在PBS中）中的80 μL染色混合物+ 2 μL Fc阻滞剂和目标抗体在4℃染色30 min：2.5μL抗-小鼠IFN-γ-PE (Tonbo Biosciences, Cat. 50-7311-U100)，和2.5 μL抗-小鼠TNF-α-APC (Biolegend, Cat. 506308)。将细胞沉淀并洗涤，然后重新悬浮于300 μL FACS缓冲液中，并立即使用流式细胞计(来自BD Bioscience的LSRII)获取数据。

携带CT-26肿瘤结节的小鼠产生对全身性PD-1阻断的异质应答.

在最后一次抗-PD-1注射以后2天(第21天)，测量肿瘤结节大小。图14A表明，43个肿瘤中的17个(40%)表现出对抗-PD-1治疗的应答，其中17个肿瘤中的8个(19%)已经完全消退。43个肿瘤中的剩余26个表现出与对照(CTRL)未治疗的小鼠类似的尺寸分布。也就是说，60%的肿瘤没有对PD-1阻断做出应答。如在图14B中所示，与未治疗的(CTRL)肿瘤或没有对抗-PD-1治疗做出应答的肿瘤相比，具有对抗-PD-1治疗的应答的肿瘤具有增加的肿瘤浸润性白细胞(TIL)数目。将在最后一次抗-PD-1注射后2-4天收获的完整肿瘤处理用于使用TAQMAN测定分析基因表达。对抗-PD-1的应答与T细胞浸润和活化标志物(图14C)和I型干扰素应答标志物(图14D)的表达水平相关联。

这些数据证实，CT-26肿瘤模型遵循清楚的双模态应答：能够产生抗肿瘤应答的小鼠表现出对肿瘤生长的显著控制，而不能对治疗做出应答的小鼠在与未治疗的肿瘤相同的生长速率前进。另外，这些数据表明肿瘤体积与T细胞浸润和活化和I型干扰素应答基因的表达之间的负相关。

肿瘤内C59-08逆转肿瘤从抗-PD-1治疗的逃逸并导致长期免疫介导的肿瘤生长控 制.

图15A显示了平均肿瘤体积随时间的变化，而图15B-C显示了各个治疗组的小鼠的长期存活。与C59-08或抗-PD-1单一治疗相比，肿瘤内C59-08与持续抗-PD-1治疗一起改善了存活率。该概念验证研究的证据指示，C59-08与抗-PD-1抗体的组合能够将无应答者转化成能够完成肿瘤排斥的应答者。

抗-PD-1 + C59-08联合治疗的效力需要CD8+ T细胞，但是不需要CD4+ T细胞

图16表明，CD8+ T细胞的除去会消除抗-PD-1 + C59-08联合治疗的效力。

抗-PD-1 + C59-08联合治疗允许对侧肿瘤的排斥.

图17表明，在抗-PD-1 +C59-08治疗组中，19只小鼠中的13只(68%)存活并排斥注射C59-08的、以及未注射C59-08的肿瘤结节。未治疗的小鼠没有表现出肿瘤大小的减小或排斥任何肿瘤(0%存活)。因而，由C59-08 + 抗-PD-1联合治疗产生的抗肿瘤应答能够消除在远离C59-08注射的部位处的肿瘤。

与PD-1阻断组合的C59-08强烈地诱导多功能CD8+ T细胞的浸润和活化.

在收集时，基于应答率将用抗-PD-1治疗过的肿瘤分组。根据下式计算肿瘤体积(mm³)：(宽度)² x长度/2。与对照寡核苷酸治疗的肿瘤相比，被归类为对抗-PD-1无应答的肿瘤表现出约20%的平均体积减小。相反，与对照寡核苷酸治疗的肿瘤相比，被归类为对抗-PD-1有应答的肿瘤表现出约80%的平均体积减小。

如在图18A-D中所示，证实了C59-08与抗-PD-1强烈地协作以诱导CD8 T细胞浸润和能够伴随地产生IFN-γ和TNF-α的多功能细胞的分化。简而言之，组合治疗的肿瘤的CD8+T细胞浸润的数目和活化状态的增加甚至优于在没有C59-08存在下的抗-PD-1-应答性肿瘤。这指示，C59-08具有在抗-PD-1应答者以及抗-PD-1无应答者中改善抗肿瘤应答的能力。

C59-08单一治疗可有效地减小肿瘤体积和诱导干扰素刺激的和炎症性的基因的 表达.

将携带CT26结肠癌的小鼠用C59-08或对照寡脱氧核苷酸肿瘤内地(IT)治疗。在第25天(最后一次治疗以后3天)，由于过度膨大的肿瘤，将注射了CTRL-ODN的组安乐死。在第35天(最后一次治疗以后13天)，将注射了C59-08的组安乐死。在第35天，用C59-08治疗的6只小鼠中的2只排斥肿瘤，没有剩下组织可供收获。在这些情况下，使用0的值计算平均肿瘤体积。使用6个肿瘤结节中的剩余4个提取TIL。

如在图19A-B中所示，C59-08能够抑制肿瘤生长和诱导IFN刺激的(ISG15、ISG20、IRF7、MX1、IP-10和IFIT)和炎症性的(MIG、TNF-α和IFN-γ)基因在从经治疗的肿瘤纯化的白细胞中的表达。这指示，C59-08能够诱导TIL中的有利基因表达谱的持久上调。

总结

针对T细胞表面PD-1受体的抗体起作用以阻断被癌细胞开启的免疫抑制途径(Wolchok和Chan, Nature, 515:496-498, 2014)。现在，如本文中所述的，证实了当单独施用时，或与针对PD-1的抗体组合施用时，被称作C59-08的CpG-C ODN可有效地抑制可移植的结肠癌的鼠CT26模型中的确立的肿瘤的生长。具体地，C59-08能够抑制肿瘤生长，增加TIL的数目，和诱导合乎需要的基因表达谱。尽管单独施用的C59-08不能影响肿瘤排斥，但是证实了C59-08与抗PD-1治疗协作，从而导致确立的肿瘤的排斥和无复发存活的持续时间的增加。惊人的是，肿瘤内C59-08向确立的抗-PD-1治疗的添加导致与肿瘤排斥相关的活化的T细胞的明显浸润。因而，已经证实抗-PD1抗体和CpG-C ODN的组合比任一种单独药剂优越地诱导肿瘤排斥。

实施例5 在具有转移性黑素瘤的患者中与派姆单抗组合的肿瘤内C59-08的1b/2期试验.

部分1 (1b期剂量递增)在具有转移性黑素瘤的患者中评价C59-08的3个递增剂量水平，且部分2 (2期扩增)将由扩增组群组成以进一步评价在特定黑素瘤群体中的效力和安全性。患者群体包括：

1) 转移性黑素瘤患者，其为抗-程序性死亡受体-1/配体-1 (抗-PD-1/L1)未治疗的；

2) 具有经证实的进行性疾病的转移性黑素瘤患者，同时接受抗-PD-1治疗。

在两个部分中，每3周用200 mg IV派姆单抗治疗患者，直到进展或直到第一剂以后45周。

在部分1中，在第1天开始，将患者用4个在2、4或8 mg的每周剂量的C59-08治疗，随后每3周1剂，直到进展或直到第一剂以后24周。将C59-08肿瘤内地注射进病灶A中，在整个试验中使用相同部位。如果在治疗过程中的任何点，病灶A已经完全消退，通过肿瘤旁注射进病灶A的部位中施用剩余的C59-08注射。

在扩增组群中在部分2中，使用选自部分1的剂量用与C59-08组合的派姆单抗治疗每位患者。

在组群1 (抗-PD-1/L1原初)中，在第22天开始，将患者用C59-08治疗每周1次持续4周，随后每3周1次持续9周。

在组群2 (进行性疾病，抗-PD-1治疗)中，在第1天开始，将患者用C59-08治疗每周1次持续4周，随后每3周1次持续9周。

在部分2中，将C59-08肿瘤内地注射进多达四个病灶(病灶A、病灶B、病灶C、病灶D)中，并在整个试验中使用相同部位。如果在治疗过程中的任何点，注射的病灶已经完全消退，通过肿瘤旁注射进所注射的病灶的部位中施用C59-08。

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15.Ahmadzadeh M等人.Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltratingthe tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired.Blood(2009) 114: 1537-1544.

16.Thompson RH等人.PD-1 is expressed by tumor infiltrating cells andis associated with poor outcome for patients with renal carcinoma.Clinical Cancer Research (2007) 15: 1757-1761。

本文中引用的所有参考文献都通过引用并入，如同每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被明确地且单独地指出通过引用并入。美国临时申请62/169,309和62/168,449特此通过引用并入。申请人根据37 C.F.R. §1.57(b)(1)意图用该通过引用并入的声明来表示每个和每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一个按照37 C.F.R. §1.57(b)(2)清楚地鉴别，即使这样的引用不紧接于通过引用并入的专门声明。如果包含的话，在说明书中包含的通过引用并入的专门声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用无意承认：所述参考文献为有关的现有技术，其也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。就所述参考文献提供的声明的术语的定义与在本发明的说明书中提供的定义冲突而言，在本发明的说明书中提供的定义应当用于解释要求保护的发明。

Claims (14)

1.PD-1拮抗剂和TLR9激动剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用包含所述PD-1拮抗剂和所述TLR9激动剂的联合治疗，其中所述TLR9激动剂是具有由5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3' (SEQ ID NO:45)组成的序列的CpG-C型寡核苷酸，并且其中所述PD-1拮抗剂是：

(i) 单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO: 7、8和9的轻链CDR和SEQ IDNO: 10、11和12的重链CDR，或

(ii) 包含重链和轻链的抗-PD-1单克隆抗体，且其中所述重链包含SEQ ID NO:21，且所述轻链包含SEQ ID NO:22。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述CpG-C型寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、头/颈鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌或小细胞肺癌(SCLC)。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述乳腺癌是三重阴性的乳腺癌，所述NSCLC是肺鳞状细胞癌，或所述肾细胞癌是透明细胞肾癌。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症被测试为人PD-L1阳性。

8.根据权利要求2所述的用途，其中以每三周1次200 mg的剂量施用派姆单抗，且以每周1次1-16 mg的剂量肿瘤内施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

9.根据权利要求2所述的用途，其中以每三周1次200 mg的剂量施用派姆单抗，且以每周1次1-16 mg持续4周的剂量，随后是每三周1次1-16 mg的剂量肿瘤内施用SEQ ID NO: 45的寡核苷酸。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其中所述个体当接受先前抗-PD-1治疗时被证实是进行性的。

11.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其中以2.0、4.0或8.0 mg的剂量肿瘤内注射所述寡核苷酸。

12.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其中所述个体以前没有用抗-PD-1治疗或抗-PD-L1治疗进行过癌症治疗。

13.根据权利要求1-12中的任一项所述的用途，其中所述CpG-C型寡核苷酸是钠盐，且所述寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、膀胱癌或结直肠癌。

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