CN114981436A - 新tlr9激动剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的寡核苷酸及其治疗用途。本发明的寡核苷酸可用于活化或调节受试者的免疫。
Description
【技术领域】
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示以引用方式并入的程度相同。
本发明涉及新寡核苷酸或衍生寡核苷酸，其可以与包括TLR9在内的核酸受体结合。本发明还涉及包含该寡核苷酸的药物组合物。本发明还涉及使用该寡核苷酸预防或治疗包括癌症或感染性疾病在内的靶疾病的方法。
【背景技术】
TLR(toll样受体)是识别病原体相关分子模式(PAMP)并且位于细胞膜或核内体膜表面上的受体家族。TLR的活化导致I型干扰素和炎性细胞因子的分泌。从TLR1到TLR10的十种TLR在人类中是已知的。其中，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是核内体驻留的，主要检测核酸。TLR3主要识别双链RNA和称为聚(I:C)的合成RNA(与病毒RNA相似)，而TLR7和TLR8主要识别单链RNA。另一方面，TLR9主要识别单链DNA。在人类中，TLR9在浆细胞样树突细胞(pDC)、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞中表达(Roda,J.M.,et alia,JImmunol,2005.175(3):p.1619-27；Liu,M.,et alia,Nat Immunol,2019.20(3):p.265-275；Hemmi,H.,et alia,Nature,2000.408(6813):p.740-5)。
TLR9激动剂活化pDC和B细胞以促进它们的增殖、炎性细胞因子和抗体的产生、抗原呈递以及共刺激分子和MHC分子的表达。在接受TLR9激动剂的刺激后，pDC和B细胞还会增加趋化因子受体的表达、对细胞凋亡的抗性以及包括促进Th1的趋化因子在内的细胞因子(例如巨噬细胞炎症蛋白1(MIP1)和10kDa的干扰素诱导蛋白(IP10))的产生。记忆B细胞特别是分化为浆细胞，所述浆细胞分泌抗体，这完全取决于TLR9的活化。TLR9激动剂的一个例子是CpG DNA(CpG)。CpG DNA含有未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤，它最初被发现是构成细菌DNA中病原体相关分子模式(PAMP)的重要基序(Krieg,A.M.,Nat Rev Drug Discov,2006.5(6):p.471-84)。
据报道，鉴于结构和功能，CpG-寡脱氧核苷酸(ODN)分为四类。A类ODN，也称为D类ODN，在3'端的几个核苷酸和5'端的几个核苷酸中具有硫代磷酸化骨架。A类ODN包含回文序列，所述回文序列包括可以形成茎环结构的CpG。A类ODN的末端含有聚G序列，所述聚G序列可形成称为G-四分体的平行四链体结构(Puig M.et alia,Nucleic Acids Res.2006,34(22):p.6488-95)。A类ODN强烈促进pDC产生干扰素-α(IFN-α)，但仅微弱地活化B细胞。B类ODN，也称为K类ODN，具有一个或多个CpG序列，并具有其中大部分核苷酸被硫代磷酸化的骨架。B类ODN强烈诱导B细胞增殖，促进B细胞分泌IgM抗体，并诱导pDC分化和成熟。C类ODN具有硫代磷酸酯骨架。C类ODN具有回文序列，其3'端带有CpG，并且该回文序列可以在分子内退火形成发夹结构。C类ODN促进pDC产生IFN-α和B细胞产生IL-6。因此，C类ODN具有与A类ODN和B类ODN相似的功能。P类ODN有两个回文序列。P类ODN可以在分子间退火以在5'端的回文处形成多联体，或在分子内退火以在富含GC的3'端形成发夹结构。P类ODN强烈诱导I型IFN的产生(Scheiermann,J.et alia,Vaccine,2014.32(48):p.6377-89)。
CpG-ODN活化表达TLR9的细胞的机制报道如下。首先，内化的CpG-ODN与核内体中的TLR9结合。一旦CpG-ODN与TLR9结合，与TLR9胞质侧结合的衔接蛋白MyD88就会被磷酸化活化。活化的MyD88通过活化IRF3、5和7等转录因子诱导包括I型干扰素(IFN)在内的细胞因子的转录。活化的MyD88还通过核因子-κB(NF-kB)途径传递信号；MyD88下游的信号泛素化IkB(kB抑制剂或κ-β抑制剂)并诱导IkB降解，从而活化NF-kB。在NF-kB活化后，NF-kB与NF-kB启动子结合并活化靶基因的表达。结果，诱导了炎症细胞因子(如白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6))的产生。
由于CpG-ODN具有上述生物TLR9活化活性，因此施用CpG-ODN适用于治疗和/或预防如下几种疾病或病症。
＜抗癌(肿瘤)活动＞
CpG-ODN可以对肿瘤微环境(TME)产生影响并将冷肿瘤转化为热肿瘤(“Warming“Cold”Melanoma with TLR9 Agonists”,Cancer Discov,2018.8(6):p.670)。TME是由肿瘤细胞和肿瘤周围的免疫细胞、成纤维细胞、血管细胞等非肿瘤细胞构成的环境。TME的状态深刻影响肿瘤进展。冷肿瘤是含有免疫抑制细胞(肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Tregs)等)和只有少数活化的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的构成免疫抑制性TME的肿瘤。冷肿瘤通常对包括免疫疗法在内的癌症治疗有抵抗力。热肿瘤是一种含有抗肿瘤免疫细胞(包括TILs和M1巨噬细胞)的构成免疫活化的TME的肿瘤。热肿瘤通常对癌症治疗有反应。例如，据报道，CpG-ODN的瘤内施用导致T细胞、pDC和NK细胞的增加，Tregs的减少和MDSC的抑制(Shirota,H.,et alia,Vaccines(Basel),2015.3(2):p.390-407)。此外，据报道TLR9激动剂可重新教育促肿瘤M2样巨噬细胞以诱导抗肿瘤M1样巨噬细胞极化(Mantovani,A.,et alia,J Exp Med,2015.212(4):p.435-45)。据报道，CpG-ODN还可增强巨噬细胞的抗肿瘤活性，以吞噬表达“不要吃我信号”的癌细胞，例如CD47(Liu,M.,et alia,Nat Immunol,2019.20(3):p.265-275)。
CpG-ODN还可以抑制单核细胞(CD11b+、Ly6G-、Ly6C高)MDSC的免疫抑制性质，例如T细胞功能的抑制活性(Shirota,Y.,et alia,J Immunol,2012.188(4):p.1592-9)。
＜Th2或Th17介导疾病的预防或治疗＞
CpG-ODN适用于有效预防或治疗Th2或Th17介导的疾病。传统的CpG ODN已被证明具有免疫调节作用，通过活化Th1细胞和Tregs来调节免疫应答的平衡，从而抑制Th2细胞和Th17细胞。认为通过CpG-ODN诱导向Th1细胞分化导致Th2细胞减少是因为Th1细胞和Th2细胞相互抑制彼此分别向Th2细胞或Th1细胞的分化。
最近报道了许多调节Th17细胞和Treg平衡的因素。这些因素的例子是T细胞受体的下游信号、共刺激分子、细胞因子、代谢途径和肠道微生物群(Lee,G.R.,IntJ Mol Sci,2018.19(3):p.730)。据报道，TLR4激动剂LPS可诱导Th17细胞分化，而TLR2激动剂肽聚糖可适度诱导Th17细胞和Th1细胞分化。同时，据报道，CpG-ODN通过产生IFN-α优先诱导Th1细胞分化(Shi,G.,et alia,J Immunol,2013.191(1):p.415-23)。
维持免疫平衡的疗法的可行性也已在体内环境中显示。例如，当将CpG-ODN用于患有溃疡性结肠炎的模型小鼠和患者时，观察到Th17细胞数量以及IL-17和IL-6的产生减少，而Treg数量和IL-10的产生增加，从而导致症状改善(Schmitt,H et alia,J CrohnsColitis,2018,12(Suppl1):p.S003)。还报道了添加CpG通过完全弗氏佐剂降低了小鼠的EAE症状，揭示了CpG在降低Th17介导的发病机制中的作用(Tigno-Aranjuez,JT,et alia,JImmunol,2009,183(9):p.5654-61)。
基于CpG ODN诱导树突细胞产生吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)及Tregs的活化和增殖的观察，还提出CpG-ODN对属于Th17介导的疾病的哮喘和特应性疾病有效(Kline,J.N.,etalia,Drug News Perspect,2008.21(8):p.434-9)。
＜联合疗法＞
此外，据报道，因为CpG-ODN表现出如上所述的免疫活性调节活性，CpG-ODN也适用于联合治疗。以前的报告报告了与下列治疗的组合，包括(i)疫苗；(ii)抗体药物；(iii)常规化疗；(iv)分子靶向药物；(v)外科处置；(vi)细胞因子；(vii)过继免疫细胞疗法(也称为过继细胞转移(ACT))；和(viii)核酸受体激动剂。
【与'(i)疫苗'结合使用】
CpG-ODN可以提高疫苗的免疫原性。例如，CpG-ODN可以与下列疫苗一起施用：抗癌疫苗(例如黑色素瘤抗原疫苗)(Scheiermann,J.et alia,D.M.,Vaccine,2014.32(48):p.6377-89；Shirota,H.,et alia,Vaccines(Basel),2015.3(2):p.390-407)以及抗病毒(诸如巨细胞病毒、疟疾、炭疽和流感病毒等)疫苗(Scheiermann,J.et alia,D.M.,Vaccine,2014.32(48):p.6377-89)。包含CpG-ODN和乙型肝炎抗原的乙型肝炎疫苗
已获得FDA批准。
【与‘(ii)抗体药物’(如免疫检查点抑制剂(CPIs)和细胞毒性抗体)联合使用】
CPI是通过与检查点分子或其配体结合来改变肿瘤微环境或感染细胞周围环境的免疫抑制状态的药物。例如，CpG-ODN与Keytruda(pembrolizumab)的组合已在进行性黑色素瘤的临床试验中得到检验(Ribas,A.,et alia,Cancer Discov,2018.8(10):p.1250-1257)。与Yervoy(ipilimumab)联合使用的临床试验也已进行，目的是治疗进行性实体瘤(Reilley,M.,et alia,Journal of Clinical Oncology,2019.37(15_suppl):p.TPS2669-TPS2669)。有趣的是，这表明CpG-ODN和CPI的组合对于对标准治疗有抵抗力的患者是有效的。例如，据报道，即使患者对CPI(如PD-1抗体)具有抗性，CpG-ODN和CPI的组合也显示出抗肿瘤活性(Wang,S.,et alia,Proc Natl Acad Sci U S A,2016.113(46):p.E7240-E7249)。细胞毒性抗体是诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的药物。已经报道了通过组合使用CpG-ODN和细胞毒性抗体的协同效应(Hiramatsu,K.,et alia,Cancer Sci,2015.106(10):p.1474-8)。例如，CpG-ODN与Rituxan(rituximab)的组合已在非霍奇金淋巴瘤的临床试验中进行了检查(Friedberg,J.W.,et alia,Blood,2005.105(2):p.489-95)。还表明，即使患者对赫赛汀(曲妥珠单抗)等细胞毒性抗体有抗性，CpG寡核苷酸、聚(I:C)和细胞毒性抗体的组合也具有抗肿瘤活性(Charlebois,R.,et alia,Cancer Res,2017.77(2):p.312-319)。
【与“(iii)常规化疗”相组合】
常规化疗药物由抑制快速生长的肿瘤细胞增殖并杀死这些细胞的化学物质制成。例如，在临床研究中检查了铂类药物、紫杉烷类药物和CpG-ODN的组合(Krieg,A.M.,J ClinInvest,2007.117(5):p.1184-94)。
【与‘(iv)分子靶向药物’相组合】
常规的分子靶向药物一般由与特定的靶分子结合并调节其功能的小分子制成。靶向分子的例子是那些导致致癌、与驱动突变相关或参与肿瘤细胞稳态的分子。例如，CpG和硼替佐米在多发性骨髓瘤中的协同作用在临床前环境中被报道，并得出结论构成在临床阶段进行测试的可行性基础(Ray,A.,et alia,Leukemia,2014.28(8):p.1716-24)。
【与(v)外科处置(包括放射疗法、冷冻消融和高频消融)相结合】
据报道，在手术切除后施用CpG-ODN提高了存活率(Weigel,B.J.,et alia,ClinCancer Res,2003.9(8):p.3105-14)。放射疗法是一种用放射线破坏正在增殖的肿瘤细胞的DNA并杀死这些细胞的治疗方法。冷冻消融是一种冷冻和杀死肿瘤细胞的治疗方法。高频消融是一种利用射频产生的热量使肿瘤细胞凝固并杀死这些细胞的治疗方法。CpG-ODN被认为可有效激发针对由这些治疗杀死的死细胞释放的肿瘤抗原的免疫(
B.et alia,G.J.,Update Cancer Ther,2008.3(1):p.27-32)。
【与'(vi)细胞因子'相组合】
细胞因子的例子是IFN-α和IL-18，它们活化NK细胞或树突细胞。据报道，IL-18和CpG-ODN的组合诱导恶性B细胞凋亡，这些B细胞分泌颗粒酶，进一步杀死邻近的恶性B细胞(
B.et alia,Update Cancer Ther,2008.3(1):p.27-32)。
【与'(vii)过继免疫细胞疗法'相组合】
过继性免疫细胞疗法是一种施用离体修饰的免疫细胞的疗法；此类疗法的例子如下：CAR-T疗法，其利用针对特定癌症抗原的TCR转导的转基因T细胞，以及来自体外刺激抗肿瘤作用的患者或供体的免疫细胞(例如TIL或树突细胞)(Xu,L.,et alia,Clin DevImmunol,2010.2010:p.410893)。
【与“(viii)核酸受体激动剂”相组合】
据报道，与TLR7/8激动剂的组合在临床试验中显示出协同效应(Shirota,H.,etalia,Vaccines(Basel),2015.3(2):p.390-407)。据报道，TLR9激动剂(例如CpG)和干扰素基因刺激剂(STING)激动剂之间的协同作用可增强Th1偏向免疫应答，例如PBMC中抗原特异性IgG和IFN-γ的产生，以及细胞毒性CD8(+)T细胞反应(Temizoz B.,et alia,Eur JImmunol,2015,45(4):p.1159-69)。
＜支持CpG施用等联合治疗的机制＞
上述一些治疗或药物已显示诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，并检查与CpG-ODN的组合。ICD是一种细胞死亡，其中被ICD杀死的细胞残骸或垂死细胞通过分泌DAMP诱导强烈的免疫应答；据报道，构成DAMP的分子是例如钙网蛋白、高迁移率基团盒(HMGB)、热休克蛋白或ATP。与通常的细胞死亡相比，已观察到此类DAMP数量增加(Bedognetti,D.,et alia,JImmunotherCancer,2019.7(1):p.131)。一些化疗药物和一些分子靶向药物被称为ICD诱导剂；此类ICD诱导剂包括多柔比星、米托蒽醌、奥沙利铂和硼替佐米。放射和光动力疗法(PDT)也被称为ICD的诱导剂(Galluzzi,L.,et alia,Nat Rev Immunol,2017.17(2):p.97-111)。
检查抑制或杀死Treg的一些治疗或药物与上述CpG-ODN的组合。例如，CpG-ODN在用抗CD25抗体耗尽Treg后协同增强免疫应答(Jarry,U.,et alia,JNeuroimmunol,2014.267(1-2):p.35-42)。
因此，CpG-ODN可以单独施用或与至少一种活性成分组合施用，用于以下药学目的：(i)预防和治疗肿瘤包括癌症(例如，转移性实体癌、黑色素瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等)和感染性疾病的免疫调节作用，(ii)预防或治疗免疫介导疾病(例如与Th2/Th17相关的疾病，包括某些类型的自身免疫性疾病和过敏性疾病)的免疫调节作用和(iii)调节表达TLR7/9的肿瘤细胞对抗癌药物和免疫细胞的反应性。
【引文列表】
【专利文献】
WO2014/082254A
JP5011520B
WO2004/016805A
【非专利文献】
(未列出作者),Warming“Cold”Melanoma with TLR9 Agonists.Cancer Discov,2018.8(6):p.670.
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【发明概要】
【技术问题】
本发明提供新的TLR激动剂及其治疗用途。
【技术方案】
发明人新发现：
(1)本发明的寡核苷酸可用于活化或调节受试者的免疫；和
(2)本发明的寡核苷酸特别可用于治疗患有包括肿瘤、微生物感染、原发性免疫缺陷病和与Th2/Th17相关的疾病在内的疾病的受试者或用于预防这些疾病。
本发明包括以下实施例：
(1)单链寡核苷酸，其包含序列基序5'-tcgcaacgttt-3'(SEQ ID NO：1)和5'-cgacg-3'。
(2)根据(1)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含核苷酸序列基序5'-tcgcaacgtt t-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3'(SEQ ID NO：2)，其中n表示任意碱基。
(3)根据(1)或(2)所述的寡核苷酸，其中所述总碱基数为20～25，优选为21～24，更优选为22～23。
(4)根据(1)～(3)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的序列基序：
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga(SEQ ID NO：54)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga(SEQ ID NO：55)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga(SEQ ID NO：56)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga(SEQ ID NO：57)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg(SEQ ID NO：58)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg(SEQ ID NO：59)；
5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga(SEQ ID NO：60)；
5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga(SEQ ID NO：61)；
5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga(SEQ ID NO：62)；和
5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga(SEQ ID NO：63)。
(5)根据(1)～(4)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述核苷酸间键被部分或完全化学修饰。
(6)根据(5)所述的寡核苷酸，其中所述化学修饰的核苷酸间键是硫代磷酸化的。
(7)根据(6)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的部分硫代磷酸化的寡核苷酸延伸体：
5'-tCgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：16)；
5'-tCgcaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：17)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：18)；
5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：19)；
5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttCgA-3'(SEQ ID NO：20)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：21)；
5'-tCgCaaCgtt tgCgaCgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：22)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：23)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：24)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：26)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgcCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：27)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg taCgA-3'(SEQ ID NO：28)；
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5'-tCgCaaCgtt tacgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：30)；
5'-tCgCaaCgtt tacgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：31)；
5'-tCgCaaCgtt tacgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：32)；
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5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：35)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：36)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：37)；
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5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgG-3'(SEQ ID NO：41)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgG-3'(SEQ ID NO：42)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg ttCgG-3'(SEQ ID NO：43)；和
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg ttCgG-3'(SEQ ID NO：44)；
其中所述大写字母表示在3'处无修饰的核苷酸间键的核苷，小写字母表示在3'处有带硫代磷酸化的核苷酸间键的核苷。
(8)根据(6)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的部分硫代磷酸化的寡核苷酸延伸体：
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：33)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：34)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：35)；和
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：36)，
其中所述大写字母表示在3'处无修饰的核苷酸间键的核苷，小写字母表示在3'处有带硫代磷酸化的核苷酸间键的核苷。
(9)根据(1)～(8)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由DNA构成。
(10)根据(1)～(9)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸进一步缺失、替换或添加了一个或多个核苷酸。
(11)根据(1)～(10)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在表达载体中。
(12)根据(1)～(10)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是环化的。
(13)根据(1)～(10)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是线性的。
(14)根据(13)所述的寡核苷酸，其中线性寡核苷酸的3'端无磷酸。
(15)双链寡核苷酸，其含有(1)～(10)之任一项所述的寡核苷酸及其互补链寡核苷酸。
(16)根据(1)～(15)之任一项所述的寡核苷酸，其与活性分子缀合。
(17)根据(16)所述的寡核苷酸，其中所述活性分子选自(多)肽/抗体和核酸/寡核苷酸。
(18)根据(16)或(17)所述的寡核苷酸，其中所述缀合是通过接头进行的。
(19)根据(18)所述的寡核苷酸，其中所述接头选自：甘油、(S)-(-)-1,2,4-丁三醇、1,3,5-戊三醇、顺式,顺式-1,3,5-环己三醇、顺式,反式-1,3,5-环己三醇、1,3,5-三-(2-羟乙基)异氰脲酸酯、四乙二醇、六乙二醇、二醇(1,3-丙二醇或十二烷-1,12-二醇、环己二醇等)、胆甾醇、硝基吲哚、三乙二醇、六乙二醇、d-间隔基、PEG-间隔基和烷基接头。
(20)药物组合物，其包含治疗有效量的根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。
(21)用于预防或治疗靶疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸，其中所述靶疾病或病症是选自下列的任一种：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
(22)根据(21)所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是选自下列的肿瘤：恶性肿瘤、上皮肿瘤或造血器官肿瘤、肉瘤、间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。
(23)根据(21)所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是由包括病毒、细菌或真菌在内的微生物引起的感染性疾病。
(24)根据(21)所述的药物组合物，其中所述靶疾病或障碍是选自下列的与Th2/Th17相关的疾病：哮喘、特应性疾病、过敏症、多发性硬化症、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
(25)根据(21)所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是由下列原因引起的原发性免疫缺陷疾病：IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变。
(26)根据(20)或(21)所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种活性成分。
(27)根据(20)或(21)所述的药物组合物，其中所述组合物与至少一种活性成分共施用。
(28)根据(26)或(27)所述的药物组合物，其中所述有效成分选自：抗癌药；分子靶向药物(包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂和蛋白酶体抑制剂)；抗癌抗体药物；细胞因子；疫苗；抗细菌剂；抗真菌剂；抗病毒剂；抗寄生虫药；中和毒素的抗体药物；其他TLR的激动剂及其组合。
(29)根据(20)或(21)所述的药物组合物，其中所述组合物通过选自下列的施用途径施用于受试者：肠内施用、肠胃外施用、局部施用和吸入。
(30)根据(29)所述的药物组合物，其中所述受试者是人。
(31)根据(30)所述的药物组合物，其中所述组合物以0.3～60mg/天，优选1～30mg/天，更优选2～8mg/天的量施用于受试者。
(32)根据(20)或(21)所述的药物组合物，其中所述组合物在过继性免疫细胞疗法或外科处置(包括放射疗法、冷冻消融、高频消融和光动力疗法(PDT))之前或之后施用。
(A1)根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸在制备用于治疗或预防选自下列的靶疾病或病症的药物中的用途：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
(A2)根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸在制备用于调节受试者免疫应答的药物中的用途。
(A3)根据(A1)所述的用途，其中所述靶疾病或病症是选自下列的肿瘤：恶性肿瘤、上皮肿瘤或造血器官肿瘤、肉瘤、间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。
(A4)根据(A1)所述的用途，其中所述靶疾病或障碍是由包括病毒、细菌或真菌在内的微生物引起的感染性疾病。
(A5)根据(A1)所述的用途，其中所述靶疾病或障碍是选自下列的与Th2/Th17相关的疾病：哮喘、特应性疾病、过敏症、多发性硬化症、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
(A6)根据(A1)所述的用途，其中所述靶疾病或病症是由下列原因引起的原发性免疫缺陷疾病：IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变。
(A7)根据(A1)或(A2)所述的用途，其中所述药物进一步包含至少一种活性成分。
(A8)根据(A1)或(A2)所述的用途，其中所述药物与至少一种活性成分共施用。
(A9)根据(A7)或(A8)所述的用途，其中所述活性成分选自：抗癌药；分子靶向药物(包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂和蛋白酶体抑制剂)；抗癌抗体药物；细胞因子；疫苗；抗细菌剂；抗真菌剂；抗病毒剂；抗寄生虫药；中和毒素的抗体药物；其他TLR的激动剂及其组合。
(A10)根据(A1)或(A2)所述的用途，其中所述药物通过选自下列的施用途径施用于受试者：肠内施用、肠胃外施用、局部施用和吸入。
(A11)根据(A10)所述的用途，其中所述受试者是人。
(A12)根据(A11)所述的用途，其中所述药物以0.3～60mg/天，优选1～30mg/天，更优选2～8mg/天施用于受试者。
(A13)根据(A1)或(A2)所述的用途，其中所述药物在过继性免疫细胞疗法或外科处置(包括放射疗法、冷冻消融、高频消融和光动力疗法(PDT))之前或之后施用。
(B1)治疗或预防受试者的靶疾病或病症的方法，其包括将根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸施用于受试者，其中所述靶疾病或病症是选自下列的任一种：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)；优选地，其中通过用寡核苷酸在受试者中活化NF-kB来治疗或预防所述靶疾病或病症。
(B2)根据(B1)所述的方法，其中所述靶疾病或病症是选自下列的肿瘤：恶性肿瘤、上皮肿瘤或造血器官肿瘤、肉瘤、间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。
(B3)根据(B1)所述的方法，其中所述靶疾病或障碍是由包括病毒、细菌或真菌在内的微生物引起的感染性疾病。
(B4)根据(B1)所述的方法，其中所述靶疾病或障碍是选自下列的与Th2/Th17相关的疾病：哮喘、特应性疾病、过敏症、多发性硬化症、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
(B5)根据(B1)所述的方法，其中所述靶疾病或病症是由下列原因引起的原发性免疫缺陷疾病：IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变。
(B6)根据(B1)所述的方法，其中所述寡核苷酸与至少一种活性成分共施用。
(B7)根据(B6)所述的方法，其中所述活性成分选自：抗癌药；分子靶向药物(包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂和蛋白酶体抑制剂)；抗癌抗体药物；细胞因子；疫苗；抗细菌剂；抗真菌剂；抗病毒剂；抗寄生虫药；中和毒素的抗体药物；其他TLR的激动剂及其组合。
(B8)根据(B1)所述的方法，其中所述寡核苷酸通过选自下列的施用途径施用于受试者：肠内施用、肠胃外施用、局部施用和吸入。
(B9)根据(B8)所述的方法，其中所述受试者是人。
(B10)根据(B9)所述的方法，其中将所述寡核苷酸以0.3～60mg/天，优选1～30mg/天，更优选2～8mg/天施用于受试者。
(B11)根据(B1)所述的方法，进一步包括过继性免疫细胞疗法或外科处置(包括放射疗法、冷冻消融、高频消融和光动力疗法(PDT))的步骤。
(C1)一种在受试者中刺激免疫应答的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸以在受试者中诱导炎性细胞因子。
(C2)一种在受试者中将偏向Th2的免疫应答重定向到偏向Th1的免疫应答的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸以在所述受试者中诱导炎性细胞因子。
(C3)根据(C1)或(C2)所述的方法，其中所述炎性细胞因子选自：IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12。
(D1)根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸，用于预防或治疗靶疾病或病症，其中所述靶疾病或病症是选自下列的任一种：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
(D2)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述靶疾病或病症是选自下列的肿瘤：恶性肿瘤、上皮肿瘤或造血器官肿瘤、肉瘤、间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。
(D3)根据(D1)所述的寡核苷酸，其中所述靶疾病或障碍是由包括病毒、细菌或真菌在内的微生物引起的感染性疾病。
(D4)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述靶疾病或病症是选自下列的与Th2/Th17相关的疾病：哮喘、特应性疾病、变态反应、多发性硬化、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
(D5)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述靶疾病或病症是由下列原因引起的原发性免疫缺陷疾病：IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变。
(D6)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与至少一种活性成分共施用。
(D7)根据(D6)使用的寡核苷酸，其中所述活性成分选自：分子靶向药物(包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂、蛋白酶体抑制剂)、抗癌抗体药物和细胞因子及其组合。
(D8)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过选自下列的剂量途径施用于受试者：肠内施用、肠胃外施用、局部施用和吸入。
(D9)根据(D8)使用的寡核苷酸，其中所述受试者是人。
(D10)根据(D9)使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸以0.3～60mg/天，优选1～30mg/天，更优选2～8mg/天施用于受试者。
(D11)根据(D1)使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在过继性免疫细胞疗法或外科处置(包括放射疗法、冷冻消融、高频消融和光动力疗法(PDT))之前或之后施用。
(E1)根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸用于治疗或预防选自下列的靶疾病或病症的用途：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
(F1)用于调节免疫应答的体内或体外试剂，其包含有效量的根据(1)～(19)之任一项所述的寡核苷酸。
【本发明的有益效果】
本发明可以提供新的CpG寡核苷酸和该寡核苷酸的治疗用途。
【附图简述】
【图1】TLR激动剂在人浆细胞样树突细胞(pDC)细胞系中活化NF-kB并产生促炎细胞因子
CAL-1/NF-kB-GFP细胞系设计用于监测NF-kB转录因子在基于细胞的测定中的活性。将由NF-kB共有转录反应元件驱动的编码GFP报告基因的载体转染到人pDC细胞系CAL-1中。
A.用1μM(微摩尔)本发明的寡脱氧核苷酸(ODN)或阳性对照刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。由TLR9激动剂诱导的GFP表达由点图显示。
B.描述ODN用TLR9活化的CAL-1/NF-kB-GFP细胞的比率的图表。用0.3μM本发明的ODN或阳性对照刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。CpG2395样品中GFP阳性细胞的比例设为100％。通过比较GFP阳性细胞与CpG2395的比例来计算每个ODN的活性。
C.用1.0μM本发明的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。A003#delA的活性与A003相比稍弱，但活性仍远强于标准TLR9激动剂之一CpG2395(见图1A)。A003#endG和A003的TLR9活化活性水平相近，说明3'端的核苷对活性不重要。
D.用1μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时，回收培养上清液。通过ELISA评估细胞因子的产生。
E、F.用1.0μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。检查GFP表达(图1E)并通过ELISA评估培养上清液中的细胞因子产生(图1F)。A003和A013的活性相互比较几乎处于同一水平，说明寡核苷酸中碱基的改变不影响活性。
G.用1.0μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时并检查GFP表达。A001/A011、A002/A012、A003/A013或A004/A014的每组都表现出相同的活性，表明每组ODN的碱基变化不会影响活性。
【图2】人TLR7和TLR8活化
A.用TLR激动剂刺激HEK blueTM TLR7细胞24小时。如图所示，TLR7激动剂Gardiquimod(GQ)和CL264活化TLR7并给出阳性信号。相反，0.3μM的标准TLR9激动剂CpG2395和本发明的ODN(A001～A004)不能活化TLR7信号通路。
B.用ODN刺激HEK blueTM TLR8细胞24小时。如图所示，TLR8激动剂TL8-506和CL075活化TLR8并给出阳性信号。相比之下，CpG2395和A001～A004(0.3μM)不能活化TLR8信号通路。
【图3】NF-kB活化和促炎细胞因子的产生
A.用0.3μM本发明的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。CaaCg对人类TLR9的活化很重要。
B.用0.3μM或0.1μM本发明的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。显示了GFP阳性细胞的比例(以％显示)。
C.用0.3μM或0.1μM本发明的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。A303、A603和A703显示出比其他测试的ODN更高的活性，这表明CaaCg的存在比Cg的数量更重要。
D.用0.3μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时，回收培养上清液。通过ELISA评估细胞因子的产生。A403和A503清楚地显示出较低水平的细胞因子产生的诱导活性，表明CaaCg对于最佳TLR9刺激很重要。
E.用0.3μM本发明的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。图中将CpG2395的GFP阳性细胞比例设为100％。每个ODN的活性由与CpG2395比较的GFP阳性细胞比率计算。DV093和DV094显示出比A003更低的TLR9活性，这表明位于A003中的特定caacg基序(但不是随机位置的caacg基序)对TLR9活性很重要。
F.用0.3μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。CpG2395的GFP阳性细胞比例设定为100％。每个ODN的活性是根据与CpG2395相比的GFP阳性细胞比率计算的。请注意，在DV093和DV094中，通过核苷酸间键的变化从caacg延伸体到CaaCg延伸体的结构变化不会增强TLR9活性。
【图4】本发明的ODN的3'区的可有可无的核苷酸
A、B.用0.3μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞6小时。GFP阳性细胞的比例(％)显示在(B)中。与A601、A602、A603、A604、A605、A606和A607相比，标准TLR9激动剂CpG2006的活性要弱得多(B)。
【图5】人TLR7和TLR8活化
A.用ODN或阳性对照刺激HEK blueTM TLR7细胞24小时。TLR7激动剂CL264活化TLR7并给出阳性信号。相比之下，CpG2395、A601、A602和A603(0.3μM)不能活化TLR7信号通路。
B.用ODN或阳性对照刺激HEK blueTM TLR8细胞24小时。TLR8激动剂CL075活化TLR8并给出阳性信号。相比之下，CpG2395、A601、A602和A603(0.3μM)不能活化TLR8信号通路。
【图6】ODN中间的核苷酸间键的变化和碱基变化对TLR9活化活性的影响可以忽略不计。
A.用A601、A601G、A602或A602G(0.3μM)刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞3小时。
B.用A601G、A611A、A602G或A612A(0.3μM)刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞3小时。
C.用0.3μM的ODN刺激CAL-1/NF-kB-GFP细胞3小时。显示了GFP阳性细胞的比例(％)。
【图7】人TLR7和TLR8活化
A.用TLR激动剂刺激HEK blueTM TLR7细胞24小时。TLR7激动剂CL264活化TLR7并给出阳性信号。相比之下，CpG2395、A601G、A611A、A602G和A612A(0.3μM)不能活化TLR7信号通路。
B.用TLR激动剂刺激HEK blueTM TLR8细胞24小时。TLR8激动剂CL075活化TLR8并给出阳性信号。相比之下，CpG2395、A601G、A611A、A602G和A612A(0.3μM)不能活化TLR8信号通路。
【图8】在人B细胞或人PBMC中诱导细胞因子产生的活性
A.用本发明的ODN在1μM刺激HAL-01细胞24小时。用抗CD40抗体(Ab)和抗CD86 Ab对细胞进行染色。用流式细胞仪评估CD40和CD86表达的诱导。
B.用本发明的ODN(0.1μM)刺激人PBMC 24小时，并用WST-1测定评估细胞增殖。
C.用本发明的ODN(0.3μM)刺激人PBMC 24小时，回收培养上清液。用ELISA评估细胞因子的产生。
【图9】对小鼠细胞的激动活性
A.用本发明的ODN刺激小鼠脾细胞24小时，回收上清液。用ELISA评估细胞因子的产生。
B、C.用本发明的ODN刺激小鼠脾细胞48小时。用WST-1测定评估细胞增殖。A601、A602和A603表现出比标准TLR9激动剂CpG2395和CpG2006更强的活性。
【图10】体内抗肿瘤活性
A.CT26细胞被接种到右侧，小鼠保持无处置2周。测量肿瘤体积并根据肿瘤体积将小鼠分为3组。在分组日(第0天)将本发明的ODN或PBS施用到瘤周区域，并在第2天重复。本发明的ODN在研究期间总共施用两次。每两天测量每组小鼠的肿瘤体积。
B.每天每只小鼠的肿瘤体积。
C.研究期间各组小鼠体重的平均值。在所有组中均未观察到严重的体重减轻。
【图11】抗肿瘤免疫记忆的诱导
A.CT26细胞被接种到右侧，小鼠保持无处置2周。测量肿瘤体积并根据肿瘤体积将小鼠分为3组。本发明的ODN或PBS的施用在分组日(第0天)开始并在第2天重复。本发明的ODN在研究期间总共施用两次。每两天测量每组小鼠的肿瘤体积。
B.CT26细胞在第14天重新接种于各组小鼠的左侧腹部，然后继续保持小鼠无处置。在CT26重新接种后14天，测量左侧的肿瘤体积。注意，用本发明的ODN治疗的小鼠在2周内没有任何进一步的治疗就拒绝了再次攻击的肿瘤，表明本发明的ODN诱导了抗肿瘤免疫的记忆。
【图12】在肺转移模型中的体内功效
为了诱导CT26细胞的肺转移，将细胞悬浮液从尾静脉(第0天)静脉内注射到BALB/c小鼠(5×105个细胞/小鼠)。第1天，开始施用本发明的ODN(背部皮肤皮下注射，40μg/50μl/小鼠)。第5天再次施用相同剂量的ODN。第18天处死小鼠。测量肺重量并计数小鼠每个肺中的转移性肿瘤结节。
【图13】对肿瘤转移的全身作用
A.为了诱导CT26细胞的肺转移，将细胞悬浮液从尾静脉(第0天)静脉注射到BALB/c小鼠(5×105个细胞/小鼠)。在肿瘤接种的第二天(第1天)，开始施用A602。测试了两种施用途径。一种是背部皮肤皮下(SC)注射，另一种是耳根皮内(ID)注射(25μg/小鼠)。在第3天和第5天进行相同剂量的施用。在第16天，处死小鼠并计数小鼠每个肺中的转移性肿瘤结节(右图)。照片：第16天受试小鼠的离体肺。
B.为了诱导CT26细胞的肝转移，将细胞悬浮液注射到脾脏(1×105个细胞/小鼠，第0天)。第2天，根据体重将小鼠分成3组，开始施用A602。本研究测试了两种施用途径，即背部皮肤皮下注射和耳根内注射(12.5μg/小鼠)。在第5天、第8天和第12天也进行相同剂量的施用。在第20天，处死小鼠并计数小鼠每个肝脏中的转移性肿瘤结节。
【图14】活化的PBMC消除B-ALL细胞
A.将人PBMC与人B-ALL细胞RCH-ACV以及本发明的ODN(0.1μM)共培养3天，用CD19和CD138抗体染色后通过流式细胞仪分析全细胞。
B.与设置为100％的非刺激样本相比，描述了样本中RCH-ACV集团的比率。
【图15】活化的PBMC消除结肠癌细胞
A.将人PBMC(5×105)与人结肠癌细胞COLO205以及本发明的ODN(0.1μM)共培养3天，用CD45和CD24抗体染色分析整个细胞。
B.与设置为100％的非刺激样本相比，描述了样本中COLO205集团的比率。
【图16】对免疫细胞的影响
A.用本发明的ODN(0.15μM)刺激人PBMC和小鼠脾细胞24小时，用WST-1测定评估细胞增殖。
B.将人PBMC与癌细胞(RCH-ACV或COLO205)连同本发明的ODN(0.1μM)共培养3天。评估了人PBMC对癌细胞的消除。通过与设定为100％的未刺激样品进行比较来描述样品中癌细胞的比例。
【优选实施方式】
除非另有说明，否则本发明中的所有术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文另有说明，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指称。类似地，除非上下文另有说明，否则“或”一词旨在包括“和”。在本说明书中，术语“一些”是指从2到3的数字。在本说明书中，术语“若干”是指从2到6的数字。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。治疗(Treat、treating或treatment)应具有相同的含义，而不涉及语法。同样，预防(prevent、preventing或prevention)应具有相同的含义，而无需考虑语法。
“核苷酸”：核苷酸构成核酸分子，例如DNA、RNA以及DNA和RNA的嵌合分子。核苷酸可以由碱基、磷酸和糖组成。核苷酸可以是核苷的磷酸酯。
“核苷”：核苷可能由碱基和糖分子组成，是核苷酸的组成部分。核苷可以包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷、腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷。
“寡核苷酸”：寡核苷酸是通过核苷酸间键连接的核苷酸的聚合物/寡聚体。寡核苷酸的构象可以是线性的或环状的。
“碱基”：碱基是核苷酸和核苷的成分之一。天然碱基包括两组，嘌呤碱基如鸟嘌呤和腺嘌呤，以及嘧啶碱基如胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。
“糖”：糖是核苷酸和核苷的成分之一。基本上，DNA中含有的糖是脱氧核糖，而RNA中含有的糖是核糖。
“核苷酸间连接”：核苷酸间连接是指核酸分子的两个相邻核苷酸之间的连接。
核苷酸、核苷、碱基和糖的一部分可以被称为它们的类似物的另一种分子取代或修饰。例如，核苷酸可以进一步包括非天然人工核苷酸如PNA；碱基还可包括非天然碱基，例如次黄嘌呤(即，作为核苷的肌苷)；并且糖可以包括非天然伪影，例如锁定核酸中的2'-4'桥。
在本申请中，“(序列)基序”仅基于“碱基”来规定，而“(序列)延伸体”基于“碱基”、“糖”和“核苷酸间连接”来规定。
本发明的寡核苷酸可以由具有脱氧核糖骨架的脱氧核糖核酸、具有核糖骨架的核糖核酸或其混合物构成；糖主链也可以用合成分子(例如锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉代或肽核酸(PNA))代替。本发明的寡核苷酸可包含化学修饰的核苷和/或修饰的核苷酸间键以增强一种或多种特性，例如核酸酶抗性或药代动力学。
化学修饰的核苷可以包括如下修饰的碱基或具有相关结构的碱基，但不限于：8-卤素(溴、氯、氟、碘)-、8-氨基-、8-硫醇-、8-硫代烷基-、8-羟基-、8-氮杂-、8-氧代-和其他8-取代的嘌呤；5-卤素(溴、氯、氟、碘)-、5-二氟甲基-、5-三氟甲基-、5-羟基、5-羧基-、5-羟甲基-、5-溴乙烯基-、5-甲酰基-、5-氮杂-,5-炔基-5-丙炔基-,5-(C1-C6)-烷基-,5-(C2-C6)-烯基-,5-(C2-C6)-炔基-和其他5-取代的嘧啶；5,6-二羟基-5,6-二氢胸腺嘧啶，N6-甲基-腺嘌呤；N4-乙基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶和其他N4-取代的胞嘧啶；2-巯基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、4-硫代尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤，2,4-二氨基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤和其他N2-取代鸟嘌呤。修饰的核碱基也可以是被其他杂环取代的碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。修饰的核碱基还可以包含额外的稠合环，并且这种核碱基的实例是N6-乙烯腺苷、N4-乙烯胞苷、N2-乙烯鸟苷和其他相关衍生物。
核苷酸间键是寡核苷酸/多核苷酸中核苷酸之间的共价骨架键。通常，天然核苷酸间键是磷酸二酯结构，但据报道各种修饰会影响分子的化学或物理性质。可用于本发明寡核苷酸的修饰核苷酸间键的化学修饰包括将天然磷酸二酯结构转化为以下键结构：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酸乙酯、膦酰基乙酸酯、α-羟基苄基磷酸酯、异丙基-苯氧基乙酸酯、硼酸磷酸酯、膦酸羧酸酯、α-羟基苄基膦酸酯、磷酸酯-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、磷酸三酯、磷酸三酯酰胺、醚、缩醛、硫醚、硫缩醛、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酸酯、氨基甲酸酯、尿素、硫脲、磺酰胺或磺酰脲、碳酸酯、羧甲基、酰胺、环氧乙烷接头、磺酸酯、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基氨基羰基、亚甲基亚氨基(MMI)、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼(MDH)、和亚甲氧基甲基亚氨基。
本发明的寡核苷酸可以是但不限于单链脱氧核糖核酸、单链核糖核酸或其嵌合分子。本发明的寡核苷酸可以是单链、双链或单链和双链的杂合体。它们还可以通过连接单个分子的5'和3'端形成环状结构；本发明的多于一种寡核苷酸可以通过共价键或通过在5'或3'端的独特接头连接以形成串联连接的细长结构或多价结构。寡核苷酸可以在分子间或分子内退火以形成细长结构、多聚体结构或多联体。寡核苷酸可以与其他分子结合以形成多聚体。本发明的寡核苷酸可以与其他寡核苷酸结合。本发明的寡核苷酸可以包含在包括质粒载体和病毒载体在内的表达载体中。
本发明的寡核苷酸可以包含CpG基序，即非甲基化二核苷酸、胞嘧啶和鸟嘌呤。
本发明的寡核苷酸可以包含共同的序列基序，tcgcaacgtt t(SEQ ID NO：1)和cgacg，优选地，tcgcaacgtt t-n-cgacg-n-cg-nn-cg(SEQ ID NO：2)，或更优选地，tcgcaacgtt t-r-cgacg-k-cg-bd-cg(SEQ ID NO：3)；其中a、t、c或g中的每一个表示碱基，分别对应于腺嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤；n表示任意碱基；r表示腺嘌呤或鸟嘌呤；k分别表示鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶；b表示胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶；d表示腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶。本发明的寡核苷酸可以在基序的3'具有r(腺嘌呤或鸟嘌呤)，形成tcgcaacgtt t-r-cgacg-k-cg-b n-cg-r(SEQ ID NO：4)。
本发明的寡核苷酸可以包含硫代磷酸化的核苷酸间键。每个硫代磷酸化核苷酸间键可以包含立体α-磷原子，产生R或S非对映异构体。硫代磷酸化的核苷酸间键也可以包含二硫代磷酸酯结构。本发明的寡核苷酸优选在具有部分硫代磷酸酯或磷酸二酯核苷酸间键的寡核苷酸的5'区域中包含特征性的部分硫代磷酸酯延伸体CaaCg，其中所述大写字母表示具有不稳定的3'核苷酸间键(例如没有磷酸二酯键非天然化学修饰)的核苷，小写字母表示3'核苷酸间键为稳定结构(例如硫代磷酸酯键)的核苷。
本发明的寡核苷酸的部分硫代磷酸化形式可优选包含部分硫代磷酸化的延伸体，例如tCgCaaCgtt t-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg(SEQ ID NO：5)，其中所述小写字母表示具有3'核苷酸间键是稳定的结构，例如硫代磷酸酯键。
上述基序或延伸体需要位于同一寡核苷酸的行中；基序可以通过核苷酸的插入在中间分开，但每个位置插入的核苷酸优选为1或2。上述基序可以突变，但核苷酸突变在每个基序中优选为1或2。基序可以在末端部分缺失至多2个碱基。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以选自具有表1所示的以下序列基序的寡核苷酸，其中所述核苷酸间键可以选自天然的(例如磷酸二酯)或合成的(例如硫代磷酸化))或其混合物：
【表1】
| 序列 | SEQ ID NO |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga | SEQ ID NO：54 |
| tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga | SEQ ID NO：55 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga | SEQ ID NO：56 |
| tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga | SEQ ID NO：57 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg | SEQ ID NO：58 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg | SEQ ID NO：59 |
| tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga | SEQ ID NO：60 |
| tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga | SEQ ID NO：61 |
| tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga | SEQ ID NO：62 |
| tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga | SEQ ID NO：63 |
在另一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以在核苷酸间键中完全硫代磷酸化。本发明的寡核苷酸的例子如下表2所示：
【表2】
| 序列 | SEQ ID NO |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcgA | SEQ ID NO：6 |
| tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcgA | SEQ ID NO：7 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA | SEQ ID NO：8 |
| tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcgA | SEQ ID NO：9 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcG | SEQ ID NO：10 |
| tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgG | SEQ ID NO：11 |
| tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcgA | SEQ ID NO：12 |
| tcgcaacgtt tacgacggcg ctcgA | SEQ ID NO：13 |
| tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcgA | SEQ ID NO：14 |
| tcgcaacgtt tacgacggcg ttcgA | SEQ ID NO：15 |
上述序列中的大写字母表示核苷或以磷酸二酯键作为3'核苷酸间键的核苷，小写字母表示在3'核苷酸间键中具有硫代磷酸化的核苷。
在另一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以在核苷酸间键中被部分硫代磷酸化。本发明的寡核苷酸可包含序列基序caacg，优选部分硫代磷酸化的延伸体caaCg、Caacg或CaaCg，更优选部分硫代磷酸化的延伸体CaaCg。此类寡核苷酸的实例如下表3所示：
【表3】
上述序列中的大写字母表示3'核苷酸间键为磷酸二酯键的核苷或核苷酸，小写字母表示3'核苷酸间键为硫代磷酸酯的核苷。
本发明的寡核苷酸可以与TLR9结合，具有增强受体下游信号转导的活性。TLR9活化活性可以通过以下现象作为替代来评估，但不限于它们(WO2014082254A，JP5011520B)：
(i)NF-kB结合寡核苷酸的启动子活性强度，描述为细胞(例如CAL-1/NF-kB-GFP)中由启动子驱动的GFP表达水平；
(ii)靶细胞产生的细胞因子水平；和
(iii)标记蛋白(例如包括CD40、CD80或CD86在内的共刺激分子)在靶细胞(如抗原呈递细胞)中的表达水平。
靶细胞的活化可以通过上述替代指标的增强来评估。此类标记的增强应通过与正常状态或未活化刺激(包括添加配体)的状态相比水平的增加来检查。
可以在培养的细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)或建立的和永生化的细胞系)中分析本发明的寡核苷酸的这种活性。此类细胞系包括：代替B细胞的HAL-1和RCH-ACV，代替浆细胞样树突细胞的CAL-1(Maeda,T.,et alia,Int J Hematol,2005.81(2):p.148-54)、Gen2.2/Gen3(Di Domizio,J.,et alia,Blood,2009.114(9):p.1794-802)或PMDC05(Narita,M.,et alia,Acta Haematol,2008.120(2):p.91-9)。
＜靶疾病＞
本发明的寡核苷酸可用于预防或治疗与免疫应答相关的靶疾病或病症，或用于调节受试者的免疫应答。靶疾病或病症的例子是肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病(包括在Th2或Th17活化时发生的疾病)、原发性免疫缺陷疾病或创伤后应激障碍(PTSD)。
所述肿瘤包括(恶性)肿瘤，例如癌(包括恶性肿瘤、上皮肿瘤、上皮内肿瘤和造血肿瘤)、肉瘤和间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。所述恶性肿瘤包括，但不限于癌，诸如，肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胆道癌、胆管癌、肾癌、肾盂输尿管癌、肾上腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、甲状腺癌、子宫癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、成神经细胞瘤、口腔癌、急性淋巴白血病、急性骨髓样白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓样白血病、恶性淋巴瘤及多发性骨髓瘤。
所述肉瘤包括，但不限于，骨肉瘤、骨囊瘤、动脉瘤性骨囊肿、骨样骨瘤、软骨肉瘤、不良分化的圆形/梭形细胞肿瘤(包括尤文肉瘤)、血管内皮瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤/肌纤维肉瘤、脊索瘤、精金瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性外周神经鞘肿瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、恶性独居纤维状肿瘤、非典型脂肪瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、恶性独居纤维状肿瘤、炎性成肌纤维细胞肿瘤、低度成肌纤维细胞肉瘤、纤维肉瘤(包括成年及硬化上皮样变种)、粘液纤维肉瘤、低度纤维粘液样肉瘤、软组织巨细胞肿瘤、恶性血管球瘤、横纹肌肉瘤、血管内皮瘤、软组织血管肉瘤、骨外骨肉瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、恶性外周神经鞘肿瘤、恶性蝾螈瘤、恶性粒状细胞肿瘤、恶性骨化性纤维粘液样肿瘤、间质肉瘤、肌上皮癌、恶性磷酸盐尿性间叶瘤、上皮样肉瘤、肺泡软部分肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨外尤文肉瘤、结缔组织增生性小圆形细胞肿瘤、肾外棒状肿瘤、血管周上皮样细胞肿瘤、内膜肉瘤、多形性肉瘤和圆形细胞肉瘤。所述间皮瘤包括，但不限于，心包间皮瘤、腹膜间皮瘤及胸膜间皮瘤。
所述发育异常包括但不限于骨髓增生异常综合征和宫颈发育不良。
本发明的寡核苷酸基于针对恶性细胞的免疫力的活化显示出针对靶疾病的功效。如果单独使用，预期当它们用于对抗具有高免疫原性的肿瘤时功效会更高。具有高免疫原性的肿瘤包括但不限于表达新抗原的癌细胞，这些新抗原是由在致瘤步骤过程中发生的基因突变产生的；此类癌症包括错配修复(dMMR)或微卫星不稳定性高(MSI-H)缺陷的癌症(Sargent,D.J.,et alia,J Clin Oncol,2010.28(20):p.3219-26；Passardi,A.,et alia,Int J Mol Sci,2017.18(6):E1324)。
本发明的寡核苷酸可以通过活化TLR9来活化pDC。活化的pDC通过干扰素进一步活化各种其他免疫细胞。因此，本发明的寡核苷酸可用于预防或治疗由包括病毒、细菌和真菌在内的微生物引起的各种感染性疾病。
引起感染性疾病的病毒包括但不限于：传染性软疣病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘病毒、带状疱疹病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、风疹病毒、麻疹病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体(RS)病毒、肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。在这些病毒中，一些病毒(如CMV、HIV、流感病毒、HSV、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV))据报道通过与TLR9结合直接活化宿主免疫(Swiecki,M.,et alia,Immunol Rev,2010.234(1):p.142-62)。
引起感染性疾病的细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性，但是本发明可以应用于任一组的细菌。据报道，至少TLR9是活化针对革兰氏阴性细菌的先天免疫所必需的(Bhan,U.,et alia,J Immunol,2007.179(6):p.3937-46)。所述革兰氏阴性细菌包括，但不限于，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfuluezae)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清型变种(Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhi)、肠沙门氏菌肠亚种甲型副伤寒血清型变种(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Paratyphi A)、肠沙门氏菌肠亚种乙型副伤寒血清型变种(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Paratyphi B)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠沙门氏菌肠炎血清型变种(Salmonella enterica serovarEnteritidis)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、变形杆菌属(Proteus)、摩根菌属(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、耶尔森菌属(Yersinia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、军团菌属(Legionella)、韦永氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)及梭杆菌属(Fusobacterium)。
真菌导致的感染病包括，但不限于，隐球菌病、念珠菌病、曲霉病、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)导致的肺炎、毛癣菌属(Trichophyton)导致的皮肤癣菌病及花斑癣(Tinea versicolor)导致的皮肤感染。确实报道了源自真菌的DNA或RNA被哺乳动物TLR9识别(Kasperkovitz,P.V.,et alia,Infect Immun,2011.79(12):p.4858-67；Patin,E.C.,et alia,Semin Cell Dev Biol,2019.89:p.24-33)。
与Th2/Th17相关的疾病是Thl抑制和Th2和/或Th17活化引起的疾病；所述疾病包括但不限于哮喘、特应性疾病(皮炎、湿疹)、过敏、多发性硬化、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
原发性免疫缺陷疾病是其中一部分免疫系统先天缺失或不能正常发挥作用的疾病，并且已知疾病的患者对感染特别敏感。可以预期，本发明的寡核苷酸尤其在缺乏功能性TLR相关系统的患者(例如IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变的患者)中显示功效，但因为预期本发明的寡核苷酸可广泛活化针对感染性疾病的免疫，其功效不限于此类疾病。
创伤后应激障碍(PTSD)是一种被报道可以被TLR9激动剂改善的疾病，并且该疾病也被认为是一种靶疾病(Zimmerman,G.,et alia,Transl Psychiatry,2012.2:p.e78)。
本发明的寡核苷酸可以用作施用患有上述靶疾病或病症的患者的药物组合物的活性成分之一，但是本发明的寡核苷酸也可以应用于受试者以用于上述靶疾病的预防目的。
本发明的寡核苷酸可以通过独特的接头与其他活性分子连接。例如，用于共施用的药物化合物的结合可以简化共施用；脂质的结合或聚乙二醇化可以改善组织分布或药代动力学。据报道，寡核苷酸的聚乙二醇化通过降低肾脏清除率延长了受试者体内的持续时间。
本发明的寡核苷酸也可以与一些有机化合物(例如维生素E(α-生育酚)或维生素D)缀合，以改善药代动力学(例如体内半衰期或细胞吸收)(Winkler,J.,Ther Deliv,2013.4(7):p.791-809)。
为了将本发明的寡核苷酸与其他有机或无机部分连接，可使用有机化合物接头；所述接头包括但不限于：甘油、(S)-(-)-1,2,4-丁三醇、1,3,5-戊三醇、顺式,顺式-1,3,5-环己三醇、顺式,反式-1,3,5-环己三醇、1,3,5-三-(2-羟乙基)异氰脲酸酯、四乙二醇及六乙二醇、二醇(诸如1,3-丙二醇或十二烷-1,12-二醇、环己二醇)、胆甾醇、硝基吲哚、三乙二醇、六乙二醇、d-间隔基、PEG-间隔基和烷基接头。接头部分也可以由氨基酸、核苷酸和/或它们的衍生物构成。
接头也可用于形成非共价键。接头包括但不限于：生物素-亲和素、插入核酸的SPB(琥珀酰亚胺-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯)、序列互补并相互结合的核酸、蛋白质-蛋白质相互作用(例如卷曲螺旋结构)。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸可以彼此、或与具有相似功能机制的其他寡核苷酸，其他有机化合物(例如(多)肽/抗体或核酸/寡核苷酸)或无机化合物(如细胞毒剂)组合使用，常用于改善或改变药物的物理性质。这种组合可以在有或无共价键的情况下产生。
本发明的寡核苷酸可以从现有的核酸来源(例如，基因组或cDNA)获得，但优选是合成的。本发明的寡核苷酸可以通过市场上可获得的多种自动化核酸合成仪来合成。这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以单独施用或与一种或多种其他活性成分同时或依次共施用。本发明的寡核苷酸也可以与一种或多种其他治疗方法同时或依次使用。
本发明的寡核苷酸可以与常规抗癌药物或药物共施用以减轻伴随肿瘤形成而出现的各种症状。常规抗癌药物的例子包括但不限于：抗生素(如蒽环类或米托蒽醌)；铂；烷化剂；抗代谢物；激素治疗药物；植物生物碱(例如长春花生物碱)；紫杉烷类(如紫杉醇或多西他赛)；和拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康或依托泊苷)。
本发明的寡核苷酸也可以与其他靶向癌细胞生物学特性的分子靶向药物共施用于有需要的受试者；分子靶向药物包括：酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂或蛋白酶体抑制剂。分子靶向药物的例包括，但不限于：依维莫司(Afinitor)、他莫昔芬(Nolvadex)、托瑞米芬(Fareston)、氟维司群(Faslodex)、阿那曲唑(Arimidex)、依西美坦(Aromasin)、拉帕替尼(Tykerb)、来曲唑(Femara)、帕博西尼(Ibrance)、瑞博西尼(Kisqali)、马来酸奈拉替尼(Nerlynx)、玻玛西尼(Verzenio)、奥拉帕尼(Lynparza)、瑞格非尼(Stivarga)、甲磺酸伊马替尼(格列卫)、乙酸兰瑞肽(Somatuline Depot)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、帕唑帕尼(Votrient)、坦罗莫司(Torisel)、阿昔替尼(Inlyta)、卡博替尼(Cabometyx)、甲磺酸乐伐替尼(Lenvima)、维A酸(Vesanoid)、达沙替尼(Sprycel)、尼洛替尼(Tasigna)、博舒替尼(Bosulif)、依鲁替尼(Imbruvica)、艾代拉里斯(Zydelig)、维奈托克(Venclexta)、盐酸帕纳替尼(Iclusig)、米哚妥林(Rydapt)、甲磺酸恩西地平(Idhifa)、奥英妥珠单抗奥加米星(Besponsa)、tisagenlecleucel(Kymriah)、艾伏尼布(Tibsovo)、杜韦利西布(Copiktra)、索拉非尼(Nexavar)、克唑替尼(Xalkori)、厄洛替尼(塔西法)、吉非替尼(易瑞沙)、二马来酸阿法替尼(Gilotrif)、色瑞替尼(LDK378/Zykadia)、奥希替尼(Tagrisso)、艾乐替尼(Alecensa)、布加替尼(Alunbrig)、曲美替尼(Mekinist)、达拉菲尼(Tafinlar)、达克替尼(Vizimpro)、地尼白介素-毒素连接物(Ontak)、伏立诺他(Zolinza)、罗米地辛(Istodax)、贝沙罗汀(Targretin)、硼替佐米(万珂)、普拉曲沙(Folotyn)、司妥昔单抗(Sylvant)、艾代拉里斯(Zydelig)、贝利司他(Beleodaq)、盐酸库潘尼西(Aliqopa)、阿卡替尼(Calquence)、卡非佐米(Kyprolis)、帕比司他(Farydak)、柠檬酸伊沙佐米(Ninlaro)、磷酸芦可替尼(Jakafi)、卡巴他赛(Jevtana)、恩杂鲁胺(Xtandi)、乙酸阿比特龙(Zytiga)、二氯化镭223(Xofigo)、阿帕鲁胺(Erleada)、维莫德吉(Erivedge)、索尼德吉(Odomzo)、威罗菲尼(Zelboraf)、考比替尼(Cotellic)、阿利维A酸(Panretin)、康奈非尼(Braftovi)、比美替尼(Mektovi)、西米普利单抗-rwlc(Libtayo)、阿利维A酸(Panretin)及凡德他尼(Caprelsa)。
本发明的寡核苷酸也可以与抗癌抗体药物共施用于受试者。预期与本发明的ODN共施用可协同增强抗体药物的活性，特别是利用免疫系统攻击癌细胞。此类抗体药物的例子包括但不限于：
(i)包含单一种类抗体的抗体药物：曲妥珠单抗(赫赛汀)、阿仑珠单抗(Campath)、贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)、培妥珠单抗(Perjeta)、西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗(Vectibix)、奈昔木单抗(Portrazza)、地努妥昔单抗(Unituxin)、雷莫芦单抗(Ciramza)、奥拉单抗(Lartruvo)、伊匹单抗(Yervoy)、纳武单抗(Opdivo)、派姆单抗(Keytruda)、阿特朱单抗(Tecentriq)、地舒单抗(Xgeva)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)、阿维鲁单抗(Bavencio)、替伊莫单抗(Zevalin)、本妥昔单抗(Adcetris)、奥比妥珠单抗(Gazyva)、莫格利珠单抗-kpkc(Poteligeo)、达雷木单抗(Darzalex)、埃罗妥珠单抗(Empliciti)、樟脑磺酸鲁卡帕尼(Rubraca)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物(Zejula)、抗-OX40；
(ii)包含双特异性抗体的抗体药物：博纳吐单抗(Blincyto)；
(iii)包含抗体-药物缀合物(ADC)的抗体药物：替伊莫单抗(Zevalin)、本妥昔单抗(Adcetris)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Kadcyla)、吉妥珠单抗奥加米星(Mylotarg)；及
(iv)ziv-阿柏西普(Zaltrap)。
本发明的寡核苷酸也可以与已经用于癌症治疗的标准护理的细胞因子(如GM-CSF、IFN-α、IFN-β或IFN-γ)共施用。
本发明的寡核苷酸可以与外科处置(包括放射疗法、高频消融、冷冻消融)(Aarts,B.M.,et alia,Insights Imaging,2019.10(1):p.53)或光敏剂施用后的光动力治疗(PDT)一起使用。考虑到特别是据报道PDT可上调抗癌免疫(Kleinovink,J.W.et alia,CancerImmunol Res,2019,5(10):p.832-838)，预计与施用本发明的寡核苷酸的组合将显示协同功效。本发明的寡核苷酸可以在佐剂或新佐剂环境(O'Donnell,J.S.,et alia,ClinCancer Res,2019,25(19):p.5743-5751)中作为活性成分施用。
本发明的寡核苷酸还可以与下列疗法联用：过继性免疫细胞疗法(也称为过继性细胞转移(ACT))(例如嵌合抗原受体T(CAR-T)-细胞疗法(axicabtagene ciloleucel
或tisagenlecleucel
))、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、树突细胞疗法或NK细胞疗法。本发明的ODN还可以与使用溶瘤病毒的疗法组合，该疗法利用人工修饰的病毒来裂解肿瘤块(Davola,M.E.,et alia,Oncoimmunology,2019.8(6):p.e1581528；Sivanandam,V.,et alia,Mol Ther Oncolytics,2019.13:p.93-106；Raja,J.,et alia,J Immunother Cancer,2018.6(1):p.140；Martinez-Quintanilla,J.,etalia,J Clin Invest,2019.130:p.1407-1418；Harrington,K.,et alia,Nat Rev DrugDiscov,2019.18(9):p.689-706)。
本发明的寡核苷酸可与预期可增强治疗所需的免疫力的治疗性疫苗联合使用。治疗性疫苗是用于治疗现有疾病的一类疫苗。此类治疗性疫苗不仅包括由弱化或解毒微生物制备的疫苗，还包括由离体处理的细胞制备的离体细胞疫苗，以及通过活化靶免疫细胞来活化免疫(如抗癌免疫)的体内疫苗。离体细胞疫苗包括由自体或同种异体树突细胞制备的Sipuleucel-T(Provenge)，或通过修饰自体或同种异体癌细胞制备的GVAX。将抗原加载到此类树突细胞中可以通过将抗原(包括肽、重组蛋白或肿瘤裂解物)与离体培养中的树突细胞接触来实现，但也可以通过融合表达抗原的细胞(例如癌细胞)与树突细胞来实现(Hollingsworth,RE,et al,NPJ Vaccines,2019.4:p.7)。
本发明的寡核苷酸可以与一组体内疫苗组合使用。体内疫苗可包括用于递送至靶抗原呈递细胞(APC)的工具，该工具与抗原(例如癌症抗原或病毒抗原)结合；用于递送至APC的工具的目标蛋白包括如下细胞表面蛋白：
·树突细胞：DEC205、CD11c、DC-SIGN、甘露糖受体、TLRs、CD91；
·B细胞：CD180、BCR、CD21、CD19；
·浆细胞样树突细胞(pDC)：CD32、CLEC12a、BDCA2、DCIR、TLR9。
用于体内疫苗的抗原可以包括肽或重组蛋白(包含稍后将描述的癌抗原或病毒抗原)；编码抗原的多核苷酸可用于在此类靶APC中直接表达抗原。
预防癌症疫苗包括：乙型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒(HPV)疫苗，例如加德西或希瑞适。还预期本发明的寡核苷酸增强已上市疫苗或处于上市前阶段的疫苗的预防活性。
本发明的寡核苷酸可用于感染性疾病的预防或治疗。寡核苷酸也可以作为佐剂与疫苗组合物混合。否则，寡核苷酸可与用于治疗感染性疾病的药物组合物(包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫药物、疫苗、抗体药物)联合施用于受试者以中和毒素。用于预防或治疗感染性疾病的疫苗包括以下几类：
·减毒活疫苗，其中包含活微生物的弱化版本。
·灭活疫苗，含有杀死的微生物，但保留了抗原性。
·亚单位疫苗，只含有最有效地刺激免疫系统的抗原。
·类毒素疫苗，旨在从微生物中解毒。
·结合疫苗，这是一种特殊的亚单位疫苗，通过结合其他免疫原性更强的亚单位来建立对免疫力较弱的微生物的免疫力。
·核酸疫苗，使人体细胞产生抗原，实现进一步的体内免疫。
·重组载体疫苗，携带重组抗原的遗传信息，以激发针对目标微生物的免疫力。
可以与本发明的寡核苷酸组合使用的疫苗的例子是：BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、大流行性H1N1流感疫苗、季节性流感疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、脑膜炎球菌疫苗、肺炎球菌疫苗、百日咳疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、轮状病毒疫苗、风疹疫苗、破伤风类毒素疫苗、伤寒疫苗和黄热病疫苗。
最近，迫切希望开发一类被称为免疫检查点抑制剂(CPI)的药物，其影响免疫检查点分子(一组调节免疫的蛋白质)，以激发治疗靶疾病所必需的免疫。本发明的寡核苷酸可以与CPI一起使用，以通过活化与免疫检查点过程相关的抗原呈递细胞协同地增强CPI的功效。免疫检查点抑制剂的靶分子例子有：PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、CD80、CD86、ICOS、B7RP1(ICOSL)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、CD28H、B7-H5、VISTA、BTLA、HVEM、CD40L、CD40、OX40、OX40L、CD137、CD137L、CD27、CD70、TIM3、GAL9、GITR、GITRL、LAG-3、MHC-II、CD47、ADORA2A(腺苷A2A受体)和腺苷(Pardoll,D.M.,Nat Rev Cancer,2012.12(4):p.252-64)。
抑制免疫抑制性免疫细胞(如Treg、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或MDSC)活性的疗法或药物也可用于与本发明的寡核苷酸的联合疗法。受此类疗法或药物影响的靶分子或途径的例子有：
·Tregs：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、TGFβ、IL-10、IL-35、ICOS和淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)、CD39、CD73、PI3K、Atg7和Atg5
·TAM：CCL2-CCR2轴和CSF1/CSF1受体(CSF1R)信号传导
·MDSC：PDE-5、COX-2、HDAC、STAT3、CCL2/CCR2、VEGF-A/MET/TIE2/VEGFR2通路、IL-8/CXCR1/2、半乳糖凝集素-1(Gal-1)。
去除这种免疫抑制性免疫细胞的疗法或药物也可用于与本发明的寡核苷酸组合。可用于去除此类细胞的细胞表面标记蛋白的例子如下：
·Tregs：CD25、CTLA-4、PD-1、ICOS、GITR、OX40、CD15s、CCR4和CCR8
·TAM：CD206、豆荚蛋白、清道夫受体A和CD52
(Ohue,Y.,et alia,Cancer Sci,2019.110(7):p.2080-2089；Yang,L.,et alia,JHematol Oncol,2017,10(1):p.58；Gabrilovich,D.I.,Cancer Immunol Res,2017,5(1):p.3-8；Ding A.S.et alia,Front Immunol,2019,10:p.1715)。
本发明的寡核苷酸可以与抗原蛋白、肽、糖缀合物或其他有机物质一起使用，以增强针对靶疾病的特异性抗原反应。抗原物质的例子如下：AFP、AKAP-4、ALK、雄激素受体、B7H3、BAGE、bcr-abl、BMLF1、BmpA、BmpB、BORIS、BRLF1、BZLF1、碳酸酐酶IX、过氧化氢酶B、CDC27、CDCA1、CDH3、CDK4、CEA、crf1、细胞周期蛋白B1、CYP1B1、DEPDC1、EBNA1、EBNA-1、EGFRvIII、包膜糖蛋白D、EpCAM、EphA2、EphA3、ERG、ETV6-AML、FAP、Fos-相关的抗原1、FOXM1、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、Gel1、GloboH、GM3、gp100、GPC3、HA、HBV蛋白、HCV蛋白、HER2、六位体、HJURP、HMWMAA、HPV-16E6、HPV-16E7、HPV-18E7、表面Ig的独特型、IE-1、KIF20A、KOC1、KSV蛋白、大T抗原、小T抗原、LCK、豆荚蛋白、LMP1、LMP2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE、MAGE-3、MAGE-A1、MAGE-A4、MAM-A、Melan-A/MART-1、MELK、MELOE-1/2、间皮素、ML-IAP、MP1、MP2、MP65、MPHOSPH1、MUC1、粘蛋白-1、MYCN、NA、NA17、NeuGcGM3、非-结构蛋白NS4、非-结构蛋白NS5、NY-BR-1、NY-ESO-1、ospA、ospB、ospC、OY-TES1、p53、Page4、PAP、PAX3、PAX5、PDGFR-β、五位体、PLAC1、pmel17、pmp20、聚唾液酸、pp65、PRAME、前列腺-特异性膜抗原10、Prostein、蛋白酶3(PR1)、PSA、PSCA、PSMA、Ras、RGS5、RhoC、RM2、RNF43、ROR1、肉瘤转位断点、SART3、选择、丝氨酸蛋白酶NS3、SHMP、sLe、SOD、精子蛋白17、SSX2、STEAP1、STn、存活素、TARP、Tax蛋白、端粒酶、端粒酶、TERT、Tie 2、TM4SF5、Tn、TOMM34、磷酸丙糖异构酶、TRP1、TRP2、TTK、酪氨酸酶、酪氨酸酶-相关的蛋白1、酪氨酸酶-相关的蛋白2、URLC10、VEGFR2、病毒壳体蛋白、病毒核心蛋白、病毒核蛋白、WT1、XAGE 1、α-辅肌动蛋白-4和β-连环素。新抗原也是一种很好的候选抗原物质。新抗原是通过体内过程新形成的抗原，例如在肿瘤形成过程中发生的诱变或由感染性外来物质产生，并被自身免疫系统识别。
抗癌化疗药物(尤其是诱导免疫原性细胞死亡(ICD)的药物)可以与本发明的寡核苷酸共施用，以显示协同增强的功效。诱导ICD的药物的例子是：蒽环类药物(包括米托蒽醌)、铂类抗癌药物(包括奥沙利铂、顺铂、卡铂、奈达铂、三硝酸三铂、吡铂、沙铂)(Hato,S.V.,et alia,Clin Cancer Res,2014.20(11):p.2831-7)。
已知具有活化抗癌免疫特性的其他药物(例如吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂(Prendergast,G.C.,et alia,Cancer Res,2017.77(24):p.6795-6811)或蛋白酶体抑制剂(包括硼替佐米)(Spisek,R.,et alia,Blood,2007.109(11):p.4839-45；Chang,C.L.,etalia,J Immunol,2012.189(6):p.3209-20))可以与本发明的寡核苷酸共施用以显示协同功效。
本发明的寡核苷酸可以与其他TLR9激动剂或其他TLR的激动剂(例如TLR3、4、8或7)共施用。本发明的寡核苷酸也可以与细胞内核苷酸传感器信号传递通路(例如cGAS-STING通路或RIG-I/MDA5通路(Bode,C.,et alia,Eur J Immunol,2016.46(7):p.1615-21；Iurescia,S.,et alia,Front Immunol,2018.9:p.711))增强剂联合使用，因为这些通路具有与TLR9(例如IFN-α或NF-kB)相同的靶分子，并且在同时活化时有望显示协同效应。活化每个受体的分子示例如下：
·TLR3激动剂：Rintatolimod、聚C 3SBIO、聚(I:C)、Hiltonol
·TLR4激动剂：ALD046、CRX527、CRX675、G100、脂质A、GSK1795091、OM174、PGN007
·TLR7激动剂：Vesatolimod、VML600、852A、NKTR262、TMX101、GS9620、RG7795、DSP0509、PF4878691、RG7854、RG7863、TMX202、TQA3334
·TLR8激动剂：GS-9688、VTX2337
·TLR9激动剂：Heplisav、SD-101、IMO2125、IMO2055、MGN1703、MGN1706、CPG7909、Litenimod、AST008、DUK-CPG-001、Actilon、CMP001、DV281、cobitolimod
·TLR9和NOD2激动剂：MIS416
·STING信号通路活化剂：ADU-S100
·STING激动剂：MK-1454、SB 11285、IMSA101
·RIG-I激动剂：RGT 100
本发明的寡核苷酸可以在递送载体中/与递送载体一起施用或以与载体连接的形式施用。载体包括但不限于：甾醇(例如胆甾醇)、Cochleates、乳化体、ISCOM；脂质(例如，阳离子脂质、阴离子脂质)、脂质体；乙二醇(PEG)；聚乙交酯-共-丙交酯(PGLA)；微球；聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC)、壳聚糖、甘露醇、羟丙基甲基纤维素(HPMC))；活细菌载体(例如，沙门氏菌属(Salmonel la)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、卡介苗、志贺菌属(Shigel la)、乳杆菌属(Lactobacil lus))；活病毒载体(例如痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒体、病毒样颗粒。
待施用本发明的寡核苷酸的目标对象优选是人，但在一个实施方式中，对象可以是非人动物，例如狗、猫、马、猪、山羊、绵羊、牛、猴、鸡、老鼠或老鼠。
“治疗有效量”：为了治疗或预防靶疾病或病症，将治疗有效量的本发明寡核苷酸施用于受试者。一种或多于一种寡核苷酸的“治疗有效量”是指用于实现治疗或预防受试者疾病的期望结果的足够量的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以以纯的形式或在药学上可接受的载体中使用。或者，本发明的ODN可以作为药物组合物施用。本发明中的“量”是指剂量。剂量可以通过本领域技术人员熟知的标准技术来确定，并且可以不同地取决于包括以下在内的因素：但不限于受试者的体型或/和整体健康状况或疾病症状的严重程度。本发明的寡核苷酸的引入可以作为单一处理或在一系列处理中进行。用于施用的本发明寡核苷酸的受试者剂量范围为每次施用约1μg(微克)～10g。优选地，剂量范围为0.1mg～5g。更优选地，剂量范围为0.3mg～3g。最优选地，剂量范围为1mg～1g。通过使用人当量剂量(HED)或人当量浓度(HEC)，可以基于适用于非人动物的量来估计人受试者的治疗有效量。人类受试者的治疗有效量可以是但不限于0.3～60mg/天，优选1～30mg/天，更优选2～8mg/天。
“施用途径”：对于临床应用，本发明的寡核苷酸可以单独施用或通过任何合适的施用途径配制成药物组合物，该施用途径可有效实现所需的治疗结果。施用本发明寡核苷酸的“途径”是指肠内、非肠道和局部施用或吸入。本发明寡核苷酸的肠内施用途径包括口服、胃、肠和直肠。肠胃外途径包括皮下、静脉内、透皮、皮内、舌下、鼻内、经粘膜、肺、阴道、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、脊柱内、肌肉内、关节内、腹膜内、心内、骨内、鞘内、玻璃体内、吸入或局部施用。本发明的寡核苷酸的局部施用途径是指将寡核苷酸从外部应用于表皮、颊腔和耳、眼和鼻。瘤内施用是施用途径之一，一般通过在肿瘤内或肿瘤周围区域注射受试化合物来进行。
“药物组合物”：药物组合物是指包含治疗有效量的本发明的寡核苷酸，有或无药学上可接受的载体的组合物。药物组合物可以包含一种或多种本发明的寡核苷酸。所述组合物包括但不限于水溶液或盐溶液、颗粒、气雾剂、丸剂、颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、口服溶解/崩解片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、乳膏剂、滴剂和适用于多种药物递送系统的其他药物组合物。组合物可以肠胃外、口服、直肠、阴道内、腹膜内、局部施用(以粉末、软膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂)，口腔或作为口服或鼻喷雾剂。在所有情况下，组合物在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的，并且可以防止微生物污染。用于肠胃外注射的本发明的药物组合物包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂，以及用于在临用前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。本发明的寡核苷酸可以悬浮在水性载体中，例如在等渗缓冲溶液中，pH为约3.0～约8.0，优选pH为约3.5～约7.4、3.5～6.0或3.5～约5.0。缓冲溶液包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，和乙酸钠-乙酸缓冲液。对于口服施用，组合物将与可食用载体一起配制以形成粉末片剂、丸剂、口服溶解/崩解片剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。对于固体组合物，常规的无毒固体载体可以包括医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。对于口腔施用，组合物将以常规方式制成片剂或锭剂。对于吸入，组合物将是来自加压包装的气溶胶喷雾剂、喷雾器或干粉并且可由本领域技术人员选择。在某些情况下，为了延长本发明寡核苷酸的效果，本发明的寡核苷酸也适合通过缓释系统施用。本发明的寡核苷酸可用于水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液中，以减缓寡核苷酸的释放。或者，通过将寡核苷酸溶解或悬浮在疏水材料(例如可接受的油载体)中来实现寡核苷酸的非肠道施用药物形式的延迟释放。通过将寡核苷酸包埋在脂质体或微乳液或其他可生物降解的半渗透性聚合物基质(例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚原酸酯和聚酐)中制成可注射的长效形式。
【实施例】
本发明将在以下实施例中更详细地描述。同时，本发明不限于这些实施例。在本文的这些实施例中，除非另有说明，否则根据所附流程进行使用市售试剂盒和试剂的实验。本领域技术人员将理解本发明的寡核苷酸可以容易地用于治疗包括癌症和感染性疾病在内的靶疾病。现在将通过以下非限制性实施例来证明本发明。
【材料和方法】
＜寡脱氧核苷酸(ODN)＞
在Hokkaido System Science Co.,Ltd.通过常规亚磷酰胺方法以3'端无磷酸酯的形式合成单链寡脱氧核苷酸(ODN)，并在制造商处确认纯度和身份。在以下实施例中，在3'端具有硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键的核苷用小写字母描述，而在3'端具有磷酸二酯(PO)核苷酸内键的核苷或寡核苷用大写字母描述。所有合成的ODN首先用蒸馏的无热原水溶解，并使用无热原试剂进行进一步稀释以进行研究。
＜10％FBS-RPMI-完全培养基＞
RPMI1640培养基补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠和50mM 2-巯基乙醇。用0.45μm注射器过滤器进一步过滤该培养基。
＜CAL-1细胞＞
在湿润气氛和5％CO2条件下在37℃用10％FBS-RPMI-完全培养基培养CAL-1细胞(人浆细胞样树突细胞系；Maeda et alia,Int J Hematol.,2005,81,148-54；JP5011520B)。CAL-1细胞在以1:5传代培养两天后汇合，但细胞在汇合之前传代，用于如下所示的研究。悬浮培养皿用于培养CAL-1细胞。
＜通过NF-kB活化的GFP诱导检测TLR9活化＞
监测由TLR9信号传导途径诱导的NF-kB启动子的转录活性水平，作为TLR9信号传导活性水平的指示。建立CAL-1/NF-kB-GFP细胞系用于监测NF-kB转录因子在基于细胞的测定中的活性(WO2014082254A)。为了建立CAL-1/NF-kB-GFP细胞系，通过电穿孔将编码由NF-kB共有转录反应元件驱动的GFP报告基因的载体转染到CAL-1细胞中。用ZEOCIN进一步选择转染的细胞。通过选择的转染子的单细胞克隆产生稳定的转染子。证实了由TLR9激动剂CpG2395(5'-tcgtcgtttt cggcgcgcgc cG-3',SEQ ID NO：45)诱导的GFP表达。简而言之，CAL-1/NF-kB-GFP细胞(1×105/well)接种在96孔平底板中，并在有或无CpG2395的情况下培养。将细胞在5％CO2加湿培养箱中于37℃温育6小时。通过流式细胞仪(FACS Calibur，BDBioscience Co.,Ltd)评估细胞中的GFP表达水平。分析GFP阳性细胞的百分比作为TLR9信号活性水平的指标。该建立的NF-kB-GFP/CAL-1细胞用于每个测定。
＜TLR7活化检测＞
TLR7的活性测量为HEK-BlueTM TLR7细胞(Invivogen)中分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的酶活性。将细胞与指定的寡核苷酸或TLR7激动剂，例如1μg(微克)/mlGardiquimod(GQ)或1μg/ml CL264，在37℃下在5％CO2加湿培养箱中温育24小时；诱导的SEAP通过底物(HEK-BlueTM检测，Invivogen)裂解产生的655nm处的吸光度水平来测量。
＜TLR8活化检测＞
TLR8的活性测量为HEK-BlueTM TLR8细胞(Invivogen)中分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的酶活性。将细胞与指定的寡核苷酸或TLR7激动剂，例如200ng/ml的TL8-506或5μg/ml的CL075，在37℃下在5％CO2加湿培养箱中温育24小时；诱导的SEAP通过底物(HEK-BlueTM检测，Invivogen)裂解产生的655nm处的吸光度水平来测量。
＜细胞因子产生的检测＞
使用以下试剂盒通过ELISA测量细胞因子的水平：人IFN-α(eBioscience)、人IL-6、人TNF-α(Thermo Fisher Scientific)、人IL-12p40(BioLegend)、小鼠IFN-α(PBL)、小鼠IL-6、小鼠TNF-α和小鼠IL-12p40(Thermo Fisher Scientific)。根据制造商的流程进行测量。
＜人PBMC的分离＞
从健康志愿者收集外周血。将相同体积的RPMI培养基加入血液中并充分混合。通过在HistopaqueTM上离心纯化人PBMC。简而言之，将HistopaqueTM-1077(SIGMA)放入离心管中，并将相同体积的血液/RPMI混合物放入HistopaqueTM。将试管以1800rpm(700×g)离心20分钟。用移液管将中间的白色层回收到另一个管中，并加入10％FBS-RPMI完全培养基。将混合物溶液以1800rpm(700xg)离心10分钟，并去除上清液。细胞沉淀用2ml蒸馏水处理以裂解红细胞，然后立即向管中加入20ml 10％FBS RPMI完全培养基。用培养基洗涤两次后，将细胞悬浮在培养基中并对细胞数进行计数。每次测定都使用新鲜分离的PBMC。
＜小鼠脾细胞的制备＞
从小鼠中回收脾脏。将脾脏放入装有RPMI培养基的培养皿中。通过使用注射器柱塞(2.5ml注射器)的橡胶尖端用尼龙网压碎脾脏。通过70μm过滤器过滤将培养基中包含的脾细胞转移到50ml Falcon管中。在以1500×g离心5分钟后，用1×DPBS洗涤细胞。用ACK裂解缓冲液处理细胞以裂解红细胞。向细胞沉淀中加入1ml ACK裂解缓冲液并用P1000移液器操作20次，然后将试管置于冰上2分钟。立即将20ml含有10％FBS的RPMI完全培养基添加到试管中。用培养基洗涤两次后，将细胞重悬于相同培养基中并对细胞数进行计数。然后将脾细胞用于进一步的研究。
【实施例1】
本发明的完全硫代磷酸化的ODN具有佐剂活性。本研究中使用的全硫代磷酸化ODN列于下表4。小写字母表示核苷在3'的核苷酸间键上经过硫代磷酸酯修饰，大写字母表示核苷在3'无修饰(无磷酸二酯键)。
【表4】
| ODN ID | 序列 | SEQ ID NO |
| CPG2395 | 5'-tcgtcgtttt cggcgcgcgc cG-3' | SEQ ID NO：45 |
| CPG685 | 5'-tcgtcgacgt cgttcgttct C-3' | SEQ ID NO：46 |
| M362 | 5'-tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgaT-3' | SEQ ID NO：47 |
| D60-1 | 5'-tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaaT-3' | SEQ ID NO：48 |
| A001 | 5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcgA-3' | SEQ ID NO：6 |
| A002 | 5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcgA-3' | SEQ ID NO：7 |
| A003 | 5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：8 |
| A004 | 5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：9 |
| A003#delA | 5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcG-3' | SEQ ID NO：10 |
| A003#endG | 5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgG-3' | SEQ ID NO：11 |
| A011 | 5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcgA-3' | SEQ ID NO：12 |
| A012 | 5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ctcgA-3' | SEQ ID NO：13 |
| A013 | 5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：14 |
| A014 | 5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：15 |
＜ODN的免疫刺激活性分析＞
将表4中所示的ODN与CAL-1/NF-kB-GFP细胞以指定浓度(0.1μM或0.3μM)温育6小时。基于用流式细胞仪(FACS Calibur，BD Bioscience Co.,Ltd.)分析的GFP阳性细胞的百分比评估ODN对NF-kB的活化。使用FlowJoTM ver 10(FlowJo LLC)分析数据。
如图图1A所示，作为标准TLR9激动剂的CpG2395刺激在CAL-1/NF-kB-GFP细胞中诱导GFP表达，表明NF-kB的活化是由用CpG2395活化的TLR9诱导的。本发明的ODN(完全硫代磷酸化(PS)A001、A002、A003和A004)显示出与CpG2395相比具有更强的TLR9活化活性。此外，如图1B所示，本发明的ODN比其他已知的CpG ODN(如CpG685、M362和D60-1)表现出更强的TLR9活性。考虑到ODN诱导的TLR9活性水平不依赖于核酸长度，认为激动活性的差异在于特定序列。
许多先前的报道认为，CpG ODN中gtcgtt序列对于人类TLR9的最佳活化的重要性(Hartmann,G.et alia,J Immunol,2000.164(2):p.944-53,Bauer,S.,et alia,Proc NatlAcad Sci U S A,2001.98(16):p.9237-42)，CpG2395和CpG685(5'-tcgtcgacgtcgttcgttct C-3'；SEQ ID NO：46)具有一个gtcgtt序列。在之前的报道中，声称CpG ODN内5'端的tcgt序列对于人TLR9的活化非常重要(Pohar,J.,et alia,J Immunol,2017.198(5):p.2093-2104；Ohto,U.,et alia,Immunity,2018.48(4):p.649-658)。根据该规则，常规CpG ODN(CpG2395、CpG685和M362(5'-tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgaT-3'；SEQ ID NO：47))在5'端具有tcgt序列作为TLR9活化基序。在本发明的ODN中，只有A003有一个gtcgtt序列，其他没有gtcgtt序列，本发明所有ODN在5'端都没有tcgt序列。然而，本发明的所有ODN都表现出比常规CpG ODN(例如CpG2395、CpG685和M362)更强的人TLR9活化。
如上所述，虽然标准CpG ODN中的5'-tcgt和'gtcgtt'基序在人类中被称为TLR9活化基序(Wang,X.,et alia,Vaccine,2008.26(15):p.1893-901)，显示本发明的ODN中的那些基序对整体活性的贡献可以忽略不计，这表明在本发明的ODN中存在人TLR9的其他最佳延伸体/基序。如图1C和1D中所示，A003和A003#endG的活动是相同的。虽然A003#delA的活性因3'端碱基的变换而略微降低，但该活性仍比常规CpG-ODN(CpG2395)强得多(如图1A所示)。这表明3'端的核苷酸对于活性是可有可无的。
另外，如图1E、1F和1G所示，每个ODN组，A001和A011；A002和A012；A003和A013；A004和A014表现出与同一组中另一个相似的活性水平，表明ODN中指定核苷酸的替换不会对ODN的活性产生任何显著变化。综上所述，ODN内5'端12、18、21和25位碱基的突变可能不会导致ODN刺激活性的降低。本发明的ODN显示具有5'-tcgcaacgtt t-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3'(SEQ ID NO：2)作为具有TLR9活化活性的核心结构。
【实施例2】
本发明的寡核苷酸主要活化TLR9。
＜ODN对人类TLR7和TLR8的活化＞
用TLR激动剂刺激HEK blueTM TLR7细胞24小时。如图2A所示，TLR7激动剂Gardiquimod(GQ)和CL264活化TLR7并给出阳性信号。相反，标准TLR9激动剂CpG2395和本发明的ODN不能活化TLR7信号通路。此外，用TLR激动剂刺激HEK blueTM TLR8细胞24小时。如图2B所示，TLR8激动剂TL8-506和CL075活化TLR8并给出阳性信号。相反，标准TLR9激动剂CpG2395和本发明的ODN不能活化TLR8信号通路。
【实施例3】
具有本发明寡核苷酸的部分硫代磷酸化的特征性核苷酸延伸体。研究了增加TLR9激动活性的本发明寡核苷酸的最小延伸体的存在。
＜ODN＞
具有部分硫代磷酸化的核苷酸间键的单链ODN如表5中所列制备。
【表5】
| ODN ID | 序列 | SEQ ID NO |
| A003 | 5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：8 |
| A103 | 5'-tCgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：16 |
| A203 | 5'-tCgcaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：17 |
| A303 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：18 |
| A403 | 5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttcgA-3' | SEQ ID NO：19 |
| A503 | 5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttCgA-3' | SEQ ID NO：20 |
| A603 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg ttCgA-3' | SEQ ID NO：21 |
| A703 | 5'-tCgCaaCgtt tgCgaCgtCg ttCgA-3' | SEQ ID NO：22 |
| DV093 | 5'-tCgtgcatcg atgcaacG-3' | SEQ ID NO：49 |
| DV093C | 5'-tCgtgcatcg atgCaaCG-3' | SEQ ID NO：50 |
| DV094 | 5'-aacaacaacg ttgttgtT-3' | SEQ ID NO：51 |
| DV094C | 5'-aaCaaCaaCg ttgttgtT-3' | SEQ ID NO：52 |
小写字母表示核苷在3'的核苷酸间键中被硫代磷酸酯修饰，大写字母表示核苷在3'处带有磷酸二酯核苷酸间键或无修饰(无磷酸二酯键)。
＜ODN的TLR9激动剂活性分析＞
ODN的激动剂活性通过CAL-1/NF-kB-GFP细胞中的GFP表达进行分析。如图3A所示，完全PS A003在6小时刺激期间在测试浓度下显示出低活性。据报道，在标准完全PS CpGODN的CG基序中，由磷酸二酯(PO)键导致的核苷酸间键变化增加了TLR9活化的活性(Pohar,J.,et alia,Sci Rep,2017.7(1):p.14598，WO2004/016805A)，A103和A203(具有带PO键的CG基序并保留与A003相同的序列)显示出增加的活性。然而，如图3A和图3B所示，在ODN的CAACG延伸体中CA处的额外PO键(A303)进一步上调活性。从图3B的左图(0.1μM)可以看出，A303的活性明显强于A103和A203。这表明CAACG延伸体内的PO键(CaaCg)对活动的重要性。如图3C所示，A403和A503表现出比A303降低的活性，而A403和A503都比A303具有增加的具有PO键的CG基序数量。这表明，尽管之前认为标准CpG ODN中具有PO键的CG基序的数量对于活性很重要(WO2004016805A)，但本发明的ODN中具有PO键的CG基序的数量对于活性并不重要。重要的是，A403和A503都没有CaaCg延伸体(CAACG基序内有2个PO键)。虽然A603和A503在CG基序处具有相同数量的PO键，但A603表现出比A503更好的活性。A603像A303一样保持CaaCg延伸体，并表现出与A303相似的活性，表明CaaCg延伸体与具有PO键的CG基序数量增加相比对于最佳活性的重要性。A703在所有CG基序处具有PO键，但表现出比A303和A603更小的活性(0.1μM刺激)，表明具有PO键的CG基序数量的增加对于本发明的ODN的最大化活性是不必要的。对于优化活性而言，具有PO键的CG基序的总数可以忽略不计，这无法从先前已知的Py(嘧啶)-PO-Pu(嘌呤)(WO2004/016805A)的作用中预期。
如图3D所示，通过检测ODN诱导的炎性细胞因子产生进一步证实了CaaCg延伸体的重要性。A303和A603诱导的细胞因子水平相似，并且产生水平高于A403和A503。在先前报道的CpG(DV093和DV094)中检查了CaaCg延伸体的重要性(图3E)。虽然DV093和DV094在其序列中都有caacg基序，但它们的活性远小于A003。
有趣的是，与原始DV093或DV094相比，DV093C和DV094C中的CaaCg延伸体(具有部分硫代磷酸化的CAACG基序)不能增加它们的活性。如图3F所示，将DV093和DV094中的caacg延伸体改变为CaaCg的核苷酸间键的变化没有提高活性。这些数据表明，特定CaaCg延伸体(例如本发明的ODN中的那段)(但不是随机定位的CaaCg ODN)的存在具有增加TLR9活性的独特性质。综上所述，5'-tCgCaaCg延伸体(例如A303和A603中的延伸体)可以在本发明的ODN的核心结构中。
【实施例4：本发明的ODN的核心结构】
＜ODN＞
如表6中所列制备具有部分硫代磷酸化的核苷酸间键的单链ODN。
【表6】
| ODN ID | 序列 | SEQ ID NO |
| A601 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg gtCgA-3' | SEQ ID NO：23 |
| A602 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ctCgA-3' | SEQ ID NO：24 |
| A603 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg ttCgA-3' | SEQ ID NO：21 |
| A604 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ttCgA-3' | SEQ ID NO：26 |
| A605 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgcCg ttCgA-3' | SEQ ID NO：27 |
| A606 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg taCgA-3' | SEQ ID NO：28 |
| A607 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg tgCgA-3' | SEQ ID NO：29 |
| CpG2006 | 5'-tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtT-3' | SEQ ID NO：53 |
ODN的活性通过CAL-1/NF-kB-GFP细胞中的GFP表达进行分析。如图4A和4B所示，所有测试的在3'区域的第18、21和22位碱基有变异的ODN表现出彼此相似的活性水平，并且它们的活性远高于标准CpG ODN(例如CpG2006)。这表明ODN的3'区域中位置18、21和22的碱基对于活性是可有可无的。如上所述，标准CpG ODN中的“gtcgtt”基序被称为人类TLR9活化基序(Wang,X.,et alia,Vaccine,2008.26(15):p.1893-901)，CpG2006在序列中具有三个基序。与此同时，A603在我们测试的ODN中只有一个基序，并且包括A603在内的所有测试的ODN都表现出相似的活性水平，表明在本发明的ODN中存在人TLR9活性的其他最佳基序或延伸体。此外，我们的数据表明，本发明的ODN中的'gtcgtt'基序对整体活性的贡献可以忽略不计，只要它们在它们的3'区域保持Cg-nn-Cg延伸体。本发明的ODN的3'端需要gn-Cg-nn-Cg作为核心结构。
如图5A和5B所示，本发明的ODN和标准TLR9激动剂CpG2395不能同时活化TLR7和TLR8信号通路，表明本发明的ODN是TLR9激动剂。
【实施例5】
本发明的部分脱硫代磷酸化ODN不具有TLR7和TLR8活性。
＜ODN＞
如表7中所列制备具有部分硫代磷酸化的核苷酸间键的单链ODN。
【表7】
| ODN ID | 序列 | SEQ ID NO |
| A601 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg gtCgA-3' | SEQ ID NO：23 |
| A601G | 5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg gtCgA-3' | SEQ ID NO：33 |
| A602 | 5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ctCgA-3' | SEQ ID NO：24 |
| A602G | 5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgA-3' | SEQ ID NO：35 |
| A611 | 5'-tCgCaaCgtt tacgacgtCg gtCgA-3' | SEQ ID NO：30 |
| A611A | 5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg gtCgA-3' | SEQ ID NO：34 |
| A612 | 5'-tCgCaaCgtt tacgacggCg ctCgA-3' | SEQ ID NO：31 |
| A612A | 5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgA-3' | SEQ ID NO：36 |
ODN的活性通过CAL-1/NF-kB-GFP细胞中的GFP表达进行分析。如图6A、6B和6C所示，所有测试的在3'侧12位具有碱基的变化和/或核苷酸间键的ODN表现出对NF-kB活化的相似水平的活性。这表明第12位的核苷酸允许突变，并且核苷酸3'的核苷酸间键可以是PO键或PS键。
如图7A和7B所示，ODN以及标准TLR9激动剂CpG2395不能同时活化TLR7和TLR8信号通路，表明ODN是TLR9活化剂。
综合实施例1～5，本发明的ODN显示具有5'-tcgcaacgtt t-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3'(SEQ ID NO：2)作为核心序列。对于最大的人TLR9刺激活性，ODN优选具有5'-tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg-3'(SEQ ID NO：5)作为核心结构。此外，由于本发明的ODN不遵循先前报道的规则，本发明的ODN与报道的标准CpG ODN不同，是新TLR9激动剂。
【实施例6：人细胞中TLR9刺激水平的评价】
＜HAL-01细胞的刺激＞
人B-ALL细胞系HAL-01细胞购自DSMZ(Cat.ACC610)。HAL-01细胞用10％FBS-RPMI完全培养基维持，并用1.0μM的ODN刺激24小时。用APC缀合的抗CD40 Ab(eBiosciences)和PE缀合的抗CD86 Ab(BD Pharmingen)对细胞进行染色。用流式细胞仪评估CD40和CD86表达的诱导。
＜人PBMC的刺激＞
用0.1μM或0.3μM的ODN刺激制备的人PBMC(5×105个细胞/200μl)24小时。根据制造商的流程，用WST-1测定法(Roche)评估细胞增殖。回收培养物上清液并根据制造商的流程用ELISA评估细胞因子的产生。
已知人B细胞表达TLR9，因此TLR9激动剂可以活化人B细胞。已经证明，人B-ALL细胞系用TLR9激动剂刺激，并且共刺激分子(如CD40和CD86)的表面表达随着刺激而上调。如图8A所示，本发明的ODN活化了B-ALL细胞系HAL-01细胞，这表现为CD40和CD86的表面表达上调。证明本发明的ODN可以诱导人PBMC的增殖和炎性细胞因子的产生。如图8B和8C所示，本发明的ODN可以刺激人PBMC，从而诱导细胞增殖和炎性细胞因子(例如IFN-α、IL-6和IL-12)的产生。
【实施例7：小鼠细胞中TLR9刺激水平的评价】
＜刺激小鼠脾细胞(脾细胞)＞
用0.03μM的ODN刺激制备的脾细胞24小时。回收培养物上清液，并根据制造商的流程用培养物上清液的ELISA评估细胞因子的产生。用不同浓度的ODN刺激制备的脾细胞24小时。根据制造商的流程，用WST-1测定法(Roche)评估细胞增殖。
已知TLR9激动剂可以诱导炎性细胞因子的产生和小鼠脾细胞的增殖。如图9A所示，本发明的ODN可以诱导小鼠炎性细胞因子(例如TNF-α和IL-12)的产生。此外，如图9B和9C所示，ODN诱导小鼠脾细胞增殖。ODN的活性明显高于标准TLR9激动剂CpG2395和CpG2006。
测试的ODN(A601、A602和A603)具有结构5'-tCgCaaCgtt t-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg-3'(SEQ ID NO：5)作为核心结构，这些ODN可以活化小鼠脾细胞以及人类PBMC。这表明，在精确位置定义的PO互连键(例如“tCgCaaCg”和“Cg-nn-Cg”结构)对于小鼠和人类的最佳TLR9活化非常重要。
【实施例8：ODN的体内抗肿瘤功效】
＜CT26细胞＞
BALB/c来源的小鼠结肠癌细胞系CT26购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,CRL-2638)。CT26细胞用10％FBS-RPMI完全培养基在湿润气氛和5％CO2条件下于37℃培养。
＜CT26细胞接种小鼠＞
CT26细胞用PBS中的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液回收。悬浮在培养基中后，将细胞通过40μm过滤器并对细胞数进行计数。将悬浮液中的细胞浓度调整为2×106个细胞/ml。对于BALB/c小鼠的接种，每只小鼠使用100μl细胞悬浮液(2×105个细胞/小鼠)。将小鼠背部剃毛后，用28号针头将100μl CT26细胞悬浮液皮下注射到小鼠右侧腹部。将小鼠保持无处置2周，直到肿瘤体积达到约150mm3。每2或3天测量一次肿瘤体积，根据肿瘤体积将小鼠分为3组。肿瘤体积按以下公式计算：
肿瘤体积(mm3)＝1/2(长×宽2)
＜ODN的施用＞
在分组日(第0天)开始向肿瘤周围施用ODN(40μg/50μl/小鼠)并在第2天重复。在研究期间总共进行了两次本发明的ODN的施用。每两到三天测量每组小鼠的肿瘤体积和体重。如图10所示，本发明的ODN的施用明显诱导小鼠肿瘤消退。在第11天，几乎所有小鼠中的肿瘤都被ODN施用排斥(图10A和10B)。在研究期间在每组小鼠中没有观察到体重减轻(图10C)。这表明ODN(A601和A602)具有抗肿瘤活性并且毒性很小。考虑到A601、A602和A603在小鼠脾细胞中显示出相同的活性(如9B图所示)，A603将表现出与A601和A602相同的强抗肿瘤活性。本发明的ODN被证明具有抗肿瘤活性。
【实施例9：ODN的体内抗肿瘤功效(2)】
＜CT26细胞的接种和ODN的处理＞
如上所述，CT26细胞被接种到BALB/c小鼠的右侧腹部。将小鼠保持无处置2周，直到肿瘤体积达到约100mm3。每2或3天测量一次肿瘤体积，根据肿瘤体积将小鼠分为3组。在分组日(第0天)开始向肿瘤周围施用ODN(A601和A602)(40μg/50μl/小鼠)并在第2天重复。本发明的ODN施用总共进行两次在学习期间。作为阴性对照，施用PBS代替含有ODN的溶液。每两到三天测量每组小鼠的肿瘤体积和体重，直到确认肿瘤排斥(第14天)。肿瘤体积按以下公式计算：
肿瘤体积(mm3)＝1/2(长×宽2)
＜CT26细胞在治疗小鼠中的再接种＞
CT26细胞(2×105)于第14天再次接种于小鼠左侧腹部，该小鼠已接种肿瘤并证实有肿瘤排斥，并进一步保持小鼠无处置。CT26重新接种后直至14天，每2或3天测量每只小鼠左侧腹部的肿瘤体积。
如图11A所示，本发明的ODN的施用在小鼠中明显诱导了肿瘤排斥。此外，用ODN处理的小鼠也排斥肿瘤(图11B)。虽然左侧的肿瘤在未用本发明的ODN处理的小鼠中生长，但所有用ODN处理的小鼠在2周内拒绝再次攻击的肿瘤而无需任何进一步的处理(图11B)。这表明本发明的ODN可以诱导和建立抗肿瘤免疫的记忆。
【实施例10：ODN对肺转移的体内功效】
＜CT26肺转移模型＞
如上所述制备CT26细胞的细胞悬浮液。将悬浮液调节至2.5×106个细胞/ml的终浓度。为了诱导CT26细胞的肺转移，将200μl细胞悬浮液使用28号针头从尾静脉静脉内(IV)注射到BALB/c小鼠(5×105个细胞/小鼠)(第0天)。第2天，开始施用ODN(背部皮肤皮下注射，40μg/50μl/小鼠)。在第5天重复相同剂量的施用。作为阴性对照，施用PBS代替含有ODN的溶液。CT26细胞移植后每周进行3次体重测量和小鼠行为观察。第18天，处死小鼠并测量肺重量。还计算了小鼠每个肺中的转移性肿瘤结节。
如图12所示，PBS处理组小鼠的肺重量急剧增加，并观察到许多肿瘤结节。相反，在用本发明的ODN处理的组的小鼠中没有观察到这种肺重量的增加。此外，在治疗组的小鼠中仅观察到少量的肿瘤结节。这表明本发明的ODN可以抑制肺中转移性癌细胞的生长。
【实施例11：ODN的体内功效检查与施用途径的变化】
＜CT26肺转移模型＞
如上所述用CT26细胞诱导肺转移。在CT26细胞注射的第二天，开始施用ODN(A602)。在这项研究中，测试了两种施用途径。一种是背部皮肤皮下(SC)注射(25μg/50μl/小鼠)，另一种是耳根皮内(ID)注射(25μg/20μl/小鼠)。在第3天和第5天重复相同剂量的施用。CT26细胞移植后，每周进行3次小鼠体重测量和行为观察。在第16天，处死小鼠并计数小鼠每个肺中的转移性肿瘤结节。
＜CT26肝转移模型＞
如上所述制备CT26细胞的细胞悬浮液。将细胞悬浮液调整至终浓度为1.0×106个细胞/ml。为诱导CT26细胞肝转移，如下所述将100μl细胞悬浮液注入脾脏(1×105个细胞/小鼠)(第0天)。简而言之，将小鼠麻醉并剃掉皮肤。在脾脏附近进行腹部切口(0.5cm)(左侧切口在腹部中线左侧约2cm)。使用30G针头将制备的CT26细胞悬浮液注入脾脏，注射后在脾脏中保持5分钟。为了防止出血，通向脾脏的血管用手术缝合线紧紧绑住，然后用锋利的剪刀切除脾脏。缝合腹膜和皮肤，将小鼠在光照下加热。监测并确认小鼠从麻醉中恢复。第2天，根据体重将小鼠分成3组，开始施用ODN(A602)。在这项研究中，测试了两种施用途径。一种是背部皮肤SC注射(12.5μg/50μl/小鼠)，另一种是ID注射到耳根(12.5μg/20μl/小鼠)。在第5天、第8天和第12天重复相同剂量的施用。CT26细胞移植后每周进行3次体重测量和小鼠行为观察。在第20天，处死小鼠并计数小鼠每个肝脏中的转移性肿瘤结节。
如图13A所示，在PBS处理组中观察到许多肿瘤结节。相比之下，在通过SC或ID途径治疗的两组中仅观察到少量肿瘤结节。有趣的是，ID施用到耳根表现出比SC施用更好的功效。这些结果表明，本发明的ODN可以阻断肺转移癌细胞的生长，并可以达到全身疗效。如图13B所示，在PBS处理组中也观察到严重的肝转移。相比之下，SC或ID途径治疗组均未观察到肿瘤结节，表明本发明的ODN可以阻止肝脏中转移性癌细胞的生长并达到全身疗效。总之，本发明的ODN可以全身性地阻断和排斥转移性肿瘤的生长。
【实施例12：人PBMC抗肿瘤免疫的活化】
＜人B-ALL细胞与人PBMC的共培养＞
将制备的人PBMC(5×105个细胞)与人B-ALL细胞系RCH-ACV(5×104个细胞)与ODN(0.1μM)一起在200μl 10％FBS-RPMI-完全培养基中共培养3天，回收共培养的细胞。通过用APC缀合的抗CD19 Ab和FITC缀合的抗CD138 Ab染色区分的RCH-ACV细胞的减少来评估人PBMC对RCH-ACV的消除。单独的人PBMC和单独的RCH-ACV用作染色对照。用流式细胞仪分析CD19和CD138双阳性细胞(RCH-ACV)的存在。在图14B中，在未刺激的PBMC中RCH-ACV的存在设定为100％。
＜人结肠癌细胞与人PBMC的共培养＞
将制备的人PBMC(5×105个细胞)与人结肠癌细胞COLO205(ATCC,CCL-222)(5×104个细胞)与ODN(0.1μM)一起在200μl的10％FBS-RPMI-完全培养基培养3天，回收共培养的细胞。通过用APC缀合的抗CD24 Ab和FITC缀合的抗CD45 Ab染色来区分的COLO205细胞的减少来评估人PBMC对COLO205的消除。单独的人PBMC和单独的COLO205用作染色对照。用流式细胞仪分析CD24阳性/CD45阴性细胞(COLO205)的存在。在图15B中，在未受刺激的PBMC中COLO205的存在设定为100％。
如图14A所示，RCH-ACV细胞为CD19和CD138双阳性细胞，而仅在制备的人PBMC中未观察到CD19和CD138双阳性细胞。在无刺激条件下共培养人PBMC和RCH-ACV时，检测到8.6％的RCH-ACV细胞。在A601、A602和A603存在的情况下，在培养的细胞中仅检测到0.2％至0.3％的RCH-ACV，表明人PBMC响应本发明的ODN消除了几乎所有的RCH-ACV细胞。如图14B所示，进一步证实了消除血液癌细胞的功效。
如图15A所示，COLO205细胞为CD24阳性和CD45阴性，而仅在制备的人PBMC中未观察到此类细胞。当人PBMC和COLO205在无刺激条件下(没有ODN的培养物)共培养时，检测到19.2％的COLO205细胞。在存在A601、A602和A603的情况下，在培养的细胞中仅检测到0.5％至0.9％的COLO205，表明人PBMC响应本发明的ODN消除了几乎所有的COLO205细胞。如图15B所示进一步证实了消除功效。
综上所述，表明由本发明的ODN活化人PBMC可以消除血液恶性肿瘤和实体瘤。
【实施例13：A601、A602和A603以外的ODN的功效】
用本发明的ODN(0.15μM)刺激人PBMC和小鼠脾细胞24小时，并用WST-1测定评估细胞增殖。如实施例12中所做的，将人PBMC与癌细胞(RCH-ACV或COLO205)连同本发明的ODN(0.1μM)共培养3天。检查了人PBMC对癌细胞的消除。在图16B中，未刺激的PBMC中癌细胞的存在设置为100％。
如先前在图6中所示，当在CAL-1/NF-kB-GFP细胞中检查时，所有ODN(A601、A602、A601G、A611A、A602G和A612A)在TLR9活化活性方面表现出相似水平。为了评估ODN在原代人PBMC和小鼠细胞中是否表现出相同的特征，将ODN(A601G、A611A、A602G和A612A)在之前用A601和A602测试过的几个分析系统中进行了评估。如图16A所示，所有测试的本发明的ODN在人PBMC和小鼠脾细胞中均以相似的幅度诱导细胞增殖。此外，如图16B所示，所有测试的本发明的ODN在人PBMC存在下均诱导癌细胞的显著消除。这些结果表明，由ODN(A601G、A611A、A602G和A612A)活化人PBMC可以像A601和A602一样消除血液系统恶性肿瘤和实体瘤。
总的来说，本发明的所有ODN在CAL-1/NF-kB-GFP细胞中表现出与A601或A602相似的活性水平，被认为可诱导人PBMC中人癌细胞的消除以及小鼠的抗肿瘤免疫应答。
【工业适用性】
本发明提供新的寡核苷酸和它们的衍生寡核苷酸。此外，本发明提供了包含选自所述寡核苷酸的寡核苷酸的药物组合物。本发明还提供了通过施用选自所述寡核苷酸的寡核苷酸来治疗靶疾病的方法。
序列表
<110> SBI Biotech Co., Ltd.
<120> 新TLR9激动剂
<130> FP4645PCT
<150> JP 2020-002715
<151> 2020-01-10
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列基序
<400> 1
tcgcaacgtt t 11
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列基序
<220>
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<400> 4
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<211> 24
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
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<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
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tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25
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<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
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tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25
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<220>
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<220>
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<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 21
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A703
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(12)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(15)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 22
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A601
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 23
tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A602
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 24
tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25
<210> 25
<400> 25
000 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A604
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 26
tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A605
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 27
tcgcaacgtt tgcgacgccg ttcga 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A606
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 28
tcgcaacgtt tgcgacggcg tacga 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A607
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 29
tcgcaacgtt tgcgacggcg tgcga 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A611
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 30
tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A612
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 31
tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A613
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 32
tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A601G
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 33
tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A611A
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 34
tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A602G
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 35
tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A612A
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 36
tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A603G?
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 37
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A613A
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 38
tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A601GendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 39
tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcgg 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A611AendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 40
tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcgg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A602GendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 41
tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcgg 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A612AendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 42
tcgcaacgtt tacgacggcg ctcgg 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A603GendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 43
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A613AendG
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(18)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(22)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 44
tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcgg 25
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG2395
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(21)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 45
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG685
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 46
tcgtcgacgt cgttcgttct c 21
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M362
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(24)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 47
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D60-1
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(29)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 48
tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DV093
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(17)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 49
tcgtgcatcg atgcaacg 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DV093C
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(13)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 50
tcgtgcatcg atgcaacg 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DV094
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(17)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 51
aacaacaacg ttgttgtt 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DV094C
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(5)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(17)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 52
aacaacaacg ttgttgtt 18
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG2006
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(23)
<223> 在3'硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键
<400> 53
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 54
tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 55
tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 56
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 57
tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 58
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg 24
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 59
tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 60
tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 61
tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 62
tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明的序列
<400> 63
tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga 25
Claims (34)
1.单链寡核苷酸，其包含序列基序5'-tcgcaacgttt-3'(SEQ ID NO：1)和5'-cgacg-3'。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含核苷酸序列基序5'-tcgcaacgtt t-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3'(SEQ ID NO：2)，其中n表示任何碱基。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述总碱基数为20～25。
4.根据权利要求1～3之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的序列基序：
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga(SEQ ID NO：54)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga(SEQ ID NO：55)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga(SEQ ID NO：56)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga(SEQ ID NO：57)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg(SEQ ID NO：58)；
5'-tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg(SEQ ID NO：59)；
5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga(SEQ ID NO：60)；
5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga(SEQ ID NO：61)；
5'-tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga(SEQ ID NO：62)；和
5'-tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga(SEQ ID NO：63)。
5.根据权利要求1～4之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述核苷酸间键是部分或完全化学修饰的。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述化学修饰的核苷酸间键是硫代磷酸化的。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的部分硫代磷酸化的寡核苷酸延伸体：
5'-tCgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：16)；
5'-tCgcaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：17)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：18)；
5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttcgA-3'(SEQ ID NO：19)；
5'-tCgCaacgtt tgCgaCgtcg ttCgA-3'(SEQ ID NO：20)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：21)；
5'-tCgCaaCgtt tgCgaCgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：22)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：23)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：24)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：26)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacgcCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：27)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg taCgA-3'(SEQ ID NO：28)；
5'-tCgCaaCgtt tgcgacggCg tgCgA-3'(SEQ ID NO：29)；
5'-tCgCaaCgtt tacgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：30)；
5'-tCgCaaCgtt tacgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：31)；
5'-tCgCaaCgtt tacgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：32)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：33)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：34)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：35)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：36)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：37)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg ttCgA-3'(SEQ ID NO：38)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg gtCgG-3'(SEQ ID NO：39)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg gtCgG-3'(SEQ ID NO：40)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgG-3'(SEQ ID NO：41)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgG-3'(SEQ ID NO：42)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg ttCgG-3'(SEQ ID NO：43)；和
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg ttCgG-3'(SEQ ID NO：44)，
其中所述大写字母表示在3'处无修饰的核苷酸间键的核苷，小写字母表示在3'处有带硫代磷酸化的核苷酸间键的核苷。
8.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下列的部分硫代磷酸化的寡核苷酸延伸体：
5'-tCgCaaCgtt tGcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：33)；
5'-tCgCaaCgtt tAcgacgtCg gtCgA-3'(SEQ ID NO：34)；
5'-tCgCaaCgtt tGcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：35)；和
5'-tCgCaaCgtt tAcgacggCg ctCgA-3'(SEQ ID NO：36)，
其中所述大写字母表示在3'处无修饰的核苷酸间键的核苷，小写字母表示在3'处有带硫代磷酸化的核苷酸间键的核苷。
9.根据权利要求1～8之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由DNA构成。
10.根据权利要求1～9之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸进一步缺失、替换或添加一个或多个核苷酸。
11.根据权利要求1～10之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在表达载体中。
12.根据权利要求1～10之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是环化的。
13.根据权利要求1～10之任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是线性的。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中所述线性寡核苷酸的3'端不含有磷酸。
15.双链寡核苷酸，其包含根据权利要求1～10之任一项所述的寡核苷酸及其互补链寡核苷酸。
16.根据权利要求1～15之任一项所述的寡核苷酸，其与至少一种活性分子缀合。
17.根据权利要求16所述的寡核苷酸，其中所述活性分子选自：(多)肽/抗体和核酸/寡核苷酸。
18.根据权利要求16或17所述的寡核苷酸，其中所述缀合是通过接头进行的。
19.根据权利要求18所述的寡核苷酸，其中所述接头选自：甘油、(S)-(-)-1,2,4-丁三醇、1,3,5-戊三醇、顺式,顺式-1,3,5-环己三醇、顺式,反式-1,3,5-环己三醇、1,3,5-三-(2-羟乙基)异氰脲酸酯、四乙二醇和六乙二醇，二醇(诸如1,3-丙二醇或十二烷-1,12-二醇，环己二醇)、胆甾醇、硝基吲哚、三乙二醇、六乙二醇、d-间隔基、PEG-间隔基和烷基接头。
20.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1～19之任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。
21.用于预防或治疗靶疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1～19之任一项所述的寡核苷酸，其中所述靶疾病或病症是选自下列的任一种：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
22.用于调节受试者免疫应答的试剂，包含治疗有效量的根据权利要求1～19之任一项所述的寡核苷酸。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是选自下列的肿瘤：恶性肿瘤、上皮肿瘤或造血器官肿瘤、肉瘤、间皮瘤、良性肿瘤、发育异常和化生。
24.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是由包括病毒、细菌和真菌在内的微生物引起的感染性疾病。
25.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是选自下列的与Th2/Th17相关的疾病：哮喘、过敏、多发性硬化、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、皮肤扁平苔藓和阿尔茨海默病。
26.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述靶疾病或病症是由下列原因引起的原发性免疫缺陷疾病：IRAK4缺陷、MyD88缺陷、Unc93B缺陷或TLR突变。
27.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种活性成分。
28.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中所述组合物与至少一种活性成分共施用。
29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中所述活性成分选自：抗癌药；分子靶向药物(包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂和蛋白酶体抑制剂)；抗癌抗体药物；细胞因子；疫苗；抗细菌剂；抗真菌剂；抗病毒剂；抗寄生虫药；中和毒素的抗体药物；其他TLR的激动剂及其组合。
30.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中所述组合物通过选自下列的剂量途径施用于受试者：肠内施用、肠胃外施用、局部施用和吸入。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述受试者是人。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物以2～8mg/天的量施用于受试者。
33.根据权利要求1～19之任一项所述的寡核苷酸在制备用于治疗或预防选自下列的任一种的药物中的用途：肿瘤、感染性疾病、与Th2/Th17相关的疾病、原发性免疫缺陷病和创伤后应激障碍(PTSD)。
34.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中所述组合物在过继性免疫细胞疗法或外科处置(包括放射疗法、冷冻消融、高频消融和光动力疗法(PDT))之前或之后施用。
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