JP2024513051A - 球状核酸ワクチンアーキテクチャを使用して複数のｔ細胞型を標的化すること - Google Patents

球状核酸ワクチンアーキテクチャを使用して複数のｔ細胞型を標的化すること Download PDF

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エー．マーキン チャド
ホープ テプレンスキー マイケル
エバンゲロパウロス マイケル
ワン シューヤー
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ノースウェスタン ユニバーシティ
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    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
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Abstract

本開示は、概して、複数のクラスの免疫細胞を標的とすることができるオリゴヌクレオチドの放射状提示によって囲まれたコアを有するナノ構造である球状核酸（ＳＮＡ）に関する。ナノ粒子を作製及び使用する方法もまた本明細書で提供される。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。【選択図】図２６

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１６７，９７７号及び２０２１年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，８６９号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下で優先権の利益を主張し、各それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
政府支援に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ２０８７８３及びＣＡ１９９０９１－０３の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を、明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「２０２１－０８７Ｒ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは２０２２年３月３０日に作成され、サイズが９，５０３バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、複数のクラスの免疫細胞を標的化することができるオリゴヌクレオチドの放射状提示によって囲まれたコアを有するナノ構造である球状核酸（ＳＮＡ）に関する。ナノ粒子を作製及び使用する方法もまた本明細書で提供される。
球状核酸（ＳＮＡ）は、特定の標的に対する免疫系を活性化することができる強力な免疫療法剤である。ナノ粒子コアに放射状にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの高密度シェルを含むＳＮＡは、ワクチン構造が機能、及び結果として生じる療法の成功に直接影響することを実証している。これは、合理的なワクチン学として知られている有力な概念であり、同じ臨床的に採用された標的を利用して免疫応答を高めることを可能にするが、効力のために活用されるアーキテクチャを有する。免疫系は複雑であり、したがって、ワクチンは、堅牢な応答及び最終的な腫瘍拒絶のために、複数の異なるタイプの細胞を活性化する必要がある。本開示は、複数の異なる免疫細胞型を活性化する複数の異なる標的の定義された位置付けを伴うＳＮＡの合成について記載し、応答を増強することができ、ＳＮＡ内の標的の構造及び位置付けがワクチンの有効性を強く決定づけることを示す。
本明細書に記載される技術の用途には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ワクチン設計
・がん免疫療法
・ナノ医療
免疫関連障害（例えば、自己免疫障害）の治療。
本明細書に記載される技術の利点には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・細胞への成分の制御された提示につながるワクチンの構造的制御、
・ナノ粒子内の免疫標的の定義された位置付け、及び細胞内輸送にわたる制御、及び免疫細胞による取り込み後の放出の動態、
・提示は、血清安定性、細胞取り込み、並びに免疫活性化及び標的成分の共送達を増強する。
・標的（例えば、がん標的）を変化させるためのモジュール性を有するプラットフォーム技術、
・増強された免疫応答
したがって、いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。更なる実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。更なる実施形態では、第１の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。更なる実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第１の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第３の抗原を含む。更なる実施形態では、本開示のＳＮＡは、主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第４の抗原を含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。更なる実施形態では、第４の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。なお更なる実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。いくつかの実施形態では、第４の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、第３の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。更なる実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第３の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第３の抗原は、同じである。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第３の抗原は、異なる。いくつかの実施形態では、第２の抗原及び第４の抗原は、同じである。更なる実施形態では、第２の抗原及び第４の抗原は、異なる。様々な実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ抗原は、ＯＶＡ２５７－２６４（ＯＶＡ１）（配列番号７）、ＧＰ１００（２５－３３）（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号１１））、ＴＣ－１ Ｅ６（４９－５８）（ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２））、ＴＣ－１ Ｅ７（４９－５７）（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３））、ＰＳＭＡ（６３４－６４２）（ＳＡＶＫＮＦＴＥＩ（配列番号１４））、ＳＰＡＳ－１（ＳＮＣ９－Ｈ８）（ＳＴＨＶＮＨＬＨＣ（配列番号１５））、ＳＩＭＳ２（２３７－２４５）（ＳＬＤＬＫＬＩＦＬ（配列番号１６））、ＰＡＰ（１１５－１２３）（ＳＡＭＴＮＬＡＡＬ（配列番号１７））、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ２７）（ＬＣＰＧＮＫＹＥＭ（配列番号９））、ＴＲＰ－１（２５２－２６０）（ＡＴＧＫＮＶＣＤＶ（配列番号１８））、ＴＲＰ－１（２５２Ｖ２６０Ｍ）（ＡＴＧＫＮＶＣＤＭ（配列番号１９））、ＴＲＰ－１（４５５－４６３）（ＴＡＰＤＮＬＧＹＡ（配列番号２０））、ＴＲＰ－１（４５５Ａ４６３Ｍ）（ＴＡＰＤＮＬＧＹＭ（配列番号２１））、ＴＲＰ－２（１８０－１８８）（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号２２））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－（１２７－１３５）、チロキナーゼ（１－９）、チロキナーゼ（３６９－３７７Ｄ）、ＭＣ３８ Ａｄｐｇｋ（ＡＳＭＴＮＭＥＬＭ（配列番号２３））、Ｉｒｇｑ－最小（ＡＡＬＬＮＳＡＶＬ（配列番号２４））、Ｉｒｇｑ－長鎖ペプチド（ＫＡＲＤＥＴＡＡＬＬＮＳＡＶＬＧＡＡＰＬＦＶＰＰＡＤ（配列番号２５））、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ抗原は、ＯＶＡ３２３－３３９（ＯＶＡ２）（配列番号８）、ＧＰ１００：（４６－５８）（ＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬ（配列番号２６））、ＴＣ－１ Ｅ６（４３－５７）（ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号２７））、ＳＩＭＳ２（２４０－２５４）（ＬＫＬＩＦＬＤＳＲＶＴＥＶＴＧ（配列番号２８））、ＰＡＰ（１１４－１２８）（ＭＳＡＭＴＮＬＡＡＬＦＰＰＥＧ（配列番号２９））、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ３０）（ＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱ（配列番号３０））、ＴＲＰ－１（１１３－１２７）（ＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩＬ（配列番号３１））、ＴＲＰ－１（１０６－１３０）（ＳＧＨＮＣＧＴＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩＬＴＶＲ（配列番号３２））、Ｌｉ－Ｋｅｙ（７７－９２）（ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＱＭＲ（配列番号３３））、チロキナーゼ（５６－７０）、ＧＰ１００（４４－５９）、ＧＰ１００（１６７－１８９）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（１０２－１１１）（ＰＡＹＥＫＬＳＡＥＱＳＰＰＰＹ（配列番号３４））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（２７－４０）（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩＬＧＶＬ（配列番号３５））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７０）（ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬ（配列番号３６））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７３）（ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ（配列番号３７））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（４３－５７）（ＩＧＣＷＹＣＲＲＲＮＧＹＲＡＬ（配列番号３８））、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。更なる実施形態では、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの各々は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。なお更なる実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態では、ＴＬＲは、ＴＬＲ９である。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧヌクレオチド配列を含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’（配列番号３９）の配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’（配列番号４０）の配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））２コレステロール－３’（配列番号４１）の配列を含むか、又はそれからなる。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））２コレステロール－３’（配列番号６）の配列を含むか、又はそれからなる。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、リンカーは、カルバメートアルキレンジスルフィドリンカー、チオールリンカー、ジスルフィドリンカー、アミドアルキレンジスルフィドリンカー、アミドアルキレンチオ－スクシンイミジルリンカー、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、ナノ粒子コアは、ミセル、リポソーム、ポリマー、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、ポリマーは、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、シリカ、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、又はキトサンである。いくつかの実施形態では、ポリマーはポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、リポソームである。様々な実施形態では、リポソームは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びコレステロールからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、１個以上のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している。なお更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール又はコレステロールである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、その５’終端及び／又は３’終端でジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）で修飾される。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、その５’終端及び／又は３’終端でチオールで修飾される。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチ
ドのシェルは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約２～約２００個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約２～約１００個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約１５０個のオリゴヌクレオチドを含む。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約２００個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約１０～約８０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約７５個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約５～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約２０～約３０ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、ＳＮＡの直径は、約１ナノメートル（ｎｍ）～約５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＳＮＡの直径は、約８０ナノメートル以下である。いくつかの実施形態では、ＳＮＡの直径は、約５０ナノメートル以下である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、標的化オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、非標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される複数のＳＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数の中の少なくとも２つのＳＮＡは、異なるナノ粒子コアを含む。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される複数のＳＮＡ又は組成物と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む薬学的製剤を提供する。
更なる態様では、本開示は、本開示のＳＮＡ、組成物、又は薬学的製剤を含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバント又は追加のアジュバントを含む。
いくつかの態様では、本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤、安定剤、若しくは保存剤中の本開示のＳＮＡ、又は本開示の薬学的製剤を含む抗原性組成物であって、対象において抗体生成、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、ヘルパーＴ細胞の活性化、又は防御免疫応答を含む免疫応答を生成することができる、抗原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗体応答を含む。更なる実施形態では、抗体応答は、中和抗体応答又は防御抗体応答である。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子産物の発現を阻害する方法であって、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含み、ポリヌクレオチドと阻害性オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズが、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性を有するポリヌクレオチドの長さにわたって生じる、方法を提供する。様々な実施形態では、遺伝子産物の発現は、インビボ又はインビトロで阻害される。
いくつかの態様では、対象において免疫応答を産生する方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載される各々のＳＮＡ、組成物、薬学的製剤、ワクチン、又は抗原性組成物を投与し、それによって、対象において免疫応答を産生することを含む、方法。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗体応答を含む。更なる実施形態では、抗体応答は、全抗原特異的抗体応答である。いくつかの実施形態では、抗体応答は、中和抗体応答又は防御抗体応答である。
いくつかの態様では、本開示は、対象を１つ以上の抗原に対して免疫化する方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載される各々のＳＮＡ、組成物、薬学的製剤、ワクチン、又は抗原性組成物を投与し、それによって、対象を１つ以上の抗原に対して免疫化することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物又はワクチンは、がんワクチンである。
いくつかの態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載される各々のＳＮＡ、組成物、薬学的製剤、ワクチン、又は抗原性組成物を投与し、それによって、対象におけるがんを治療することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、膠芽細胞腫、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、黒色腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、オステオカルシノマ（ｏｓｔｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、及びヒトパピローマウイルス誘発がん、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、がんは、結腸がんである。更なる実施形態では、がんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、追加の薬剤を投与することを更に含む。様々な実施形態では、追加の薬剤は、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体、抗プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）抗体、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）抗体、又はそれらの組み合わせである。
２つの抗原クラスを組み込んだ球状核酸（ＳＮＡ）構造を示す。（左）二重抗原ＳＮＡ（ＤＡ－ＳＮＡ）１では、ＭＨＣ－Ｉ（キラーＣＤ８＋Ｔ細胞）抗原はリポソームのコアに封入され、一方、ＭＨＣ－ＩＩ（ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞）抗原はアジュバントＤＮＡシェルにハイブリダイズする。（右）ＤＡ－ＳＮＡ２は、その逆である。 ＳＮＡ構造により、増強された特性が実証され、免疫療法におけるツールとして使用することができることを示す。 免疫療法におけるツールとしてのその使用に特に関連するＳＮＡ構造の追加の実証されて増強された特性を示す。 独自の位置付けで画定される２つのクラスの抗原を組み込んだＳＮＡ構造を示す。 異なる二重抗原ＳＮＡが異なるＴ細胞においてサイトカイン産生を活性化した実験の結果を示す。 Ｔ細胞におけるメモリーマーカーの発現が、ＤＡ－ＳＮＡ構造に基づいて異なった実験の結果を示す。 循環抗原特異的免疫細胞が二重抗原球状核酸（ＤＡ－ＳＮＡ）治療に基づいて異なっていたことを示す実験の結果を示す。 循環免疫細胞メモリーがＤＡ－ＳＮＡ治療からの細胞をプロファイリングすることを示す実験の結果を示す。 ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化するために抗原を使用する構造的変化が、有効性の差につながることを示す。ＤＡ－ＳＮＡ２は、ワクチンの効力及び抗腫瘍効果を劇的に変化させ、腫瘍を失速させた。 球状核酸（ＳＮＡ）が、免疫応答に対する構造的配置の影響の解明を可能にすることを示す略画。 構造的なＳＮＡの変化により、腫瘍成長が変化したことを示す。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスの右脇腹に、５００，０００個のＥＧ．７－ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下注射した。３日目に、マウスへの毎週の治療を開始した。合計４つのワクチンを投与し、腫瘍を２～３日毎に測定した。群当たりＮ＝９。統計を、２４日目の一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ多重比較事後検定を使用して計算した＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図９に関連して、図１１は、追加的に、ＭＨＣ－Ｉ抗原及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の両方を含むＳＮＡによって提供される追加された利益を、ＭＨＣ－Ｉ抗原を単に含むのと対比して示すデータを含む。ＯＶＡ２抗原のないＯＶＡ１抗原（「ＯＶＡ１のみのＳＮＡ」）の存在は、ＤＡ－ＳＮＡ２が行う長期間にわたる腫瘍成長を失速させなかった。 免疫細胞脾臓集団が、ワクチン接種の結果として変化することを示す。ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ６雌マウスにＳＮＡを毎週合計４回注射した後、脾臓を採取し、処理して、細胞集団を同定した。（左）ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞である集団の割合、又は（右）ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ４（ヘルパー）Ｔ細胞に対する相対比を示す。２４日目の一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用して、統計を計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＭＨＣ Ｉ及びＩＩ抗原による同時ＤＣ活性化が、Ｔ細胞増殖の増加につながることを示す。同定されたヘルパー（ＯＶＡ２）抗原及び細胞傷害性（ＯＶＡ１）抗原を有するＯＶＡ系を使用すると、両方のクラスの抗原が１つのＳＮＡ内の同じ細胞に送達されたときに、増強された免疫活性化が観察された。同じ細胞への異なる抗原型の送達（組み合わせ）は、別個のＳＮＡ上での各抗原型の送達（別個）と比較して、Ｔ細胞増殖においておよそ２倍の増強を誘発した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の遺伝子発現プロファイルが、ワクチン接種条件に基づいて独自であることを示す。異なる治療によるインビボワクチン接種に続く脾臓細胞から単離したＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞集団のトランスクリプトームについての主成分分析（ＰＣＡ）。ＰＣＡは、データセット内に存在する変動を可能な限り保持しながら、多数の相互に関連する変数からなるゲノムデータセットの次元を削減する。同種の色（治療）のグループ化は、治療が同様の遺伝子レベルの変化を引き起こしていたことを示す。ｘ軸（ＰＣ１）上の最も離れた部分は、遺伝的レベルで最も類似していなかった群（すなわち、左の混和物及びＯＶＡ１Ｈのみを含有するＳＮＡ、並びに右の混和物及び３つ全てのＳＮＡ群）を示す。次のレベルの分散は、ｙ軸（ＰＣ２）上の群間の分離である。 ＣＤ８＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルが、ワクチン接種条件に基づいて異なっていたことを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団についての遺伝子発現ヒートマップは、ワクチン接種治療条件に基づいて独自に活性化された遺伝子経路を表した。黒色のボックスは、治療群にわたる実質的な変動性を有する遺伝子を強調する。 ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルがワクチン接種条件に基づいて異なっていたことを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団についての遺伝子発現ヒートマップは、ワクチン接種治療条件に基づいて独自に活性化された遺伝子経路を表した。黒色のボックスは、治療群にわたる実質的な変動性を有する遺伝子を強調する。 ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルがワクチン接種条件に基づいて異なっていたことを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団についての遺伝子発現ヒートマップは、ワクチン接種治療条件に基づいて独自に活性化された遺伝子経路を表した。黒色のボックスは、治療群にわたる実質的な変動性を有する遺伝子を強調する。 ＤＡ－ＳＮＡ２（例えば、ＤＡ－ＳＮＡ－１及びＤＡ－ＳＮＡ－２の記載については、図４を参照されたい）が、堅牢なＣＤ８＋Ｔ細胞メモリーを生成したことを示す。二重抗原ＳＮＡ（ＤＡ－ＳＮＡ）内の抗原の位置付けは、免疫応答に影響を及ぼした。ＤＡ－ＳＮＡ２は、他のワクチン接種治療と比較して、惹起されたＣＤ８＋エフェクター機能のレベルを高めた。どちらのＤＡ－ＳＮＡも、ＣＤ４＋エフェクター機能を増強した。 ＤＡ－ＳＮＡ２ワクチン接種が、抗原刺激時にＩＦＮ－γ分泌を増加させたことを示す。異なるエクスビボ刺激時のＩＦＮ－γ－分泌脾臓Ｔ細胞の代表的な計数及び画像。 ＤＡ－ＳＮＡ２ワクチン接種が、抗原刺激時にＩＦＮ－γ分泌を増加させたことを示す。異なるエクスビボ刺激時のＩＦＮ－γ－分泌脾臓Ｔ細胞の計数。（図１８に示される代表的な画像）。 ＩＦＮ－γ及びＣＤ１０７ａの産生が、治療群のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞において増加したことを示す。ＣＤ８＋（左）又はＣＤ４＋（右）のいずれかのＴ細胞における細胞内ＩＦＮ－γ（左及び右）及びＣＤ１０７ａ（中央）レベルは、異なるエクスビボ刺激時に、ＤＡ－ＳＮＡ２でワクチン接種したＴ細胞におけるＩＦＮ－γの増強を実証する。＊Ｐ＜０．０５。 ＯＶＡ１特異的Ｔ細胞メモリーが、ＳＮＡ治療のために増強されたことを示す。異なる群（図１１と同じスケジュールに従って）治療した腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ６マウス（群当たりｎ＝６）を、治療の過程全体を通したメモリー免疫応答の評価のためにｄ１７において採取した。（左）二量体によって測定したＣＤ８－抗原特異的（ＯＶＡ１）Ｔ細胞の量が示されている。（右）これらの特異的Ｔ細胞のうち、エフェクターメモリー状態は、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化マウスで最も増強されている。バーのすぐ上の星は、ＰＢＳ群に対する比較である。それ以外では、特定の比較が示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＶＡ２特異的Ｔ細胞メモリーがＳＮＡ治療のために増強されたことを示す。異なる群（図２１と同じスケジュールに従って）治療した腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ６マウス（群当たりｎ＝６）を、治療の経過全体を通したメモリー免疫応答の評価のためにｄ１７において採取した。（左）四量体によって測定したＣＤ４－抗原特異的（ＯＶＡ２）Ｔ細胞の量が示されている。（右）これらの特異的Ｔ細胞のうち、エフェクターメモリー状態は、ＤＡ－ＳＮＡ１免疫化マウスで最も増強されており、ＤＡ－ＳＮＡ２及びＯＶＡ１ＨのみのＳＮＡ群に対してわずかに低いレベルである。＊Ｐ＜０．０５。 ＤＡ－ＳＮＡが、臨床的に関連する黒色腫腫瘍に適用されるときに腫瘍成長を失速させたことを示す。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスの右脇腹に、１００，０００個のＢ１６．Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。３日目に、マウスへの毎週の治療を開始した。合計４つのワクチンを投与し、腫瘍を２～３日毎に測定した。群当たりＮ＝６。統計を、２０日目の一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ多重比較事後検定を使用して計算した ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 抗ＰＤ－１との併用療法が、構造駆動型ＳＮＡの抗腫瘍特性を増強したことを示す。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスの右脇腹に、１００，０００個のＢ１６．Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。３日目に、マウスへの毎週の治療を開始した。合計４つのワクチンを、ワクチン注射の３及び６日後に注射した抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤とともに投与した。腫瘍を２～３日毎に測定した。群当たりＮ＝６。統計を、群を抗ＰＤ－１と比較する一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ多重比較事後検定を使用して計算した ＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 併用療法がまた、動物生存率に正の影響を及ぼしたことを示す。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスの右脇腹に、１００，０００個のＢ１６．Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。３日目に、マウスへの毎週の治療を開始した。合計４つのワクチンを、ワクチン注射の３及び６日後に注射した抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤とともに投与した。腫瘍を２～３日毎に測定し、腫瘍サイズが１５００ｍｍ＾３に達したときに、動物を犠死させた。群当たりＮ＝６。腫瘍体積についての統計を、群を抗ＰＤ－１と比較する一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ多重比較事後検定を使用して計算した。生存統計を、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 球状核酸（ＳＮＡ）ワクチンからの２つのクラスの抗原を送達すると、抗原がインビトロで処理される方法が変化することを示す。ａ）同じナノ粒子構造内のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ制限抗原の位置付けを変化させるために合成された二重抗原ＳＮＡ（ＤＡ－ＳＮＡ）ワクチン。ｂ）別個のナノ粒子（破線、別個）又は単一のＤＡ－ＳＮＡ（実線、組み合わせ）のいずれか上での２つの抗原クラスを送達しても、ＣＤ８６又はＣＤ８０発現ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの集団の倍率変化に影響を与えない。ｃ）ＯＶＡ１抗原（左）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞又はナイーブ脾臓Ｔ細胞と治療パルスＤＣの共培養から惹起されたＯＶＡ２抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞。（左）Ｔ細胞対別個及び組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（それぞれ、Ｐ＝０．００２５及び０．００１６）、並びに別個及び組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（それぞれ、Ｐ＝０．００１７及び０．００９４）。（右）Ｔ細胞対組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０２６８）、及びＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０２８５）。ｄ）抗原特異的ＣＤ８＋（左）又はＣＤ４＋（右）Ｔ細胞の集団内のＣＤ６９活性化マーカーシグナルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）。（右）Ｔ細胞対組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．００４７）。ｅ）治療パルスＤＣとの共培養後のＯＶＡ１抗原に特異的なＯＴ１脾臓細胞からのＴ細胞増殖の倍率変化。（左）別個対組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．００３６）、（右）別個対組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０３０６）。全てのパネルについて、関連する比較間の統計的有意性とともに示される平均値±ｓ．ｅ．ｍ．。有意性を、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、群当たりｎ＝３～４回の反復で計算した。ｎｓ＝有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 球状核酸（ＳＮＡ）ワクチンからの２つのクラスの抗原を送達すると、抗原がインビトロで処理される方法が変化することを示す。ａ）同じナノ粒子構造内のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ制限抗原の位置付けを変化させるために合成された二重抗原ＳＮＡ（ＤＡ－ＳＮＡ）ワクチン。ｂ）別個のナノ粒子（破線、別個）又は単一のＤＡ－ＳＮＡ（実線、組み合わせ）のいずれか上での２つの抗原クラスを送達しても、ＣＤ８６又はＣＤ８０発現ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの集団の倍率変化に影響を与えない。ｃ）ＯＶＡ１抗原（左）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞又はナイーブ脾臓Ｔ細胞と治療パルスＤＣの共培養から惹起されたＯＶＡ２抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞。（左）Ｔ細胞対別個及び組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（それぞれ、Ｐ＝０．００２５及び０．００１６）、並びに別個及び組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（それぞれ、Ｐ＝０．００１７及び０．００９４）。（右）Ｔ細胞対組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０２６８）、及びＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０２８５）。ｄ）抗原特異的ＣＤ８＋（左）又はＣＤ４＋（右）Ｔ細胞の集団内のＣＤ６９活性化マーカーシグナルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）。（右）Ｔ細胞対組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．００４７）。ｅ）治療パルスＤＣとの共培養後のＯＶＡ１抗原に特異的なＯＴ１脾臓細胞からのＴ細胞増殖の倍率変化。（左）別個対組み合わせＯＶＡ１（封入）＆ＯＶＡ２（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．００３６）、（右）別個対組み合わせＯＶＡ２（封入）＆ＯＶＡ１（ハイブリダイズ）（Ｐ＝０．０３０６）。全てのパネルについて、関連する比較間の統計的有意性とともに示される平均値±ｓ．ｅ．ｍ．。有意性を、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、群当たりｎ＝３～４回の反復で計算した。ｎｓ＝有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 抗原分布の影響を評価するために、ＤＡ－ＳＮＡ治療との並列比較として投与される別個のＳＮＡの組み合わせの概略図。別個のナノ粒子を、表面上でハイブリダイズした単一抗原、及びリポソームコア内に封入された単一抗原として調製した。 リポソーム内に封入されたペプチドの量を定量化するために使用されるペプチドアッセイからの標準曲線の例を示す。データポイントを、常にＲ２＞０．９８を有する線形回帰に適合させた。 製造業者が供給する標準を使用する脂質含有量の分析を通してリポソームの濃度を定量化するために使用される、ホスファチジルコリン（ＰＣ）アッセイからの標準曲線の例を示す。データポイントを、常にＲ２＞０．９８を有する線形回帰に適合させた。 実施例２で使用した４つの精製ペプチド－ＤＮＡコンジュゲート：Ｍ２７、Ｍ３０、ＯＶＡ１、ＯＶＡ２のＥＳＩを、予想されるこれらの確認された質量とともに示す。 リポソーム及びＳＮＡの動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。統計的有意性を有するＤＡ－ＳＮＡ１又はＤＡ－ＳＮＡ２構造のいずれかへの封入されたリポソーム又はＤＯＰＣリポソーム間のサイズシフトを示し、ＳＮＡ形成を示す。データは、５つの独立した測定値からの平均値±標準誤差を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０００１。 ＣＤ８＋ＯＶＡ１－Ｈ－２ｋｂ又はＣＤ４＋ＯＶＡ２－Ｈ－２－Ｉａｄのいずれかについて二重陽性である生存ＣＤ１９－脾臓細胞の割合を定量化するための図２６Ｃについてのゲーティング戦略を示す。 ＤＡ－ＳＮＡ内の抗原位置付けが免疫化後の免疫応答に影響を及ぼしたことを示す。ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスについての隔週の免疫化スケジュール。用量：６ｎｍｏｌの各抗原、６ｎｍｏｌのアジュバント。ｂ）ワクチン接種スキーム後の脾臓におけるＣＤ８＋（左）又はＣＤ４＋（右）細胞集団の変化。（左）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０４１４）。ｃ）ＩＦＮ－γ炎症誘発性サイトカイン（左）又はＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカー（中央）の細胞内産生を、ペプチド抗原によるエクスビボ再刺激時に評価した。多機能性Ｔ細胞（両方のマーカーに対して二重陽性）を定量化した（右）。ＤＡ－ＳＮＡ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における全てのマーカーの産生を有意に上昇させたのに対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞における産生間の差はより微少であり、どちらのＤＡ－ＳＮＡも、混和物ワクチンで免疫化したマウスよりも著しくレベルを上昇させた。（上）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２、及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれの全てが、左：Ｐ＝０．０１０２及び０．０１２４、中央：Ｐ＝０．０１８８及び０．０２６６、右：Ｐ＝０．０１及び０．０１１９）。ｄ）ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－マーカーを通して測定したエフェクターメモリー表現型は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のためのＤＡ－ＳＮＡ２によって増加した。ＣＤ４＋エフェクター機能は、ＤＡ－ＳＮＡ１免疫化に対して最も上昇した。（左）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝０．００１６及び０．０３８０）。ｅ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（右）によって測定した全スポット形成細胞（ＳＦＣ）とともに、異なるエクスビボ刺激時のＩＦＮ－γ分泌脾臓Ｔ細胞の代表的な計数及び画像（左）。ＯＶＡ１エクスビボ刺激についての、混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝＜０．０００１及び０．００４７）。ＯＶＡ２エクスビボ刺激についての、混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝＜０．０００１及び０．０００４）。示される平均値±標準誤差。群当たりｎ＝３匹のマウス。関連する比較間の統計的有意性を示す。全てのパネルについて、有意性を、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＤＡ－ＳＮＡ内の抗原位置付けが免疫化後の免疫応答に影響を及ぼしたことを示す。ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスについての隔週の免疫化スケジュール。用量：６ｎｍｏｌの各抗原、６ｎｍｏｌのアジュバント。ｂ）ワクチン接種スキーム後の脾臓におけるＣＤ８＋（左）又はＣＤ４＋（右）細胞集団の変化。（左）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０４１４）。ｃ）ＩＦＮ－γ炎症誘発性サイトカイン（左）又はＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカー（中央）の細胞内産生を、ペプチド抗原によるエクスビボ再刺激時に評価した。多機能性Ｔ細胞（両方のマーカーに対して二重陽性）を定量化した（右）。ＤＡ－ＳＮＡ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における全てのマーカーの産生を有意に上昇させたのに対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞における産生間の差はより微少であり、どちらのＤＡ－ＳＮＡも、混和物ワクチンで免疫化したマウスよりも著しくレベルを上昇させた。（上）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２、及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれの全てが、左：Ｐ＝０．０１０２及び０．０１２４、中央：Ｐ＝０．０１８８及び０．０２６６、右：Ｐ＝０．０１及び０．０１１９）。ｄ）ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－マーカーを通して測定したエフェクターメモリー表現型は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のためのＤＡ－ＳＮＡ２によって増加した。ＣＤ４＋エフェクター機能は、ＤＡ－ＳＮＡ１免疫化に対して最も上昇した。（左）混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝０．００１６及び０．０３８０）。ｅ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（右）によって測定した全スポット形成細胞（ＳＦＣ）とともに、異なるエクスビボ刺激時のＩＦＮ－γ分泌脾臓Ｔ細胞の代表的な計数及び画像（左）。ＯＶＡ１エクスビボ刺激についての、混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝＜０．０００１及び０．００４７）。ＯＶＡ２エクスビボ刺激についての、混和物対ＤＡ－ＳＮＡ２及びＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝＜０．０００１及び０．０００４）。示される平均値±標準誤差。群当たりｎ＝３匹のマウス。関連する比較間の統計的有意性を示す。全てのパネルについて、有意性を、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 異なって構造化されたワクチンを用いたマウスの免疫化が、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞間の遺伝子発現の特定の差を誘導したことを示す。ａ）ＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞の完全なトランスクリプトームからの主成分分析（ＰＣＡ）プロット。ｂ）異なる治療の結果として、ＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞集団についての対数倍変化（ＬＦＣ）のサブセットによって表される遺伝子発現変化。ｃ）ＧＳＥＡ分析を使用して計算された有意に濃縮された経路の選択。四角の色は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞のための異なる治療の結果としての各経路についての濃縮スコアに対応する。ｄ）ＣＤ８＋（上）及びＣＤ４＋（下）Ｔ細胞についての遺伝子シグネチャー。色は、正規化された（ｚスコアリングされた）遺伝子発現レベルを指す。標識された関連遺伝子の選択。ｅ）ＤＡ－ＳＮＡ２とＤＡ－ＳＮＡ１との一対比較間のＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞のボルケーノプロット。赤い点は、有意に発現した遺伝子を示し、陽性のＬＦＣは、ＤＡ－ＳＮＡ１に関してＤＡ－ＳＮＡ２に対する上方調節を示し、陰性のＬＦＣは、ＤＡ－ＳＮＡ１に関してＤＡ－ＳＮＡ２に対する下方調節を示す。 異なって構造化されたワクチンを用いたマウスの免疫化が、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞間の遺伝子発現の特定の差を誘導したことを示す。ａ）ＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞の完全なトランスクリプトームからの主成分分析（ＰＣＡ）プロット。ｂ）異なる治療の結果として、ＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞集団についての対数倍変化（ＬＦＣ）のサブセットによって表される遺伝子発現変化。ｃ）ＧＳＥＡ分析を使用して計算された有意に濃縮された経路の選択。四角の色は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞のための異なる治療の結果としての各経路についての濃縮スコアに対応する。ｄ）ＣＤ８＋（上）及びＣＤ４＋（下）Ｔ細胞についての遺伝子シグネチャー。色は、正規化された（ｚスコアリングされた）遺伝子発現レベルを指す。標識された関連遺伝子の選択。ｅ）ＤＡ－ＳＮＡ２とＤＡ－ＳＮＡ１との一対比較間のＣＤ８＋（左）及びＣＤ４＋（右）Ｔ細胞のボルケーノプロット。赤い点は、有意に発現した遺伝子を示し、陽性のＬＦＣは、ＤＡ－ＳＮＡ１に関してＤＡ－ＳＮＡ２に対する上方調節を示し、陰性のＬＦＣは、ＤＡ－ＳＮＡ１に関してＤＡ－ＳＮＡ２に対する下方調節を示す。 増強された腫瘍抑制のためのＤＡ－ＳＮＡ免疫活性化を示す。ａ～ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞（５×１０５）を皮下接種し、合計４回のワクチン接種（６ｎｍｏｌアジュバント、６ｎｍｏｌの各抗原）のために、３日目に開始する毎週の免疫化を提供した。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。ＤＡ－ＳＮＡ１及び混和物と比較したＤＡ－ＳＮＡ２の２４日目の腫瘍体積（それぞれ、Ｐ＝０．０１２１及びＰ＝０．００８４）。ＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０２１９）、ＤＡ－ＳＮＡ２対ＰＢＳ及び混和物（それぞれ、Ｐ＝０．００３０及びＰ＝０．００２９）を比較する動物生存率。ｄ）ａに示される治療スケジュールに従った腫瘍重量（１５日目）。ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１及びＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝０．００６４及びＰ＝０．００３４）を比較する腫瘍重量 ｅ）実験終了時の脾臓における免疫ＣＤ８＋Ｔ細胞の評価（左）。ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比（右）。ＤＡ－ＳＮＡ２対ＰＢＳ（Ｐ＝０．０２９７）、混和物（Ｐ＝０．００１３）、及びＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．０００２）の脾臓におけるＴ細胞。ｆ～ｉ）ａ．ｆ）のＯＶＡ１抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に示されるスケジュール下で、腫瘍保有マウスから単離した１５日目のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。ＤＡ－ＳＮＡ２対混和物（Ｐ＝０．０４０１）。ｇ）この抗原特異的Ｔ細胞サブセット内のエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ６２Ｌ－）。ＤＡ－ＳＮＡ２対混和物（Ｐ＝０．００２０）。ｈ）ＯＶＡ２抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞。混和物対ＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．０２２９）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０４３６）。ｉ）エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ６２Ｌ－）。ＤＡ－ＳＮＡ１対混和物（Ｐ＝０．０００１）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．００１２）。データは、２つの独立した実験（各実験ｎ＝７～９）からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。パネルｂ、ｄ～ｇ、ｉについては、有意性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。パネルｈは、標準偏差における群間の有意差に起因して、Ｗｅｌｃｈ ＡＮＯＶＡに続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用した。パネルｃを、ログランク検定を使用して分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 増強された腫瘍抑制のためのＤＡ－ＳＮＡ免疫活性化を示す。ａ～ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞（５×１０５）を皮下接種し、合計４回のワクチン接種（６ｎｍｏｌアジュバント、６ｎｍｏｌの各抗原）のために、３日目に開始する毎週の免疫化を提供した。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。ＤＡ－ＳＮＡ１及び混和物と比較したＤＡ－ＳＮＡ２の２４日目の腫瘍体積（それぞれ、Ｐ＝０．０１２１及びＰ＝０．００８４）。ＤＡ－ＳＮＡ１対ＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０２１９）、ＤＡ－ＳＮＡ２対ＰＢＳ及び混和物（それぞれ、Ｐ＝０．００３０及びＰ＝０．００２９）を比較する動物生存率。ｄ）ａに示される治療スケジュールに従った腫瘍重量（１５日目）。ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１及びＤＡ－ＳＮＡ２（それぞれ、Ｐ＝０．００６４及びＰ＝０．００３４）を比較する腫瘍重量 ｅ）実験終了時の脾臓における免疫ＣＤ８＋Ｔ細胞の評価（左）。ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比（右）。ＤＡ－ＳＮＡ２対ＰＢＳ（Ｐ＝０．０２９７）、混和物（Ｐ＝０．００１３）、及びＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．０００２）の脾臓におけるＴ細胞。ｆ～ｉ）ａ．ｆ）のＯＶＡ１抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に示されるスケジュール下で、腫瘍保有マウスから単離した１５日目のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。ＤＡ－ＳＮＡ２対混和物（Ｐ＝０．０４０１）。ｇ）この抗原特異的Ｔ細胞サブセット内のエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ６２Ｌ－）。ＤＡ－ＳＮＡ２対混和物（Ｐ＝０．００２０）。ｈ）ＯＶＡ２抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞。混和物対ＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．０２２９）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０４３６）。ｉ）エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ６２Ｌ－）。ＤＡ－ＳＮＡ１対混和物（Ｐ＝０．０００１）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．００１２）。データは、２つの独立した実験（各実験ｎ＝７～９）からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。パネルｂ、ｄ～ｇ、ｉについては、有意性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。パネルｈは、標準偏差における群間の有意差に起因して、Ｗｅｌｃｈ ＡＮＯＶＡに続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用した。パネルｃを、ログランク検定を使用して分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 治療成長当たりの個々の動物からのＥ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍成長値を図３５Ｂに示す。異なる群のスパイダープロット間の容易な比較のために、２１日目に線を引いた。 １５日目の腫瘍重量を計算するために使用されるＥ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍の肉眼的画像を示す。点線の白い円は、腫瘍が存在しないマウスを表す。スケールバー：１ｍｍ。 免疫チェックポイント阻害剤を用いた二重抗原免疫療法を利用する腫瘍阻害を示す。ａ～ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、Ｂ１６－Ｆ１０細胞（１０５個）を皮下接種し、合計４回のワクチン接種（９ｎｍｏｌのアジュバント、９ｎｍｏｌの各抗原）のために、３日目に開始する毎週の皮下免疫化を提供した。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。ｃ）単離されたＰＢＭＣにおけるＭ２７抗原及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞マーカー４４＋／６２－に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞。ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．００６０）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０００１）。ｄ～ｅ）ＤＡ－ＳＮＡ免疫化の３日後及び６日後に腹腔内に投与される抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＤＡ－ＳＮＡの毎週の皮下免疫化を受けるＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウス。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。１７日目（Ｐ＝０．０３５４）、２０日目（Ｐ＝０．０３１９）、及び２２日目（Ｐ＝０．０４７５）の抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１を比較する腫瘍成長。ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＜０．０００１）及び抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）を比較する動物生存率。ｆ～ｋ）ｄ．ｆ）の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の評価、及びｇ）の全エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／６２Ｌ－）に示されるスケジュールを受ける腫瘍保有マウスから単離した１７日目のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。ｆについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．０００１）、抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０００９））、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）。ｇについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝＜０．０００１）、抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００９０）。ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．００２３）及び抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０２０３）。ｈ）Ｍ２７特異的ＣＤ８＋／ＣＤ１９－Ｔ細胞。ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．００９３）、抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０１３８）、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００５２）。ｉ）循環ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量化、及びｊ）エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／６２Ｌ－）の評価。ｉについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０３７２）。ｊについて：ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０２６８）及びＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０３４９）、抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００６７）、及びＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００８９）。ｋ）Ｍ３０特異的ＣＤ４＋／ＣＤ１９－Ｔ細胞。データは、２つの独立した実験（ｎ＝９～１５）からの平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す。ｂ及びｅを除く全てのパネルについて、有意性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。動物生存率を、ログランク検定を使用して分析した。ｄにおけるアスタリスクは、ＤＡ－ＳＮＡ２治療群と抗ＰＤ－１治療群との間の統計的に有意な差を示す。ｎ．ｓ．＝有意ではない；ｎ．ｄ＝検出されない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 免疫チェックポイント阻害剤を用いた二重抗原免疫療法を利用する腫瘍阻害を示す。ａ～ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、Ｂ１６－Ｆ１０細胞（１０５個）を皮下接種し、合計４回のワクチン接種（９ｎｍｏｌのアジュバント、９ｎｍｏｌの各抗原）のために、３日目に開始する毎週の皮下免疫化を提供した。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。ｃ）単離されたＰＢＭＣにおけるＭ２７抗原及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞マーカー４４＋／６２－に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞。ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１（Ｐ＝０．００６０）及びＤＡ－ＳＮＡ２（Ｐ＝０．０００１）。ｄ～ｅ）ＤＡ－ＳＮＡ免疫化の３日後及び６日後に腹腔内に投与される抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＤＡ－ＳＮＡの毎週の皮下免疫化を受けるＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウス。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。１７日目（Ｐ＝０．０３５４）、２０日目（Ｐ＝０．０３１９）、及び２２日目（Ｐ＝０．０４７５）の抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１を比較する腫瘍成長。ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＜０．０００１）及び抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）を比較する動物生存率。ｆ～ｋ）ｄ．ｆ）の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の評価、及びｇ）の全エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／６２Ｌ－）に示されるスケジュールを受ける腫瘍保有マウスから単離した１７日目のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。ｆについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．０００１）、抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０００９））、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）。ｇについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝＜０．０００１）、抗ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００９０）。ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．００２３）及び抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０２０３）。ｈ）Ｍ２７特異的ＣＤ８＋／ＣＤ１９－Ｔ細胞。ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＰＢＳ（Ｐ＝０．００９３）、抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０１３８）、及びＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００５２）。ｉ）循環ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量化、及びｊ）エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋／６２Ｌ－）の評価。ｉについて：ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０３７２）。ｊについて：ＰＢＳ対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０２６８）及びＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．０３４９）、抗ＰＤ－１対ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００６７）、及びＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１（Ｐ＝０．００８９）。ｋ）Ｍ３０特異的ＣＤ４＋／ＣＤ１９－Ｔ細胞。データは、２つの独立した実験（ｎ＝９～１５）からの平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す。ｂ及びｅを除く全てのパネルについて、有意性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。動物生存率を、ログランク検定を使用して分析した。ｄにおけるアスタリスクは、ＤＡ－ＳＮＡ２治療群と抗ＰＤ－１治療群との間の統計的に有意な差を示す。ｎ．ｓ．＝有意ではない；ｎ．ｄ＝検出されない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 治療群当たりの個々の動物からのＢ１６－Ｆ１０腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍成長値を図３８Ｄに示す。 ワクチン設計が異種腫瘍集団と戦わなければならないことを示す略画である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、インターフェロン－γなどのサイトカインを分泌することによって（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｑｉｎ ａｎｄ Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ，２０００）、又はマクロファージ及び好酸球などのエフェクター細胞の活性化及び動員によって（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，１９９１；Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の不在下で抗腫瘍応答をもたらすことができる。しかしながら、がんに対する免疫応答におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の主な役割は、ＣＤ８＋細胞をプライムし、それらの増殖を維持することである。 ワクチン設計が不均一な腫瘍集団と戦わなければならないことを示す略画である。 追加の免疫細胞を惹起する抗原標的化戦略がワクチン効果を改善することを示す。 強力なワクチン送達が複数のクラスの細胞を刺激することを示す略画。 ａ～ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、ＭＣ３８細胞（５×１０５個）を皮下接種し、合計４回のワクチン接種（６ｎｍｏｌのアジュバント、６ｎｍｏｌの各抗原）のために、３日目に開始する毎週の免疫化を提供した、実験の結果を示す。平均腫瘍成長曲線及び動物生存率を示す。ｃ）２４日目の平均腫瘍体積。
様々な態様では、本開示は、異なるクラスの抗原の組み込み及び個別の構造的位置付けを通して複数のクラスの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を標的化する、オリゴヌクレオチドの高密度放射状提示によって囲まれたコアを有するナノ構造である球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。抗原は、ナノ粒子コアに封入された、表面にアンカーされた、又はアジュバントオリゴヌクレオチドＳＮＡシェルにハイブリダイズしている相補的オリゴヌクレオチド鎖にコンジュゲートされた場所が挙げられるが、これに限定されない、場所に組み込むことができる。様々な実施形態では、本開示のマルチ抗原標的化ＳＮＡは、相乗的免疫応答のために複数の異なるタイプの免疫細胞を最適に活性化するワクチン成分の定義された構造的提示を提供する。
球状核酸（ＳＮＡ）は、ワクチン成分の送達及び効力を改善することができるナノ材料である。放射状に向きを定められたオリゴヌクレオチド（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）中のｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を作動させる非メチル化シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）モチーフＤＮＡ）の高密度表面層を有するナノ粒子コアから構成されるＳＮＡは、従来のワクチンに優るいくつかの利点を有するモジュール構造である。それらは、高い親和性標的結合、トランスフェクション試薬を必要としない迅速な細胞取り込み、高い生体適合性、低減されたヌクレアーゼ分解、及び皮下注射時のリンパ節への容易な排出を有する（Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４（３），１３７６－１３９１、Ｂａｎｇａ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｔ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６（２８），９８６６－９８６９、Ｒａｄｏｖｉｃ－Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｆ．；Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．；Ｍａｄｅｒ，Ｃ．Ｃ．；Ｎａｌｌａｇａｔｌａ，Ｓ．；Ｋａｎｇ，Ｒ．Ｓ．；Ｈａｏ，Ｌ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｈａｌｏ，Ｔ．Ｌ．；Ｍｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．；Ｒｉｓｃｈｅ，Ｃ．Ｈ．；Ａｎａｎｔａｔｍｕｌａ，Ｓ．；Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｍ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１５，１１２（１３），３８９２－３８９７、Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｈａｏ，Ｌ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１３，１１０（１９），７６２５－７６３０、Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１２（５７７６），１０２７－１０３０、Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｑｉｎ，Ｌ．；Ｙａｍａｎｋｕｒｔ，Ｇ．；Ｓｋａｋｕｊ，Ｋ．；Ｈｕａｎｇ，Ｚ．；Ｃｈｅｎ，Ｐ．－Ｃ．；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｄ．；Ｌｅｅ，Ａ．；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１９，１１６（２１），１０４７３－１０４８１）。それらの合成の容易さ及び固有のモジュール性は、２つの主要成分－オリゴヌクレオチドアジュバント（免疫系活性化剤）シェル及び抗原（免疫系標的）の多様な配置を有する組成的に同等の構造設計を可能にする。構造修飾は、ワクチンアーキテクチャが機能に影響を与え、独特な免疫応答を産生することを示しており、これは、モデルオボアルブミン（ＯＶＡ）リンパ腫腫瘍及びＨＰＶなどの複数の腫瘍モデル、並びに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的化する前立腺がん関連系において実証されている。しかしながら、これまでのところ、免疫細胞の１つのクラス：細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のみを活性化する抗原が組み込まれている。
腫瘍の不均一性及び免疫系を進化及び回避する能力のために、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を標的化する増強された主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ－Ｉ）を生成するだけでなく、相乗的相互作用も関与させることが重要である。具体的には、ＣＤ８＋及びヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が、長期にわたる腫瘍拒絶に必要である（Ｏｓｔｒｏｕｍｏｖ，Ｄ．；Ｆｅｋｅｔｅ－Ｄｒｉｍｕｓｚ，Ｎ．；Ｓａｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．；Ｋｕｈｎｅｌ，Ｆ．；Ｗｏｌｌｅｒ，Ｎ．ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１８，７５（４），６８９－７１３、Ｓｈａｎｋａｒａｎ，Ｖ．；Ｉｋｅｄａ，Ｈ．；Ｂｒｕｃｅ，Ａ．Ｔ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．ＩＦＮγ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔｕｍｏｕｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｈａｐｅ Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１０（６８３２），１１０７－１１１１）。したがって、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ抗原を同時に使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方をプライムすることによって増強されたワクチン有効性を有するＳＮＡを提供する。これは、黒色腫において特に重要であり、化学療法又は放射線などの旧来の治療は、高い遺伝子変異量を有し、したがって、免疫系を容易に回避することができるため、効果が弱い。しかしながら、現在の臨床的代替法は、変異に対応することができる広範な反応を惹起するのに効果がないか、論理的に困難であるか、又は高価であるかのいずれかであり、結果として生じる免疫応答に対する構造の影響を考慮したものはない。ＳＮＡは、免疫刺激キューの提示を制御し、腫瘍免疫回避の可能性を低下させるために複数の黒色腫関連抗原を標的化することによって、堅牢ながんワクチンとして機能することができる。本開示は、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の両方を刺激するために特定の構造配置で複数のエピトープを提示することによって、ワクチン効力を改善するための合理的なワクチン学手法を利用する。
本明細書では、これらの２つのクラスの抗原（一方はＣＤ８＋Ｔ細胞を標的化し、もう一方はＣＤ４＋Ｔ細胞を標的化する）の構造的位置付けが、遺伝子、細胞、及び生物レベルでの変化を誘導することによって、ワクチンの有効性を劇的に変化することが開示されている。モデルＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ ＯＶＡ抗原を使用して、組成的に同等なＳＮＡが、異なる免疫応答を指示することが観察された。ＭＨＣ－Ｉ抗原がシェルにハイブリダイズし、ＭＨＣ－Ｉ抗原がコアに封入された１つの特定のＳＮＡ構造は、ＭＨＣ－Ｉ抗原と－ＩＩ抗原とを入れ替えた位置付けを有する逆のものと比較して、ＣＤ８＋エフェクター細胞の２倍の増加（図１）、並びに抗原及びアジュバントの両方の単純混合物と比較して、３倍の増加を誘発した。追加的に、このＳＮＡ構造は、抗原特異的ＩＦＮ－γ分泌及び細胞内ＩＦＮ－γ産生を、逆ＳＮＡ又は単純混合物からのレベルよりも５倍高いレベルまで増強した。これにより、免疫化後の脾臓におけるバルクＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑによって測定されるような、トランスクリプトームの変化の直接的な結果であることが見出された。重要なことに、これらの傾向は、インビボ黒色腫系に変換され、異なるＳＮＡは、腫瘍成長における有意な差を誘導する。
本開示は、腫瘍の不均一性が、より複雑なワクチンの合理的な設計を通してどのように対処され得るかを実証する。この手法を組み込み、ワクチン設計における抗原位置付けを考慮することによって、本明細書では、ＳＮＡワクチン効力を変化させることができることが実証される。本開示の材料及び方法は、ナノ構造を使用する機会に対処して、免疫細胞に複数の免疫刺激キューを提示し、その処理を連係させるため、この分野に広く適用可能である。例えば、本明細書に記載の技術は、ワクチン機能のための構造的基礎の機構的理解を知らせるため、他のシステム及び生物学的知識に変換可能である。本明細書に記載の技術は、拡張可能、制御可能、かつ全体的に生成される免疫応答を可能にする。本明細書に記載される複数の標的を組み込む最適化された構造的提示では、がんの場合、腫瘍免疫回避の前により速く完全な寛解につながるより堅牢な応答がある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の指示対象が含まれる。
「～から」、「～まで」、「最大」、「少なくとも」、「～より大きい」、「～より小さい」などの全ての言語は、列挙された数を含み、その後部分的な範囲に分解することができる範囲を指す。
範囲には、各個々のメンバーが含まれる。したがって、例えば、１～３つのメンバーを有する群は、１つ、２つ、又は３つのメンバーを有する群を指す。同様に、６つのメンバーを有する群は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は６つのメンバーを有する群を指す。
「約」及び「およそ」とは、一般に、測定の性質又は精度を考慮して測定された量について許容される誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、２０～２５パーセント（％）以内、例えば、記載された値又は値の範囲の２０パーセント以内、１０パーセント以内、５パーセント以内、４パーセント以内、３パーセント以内、２パーセント以内、又は１パーセント以内である。
「対象」は、脊椎動物生物である。対象は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、又は非ヒト霊長類）であり得るか、又は対象は、ヒト対象であり得る。
本明細書で使用される場合、「投与すること」、「投与する」、「投与」などの用語は、ＳＮＡを、そのような薬剤による治療を必要とする対象に移送、送達、導入、又は輸送する任意のモードを指す。そのようなモードには、経口、局所、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、鼻腔内、及び皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」は、疾患（例えば、がん）に関連する症状の重症度及び／又は発症の任意の低減を指す。したがって、「治療すること」及び「治療」には、治療的及び予防的手段が含まれる。当業者は、疾患（例えば、がん）からの任意の程度の保護又は回復が、ヒト患者などの対象に有益であることを理解するであろう。患者の生活の質は、対象における症状の重症度を任意の程度まで低減し、かつ／又は症状の出現を遅らせることによって向上させる。
本明細書で使用される場合、「標的化オリゴヌクレオチド」は、ＳＮＡを特定の組織及び／又は特定の細胞型に指向するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドはアプタマーである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、ナノ粒子コアの外部に結合したアプタマーを含み、アプタマーは、特定の細胞型の表面上の１つ以上の受容体に結合するように設計されている。
本明細書で使用される場合、「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、免疫応答を刺激（例えば、誘導又は増強）することができるオリゴヌクレオチドである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの典型的な例は、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及び二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。「ＣｐＧモチーフ」は、シトシン－グアニンジヌクレオチド配列である。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニスト）である。
「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、ｍＲＮＡをリボソーム内のタンパク質に翻訳することを妨げることによって、又は１つ以上の標的遺伝子若しくはｍＲＮＡに特異的に結合（ハイブリダイズ）し、それによって標的タンパク質の発現又は生物学的活性を低減する、標的タンパク質のうちの１つ以上をコードする遺伝子又はｍＲＮＡのいずれかに十分に相補的である、タンパク質の産生又は発現を低減するオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドには、単離又は合成の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ模倣物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、先天性免疫受容体のＤＮＡ又はＲＮＡ阻害剤、アプタマー、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムが含まれるが、これらに限定されない。
「非標的化オリゴヌクレオチド」という用語は、いくつかの実施形態では、特定の活性（例えば、免疫刺激性活性）に関連していないが、代わりに、ＳＮＡの外部表面上で、ある特定の密度のオリゴヌクレオチドを達成するために使用される、ＳＮＡのオリゴヌクレオチドのシェルに含まれるオリゴヌクレオチドを指す。非標的化オリゴヌクレオチドの非限定的な例は、スクランブルヌクレオチド配列及び／又はホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリチミジンオリゴヌクレオチド（Ｔ２０などの））を含むオリゴヌクレオチドである。
「抗原性組成物」は、例えば、本明細書に記載の抗原のうちの１つ以上などの抗原に対する、特異的な免疫応答を誘発することができる、ヒト又は動物対象への投与（例えば、実験的又は臨床的な設定での）に好適な物質の組成物である。本開示の文脈において、抗原性組成物という用語は、本明細書に記載の抗原のうちの１つ以上などの抗原に対する防御又は緩和免疫応答を誘発する目的での、対象又は対象の集団への投与が意図される組成物を包含すると理解される。
本明細書で使用される場合、「用量」という用語は、任意の時点で対象によって摂取される（対象に投与されるか又は対象によって受け取られる）本開示のＳＮＡ（例えば、本明細書に記載されるＳＮＡ、抗原性組成物、薬学的製剤）のうちのいずれかの測定された分量を指す。
「免疫応答」は、本明細書に記載されるＳＮＡなどの刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は単球などの免疫系の細胞の応答である。免疫応答は、Ｂ細胞応答であり得、これは、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の産生をもたらす。免疫応答はまた、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答又はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答などのＴ細胞応答であり得る。Ｂ細胞及びＴ細胞応答は、「細胞性」免疫応答の態様である。本明細書に記載されるように、「免疫応答」はまた、免疫系が腫瘍と活発に戦っている間にプライムされる「治療ベースの」応答であり得る。免疫応答はまた、抗体によって媒介される「体液性」免疫応答であり得る。いくつかの場合では、応答は、特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。「防御免疫応答」は、抗原の有害な機能若しくは活性を阻害するか、又は抗原から生じる症状（死亡を含む）を減少させる免疫応答である。この文脈における防御は、対象が感染に対して完全に保護されることを必ずしも必要としない。防御応答は、対象が疾患の症状の発生から保護されるとき、又は対象がより低い重症度の疾患症状を経験するときに達成される。防御免疫応答は、例えば、偽ウイルス中和アッセイ（又は代理ウイルス中和試験）、ＥＬＩＳＡ中和アッセイ、抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）などの、免疫化された対象からの血清試料を使用し、偽ウイルス結合の阻害のための血清抗体の能力を試験する免疫アッセイによって測定され得る。加えて、ワクチンの有効性は、免疫化後のＢ又はＴ細胞活性化を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析又はＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して測定することによって試験され得る。防御免疫応答は、動物モデルにおいてインビボで抗原チャレンジに対する抵抗性を測定することによって試験され得る。ヒトにおいて、防御免疫応答は、未治療対照と比較して、治療対象における症状、罹患率、死亡率などの測定値を比較する、集団研究において実証され得る。本明細書に記載されるＳＮＡなどの免疫原性刺激への対象の曝露は、刺激に特異的な一次免疫応答を誘発する、すなわち、曝露は免疫応答を「プライム」する。刺激へのその後の曝露（例えば、免疫化による）は、特異的免疫応答の規模（又は持続期間、又はその両方）を増加又は「ブースト」し得る。したがって、例えば、本開示の抗原性組成物を投与することによって既存の免疫応答を「ブースト」することは、抗原特異的応答の規模を増加させる（例えば、産生された抗体の幅を広げることによって（すなわち、変異体に対して免疫系をプライムするブースターを投与する場合）、抗体価及び／若しくは親和性を増加させることによって、抗原特異的Ｂ若しくはＴ細胞の頻度を増加させることによって、成熟エフェクター機能を誘導することによって、又はそれらの組み合わせ）。Ｂ及びＴ細胞の「成熟度及びメモリー」はまた、免疫応答の指標として測定され得る。
「アジュバント」は、抗原を含む組成物に添加されるときに、曝露に際してレシピエントにおける抗原に対する免疫応答を非特異的に増強又は強化する物質を指す。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、本発明で提供されるＳＮＡは、アジュバントとして免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、限定するものではないが、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト）を含み、本明細書に記載される抗原を含む。本開示による使用が企図される追加のアジュバントとしては、本明細書に記載されるＴＬＲアゴニスト（例えば、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＴＬＲ７のイミキモド、ＴＬＲ８のモトリモド、ＴＬＲ４のＭＰＬＡ４、ＴＬＲ３のポリ（Ｉ：Ｃ）、又はそれらの組み合わせ）に加えて、アルミニウム（例えば、水酸化アルミニウム）、脂質系のアジュバントＡＳ０１Ｂ、ミョウバン、ＭＦ５９が挙げられる。
物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果をもたらすために必要な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。本開示のＳＮＡを投与する文脈において、例えば、有効量は、免疫応答を誘発するのに十分な抗原を含有する。いくつかの実施形態では、有効量のＳＮＡは、遺伝子発現を阻害するのに十分な量である。有効量は、本明細書に更に記載される１つ以上の用量で投与され得る。有効性は、実験的又は臨床的な試験において、例えば、実験対照と比較して、目的の物質を用いて達成された結果を比較することによって、示され得る。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、本明細書の全体を包含し得る。
球状核酸
球状核酸（ＳＮＡ）は、ナノ粒子コアの表面上に、高密度に機能化され、高度に配向されたポリヌクレオチドを含む。様々な態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、ミセル、リポソーム、ポリマー、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、ポリマーは、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、シリカ、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、又はキトサンである。いくつかの実施形態では、ポリマーはポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。ポリヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは無関係なほぼ全ての細胞中への侵入及びヌクレアーゼ分解に対する耐性を含む、伝統的な核酸送達方法を上回る特有の利点を与える。更に、ＳＮＡは、血液脳関門（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００３１７４５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）及び血液腫瘍関門並びに表皮（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２３３２７０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を含む、生物学的関門を貫通し得る。
リポソームは、親水性コアを有する１つ又はいくつかの疎水性脂質二重層を含む様々なサイズ範囲の球状の自己閉鎖構造である。これらの脂質ベースの担体の直径は、０．１５～１マイクロメートルの範囲であり、これは、２０～１００ナノメートルの有効な治療範囲よりも顕著に大きい。小さな単層小胞（ＳＵＶ）と呼ばれるリポソームは、２０～５０ナノメートルのサイズの範囲で合成することができるが、粒子間融合につながる不安定性及び凝集などの課題に直面する。この粒子間融合は、治療剤におけるＳＵＶの使用を制限する。いくつかの態様では、リポソーム球状核酸（ＬＳＮＡ）は、リポソームコアと、リポソームコアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む。本開示による使用が企図される抗原は、本明細書において以下に更に記載される。
したがって、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８４２９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるようなリポソーム粒子もまた、本開示によって提供される。本開示のリポソーム粒子は、少なくとも実質的に球状の形状、内側及び外側を有し、複数の脂質基を含む。様々な実施形態では、複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む。本開示によって企図される脂質としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、カルジオリピン、脂質Ａ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介してリポソームコアの外部に結合している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を通してナノ粒子コアの外部に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している。なお更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール又はコレステロールである。したがって、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、脂質アンカー基を含有するオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートであり、該脂質アンカー基は、脂質二重層に吸着される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの全てが、脂質アンカー基を含有するオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートであり、該脂質アンカー基は、脂質二重層に吸着される。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、脂質アンカー基を通してリポソームコアの外部に結合（例えば、吸着）している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、又はコレステロールを含む。脂質アンカーを含むオリゴヌクレオチドを作製する方法が、本明細書に開示される。例として、最初に、オリゴヌクレオチド及びホスホロアミダイト修飾トコフェロールが提供され、次いで、オリゴヌクレオチドをホスホロアミダイト修飾トコフェロールに曝露して、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを作り出す。限定することを意味するものではないが、アミド結合又はクリックケミストリーを含む、当業者に既知の任意の化学を使用して、脂質アンカーをオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
リポソームＳＮＡ（ＬＳＮＡ）を作製する方法は、本明細書に記載されており、一般に知られている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１９，１１６（２１），１０４７３－１０４８１）を参照されたい）。
脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのシェルで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲート、及び主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原、及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原を含む。本開示による使用が企図される抗原は、本明細書において以下に更に記載される。オリゴヌクレオチドのシェルは、脂質ナノ粒子コアの外部表面に結合し、本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、同様の脂質／リピドイド構造、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、ステロールは、３β－ヒドロキシコレスト－５－エン（コレステロール）、９，１０－セココレスタ－５，７，１０（１９）－トリエン－３β－オール（ビタミンＤ３）、９，１０－セコエルゴスタ－５，７，１０（１９），２２－テトラエン－３β－オール（ビタミンＤ２）、カルシポトリオール、２４－エチル－５，２２－コレスタジエン－３β－オール（スチグマステロール）、２２，２３－ジヒドロスチグマステロール（β－シトステロール）、３，２８－ジヒドロキシ－ルペオール（ベツリン）、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、２４α－メチルコレステロール（カンペステロール）、２４－エチルコレスタ－５，２４（２８）Ｅ－ジエン－３β－オール（フコステロール）、２４－メチルコレスタ－５，２２－ジエン－３β－オール（ブラシカステロール）、２４－メチルコレスタ－５，７，２２－トリエン－３β－オール（エルゴステロール）、９，１１－デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は１つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートへの共有結合を介して、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを通して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される脂質アンカー基を通して脂質ナノ粒子コアの外部に結合（又は吸着）している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、本明細書に記載される脂質基を通して脂質ナノ粒子コアの外部に結合（又は吸着）している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’又は３’終端に結合している。様々な実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、又はコレステロールである。
ＳＮＡは、約１ナノメートル（ｎｍ）～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約４００ｎｍ、約１ｎｍ～約３００ｎｍ、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、約１ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約７０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約６０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約５０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約４０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約３０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約２０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１４０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１３０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１１０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約９０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約８０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約７０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約６０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約５０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約４０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約３０ｎｍの直径、又は約１０ｎｍ～約２０ｎｍの直径のサイズの範囲であり得る。更なる態様では、本開示は、複数のＳＮＡであって、各ＳＮＡが、それに結合した１個以上のオリゴヌクレオチドを含む、複数のＳＮＡを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、複数のＳＮＡのサイズは、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ（平均直径）、平均直径約１０ｎｍ～約１４０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１１０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約９０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約８０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約７０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約６０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約４０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、又は平均直径約１０ｎｍ～約２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＳＮＡの直径（又は複数のＳＮＡについては平均直径）は、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、又は約４０～約８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、方法で使用されるナノ粒子のサイズは、それらの特定の使用又は用途によって必要に応じて変化する。サイズの変動は、有利には、ＳＮＡの特定の物理的特性、例えば、本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドが結合し得る表面積の量を最適化するために使用される。ＳＮＡの前述の直径は、ナノ粒子コア自体の直径、又はナノ粒子コア及びそれに結合する１個以上のオリゴヌクレオチドの直径に適用することができることが理解されるであろう。
抗原
本開示の球状核酸（ＳＮＡ）は、様々な態様では、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む。本明細書に記載されるように、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の数及び位置決めは、例えば、ワクチンとしてのその使用におけるＳＮＡの効力に影響を与える。ＭＨＣ－Ｉ抗原はＣＤ８＋Ｔ細胞をプライムし、一方、ＭＨＣ－ＩＩ抗原はＣＤ４＋Ｔ細胞をプライムする。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、ＳＮＡは、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ抗原及び少なくとも１つのＭＨＣ－ＩＩ抗原を含む。本開示によって企図されるＭＨＣ－Ｉ抗原としては、ＯＶＡ２５７－２６４（ＯＶＡ１）（配列番号７）、ＧＰ１００（２５－３３）（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号１１））、ＴＣ－１ Ｅ６（４９－５８）（ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２））、ＴＣ－１ Ｅ７（４９－５７）（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３））、ＰＳＭＡ（６３４－６４２）（ＳＡＶＫＮＦＴＥＩ（配列番号１４））、ＳＰＡＳ－１（ＳＮＣ９－Ｈ８）（ＳＴＨＶＮＨＬＨＣ（配列番号１５））、ＳＩＭＳ２（２３７－２４５）（ＳＬＤＬＫＬＩＦＬ（配列番号１６））、ＰＡＰ（１１５－１２３）（ＳＡＭＴＮＬＡＡＬ（配列番号１７））、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ２７）（ＬＣＰＧＮＫＹＥＭ（配列番号９））、ＴＲＰ－１（２５２－２６０）（ＡＴＧＫＮＶＣＤＶ（配列番号１８））、ＴＲＰ－１（２５２Ｖ２６０Ｍ）（ＡＴＧＫＮＶＣＤＭ（配列番号１９））、ＴＲＰ－１（４５５－４６３）（ＴＡＰＤＮＬＧＹＡ（配列番号２０））、ＴＲＰ－１（４５５Ａ４６３Ｍ）（ＴＡＰＤＮＬＧＹＭ（配列番号２１））、ＴＲＰ－２（１８０－１８８）（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号２２））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－（１２７－１３５）、チロキナーゼ（１－９）、チロキナーゼ（３６９－３７７Ｄ）、ＭＣ３８ Ａｄｐｇｋ（ＡＳＭＴＮＭＥＬＭ（配列番号２３））、Ｉｒｇｑ－最小（ＡＡＬＬＮＳＡＶＬ（配列番号２４））、Ｉｒｇｑ－長鎖ペプチド（ＫＡＲＤＥＴＡＡＬＬＮＳＡＶＬＧＡＡＰＬＦＶＰＰＡＤ（配列番号２５））、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本開示によって企図されるＭＨＣ－ＩＩ抗原としては、ＯＶＡ３２３－３３９（ＯＶＡ２）（配列番号８）、ＧＰ１００：（４６－５８）（ＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬ（配列番号２６））、ＴＣ－１ Ｅ６（４３－５７）（ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号２７））、ＳＩＭＳ２（２４０－２５４）（ＬＫＬＩＦＬＤＳＲＶＴＥＶＴＧ（配列番号２８））、ＰＡＰ（１１４－１２８）（ＭＳＡＭＴＮＬＡＡＬＦＰＰＥＧ（配列番号２９））、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ３０）（ＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱ（配列番号３０））、ＴＲＰ－１（１１３－１２７）（ＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩＬ（配列番号３１））、ＴＲＰ－１（１０６－１３０）（ＳＧＨＮＣＧＴＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩＬＴＶＲ（配列番号３２））、Ｌｉ－Ｋｅｙ（７７－９２）（ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＱＭＲ（配列番号３３））、チロキナーゼ（５６－７０）、ＧＰ１００（４４－５９）、ＧＰ１００（１６７－１８９）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（１０２－１１１）（ＰＡＹＥＫＬＳＡＥＱＳＰＰＰＹ（配列番号３４））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（２７－４０）（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩＬＧＶＬ（配列番号３５））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７０）（ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬ（配列番号３６））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７３）（ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ（配列番号３７））、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（４３－５７）（ＩＧＣＷＹＣＲＲＲＮＧＹＲＡＬ（配列番号３８））、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の任意の構成及び組み合わせがＳＮＡで使用され得ることを企図する。したがって、様々な態様及び実施形態では、本開示は、ａ）ＭＨＣ－Ｉ抗原及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の両方がナノ粒子コアに封入され、抗原がナノ粒子コアの外部側に会合していない、ｂ）ＭＨＣ－Ｉ抗原及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の両方がナノ粒子コアに封入され、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩ抗原がナノ粒子コアの外部側に追加的に会合している、ｃ）ＭＨＣ－Ｉ抗原及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の両方がナノ粒子コアの外部側上にあり、抗原がナノ粒子コアに封入されていない、ｄ）ＭＨＣ－Ｉ抗原及びＭＨＣ－ＩＩ抗原の両方がナノ粒子コアの外部側上にあり、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩ抗原がナノ粒子コアに追加的に封入されている、ｅ）ＭＨＣ－Ｉ抗原がナノ粒子コアに封入され、ＭＨＣ－ＩＩ抗原がナノ粒子コアの外部側に会合している、ｆ）ＭＨＣ－ＩＩ抗原がナノ粒子コアに封入され、ＭＨＣ－Ｉ抗原がナノ粒子コアの外部側に会合している、ＳＮＡを提供する。したがって、様々な実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ抗原（複数可）及びＭＨＣ－ＩＩ抗原（複数可）は、ナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合して（例えば、共有結合性若しくは非共有結合性の相互作用を通して）、又はそれらの任意の組み合わせで、ナノ粒子コア内に封入される。ナノ粒子コアの外部側上でナノ粒子コアに会合している抗原は、本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、ナノ粒子コアの遠位に位置する。したがって、いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に結合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、次いで、抗原はオリゴヌクレオチドの５’終端に結合している）。あるいは、いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に結合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、次いで、抗原はオリゴヌクレオチドの３’終端に結合している）。更なる実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアの近位にあるオリゴヌクレオチドの終端に結合しており、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている。あるいは、いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアの遠位にあるオリゴヌクレオチドの終端に結合しており、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。更なる実施形態では、第２の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。本明細書で使用される場合、「リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している」抗原は、ａ）抗原がナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドに直接結合していること、及び／又はｂ）抗原がナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに結合していることが挙げられるが、これらに限定されない、様々な方法で結合し得る。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、抗原が、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドに直接結合しているとき、抗原は、非標的化オリゴヌクレオチドに結合している。したがって、いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。更なる実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第２の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。更なる実施形態では、第１の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。様々な実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。更なる実施形態では、第１の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第３の抗原を含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第４の抗原を含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。更なる実施形態では、第４の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。なお更なる実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。いくつかの実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。いくつかの実施形態では、第４の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。更なる実施形態では、第３の抗原は、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。更なる実施形態では、第３の抗原は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している。なお更なる実施形態では、第３の抗原は、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合している。いくつかの実施形態では、第４の抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第３の抗原は、同じである。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第３の抗原は、異なる。なお更なる実施形態では、第２の抗原及び第４の抗原は、同じである。いくつかの実施形態では、第２の抗原及び第４の抗原は、異なる。
いくつかの態様では、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ抗原である複数の第１の抗原、ＭＨＣ－ＩＩ抗原である複数の第２の抗原、又はその両方を含むＳＮＡを提供する。第１の抗原及び／又は第２の抗原は、ナノ粒子コアに封入されているか、ナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合しているか、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、複数の第１の抗原の各々は、同じである。更なる実施形態では、複数の第１の抗原は、本明細書に記載される第１の抗原の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、複数の第２の抗原の各々は、同じである。更なる実施形態では、複数の第２の抗原は、本明細書に記載される第２の抗原の任意の組み合わせを含む。したがって、ＳＮＡは、本明細書に記載される第１の抗原及び第２の抗原の任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの態様では、本開示は、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）ナノ粒子コアに封入されている１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原及びナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合している１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原と、を含む、ＳＮＡを提供する。更なる態様では、本開示は、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）ナノ粒子コアに封入されている１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原及びナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合している１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原と、を含む、ＳＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原のうちのいくつかは、ナノ粒子コアに封入されており、また、ナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合している。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原のうちのいくつかは、ナノ粒子コアに封入されており、また、ナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアに会合している。更なる実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原のうちのいくつか及び１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原のうちのいくつかは、ナノ粒子コアに封入されており、ナノ粒子コアの外部側上のナノ粒子コアにも会合している。様々な実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原は全て同じであり、一方、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ抗原は、本明細書に記載されるＭＨＣ－Ｉ抗原の任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原は全て同じであり、一方、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－ＩＩ抗原は、本明細書に記載されるＭＨＣ－ＩＩ抗原の任意の組み合わせを含む。
更なる態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第１の抗原と、（ｄ）主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。
更なる態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第１の抗原と、（ｄ）主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第２の抗原と、（ｅ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第３の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第３の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コア、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェル、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第１の抗原と、（ｄ）主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第２の抗原と、（ｅ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第３の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第３の抗原と、（ｆ）主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第４の抗原であって、ナノ粒子コアに封入されるか、リンカーを通してオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合するか、リンカーを通してナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである、第４の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。
本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、球状核酸（ＳＮＡ）は、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、第１の抗原が、ナノ粒子コアに封入され、かつ第２の抗原が、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している、第１の抗原及び第２の抗原と、を含む。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、本明細書に記載される方法は、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、第１の抗原が、ナノ粒子コアに封入され、かつ第２の抗原が、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している、第１の抗原及び第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を対象に投与することを含む。
本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、球状核酸（ＳＮＡ）は、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、第２の抗原が、ナノ粒子コアに封入され、かつ第１の抗原が、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している、第１の抗原及び第２の抗原と、を含む。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、本明細書に記載される方法は、球状核酸（ＳＮＡ）を対象に投与することを含み、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、（ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原であって、第２の抗原が、ナノ粒子コアに封入され、かつ第１の抗原が、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、リンカーを通して結合している、第１の抗原及び第２の抗原と、を含む。
オリゴヌクレオチド
本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、ナノ粒子コアと、ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのシェルと、主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの約又は少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、非標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。本開示による使用が企図されるオリゴヌクレオチドには、任意の手段（例えば、共有結合又は非共有結合）を通してナノ粒子コアに結合したものが含まれる。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本明細書に記載されるように、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む、オリゴヌクレオチドの修飾形態もまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全て又は部分的にペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間結合は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。更に他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、１つ以上のユニバーサル塩基を含むものが挙げられる。「ユニバーサル塩基」とは、著しい構造不安定化を伴わずに水素結合を形成することによって、核酸中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵのうちのいずれか１つへの結合を置き換えることができる分子を指す。ユニバーサル塩基類似体と組み込まれたオリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例としては、５’－ニトロインドール－２’－デオキシリボシド、３－ニトロピロール、イノシン、及びヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。本明細書で使用される「核酸塩基」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵを含む。天然に存在しない核酸塩基としては、例えば、限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ’、Ｎ’－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン（ｍＣ）、５－（Ｃ３～Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにＢｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号及びにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ ４４２９－４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が挙げられる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体及び互変異性体も含まれる。更に、天然に存在する及び天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３の１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３－７２２（特に、６２２及び６２３頁を参照されたい）、並びにｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５－６０７において参照されたく、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「ユニバーサル塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」も含む。ユニバーサル塩基には、３－ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５－ニトロインドール）、及び任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバーサル塩基には、当技術分野において既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、又はトリアゾール誘導体が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの例には、修飾された骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するもの及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、又は２’から２’結合である逆向きの極性を有するものが挙げられる。最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’から３’結合を含む逆極性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、脱塩基性であり得る（ヌクレオチドが欠落しているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆ヌクレオシド残基も企図される。塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとが混合されたヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖のヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルフォキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びメチレンチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分が混在するその他の骨格がある。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、１つ以上の糖及び／又はヌクレオチド単位の１つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物がある。オリゴヌクレオチドの塩基は、ハイブリダイゼーションのために維持される。いくつかの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号、並びにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第５，４８９，６７７号及び同第５，６０２，２４０号に記載の－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む。米国特許第５，０３４，５０６号に記載のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の２つの連続するモノマー間の結合は、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲＨ－、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、－Ｓｉ（Ｒ”）２－、－ＳＯ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）２－、－ＰＯ（ＢＨ３）－、－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－、－Ｐ（Ｓ）２－、－ＰＯ（Ｒ”）－、－ＰＯ（ＯＣＨ３）－、及び－ＰＯ（ＮＨＲＨ）から選択される２～４個の、望ましくは３個の基／原子からなり、式中、ＲＨは、水素及びＣ１－４－アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１－６－アルキル及びフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用されるときＲ５を含む）、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－ＣＨ２－－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＳ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－Ｃ（＝ＮＲＨ）－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、－ＣＨ２－Ｏ－ＮＲＨ－、－ＣＯ－ＮＲＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－ＣＯ－、－Ｏ－ＮＲＨ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＮＲＨ、－Ｏ－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－Ｏ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＳＯ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＳＯ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＳＯ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－；－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲＮ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＮＲＨＨ－、－ＮＲＨ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）－Ｏ－，－ＣＨ２－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＣＨ２－、及び－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ”）２－Ｏ－であり、これらの中でとりわけ、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－Ｏ－Ｐ（－Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－ＮＲＨＰ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＣＨ３）－Ｏ－、及び－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲＮ）－Ｏ－（式中、ＲＨは、水素及びＣ１－４－アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１－６－アルキル及びフェニルから選択される）が企図される。更なる例示は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５，５，３４３－３５５及びＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖｏｌ ２５，ｐｐ ４４２９－４４４３に提供されている。
オリゴヌクレオチドのなお他の修飾形態は、米国特許出願第２００４／０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖部分を含有してもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２’位に含み：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれ、式中、ｎ及びｍは、１～約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又はＲＮＡ切断基。一態様では、修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られる、２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾としては、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において、２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
更に他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。２’修飾は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位にあってもよい。一態様では、２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド中、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、糖の修飾には、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様では、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ２－）ｎであり、式中、ｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基としては、三環系のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）のようなＧ－クランプ（Ｇ－ｃｌａｍｐ）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）が挙げられる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが挙げられる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンを含み、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており、特定の態様では、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号及び同第５，６８１，９４１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４－７５（２００５）、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４－１３６８５（２００２）を参照されたい。
様々な態様では、本開示のオリゴヌクレオチド又はその修飾形態は、一般に、約５ヌクレオチド長～約１０００ヌクレオチド長である。より具体的には、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約１０００ヌクレオチド長、約５～約９００ヌクレオチド長、約５～約８００ヌクレオチド長、約５～約７００ヌクレオチド長、約５～約６００ヌクレオチド長、約５～約５００ヌクレオチド長、約５～約４５０ヌクレオチド長、約５～約４００ヌクレオチド長、約５～約３５０ヌクレオチド長、約５～約３００ヌクレオチド長、約５～約２５０ヌクレオチド長、約５～約２００ヌクレオチド長、約５～約１５０ヌクレオチド長、約５～約１００、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長、約５～約４５ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３５ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２５ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１５ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド長、約１０～約１０００ヌクレオチド長、約１０～約９００ヌクレオチド長、約１０～約８００ヌクレオチド長、約１０～約７００ヌクレオチド長、約１０～約６００ヌクレオチド長、約１０～約５００ヌクレオチド長、約１０～約４５０ヌクレオチド長、約１０～約４００ヌクレオチド長、約１０～約３５０ヌクレオチド長、約１０～約３００ヌクレオチド長、約１０～約２５０ヌクレオチド長、約１０～約２００ヌクレオチド長、約１０～約１５０ヌクレオチド長、約１０～約１００ヌクレオチド長、約１０～約９０ヌクレオチド長、約１０～約８０ヌクレオチド長、約１０～約７０ヌクレオチド長、約１０～約６０ヌクレオチド長、約１０～約５０ヌクレオチド長、約１０～約４５ヌクレオチド長、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３５ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約２５ヌクレオチド長、約１０～約２０ヌクレオチド長、約１０～約１５ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１５～約２６ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約１００ヌクレオチド長、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。したがって、様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、若しくはそれ以上、又は少なくともそれらのヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上未満のヌクレオチド長である。様々な実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、全てが同じ長さ／配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも１個の他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び／又は配列を有する１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、かつ限定するものではないが、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、１つの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも１個の他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、（ＧＧＸ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、配列中、ｎは２～２０であり、Ｘは核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、又はＵ）である。いくつかの実施形態では、（ＧＧＸ）ｎヌクレオチド配列は、１個以上のオリゴヌクレオチドの５’終端にある。いくつかの実施形態では、（ＧＧＸ）ｎヌクレオチド配列は、１個以上のオリゴヌクレオチドの３’終端にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、配列中、ｎは２～２０である。いくつかの実施形態では、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列は、１個以上のオリゴヌクレオチドの５’終端にある。いくつかの実施形態では、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列は、１個以上のオリゴヌクレオチドの３’終端にある。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドは、アプタマーなどの標的化オリゴヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの全ての特徴及び態様（例えば、長さ、タイプ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態）、スペーサーの任意の存在）は、アプタマーにも適用される。アプタマーは、目的の様々な標的分析物に結合するように進化させることができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖であってもよい。
スペーサー。いくつかの態様及び実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに結合するオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、スペーサーを含む。本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、ナノ粒子コアとオリゴヌクレオチドとの間の距離を増加させる、又は複数のコピーでナノ粒子コアに結合したときに個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる、又はＳＮＡの合成を向上させる役割を果たす部分を意味する。したがって、スペーサーは、オリゴヌクレオチドとナノ粒子コアとの間に位置することが企図される。
いくつかの態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。いくつかの態様では、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないポリマーである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、スペーサーは、オリゴ（エチレングリコール）ベースのスペーサーである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のスペーサー（例えば、スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））部分を含む。更なる実施形態では、スペーサーはアルカン系スペーサー（例えば、Ｃ１２）である。いくつかの実施形態では、スペーサーはオリゴヌクレオチドスペーサー（例えば、Ｔ５）である。オリゴヌクレオチドスペーサーは、ナノ粒子コア又は標的に結合するようになるオリゴヌクレオチドの能力を妨害しない任意の配列を有し得る。特定の態様では、オリゴヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てのアデニル酸、全てのチミジル酸、全てのシチジル酸、全てのグアニル酸、全てのウリジル酸、又は全ての他のいくつかの修飾塩基である。
様々な実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約３ヌクレオチド、少なくとも約４ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、５～１０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、又は更には３０ヌクレオチド超であるか、又はそれらに等しい。
ＳＮＡ表面密度。一般に、少なくとも約０．５ｐモル／ｃｍ２であるオリゴヌクレオチド表面密度が、安定なＳＮＡを提供するのに適当である。更なる実施形態では、少なくとも約１ｐｍｏｌ／ｃｍ２、１．５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、又は２ｐｍｏｌｅｓ／ｃｍ２であるオリゴヌクレオチド表面密度が、安定なＳＮＡ（例えば、ＬＳＮＡ又はＬＮＰ－ＳＮＡ）を提供するのに適当である。いくつかの態様では、本開示のＳＮＡの表面密度は、少なくとも１５ ｐｍｏｌｅｓ／ｃｍ２である。また、オリゴヌクレオチドが、約０．５ｐｍｏｌ／ｃｍ２～約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、又は約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２～約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、又は約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２～約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度でＳＮＡのナノ粒子コアに結合される方法も提供される。いくつかの態様では、表面密度は、約１．７ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。いくつかの態様では、表面密度は、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。更なる実施形態では、表面密度は、少なくとも約０．５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約０．６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約０．７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約０．８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約０．９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１ｐｍｏｌ／ｍｃ２、少なくとも約１．５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、又はそれ以上である。更なる実施形態では、表面密度は、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１９ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約ｔ８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、又は約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満である。
あるいは、ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドの密度を、ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドの数によって測定する。本開示のＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載されるＳＮＡが、その表面上に約１～約２，５００個又は約１～約５００個のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなることが企図される。様々な実施形態では、ＳＮＡは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約１０～約５００個、又は約１０～約３００個、又は約１０～約２００個、又は約１０～約１９０個、又は約１０～約１８０個、又は約１０～約１７０個、又は約１０～約１６０個、又は約１０～約１５０個、又は約１０～約１４０個、又は約１０～約１３０個、又は約１０～約１２０個、又は約１０～約１１０個、又は約１０～約１００個、又は約１０～約９０個、又は約１０～約８０個、又は約１０～約７０個、又は１０～約６０個、又は約１０～約５０個、又は約１０～約４０個、又は約１０～約３０個、又は約１０～約２０個、又は約７５～約２００個、又は約７５～約１５０個、又は約１００～約２００個、又は約１５０～約２００個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約８０～約１４０個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェル内の５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００個のオリゴヌクレオチドからなる。なお更なる実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００個、又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、又は２００個のオリゴヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約１０～約８０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約７５個のオリゴヌクレオチドを含むか、それからなる。
リンカー。本開示は、抗原が、リンカーを介してＳＮＡの表面に会合し、かつ／又は結合している組成物及び方法を提供する。様々な実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、無痕跡型リンカー、及びそれらの組み合わせであり得る。
リンカーは、抗原を開示されたＳＮＡ内のオリゴヌクレオチドに結合するか、又は抗原をＳＮＡの表面に結合する（すなわち、抗原－リンカー－オリゴヌクレオチド又は抗原－リンカー）。オリゴヌクレオチドは、ＳＮＡに結合した別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるか、又はＳＮＡに直接結合することができる（例えば、脂質アンカー基を介して）。いくつかの具体的に企図されるリンカーとしては、カルバメートアルキレン、カルバメートアルキレンアリールジスルフィドリンカー、アミドアルキレンジスルフィドリンカー、アミドアルキレンアリールジスルフィドリンカー、チオールリンカー、及びアミドアルキレンスクシンイミジルリンカーが挙げられる。場合によっては、リンカーは、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｃ２－５アルキレン－Ｓ－Ｓ－Ｃ２－７アルキレン－又は－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ２－５アルキレン－Ｓ－Ｓ－Ｃ２－７アルキレン－を含む。－Ｓ－Ｓ－部分に対する炭素アルファは、分岐状、例えば、－ＣＨＸ－Ｓ－Ｓ－若しくは－Ｓ－Ｓ－ＣＨＹ－、又はそれらの組み合わせであり得、式中、Ｘ及びＹは、独立して、Ｍｅ、Ｅｔ、又はｉＰｒである。抗原に対する炭素アルファは、分岐状、例えば、－ＣＨＸ－Ｃ２－４アルキレン－Ｓ－Ｓ－であり得、式中、Ｘは、Ｍｅ、Ｅｔ、又はｉＰｒである。場合によっては、リンカーは、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２－Ａｒ－Ｓ－Ｓ－Ｃ２－７アルキレン－であり、Ａｒは、メタ又はパラ置換フェニルである。場合によっては、リンカーは、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ２－４アルキレン－Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－Ｃ２－６アルキレン－である。
追加のリンカーとしては、ＳＨリンカー、ＳＭリンカー、ＳＥリンカー、及びＳＩリンカーが挙げられる。本開示は、抗原放出を調節するために利用可能な複数の結合点（例えば、ジスルフィド切断、リンカー環化、及び脱ハイブリダイゼーション）を企図し、各結合点における抗原放出の動態を制御することができる。例えば、ジスルフィドについての立体バルクは、ＳＮ２反応の速度を低下させることができ、アルキルスペーサー又はアルキルスペーサーに結合した立体バルクの長さの増加は、閉環の速度に影響を与えることができ、ミスマッチヌクレオチド配列は、溶融温度（Ｔｍ）を低下させ、一方、ロックド核酸は、Ｔｍを増加させる。
免疫調節におけるＳＮＡの使用
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染性疾患と戦うために２つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性ＩｇＭ抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）への曝露によって活性化される。ＰＡＭＰの認識は、受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するＴＬＲ８及びＴＬＲ９などのＴＬＲ受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に位置する。ＴＬＲ８及びＴＬＲ９受容体の調節機構は、例えば、限定するものではないが、ＤＮＡ－タンパク質相互作用に基づいている。
本明細書に記載されるように、細菌ＤＮＡに見られるものと同様のＣｐＧモチーフを含有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ受容体の同様の応答を刺激する。したがって、本開示のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアゴニストとして機能する能力を有する。本開示によって企図される他のＴＬＲアゴニストには、一本鎖ＲＮＡ及び小分子（例えば、Ｒ８４８（レシキモド））が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、免疫調節（例えば、免疫刺激性）オリゴヌクレオチドは、疾患（例えば、がん）の治療を含む、様々な有望な治療用途を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体を調節するために本明細書に記載されるＳＮＡを利用する方法が開示される。本方法は、ＴＬＲアゴニストの使用を通してＴｏｌｌ様受容体活性を上方調節する。方法は、ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を本開示のＳＮＡと接触させ、それによってｔｏｌｌ様受容体の活性及び／又は発現を調節することを含む。調節されるｔｏｌｌ様受容体には、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、及び／又はｔｏｌｌ様受容体１３のうちの１つ以上が含まれる。
免疫応答を誘導する方法
本開示はまた、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法であって、対象に、有効量の本開示のＳＮＡ（例えば、抗原性組成物として製剤化された）を投与することを含む、方法を含む。様々な実施形態では、本開示のＳＮＡ（例えば、組成物、薬学的製剤、又は抗原性組成物として製剤化された）を対象に投与することは、ＳＮＡを投与されなかった対象において産生される抗原（複数可）に対する中和抗体の量と比べて、対象において産生される抗原（複数可）に対する中和抗体の量の増加をもたらす。更なる実施形態では、増加は、２倍の増加、５倍の増加、１０倍の増加、５０倍の増加、１００倍の増加、２００倍の増加、５００倍の増加、７００倍の増加、又は１０００倍の増加である。
更なる実施形態では、本開示のＳＮＡは、ヒト末梢血単核細胞を活性化し、本明細書に記載される１つ以上の抗原に対する抗体応答を生成する。いくつかの実施形態では、抗体応答は、全抗原特異的抗体応答である。更なる実施形態では、本開示のＳＮＡ（例えば、組成物、薬学的製剤、又は抗原性組成物として製剤化された）を対象に投与することは、ＳＮＡを投与されなかった対象において産生される抗原（複数可）に対する全抗原特異的抗体の量と比べて、対象において産生される抗原（複数可）に対する全抗原特異的抗体の量の増加をもたらす。更なる実施形態では、増加は、２倍の増加、５倍の増加、１０倍の増加、５０倍の増加、１００倍の増加、２００倍の増加、５００倍の増加、７００倍の増加、又は１０００倍の増加である。「全抗原特異的抗体応答」は、特定の抗原に結合する抗体（中和抗体及び非中和抗体を含む）の全ての尺度である。
本開示の方法によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、中和抗体応答、Ｔ及びＢ細胞の成熟及びメモリー、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、並びにＣＤ４＋、ＣＤ８＋などのＴ細胞媒介性応答を含む。本明細書に開示されるＳＮＡによって生成される免疫応答は、免疫応答を生成し、好ましくは、本明細書に記載される疾患（例えば、がん）を治療する。抗原性組成物の投与（免疫化又はワクチン接種）後の抗体応答を評価するための方法は、当技術分野で知られており、かつ／又は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性応答（例えば、増殖応答又はサイトカイン応答などのペプチド特異的応答）を含む。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、免疫応答は、Ｂ細胞応答及びＴ細胞応答の両方を含む。抗原性組成物は、筋肉内注射、皮下注射、皮内投与及び粘膜投与、例えば、経口又は鼻腔内などのいくつかの好適な方法で投与され得る。追加の投与モードには、静脈内、腹腔内、鼻腔内投与、膣内、直腸内、及び経口投与が含まれるが、これらに限定されない。免疫化される対象における異なる投与経路の組み合わせ、例えば、同時の筋肉内及び鼻腔内投与もまた、本開示によって企図される。
投与は、単回用量又は複数回用量スケジュールを含み得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュール及び／又はブースター免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、様々な用量が、同じか又は異なる経路、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブースと、又は皮下プライム及び皮下ブーストによって与えられ得る。１つを超える用量（典型的には２つの用量）の投与は、免疫学的に無感作の対象又は低応答性集団の対象（例えば、糖尿病患者、又は慢性腎臓疾患を有する対象（例えば、透析患者））において特に有用である。様々な実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約２週間後又は少なくとも約２週間後に投与される。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間離して（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、又は約１６週間）投与される。いくつかの実施形態では、複数回用量は、１、２、３、４、又は５ヶ月離して投与される。本開示の抗原性組成物は、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療従事者への同じ医療相談又は訪問の間に）患者に投与され得る。
障害を治療するためのＬＮＰ－ＳＮＡの使用
いくつかの態様では、本開示のＳＮＡは、障害を治療するために使用される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のＳＮＡを、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、対象に、有効量の本開示のＳＮＡを投与し、それによって、対象におけるがんを治療することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、膠芽細胞腫、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、黒色腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、オステオカルシノマ（ｏｓｔｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、及びヒトパピローマウイルス誘発がん、又はそれらの組み合わせである。
追加の薬剤
本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、追加の薬剤は、本開示のＳＮＡとは別個に投与される。したがって様々な実施形態では、治療剤は、障害（例えば、がん）を治療するために、本開示のＳＮＡの前、後、又は同時に投与される。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるＳＮＡは、任意選択で、追加の薬剤又はその複数を更に含む。追加の薬剤は、様々な実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ／又は追加の薬剤はＳＮＡのナノ粒子コアに会合しており、かつ／又は追加の薬剤はＳＮＡのナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、追加の薬剤はオリゴヌクレオチドの５’終端に会合している）。あるいは、いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、追加の薬剤はオリゴヌクレオチドの３’終端に会合している）。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、１つ以上の追加の薬剤が、ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的及び非共有結合的の両方で会合しているＳＮＡを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び／又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。
本開示によって企図される追加の薬剤としては、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体又は抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体である。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物若しくは薬物、又は天然若しくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。「低分子量」とは、１５００ダルトン未満、典型的には１００～７００ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。
遺伝子調節におけるＳＮＡの使用
本開示のいくつかの態様では、本開示のＳＮＡ（例えば、ＬＮＰ－ＳＮＡ、ＬＳＮＡ）に会合するオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、ワクチン機能及び遺伝子阻害機能の両方を果たす。そのような態様では、ナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェルは、標的遺伝子発現を阻害するように設計された１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチド及び１個以上の阻害性オリゴヌクレオチドを含む。
遺伝子産物の発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、ＳＮＡの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％阻害されるものが含まれる。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
阻害の程度は、体液試料若しくは生検試料から、又は当技術分野において周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、特定の種類のＳＮＡ及び特定のオリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて決定される。
様々な態様では、方法は、標的オリゴヌクレオチドに１００％相補的である、すなわち完全に一致するが、他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも（以上を意味する）約９５％相補的、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子産物の所望の程度の阻害を達成することができる程度にオリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である、阻害性オリゴヌクレオチドの使用を含む。
相補性パーセントは、オリゴヌクレオチドの長さにわたって決定される。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドの２０ヌクレオチドのうちの１８ヌクレオチドが全長１００ヌクレオチドの標的ポリオリゴヌクレオチドの２０ヌクレオチド領域に相補的であるアンチセンス化合物を考えると、オリゴヌクレオチドは９０パーセント相補的であろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか又は相補的ヌクレオチドが散在していてもよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接する必要はない。阻害性オリゴヌクレオチドの標的核酸の領域との相補性パーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を使用して日常的に決定することができる。
そのような方法で利用されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかである。ＲＮＡは、調節機能を果たす阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）などの阻害性オリゴヌクレオチドであってもよく、様々な実施形態では、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及びリボザイムからなる群から選択される。あるいは、ＲＮＡは、調節機能を果たすマイクロＲＮＡである。ＤＮＡは、いくつかの実施形態では、アンチセンス－ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。
以下の実施例は、単に本開示を例示するために与えられたものであり、その範囲を限定するために与えられたものではない。
実施例１
本開示のＳＮＡを合成する方法。いくつかの実施形態では、多抗原標的化ＳＮＡワクチンを、リポソームコアを使用して合成する。ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）を含有する脂質フィルムを、溶解したペプチド抗原を含有するＰＢＳで水和させる。次いで、これらを押し出し、一晩透析して、過剰な封入されていないペプチドを除去し、ＤＬＳ、ピアスアッセイ（ペプチド定量化用）、及びＰＣアッセイ（脂質定量化用）を使用して特徴付ける。これとは別に、ペプチドコンジュゲートされた相補的ＤＮＡ（アジュバントに対する）を合成する。このプロセスは、多くの化学反応を取ることができるが、ペプチド（方法１－システイン、又は方法２－リンカー結合）と相補的ＤＮＡ（チオール末端処理を通した）との間のジスルフィド相互作用を伴う。システインの場合（方法１）、最初に、ペプチドを室温で少なくとも１時間、アルドリチオールで活性化する。次いで、この産物を、５：１のモル比でチオール末端相補的ＤＮＡと一晩混合する。方法２では、樹脂上のペプチドのＮ末端を、ＮＨＳエステル末端リンカーと室温で一晩反応させる。この産物を、樹脂から切断し、脱保護し、１０：１のモル比でチオール末端相補的ＤＮＡとのコンジュゲーションの前に精製する。いずれの方法においても、最終産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動を通して精製し、ＥＳＩを使用して分析する。精製した産物を、コレステロール末端ＤＮＡアジュバントと１：１で混合し、凍結乾燥させる。これを二本鎖緩衝液中に再懸濁し、二本鎖にゆっくりと冷却する（７０℃で１０分、２５℃で１．５時間、４℃で一晩）。次いで、二本鎖をリポソームに封入されたペプチドと等モル比で混合し、リポソームを再充填して（リポソーム当たり最大７５本の鎖）、ＳＮＡを形成する。
実施例２
がんワクチンは、侵襲性腫瘍に対して効果的であるために複数の免疫細胞型を活性化しなければならないが、これらの多標的化ワクチンについての設計上の考慮事項は十分に検証されていない。本明細書では、複数の抗原性ペプチドの構造的提示の、トランスクリプトームレベル、細胞レベル、及び生物レベルでの免疫応答に対する影響を実証する。球状核酸（ＳＮＡ）ナノ構築物を使用して、２つのＴ細胞型を活性化するための２つの抗原クラスの空間分布及びナノスケール配置に由来する、抗原プロセッシング、サイトカイン産生、及びメモリーにおける差を調査した。２つの単一抗原ＳＮＡと比較して、単一の二重抗原ＳＮＡ（ＤＡ－ＳＮＡ）は、それぞれ、抗原特異的Ｔ細胞の活性化及び増殖において３０％及び２倍の増加を誘発した。ＤＡ－ＳＮＡ内での抗原位置付けにより、免疫学的遺伝子発現及び腫瘍成長が変化した。封入ヘルパーＴ細胞抗原及び外部的コンジュゲート細胞傷害性Ｔ細胞抗原（ＤＡ－ＳＮＡ２と称される）は、抗腫瘍遺伝子経路を上昇させ、リンパ腫マウスの腫瘍を停滞させた。臨床的に関連する黒色腫における抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と組み合わせたとき、ＤＡ－ＳＮＡ２は、腫瘍を抑制し、循環Ｔ細胞メモリーを増加させた。本実施例は、改善された有効性を有する多抗原ワクチンを合成するために、モジュラーナノスケールアーキテクチャによって得られる構造制御を実装することの重要性を実証する。
ワクチン接種は、標的化可能な腫瘍関連抗原及びネオ抗原を発現するがんに対する魅力的な戦略である。黒色腫については、同定された腫瘍関連タンパク質（例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１）を標的とするワクチンを開発への取り組みが増加している。１－４しかしながら、これらのワクチンは、いくつかの利点（すなわち、活性化された黒色腫特異的Ｔ細胞の増加）を誘発するが、多くは１つの免疫細胞型のみを活性化するように設計されている。腫瘍は、免疫監視機構の容易な脱出を可能にする著しい不均一性及び高い遺伝子変異量５、６を有することができる。７したがって、主に１つの免疫細胞型を活性化するワクチンは不十分であり、完全な腫瘍寛解を誘導するために複数の細胞型を標的化する抗原を含有するワクチンが必要である。
多面的な免疫応答を誘発するための一般的な手法は、１）配列が、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の両方を活性化するための複数のエピトープをカバーする「長鎖ペプチド」、又は２）Ｔ細胞サブクラスに各々独自の複数の「最小」ペプチド抗原の投与である。８－１１しかしながら、これらの進行中の取り組みの多くは、アジュバントの有無にかかわらず、混合物として生理食塩水中で送達されるペプチドのプールを伴う。
本実施例では、複数の細胞標的化抗原を伴うワクチン設計空間を検証した。抗原位置付けにおける構造変化を採用することによって、結果として生じる免疫応答の影響を解明し、翻訳的な取り組みの成功を後押しするのに役立てた。使用される抗原は、腫瘍を効果的に死滅させるために細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞、及び長期的な腫瘍拒絶のための相互作用を相乗作用させるためのヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞を活性化する。１７、１８ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞を腫瘍部位に動員し、それらの増殖及びエフェクター機能を増強することにより、腫瘍指向性ＣＤ８＋機能性を維持する。１９－２３細胞傷害性Ｔ細胞抗原及びヘルパーＴ細胞抗原の両方を有するがんワクチン経路は、ＭＨＣ－Ｉ受容体上の細胞傷害性抗原の提示及びＭＨＣ－ＩＩ受容体上のヘルパー抗原の提示を通して、異なるクラスのＴ細胞を活性化することができる。（図４０～４３を参照されたい）。また、Ｈｏｏｓ，Ａ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６，１５（４），２３５－２４７を参照されたい。したがって、本明細書に記載のワクチンは、免疫系を最も効果的にプライムするために、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）－Ｉ制限抗原標的及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）－ＩＩ制限抗原標的（それぞれ、ＣＤ８＋活性化及びＣＤ４＋活性化）の両方の正確な構造的位置付けを考慮する。
本明細書では、球状核酸（ＳＮＡ）プラットフォームを利用して、多抗原免疫学的プロセスに対するナノスケール構造の効果を解明した。ＳＮＡは、オリゴヌクレオチドの高密度、放射状に配置された表面を有するナノ粒子コア（例えば、リポソーム）から構成される。ＳＮＡは、それらの生体適合性、２４大量に細胞に迅速に侵入する能力、２５、２６シェルとしてｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストＤＮＡを採用する場合の強力な免疫活性化、２７及び周知の化学を使用して構成要素の定義されたナノスケール位置付けを可能にするモジュール性のため、これらの複雑な関係を検証するための有力なツールである。２８－３０本実施例では、複数の免疫細胞標的抗原を運ぶＳＮＡワクチンの構造が、免疫活性化にどのように大きく影響するかが実証されている。ＳＮＡ内の抗原型の位置を変化させると、トランスクリプトームレベルで免疫細胞経路が上方制御され、細胞レベルでのサイトカイン及びメモリーマーカーの産生及び分泌が増強され、生物レベルでの腫瘍成長が遅くなる。総合すると、これらの変化は、侵襲性Ｂ１６－Ｆ１０黒色腫腫瘍モデルに対するワクチンの効力を定義し、重要なことに、他の療法に結び付く多抗原位置付けに関する設計上の洞察を解明した。
結果及び議論
本実施例に記載の実験では、多抗原ＳＮＡワクチンのための最適な抗原プロセッシング条件を決定して、堅牢な細胞傷害性及びヘルパーＴ細胞応答を生成しようとした。具体的には、樹状細胞（ＤＣ）への２つの抗原クラス（ＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ制限）の送達が、インビトロでのプロセッシングをどのように変化させるかを調査した。ＤＣは、効果的なＴ細胞プライミングのためのシグナル伝達を誘導する重要なプロフェッショナル抗原提示細胞である。以前の文献では、細胞傷害性抗原及びヘルパー抗原の両方の同時送達を通してＤＣ活性化を増強する可能性を実証しているが３１、３２、そのような抗原を提示する最良の方法を理解することができるプラットフォームを有していない。１４異なるナノ粒子上での両方の抗原クラスの送達とは対照的に、同じナノ粒子上での両方の抗原クラスの同時送達は、両方のＴ細胞型の活性化を増強し、抗原の構造的位置がワクチン性能に顕著な影響を及ぼすという仮説が立てられた。
ＳＮＡ上の抗原分布に基づくインビトロでの複数の抗原のプロセッシング。この理論を試験するために、異なるナノスケールの位置にＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩの両方の制限抗原を含有する二重抗原ＳＮＡワクチン（ＤＡ－ＳＮＡ）（各抗原の配置に基づいてＤＡ－ＳＮＡ１及びＤＡ－ＳＮＡ２と称される（例えば、図１、４、及び２６Ａを参照されたい）を、設計及び合成した。ＳＮＡモジュール性のために、ＳＮＡ構築物内には、抗原を配置することができる多数の異なる位置がある。この研究のために、抗原位置付けのための封入及びハイブリダイゼーション配置を選択し、互いに比較した。異なるナノ粒子上の抗原及び送達の分布が免疫活性化にどのように影響するかを評価するために、各々がＤＡ－ＳＮＡワクチンと同じポジションに１つの抗原クラスのみを提示する２つの個々のＳＮＡを含有する製剤を合成した（図２７）。製剤は、単一の抗原を送達する個々のＳＮＡについては「別個」と称され、二重抗原含有ＤＡ－ＳＮＡについては「組み合わせ」と称された。
ＤＡ－ＳＮＡを合成するために、１つの抗原クラスからのペプチドを、それらの形成中に５０ｎｍの１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）リポソームに封入した（図２８及び２９）。並行して、他の抗原クラスのペプチドを、ジスルフィド結合形成を使用して、ＳＮＡのＣｐＧモチーフアジュバントＤＮＡシェル（「ＣｐＧ補体」）に相補的な鎖にコンジュゲートした（図３０）。本実施例で使用されるＤＮＡ及びペプチド配列は、表１及び表２に見出すことができる）。相補的な３’－コレステロール末端のＣｐＧ鎖に付加された抗原でＣｐＧ補体をゆっくり冷却することによって、ハイブリダイズした二本鎖を形成した。コレステロールは、二重鎖をリポソームの表面に固定する。このハイブリダイズした産物をリポソームに添加して、等モル量の各抗原を得た。リポソーム表面に、抗原を含有していない非標的化ＤＮＡを再充填して、１．６ｐｍｏｌ／ｃｍ２の密度に相当する、リポソーム当たり７５本の全ＤＮＡ鎖を得、生物学においてそれらを有用にするＳＮＡに関連付けられた特性を観察する（図２、図３、及び図１０を参照されたい）。１６単一の封入抗原又は単一のハイブリダイズ抗原のいずれかを含有するＳＮＡ（「別個」製剤）を、以前のプロトコルに従って合成した。１６ＳＮＡの形成を、動的光散乱を使用して確認した（図３１）。
これらの異なる構造が合成されると、ＤＣにおけるそれらの活性化を、それぞれＯＶＡ１及びＯＶＡ２として知られているオボアルブミン（ＯＶＡ）のＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ制限モデル抗原を使用して評価した。ＤＣキューの活性化及びＴ細胞をプライムする能力を、組み合わせＤＡ－ＳＮＡワクチンに対して、２つの別個ＳＮＡ構造として送達されるマウス骨髄誘導ＤＣ及び抗原を使用して特徴付けた。具体的には、先天性共刺激マーカーＣＤ８６及びＣＤ８０を発現するＣＤ１１ｃ＋ＤＣの割合は、構造配置に依存して著しく変化しなかった（図２６Ｂ）。これは、アジュバントの送達が組み合わせ及び別個の製剤において等価であるという事実による可能性が高く、ＣｐＧへのハイブリダイゼーションがＴＬＲ９活性化を妨害しないことを示す。更に、腫瘍抗原を認識する免疫系の能力の指標である抗原特異的Ｔ細胞を惹起するためのナイーブ脾臓Ｔ細胞への抗原の提示３３は、抗原が配置された方法によって影響を受けなかった。ナイーブＴ細胞は、ＯＶＡ１特異的Ｔ細胞及びＯＶＡ２特異的Ｔ細胞にクローン的に拡張することができた（図２６Ｃ）。図３２のゲーティング戦略。実際、生存ＣＤ１９集団の約０．６～０．７％は、ＯＶＡ１－Ｈ－２ｋｂ二量体及びＣＤ８＋マーカーに対して二重陽性であった。ＯＶＡ２特異的Ｔ細胞分化に対する同様の傾向が観察され、約０．９～１．１％が、ＯＶＡ２－Ｈ－２－Ｉａｄ四量体及びＣＤ４＋抗体について二重陽性マーカーを含んでいた。別個の製剤ではなく、ＤＡ－ＳＮＡ構造のみが、Ｔ細胞対照ベースラインの量を上回る抗原特異的Ｔ細胞の量を有意に上昇させることができた。これは、両方の抗原のＤＣへの組み合わされた送達が、より強いＴ細胞分化につながることを示唆した。これは、いずれかの抗原特異的Ｔ細胞集団内の早期活性化マーカーＣＤ６９の発現を評価したときに、より明らかであった。抗原を１つのＤＡ－ＳＮＡとして組み合わせて送達したとき、ＣＤ６９シグナルの量の増加（蛍光強度中央値であるＭＦＩによって測定）が存在し、ＤＡ－ＳＮＡ２構造は、全ての試験群よりも優れた性能を持っていた（図２６Ｄ）。更に、抗原位置付けにかかわらず、ＤＡ－ＳＮＡ構造における抗原の送達を、ＯＶＡ１抗原に特異的なＯＴ１脾臓細胞を使用して、抗腫瘍応答の重要なステップであるＴ細胞増殖の２倍の増加に結び付いた（図２６Ｅ、図１３）。これらの知見に基づいて、別個のＳＮＡ製剤の代わりに、ＤＡ－ＳＮＡを後続の全ての実験に使用した。
ＤＡ－ＳＮＡを介したインビボ活性化。ＤＡ－ＳＮＡを使用するこれらの有望なインビトロでの知見に基づいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをインビボで免疫化して、ＤＡ－ＳＮＡワクチン内のＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ制限抗原の位置付けの差異が免疫活性にどのように影響を与えるかを表現した。マウスに、全３回の注射（ＤＮＡ及び各ペプチドによる６ｎｍｏｌ、図３３Ａ）を与えた。３５日目に、脾臓細胞を採取して、両方のペプチド抗原に向かって惹起された特異的免疫応答を評価した。５週間の期間後、ペプチド抗原及びアジュバントＤＮＡの両方を含有する単純混合物を使用した場合と比較して、ＣＤ８＋レベルは、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化について有意に上昇した（「混和物」と称される、図３３Ｂ）。ＣＤ４＋レベルは、治療群間で有意に変化しなかったが、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化の結果として、ヘルパーＴ細胞の約８％の減少が観察された（図３３Ｂ）。ＤＡ－ＳＮＡ２は、エクスビボで、ＯＶＡ１ペプチドで再刺激すると、主要な炎症誘発性サイトカインであるＩＦＮ－γ、及び脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａの産生を有意に上昇させることができる唯一のワクチンであった。ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化はまた、より大きな割合の多機能性脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した（約１７％、図３３Ｃ、図５、図２０）。更に、これは、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－、約４８％）の割合の増加と相関した（図３３Ｄ、図６、図１７）。ＯＶＡ２ペプチドによるＣＤ４＋Ｔ細胞のエクスビボ刺激は、混和物治療と比較して、両方のＤＡ－ＳＮＡについてこれらの同じパラメータの全体的な増加を示し、免疫細胞への抗原及びアジュバントの両方の組み合わせ送達の重要性を更に実証した。２つのＤＡ－ＳＮＡ構築物間に有意な差は観察されなかった（図３３Ｃ～Ｄ、図５、図６）。酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを通してＩＦＮ－γ分泌を評価した場合、混和物と比較して両方のＤＡ－ＳＮＡ構造についてスポット形成細胞（ＳＦＣ）の上昇が観察され、ＤＡ－ＳＮＡ２について最大の増強が見られた（図３３Ｅ、図１８、及び図１９）。更に、ＯＶＡ１又はＯＶＡ２のいずれかでエクスビボで刺激した場合、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化によって惹起された脾臓細胞は、ＤＡ－ＳＮＡ１免疫化よりも少なくとも２倍多いＳＦＣにつながり、ＭＨＣ－Ｉ又は－ＩＩ制限抗原キューにエクスビボで応答するためにＤＡ－ＳＮＡ上の抗原のこの配列を利用する効力を実証した。全体として、これらの結果は、ハイブリダイズしたアーキテクチャにおけるＭＨＣ－Ｉ制限抗原の位置付けが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強力に活性化するためのＤＣプロセッシングの提示を最適化し、一方、ＭＨＣ－ＩＩ制限抗原をコア内に封入することにより、細胞傷害性機能を保ちながら、ＣＤ４＋活性の適度な増強を誘導することを強調した。
ＲＮＡ配列決定を介したＤＡ－ＳＮＡ誘導免疫活性化及び増殖の機構的理解。異なるＤＡ－ＳＮＡ及び混和物治療が、そのような多様な免疫学的応答をインビボでどのように誘導したかを理解するために、脾臓ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、免疫化及びバルクＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を実施した後に収集及び単離した。主成分分析（ＰＣＡ）は、混和物製剤で免疫化したマウスのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞遺伝子発現プロファイルが、ナイーブマウスからのものと最も類似していることを総合的に明らかにし、これが低い全体的な活性化の原因であることを示唆していた（図３４Ａ）。ＤＡ－ＳＮＡ２で免疫化したマウスは、それらのＣＤ８＋トランスクリプトームにおいてナイーブマウスと最も異なるのに対して、ＤＡ－ＳＮＡ１及びＤＡ－ＳＮＡ２の両方で、同様にＣＤ４＋Ｔ細胞におけるそれらの遺伝子発現プロファイルにおいてナイーブマウスとは異なっていた（図１４）。これは、図３３で観察された、ＤＡ－ＳＮＡ２によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞機能が大幅に増加するが、両方のＤＡ－ＳＮＡ間のＣＤ４＋Ｔ細胞機能レベルは同等であるという根拠を示唆した。更に、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化マウスの差次的調節遺伝子は、他の治療と比較して、両方のＴ細胞型でより大きな絶対対数倍率変化（ＬＦＣ）を示し、ＤＡ－ＳＮＡ１と比較して、ＤＡ－ＳＮＡ２免疫化の結果として差次的調節遺伝子の数が少なくとも２倍であった（図３４Ｂ）。差次的調節遺伝子は、炎症応答及び炎症誘発性サイトカインの上方調節、走化性、並びに主要免疫細胞集団の移動を伴う経路において濃縮されていた（図３４Ｃ、図１４、図１５、及び図１６）。ＤＡ－ＳＮＡ２治療からの濃縮経路のうちのいくつかは混和物治療と共有され、他はＤＡ－ＳＮＡ１治療と共有されたが、全体的に、ＤＡ－ＳＮＡ２アーキテクチャについてのトランスクリプトームレベルで誘導された広範囲の活性化は、増強された免疫学的出力と相関していた。
関連する遺伝子シグネチャーは、全ての治療にわたる適応免疫及び自然免疫の活性化並びに機能に関して同定され、これには、例えば、ＣＸＣＲ３、ＴＮＦＳＦ９、及びＧＺＭＫが含まれる（図３４Ｄ）。これらの遺伝子は、それぞれ、Ｔ細胞エフェクター機能及びトラフィキング、抗原提示及び細胞傷害性Ｔ細胞の生成、並びにヘルパーＴ細胞の細胞溶解機能に特に関連性を有する。ＤＡ－ＳＮＡ２のＤＡ－ＳＮＡ１に対する特定の比較は、単純に抗原クラスの位置付けを変化させることによって誘導される独自のナノスケール誘導遺伝子差を実証する（図３４Ｅ）。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞において、それぞれ合計４５２及び２２９個の重複する有意な遺伝子が、両方のＤＡ－ＳＮＡ間で検出された。具体的には、ＤＡ－ＳＮＡ２は、ＤＡ－ＳＮＡ１と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ２ＲＡ、ＣＤ４４、ＸＣＬ１、及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ３、ＣＣＲ７、ＣＣＬ９のより高い発現を誘導した。最終的に、全ての免疫化治療にわたる遺伝子シグネチャーを比較することにより、ワクチン構造、特にナノスケールの抗原位置付けがゲノム及び発現パターンに与える重大な影響が浮き彫りになった。これらの結果は、検出された免疫学的測定値を裏付け、Ｔ細胞の活性化及び持続的な応答につながる経路を浮き彫りにする機構的根拠を提供し、目的に合った構造の考慮を使用するワクチン設計のための枠組みを詳述した。
ＤＡ－ＳＮＡ構造駆動型腫瘍阻害及び免疫活性化。ＤＡ－ＳＮＡの治療有効性及び免疫学的影響を評価するために、我々は、上記で使用されるＯＶＡ１エピトープ及びＯＶＡ２エピトープの両方を発現する、ＯＶＡタンパク質のその安定発現によるマウスＥ．Ｇ７－ＯＶＡリンパ腫がんモデルを採用した。３４簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下接種し、ＤＡ－ＳＮＡ又は混和物製剤（６ｎｍｏｌの各ＯＶＡ１及びＯＶＡ２抗原、６ｎｍｏｌのアジュバントＤＮＡ）のいずれかで毎週免疫化した（図３５Ａ）。ＤＡ－ＳＮＡ２で免疫した腫瘍保有マウスは、第２の免疫化（１５日目）から早くも５日後に、対照（生理食塩水治療）及び混和物群の両方と比較して約３倍の腫瘍成長の低下を実証し、生理食塩水治療マウスと比較して、腫瘍接種の２２日後に１６倍を超える腫瘍成長の差を実証した（図３５Ｂ、図９、及び図３６）。重要なことに、ＤＡ－ＳＮＡ１治療は、ＤＡ－ＳＮＡ２治療とは異なり、混和物と比較して、腫瘍成長を効果的に停止させなかった。混和物及びＤＡ－ＳＮＡ１と比較して、ＤＡ－ＳＮＡ２は、２４日目に腫瘍成長の約７倍の低下をもたらし、抗原位置決めの顕著な影響を浮き彫りにし、最終的に、動物生存期間の有意な延長に結び付いた（日数での生存率中央値：ＰＢＳ＝２７、混和物＝２４、ＤＡ－ＳＮＡ１＝２８、ＤＡ－ＳＮＡ２＝３５）（図３５Ｃ、図１１）。腫瘍成長に対する治療の物理的影響を更に調査するために、同じ治療レジメンの後、１５日目に腫瘍をマウスから切除し、その後秤量した（図３５Ｄ及び図３７）。興味深いことに、腫瘍成長曲線のこの時点で、両方のＳＮＡ群は、ＰＢＳ治療マウスと比較して、腫瘍重量の有意な低減を示し、ＤＡ－ＳＮＡ１が、抗腫瘍免疫応答を惹起することが可能であったが、ＤＡ－ＳＮＡ２から惹起するものほど持続的ではなかったことを示唆している。
脾臓を採取し、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の変化について評価して、腫瘍縮小に寄与した可能性のある治療の結果としての差を解明した（図３５Ｅ、図１２）。ＤＡ－ＳＮＡ２治療マウスの脾臓は、他の治療群と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意に高い割合を生成し、ＣＤ８＋のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する全体的に高い比率も表示した。腫瘍抑制に寄与した免疫学的差を評価するために、腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍成長における差異が最初に観察されたとき、及び他の治療がごくわずかな影響を有しながら、ＤＡ－ＳＮＡ２治療の影響が腫瘍成長を停止し始めたときに、１５日目に循環末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について評価した。注目すべきは、ＤＡ－ＳＮＡ２治療マウスは、循環抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の最高レベルを示した（図３５Ｆ、図７、図２１）。ＣＤ８＋リンパ球のこのサブセットを、それらのメモリー表現型について更に評価した。この場合、ＤＡ－ＳＮＡ２治療は、エフェクターメモリー表現型をＯＶＡ１特異的循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の６０％よりも有意に上昇させた（図３５Ｇ、図８、図２２）。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＤＡ－ＳＮＡで治療したマウスについても有意に上昇した（図３５Ｈ、図７、図２１）。予想されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞について本明細書で以前に検証されたトランスクリプトームプロファイル及び免疫学的パラメータのために、２つのＤＡ－ＳＮＡ群間には、ごくわずかな差があった。このサブ集団内のメモリー表現型を正確に表現するのに十分なＯＶＡ２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は存在しなかったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の約１０％を成熟させたＤＡ－ＳＮＡ２での治療と比較して、ＤＡ－ＳＮＡ１で治療されたとき（ＣＤ４＋Ｔ細胞の約３０％）に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の全体が、増強されたエフェクターメモリー状態を実証した（図３５Ｉ、図８）。
臨床的に関連する黒色腫腫瘍モデルにおける抗原位置付けの構造的影響。モデル系においてこれまでにＤＡ－ＳＮＡ構造に関して学んだ知見を、二重抗原位置付けがＢ１６－Ｆ１０黒色腫腫瘍の成長に影響を及ぼす能力を評価するために利用した。このモデルは、免疫抑制特性を増強した高侵襲性として確立されている。３５腫瘍にのみ存在する変異を含有するＭＡＲＴ－１タンパク質からの、最近報告された３６Ｍ２７及びＭ３０ネオエピトープを、それぞれＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ抗原として選択した。当初、ＤＡ－ＳＮＡ１又はＤＡ－ＳＮＡ２のいずれかの毎週のワクチン接種を受けたＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスは、生理食塩水治療マウスと比較して、１７日目の腫瘍成長の実質的な阻害率（それぞれ６８％及び４８％）を示した（図３８Ａ～Ｂ、図２３）。実際、生理食塩水治療と比べて、いずれかのＤＡ－ＳＮＡで治療したマウスについて、循環エフェクターメモリー抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の統計的に有意な約４倍の増加を観察した（図３８Ｃ）。したがって、抗原特異的免疫応答が産生されたが、これが腫瘍成長に及ぼしたごくわずかな影響は、これらのＴ細胞の治療的潜在性を阻害していた高免疫抑制腫瘍環境の可能性を示している。
これらの観察及びこの腫瘍モデルの固有の侵襲性のために、腫瘍の免疫抑制を克服する取り組みにおいて、ＤＡ－ＳＮＡ治療を、進行性黒色腫のためのＦＤＡ承認治療である免疫チェックポイント阻害剤抗ＰＤ－１と組み合わせた。３７、３８注目すべきは、抗ＰＤ－１をＤＡ－ＳＮＡと同時投与した場合、ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１の組み合わせで治療した動物については、腫瘍接種後１７日という早さで腫瘍成長の有意な減少が観察され始め、一方、他の治療群のマウスについては、腫瘍成長の実質的な減少は観察されなかった（図３８Ｄ）。図２４、図２５、及び図３９も参照されたい。これは、生理食塩水治療群又は抗ＰＤ－１単独療法治療群と比較して、これらのマウスについての生存期間中央値の４０％の延長に結び付いた（図３８Ｅ）。更に、ＤＡ－ＳＮＡ組み合わせ治療群間の比較により、組み合わせＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１動物についての全体的な生存期間中央値の実質的な改善が明らかになった（ｐ＝０．０５０７）。末梢血から単離された免疫細胞の評価により、ＤＡ－ＳＮＡ２がチェックポイント阻害剤と相乗的に作用するように見えるこの劇的な構造誘発差が更に浮き彫りになる。全ての他の群と比較して、組み合わせＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１治療を受けた動物についての循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加が観察された（図３８Ｆ）。興味深いことに、これらの循環ＰＢＭＣの中で全ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞集団を評価したとき、両方の組み合わせＤＡ－ＳＮＡ＋抗ＰＤ－１群について有意な増加を検出し、ＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１は、循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の約６０％においてエフェクターメモリー表現型を生成した（図３８Ｇ）。更に、この組み合わせＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１治療のみが、堅牢な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができた（図３８Ｈ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞循環の観察により、組み合わせＤＡ－ＳＮＡ２＋抗ＰＤ－１療法の結果として同様の高い増加が明らかになったが（図３８Ｉ）、両方の組み合わせＤＡ－ＳＮＡ＋抗ＰＤ－１群は、エフェクターメモリー表現型をＣＤ４＋Ｔ細胞集団の約２８％に有意に上昇させた（図３８Ｊ）。組み合わせＤＡ－ＳＮＡ２＋ＰＤ－１治療は、ＤＡ－ＳＮＡ１＋抗ＰＤ－１治療と比較して、抗ＰＤ－１単独療法とともに抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞産生レベルを増加させたが、群間で有意な差は観察されなかった（図３８Ｋ）。
結論
広範な研究は、一般に、有力な新しい免疫療法を生み出すことにおけるアジュバント及び抗原の重要性を検証してきたが、これまでのところ、特定の構築物内の複数の抗原の構造的提示の重要性、及び強力かつ所望の免疫応答を誘発することにおけるその役割を検証した一連の研究はない。総合すると、本明細書で提供されるデータは、ワクチン有効性において抗原位置付けが抗原選択と同様に重要であることを示している。実際、特定の実施形態では、２つの組成的にほぼ同一のワクチンにおけるＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ制限抗原の位置付けを変化させると、腫瘍に対する治療の利益が劇的に変化し、一方のワクチンは強力であり、他方は総体的に効果が無かった。これらの差の起源は、それが免疫細胞において受けるプロセッシングの経路に影響を与える抗原位置決め、及び異なる細胞区画におけるその滞留時間に起因し得る。プロセッシング経路及びこれらのシグナル伝達の動態を変化させることによって、これは、結果として生じる免疫応答に遺伝子、細胞、及び生物レベルで影響を与える。封入されたＭＨＣ－ＩＩ及びハイブリダイズしたＭＨＣ－Ｉ制限抗原は、重要な免疫細胞の炎症反応、走化性、及び移動に特異的な遺伝子を上方制御し、これらは一緒に免疫細胞活性に影響する。これらの構造的に定義された遺伝子差は、インビボ免疫化を繰り返すと免疫学的挙動に結び付き、最終的に両方のモデルＥ．Ｇ７－ＯＶＡリンパ腫及び臨床的に関連するＢ１６－Ｆ１０黒色腫のマウス腫瘍系における腫瘍成長プロファイルを定義する。これは、複数の細胞プロセスにわたるワクチン抗原位置決めの影響の重要な実証である。
本発明の実施例は、所望のシグナル伝達プロファイルに一致するように抗原提示を最適化する力が、強力なワクチンを生成するために重要であることを示し、抗原位置付けにおける小さなワクチン変化が、細胞間コミュニケーション、クロストーク、及び細胞相乗効果を有意に上昇させた。
材料及び方法
材料及び動物：特に明記しない限り、全ての試薬は、商業的に購入し、受け取ったままで使用した。以下に記載されるように、オリゴヌクレオチドを合成した。ペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎのペプチド合成コアから購入した。化学物質は、括弧内に列挙された供給元から購入した。８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス及びＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ（ＯＴ－１，００３８３１）雌マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスは、全ての国及び地域のガイドライン及び規制に従って使用し、実施されたプロトコルは、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＩＵＣＡＣ）の実験動物使用委員会によって承認された。Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ及びＢ１６－Ｆ１０細胞は、ＡＴＣＣから購入した。抗体を購入し、クローンを表３に提供する。
オリゴヌクレオチドの合成及び精製：示されるように、ホスフェート又はホスホロチオエート骨格を有する標準的なホスホロアミダイト化学物質を使用して、オリゴヌクレオチドをＡＢＩ３９４合成器上で合成した（表１）。合成に続いて、鎖が染料を含有しない限り、３７％水酸化アンモニウム／４０％メチルアミンの１：１溶液を使用して、鎖を５５℃で３５分間脱保護し、この場合、３７％水酸化アンモニウムを使用して、鎖を室温（ＲＴ）で一晩脱保護した。次いで、逆相ＨＰＬＣ上のＣ１８又はＣ４（染料又はコレステロールを含有する鎖の場合）カラムを使用して鎖を精製し、ピークを画分として収集した。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を、２０％の酢酸水溶液中で室温で１時間インキュベートすることによって産物鎖から除去し、続いて、酢酸エチルで３回洗浄して、ＤＭＴを除去した。最終産物を凍結乾燥し、脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）中に再懸濁した。濃度を、ＩＤＴ ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒオンラインツール（表１に列挙される）を通して計算した減衰係数を用いて、２６０ｎｍでのＵＶ－ｖｉｓ吸収を使用して測定した。
オリゴヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの合成及び精製：ｄｉＨ２Ｏ中のチオール官能化オリゴヌクレオチドを還元して、将来の反応のための遊離チオールを生成した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ８．５に溶解したジチオスレイトール（１００ｍＭ、ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、還元を１００ｍＭの最終濃度、室温で４５分間行った。この溶液を、３ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）スピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）内で、ｄｉＨ２Ｏで少なくとも３回洗浄した。ＯＶＡペプチドコンジュゲートについては、樹脂上のペプチドを購入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びアセトンで各々３回洗浄した後、５μｍｏｌを室温で一晩、ＤＭＦ（固体支持体上の最初のペプチド負荷に対して１０当量）に溶解したスクシンイミジル２－（２－ピリジルジチオ）エチルカーボネート（ＳＤＥＣ、以前のプロトコル３９を使用して作製）の溶液、及びＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５当量）と反応させた。その後、ビーズをＤＭＦ及びアセトンで各々３回洗浄し、空気中で乾燥させた後、９５％トリフルオロ酢酸（２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％ｄｉＨ２Ｏ）で室温で１時間脱保護した。ＴＦＡを窒素を使用して吹き飛ばし、ビーズをＤＭＦ中に再溶解させ、グラスウールを通して濾過した。およそ５～６倍のジエチルエーテルを添加することによってペプチド産物を沈殿させ、－２０℃で１～２時間放置して、更に沈殿させた。溶液を遠心分離（２，０００×ｇ、３分）して、ペプチドをペレット化し、これを回収し、乾燥させ、ＤＭＦに溶解させた。還元したＤＮＡ（０．５μｍｏｌ）を、およそ１．５ｍＬの反応の総体積にするために、水中の７０～７５％ＤＭＦ中の溶解したペプチド（５μｍｏｌ）と室温で一晩反応させた。ＭＡＲＴ－１ペプチドコンジュゲートについては、室温で３０分間の穏やかな撹拌下で１０当量のＤＭＦに溶解した２，２’－ジチオジピリジン（１５０μｍｏｌ）を使用して、ペプチドを活性化した。次いで、活性化したペプチドを、ジエチルエーテル中で３回洗浄し、遠心分離（２，０００×ｇ、３分）によってペレット化し、乾燥させた。還元したＤＮＡ（０．３μｍｏｌ）を、およそ１．５ｍＬの反応の総体積にするために、水中のおよそ７０％ＤＭＦ中の溶解したペプチド（５μｍｏｌ）と室温で一晩反応させた。
ペプチドのコンジュゲーションに続いて、溶液を１７，０００×ｇで２分間遠心分離して、任意の粉砕ペプチドをペレット化し、上清を３ｋＤａのＭＷＣＯスピンフィルターに移して、ｄｉＨ２Ｏで３～４回洗浄した。体積を＜５００μＬに濃縮し、溶液を分取スケール変性（８Ｍ尿素）１５％ＰＡＧＥゲル（単一のゲルに投入したＤＮＡは、０．５μｍｏｌ以下）によって精製した。ゲルを１７５Ｖで３０分間、次いで３５０Ｖでおよそ３時間操作し、その後、ＵＶランプを使用して撮像して、所望のバンドを切り出した。切り出したゲルバンドを粉砕し、産物をおよそ４時間毎に１×トリス／ボレート／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液で３回洗浄することによって収集した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって産物質量を確認し、ＤＮＡの減衰係数を仮定して、濃度を２６０ｎｍでＵＶ－ｖｉｓによって測定した。
ＳＮＡ合成：ＳＮＡを、以前に報告されたように、わずかな修飾で合成した。１６、４０簡潔に述べると、５０ｍｇの１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の乾燥した脂質フィルムを、封入されたリポソームのために、３～４ｍＬのＰＢＳ又はＰＢＳ含有ペプチドで水和させた。（注記：ペプチドを含有する溶液には、ＯＶＡ１：およそ１００μＬの１Ｍ ＮａＯＨを含有するＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬ、ＯＶＡ２：およそ６０μＬの１Ｍ ＮａＯＨを含有するＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬ、Ｍ２７：およそ６０μＬの１Ｍ ＮａＯＨを含有するＰＢＳに溶解した２．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｍ３０：およそ１００μＬの１Ｍ ＮａＯＨを含有するＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬ）溶液を、液体窒素中で２０回凍結融解、次いで３７～４０℃での超音波処理に供した。リポソームを、２００、１００、８０、及び５０ｎｍの孔径を有するポリカーボネートフィルターを使用する連続高圧押し出し（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を使用して押し出し、リポソームを各孔径に３回通した。押し出しに続いて、リポソームを１００ｋＤａのＭＷＣＯスピンフィルターを使用しておよそ２～３ｍＬまで濃縮し、３．５ＬのＰＢＳに対して一晩透析して、未封入のペプチドを除去した。リポソーム濃度を、５０ｎｍのリポソームがリポソーム当たり１８，１４０個の脂質を含有すると仮定して、ホスファチジルコリン（ＰＣ）アッセイキット（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ０４９－１ＫＴ）を使用して決定した。２４リポソームがペプチドを封入している場合、ペプチド濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）蛍光アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２３２９０）を使用して、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して、リポソームを破壊し、定量化のためにペプチドを放出し、標準曲線として１％ＳＤＳに溶解したペプチドを使用して測定した。リポソーム当たりのペプチドの負荷を、ペプチド濃度をリポソーム濃度で除算することによって計算した。粒子当たりの各抗原の量は、異なる開始濃度を使用して調整した各バッチの封入率に依存して、約２５～４０の範囲であった。
精製したオリゴヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを、１：１のモル比で、相補的な３’－コレステロール末端のＣｐＧ ＤＮＡと混合し、一晩遠心濃縮した。翌日、およそ２０～４０μＬの二本鎖緩衝液（ＩＤＴ）を添加し、溶液をゆっくり冷却して、プログラムに従って鎖を二本鎖にした：１０分間７０℃、１．５時間２３℃、≧時間４℃。二本鎖を、リポソーム内に封入されたペプチドに等モル量で合成されたリポソームの溶液に添加した。リポソーム当たり最大７５本の鎖を得るために、残りの空間を３’コレステロール末端Ｔ２０ ＤＮＡで満たした。この混合物を３７℃で一晩インキュベートし、その後４℃で貯蔵した。
細胞培養：全ての細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で維持した。Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞及びＤＣを、本明細書ではＲＰＭＩ＋／＋と称される１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ－ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、１１８７５０９３）で培養した。Ｂ１６－Ｆ１０を、１０％ＨＩ－ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，１１９６５０９２）を使用して取り扱った。
骨髄誘導樹状細胞（ＢＭＤＣ）の収集：骨髄細胞を、以前のプロトコル３９に従ってマウスから収集し、簡潔に述べると、赤血球を、２～３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，Ａ１０４９２０１）でおよそ４分間溶解し、集団からＤＣを区別するために、使用する前に、５～７日間、４０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，５７６３０４）を有する１０ｃｍ２細胞培養皿上にプレートした。
インビトロでのＴ細胞のＢＭＤＣの活性化及びクロスプライミング：細胞を１０ｃｍ２の細胞培養皿から収集し、ＤＣを磁気ビオチンポジティブセレクションキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１７６６５）を使用して混合物から単離した。ＣＤ１１ｃ＋ビオチン標識抗体を使用して、ＤＣを選択し（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、分離後、精製したＤＣをＶｉ－ＣＥＬＬ ＢＬＵ細胞生存能力分析器を使用してカウントした。ＤＣ活性化のために、６×１０４個のＤＣを、最終体積２００μＬのＳＮＡ処理で培養した。インキュベーター内での２２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄して、処理を終了し、チューブ当たり０．５μＬの各抗体（Ｌ／Ｄ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、及びＣＤ８０）を使用して４℃で１５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２０８０１）で固定した。Ｔ細胞の特異性及び活性化を評価するために、１．６×１０５個の精製したＤＣを、最終体積２００μＬのインキュベーター内で、ＳＮＡ処理で３０分間パルスした。３０分間のパルス後、細胞をＲＰＭＩ＋／＋で２回洗浄して、細胞溶液から任意の残留ＳＮＡを除去し、細胞を５００μＬのＲＰＭＩ＋／＋中に再懸濁した。同時に、脾臓細胞をナイーブマウスから単離した。脾臓の解離及び赤血球の溶解後、細胞をカウントし、温めたＲＰＭＩ＋／＋中に３×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、この細胞溶液１００μＬを９６ウェルの丸底プレート中の各ウェルに移した。各ウェルに、ＤＣ：脾臓細胞の比率が１：９になるように、処理されたＤＣ（３．３×１０４個の細胞）１００μＬを添加した。細胞をインキュベーター内で３日間共培養し、この後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤｉｍｅｒＸ Ｍｏｕｓｅ Ｈ－２Ｋｂ：Ｉｇ 融合タンパク質（ＢＤ，５５２９４４）又はＯＶＡ２四量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）のいずれかについての製造業者の指示に従って染色した。ペプチド特異的ＴＣＲマーカーに加えて抗体を染色することには、Ｌ／Ｄ、ＣＤ８又はＣＤ４のいずれか、ＣＤ１９、並びにＣＤ６９が含まれていた。染色後、細胞を１００μＬの固定緩衝液で固定した。Ｔ細胞増殖を評価するために、２．６×１０５個の精製したＤＣを、最終体積２００μＬのインキュベーター内で、ＳＮＡ処理で３０分間パルスした。３０分間のパルス後、細胞をＲＰＭＩ＋／＋で２回洗浄して、細胞溶液から任意の残留ＳＮＡを除去し、細胞を２６６．６μＬのＲＰＭＩ＋／＋中に再懸濁した。同時に、脾臓細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ（ＯＴ－１）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ，００３８３１）から単離した。脾臓の解離及び赤血球の溶解後、細胞をカウントし、細胞増殖染料ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，６５－０８４２－８５）で染色するために、ＰＢＳ中で４×１０７細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。染色後、細胞を洗浄し、カウントし、ＲＰＭＩ＋／＋中で３×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、この細胞溶液１００μＬを９６ウェルの丸底プレート中の各ウェルに移した。各ウェルに、ＤＣ：脾臓細胞の比率が１：９になるように、処理したＤＣ（３．３×１０４個の細胞）３３．３μＬを添加し、各ウェルを培地を用いて最大２００μＬの最終体積にした。細胞をインキュベーターで３日間共培養し、この後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ８（チューブ当たり０．５μＬの抗体）を染色し、洗浄し、Ｔ細胞増殖の尺度としてｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０の希釈液を使用してフローサイトメトリーで直ちに分析した。全ての試料を、ＢＤ Ａ３ Ｓｙｍｐｈｏｎｙのフローサイトメーターを使用して、ＦｌｏｗＪｏで分析したデータで分析した。
５週間の蓄積免疫応答を測定するためのインビボ免疫化：雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、異なる治療で２週間に３回皮下免疫化した。治療には、単純混合物（混和物、６ｎｍｏｌの各ペプチド及び６ｎｍｏｌのＣｐＧ １８２６ ＤＮＡ）又はいずれかのＤＡ－ＳＮＡ（各ＯＶＡペプチド及びＣｐＧ１８２６により６ｎｍｏｌ）が含まれていた。注射した治療物の体積を１００μＬに保った。最終免疫化の１週間後、マウスを犠死させ、その後の免疫評価のために脾臓を採取した。
採取手順：除去した脾臓を収集し、全ての脾臓が収集されるまで、３～５ｍＬのＲＰＭＩ＋／＋中に一時的に保持し、このとき、ＰＢＳの一定の流れで７０μｍの細胞ストレーナーを通過させた。細胞を、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この後に、上清を除去し、細胞を、２～３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１０４９２０１）中に４分間再懸濁した。溶解緩衝液を希釈するために、次いで、ＰＢＳを３０ｍＬの最終体積に添加し、細胞を遠心分離の前にカウントして、１×１０８細胞ｍＬ－１の濃度でＲＰＭＩ＋／＋培地中に再懸濁した。
ＩＦＮ－γサイトカイン産生：Ｔ細胞をエクスビボで再刺激して、抗原特異的細胞内ＩＦＮ－γ産生を評価した。４×１０６個の脾臓細胞を、ＯＶＡ１又はＯＶＡ２ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）のいずれか、モネンシン（２μＭ）、ブレフェルジンＡ（５μｇ／ｍＬ）、及びＣＤ１０７ａ抗体（０．５μＬ）を含有する４５０μＬのＲＰＭＩ＋／＋培地を有する５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で４時間培養した。４時間のインキュベーションの後、細胞を１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引し、６００μＬのＰＢＳで洗浄した後、表面抗体（Ｌ／Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ４の各々の試料当たり０．５μＬ）で、４℃で１５分間染色した。細胞を６００μＬのＰＢＳで洗浄し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引し、１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ固定及び透過処理溶液（ＢＤ，５５４７２２）に４℃で２０分間再懸濁した。その後に、細胞を６００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ，５５４７２３）で洗浄し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引し、細胞内抗体ＩＦＮ－γ（試料当たり０．５μＬ）を含有する１００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中に再懸濁した。試料をフローサイトメトリー分析の前に４℃で貯蔵した。
Ｔ細胞メモリー表現型：Ｔ細胞をエフェクターメモリー表現型について評価した。３×１０６個の脾臓細胞を６００μＬのＰＢＳで洗浄し、表面抗体（Ｌ／Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ４４、及びＣＤ６２Ｌの各々の試料当たり０．５μＬ）で１５分間染色した。細胞を６００μＬのＰＢＳで洗浄し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引し、１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２０８０１）中に再懸濁し、フローサイトメトリー分析の前に４℃で貯蔵した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：ＥＬＩＳｐｏｔ分析を、製造業者の指示に従って、市販のＭｏｕｓｅ ＩＮＦ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｓｅｔ（ＢＤ、５５１０８３）を使用して実施した。簡潔に述べると、提供された清浄なプレートを、捕捉抗体で、４℃で一晩コーティングした。その後に、プレートをＲＰＭＩ＋／＋培地で洗浄し、次いで、２００μＬのＲＰＭＩ＋／＋培地で、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液をピペット操作によって除去し、ウェルを乾燥させないように留意し、１００μＬのＲＰＭＩ＋／＋中の２×１０５個の脾臓細胞に迅速に置き換えた。各ウェルに、追加の１００μＬの抗原、非特異的ペプチド、培地（陰性対照）、又は陽性対照溶液のいずれかを添加した（抗原及び非特異的ペプチドを５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、陽性対照を、各々２μｇ／ｍＬの最終濃度で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の混合物として調製した）。溶液を、５％ＣＯ２中で、３７℃で４８時間インキュベーター内に放置した。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、検出抗体、酵素コンジュゲート、及び発色性基質を製造業者の指示に従って添加した。乾燥させたプレートを、ＣＴＬ免疫スポットイメージャーを使用して撮像及び分析した。
バルクＲＮＡ配列決定：磁気ポジティブセレクションキットを使用して、個々の治療群からの全脾臓細胞からＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１８９５２及び１８９５３）。これらの単離された細胞集団から、ＲＮＡ抽出を、製造業者の仕様に従って、ＱＩＡシュレッダー（Ｑｉａｇｅｎ）と組み合わせたＲＮｅａｓｙ（登録商標）プラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化し、ＲＮＡ試料を更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。配列決定を、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＮＵＳｅｑ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで実施した。簡潔に述べると、全ＲＮＡ実施例を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００から生成されたＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を使用して品質についてチェックした。ＲＮＡ量をＱｕｂｉｔ蛍光計で確認した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリー調製キットを使用して、１２５ｎｇの高品質ＲＮＡ試料（ＲＩＮ＞７）から配列決定ライブラリーを調製した。ｍＲＮＡ精製及び断片化、ｃＤＮＡ合成、３’終端アデニル化、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーション、ライブラリーＰＣＲ増幅及び検証を含むキット手順を、修正なしで実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００シーケンサーを使用してライブラリーを配列決定し、試料当たり２０００万～２５００万リードの深さで５０ｂｐの単一リードを生成した。ＦＡＳＴＱフォーマットにおける読み取りの品質を、ＦａｓｔＱＣを使用して評価した。リードを調整して、ｃｕｔａｄａｐｔを使用して３’終端からＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを除去した。４１調整したリードをＳＴＡＲを使用してハツカネズミゲノム（ｍｍ１０）にアライメントした。４２各遺伝子についてのリードカウントを、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓｅａｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から入手したｍｍ１０の遺伝子アノテーションファイルと併せてｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ４３を使用して計算した。正規化及び差次的発現を、Ｗａｌｄ検定を採用したＤＥＳｅｑ２を使用して計算した。４４有意に差次的に発現した遺伝子を決定するためのカットオフは、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して０．０５未満のＦＤＲ調節ｐ値であった。
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）：差次的発現遺伝子が差次的濃縮経路に接続されているかどうかを理解するために、ＧＳＥＡ４５を実施した。ＲＮＡ配列決定で検出された遺伝子を、ＤｅＳｅｑ２分析から得られたｌｏｇ１０変換された名目上のＰ値に基づいてランク付けし、ナイーブＴ細胞と比較した。経路濃縮分析を、ＧＳＥＡソフトウェア（ｖ４．０．３）を使用し、Ｒｅｉｍａｎｄらのプロトコルに従って実施した。４６遺伝子セットを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅから得て、Ｒｅａｃｔｏｍｅ，ＫＥＧＧを含めた。ランク付けされたリストを、マウス遺伝子シンボルを使用してＨｕｍａｎ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ（ｖ７．１）に再マップした分子署名データベースからのＣＨＩＰプラットフォームを使用して再マップした。用語は、ＦＤＲ＜０．０５を有する場合、差次的に濃縮されたものとして定義した。強く濃縮された経路のサブセットを、ｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（ｖ１．０．１２）を使用するＲでの視覚化のために選択した。この選択は、ＦＤＲ＜０．０５を有する全ての経路を含み、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞における免疫応答に関連するものであった。
遺伝子発現プロファイル：ＦＤＲｐ値＜０．０５によって定義されるように、両方のＳＮＡ治療群において発現が有意に変化した遺伝子を、ヒートマップとしての視覚化のために選択した。ＦＰＫＭにおける遺伝子発現スコアを、治療群にわたるｚスコアに変換し、Ｋ平均クラスタリングを使用して遺伝子発現値をクラスタリングした。ナイーブＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を対照として設定する、対象の２つの条件の間で一対組み合わせを実施した。ＦＤＲｐ値＜０．０５及びｌｏｇ２倍率変化＞０．５（上方制御）又はｌｏｇ２倍率変化＜０．０５（下方制御）によって定義されるように、群間で上方又は下方制御される遺伝子を、ボルケーノプロットを使用して視覚化した。インビボ有効性研究：８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。右脇腹に５×１０５個のＥ．Ｇ７－ＯＶＡ又は１０５個のＢ１６－Ｆ１０細胞を動物に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、腫瘍接種を実施した。免疫化物を、腹部へのｓ．ｃ．注射によって、６ｎｍｏｌ（ＯＶＡ１／２）又は９ｎｍｏｌ（Ｍ２７／３０）のいずれかの各抗原及びＣｐＧの用量で投与した。免疫化物を、腹部へのｓ．ｃ．注射によって、それぞれの図に提供される治療スケジュールに列挙されるように投与した。免疫チェックポイント阻害剤抗ＰＤ－１との併用療法のために、腹腔内注射を介して、マウスに１００μｇの抗マウスＰＤ－１（ｃｌｏｎｅ ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を投与した。腫瘍成長を所定の日に測定し、体積を以下の式を使用して計算した：腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５。腫瘍体積が２，０００ｍｍ３（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）又は１，５００ｍｍ３（Ｂ１６－Ｆ１０）に達したとき、又は動物が瀕死になったとき、動物を安楽死させた。
ＰＢＭＣの免疫活性化：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の収集のために、動物に、上記のように、がん細胞を接種した。治療を同じスケジュールに従って実施し、動物を１５日目（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）又は１７日目（Ｂ１６－Ｆ１０）に安楽死させた。血液を、心臓穿刺を介してＥＤＴＡライニング収集チューブ（ＢＤ）に収集し、反転させることによって短時間混合した。赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して溶解し、洗浄し、その後、残りの細胞を、Ｌ／Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４４、及びＣＤ６２Ｌに対する抗体で上述の方法を使用して染色した。
全体的な臓器免疫の評価：右脇腹にＥ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに対して、腫瘍重量及び脾臓細胞評価を実施した。腫瘍接種の３日後、第１の免疫化物を投与し、続いて７日後（１０日目）に追加の用量を投与した。腫瘍及び脾臓を１５日目に動物から切除し、その後分析した。単一細胞の脾臓細胞溶液を生成するために、ＰＢＳ溶液中の水和を維持しながら、脾臓を７０μｍの細胞ストレーナーを通して機械的に押し込んだ。その後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、ペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中に４分間再懸濁して、赤血球を溶解し、その後、遠心分離の前にＰＢＳ中で中和した。遠心分離に続いて、細胞を以下の抗体を使用して標識した：ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９。
統計分析：統計を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して計算し、使用される特定の統計分析を、それぞれの図のキャプションに強調表示する。群間の標準偏差の大きな差に基づいて行われ得る仮定の欠如のために、複数の群間の比較を、Ｓｉｄａｋ又はＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ、又はＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いたＷｅｌｃｈ ＡＮＯＶＡを用いて分析した。動物生存率についての統計を、ログランク試験を使用して計算した。図３５Ｅ～Ｆ及び図３８Ｈ、Ｊについての外れ値を、それぞれ、Ｑが１０％又は１％に設定されたＲＯＵＴ法を使用して特定した。全ての場合について、ｐ値を、以下のように示した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．は有意性が決定されなかったことを示し、ｎ．ｄ．は値が検出されなかったことを示す。各群への動物の配分、投与された免疫化物、及び腫瘍研究のための測定を盲検で実施した。グラフ中の値を平均値±標準誤差として示しており、これを、試料サイズと同様に、それぞれの図のキャプションに示す。
実施例３
本実施例では、結腸がんモデルにおける本開示によるＳＮＡ構築物を使用する実験について記載する。
８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。右脇腹に５×１０５個のＭＣ３８結腸がん細胞を動物に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、腫瘍接種を実施した。免疫化物を、腹部へのｓ．ｃ．注射によって、６ｎｍｏｌ（Ａｄｐｇｋ１／２）の各抗原及びＣｐＧのいずれかの用量で投与した。免疫化物を、腹部へのｓ．ｃ．注射によって、提供される治療スケジュールに列挙されるように投与した。腫瘍成長を所定の日に測定し、体積を以下の式を使用して計算した：腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５。腫瘍体積が２，０００ｍｍ３（ＭＣ３８）に達したとき、又は動物が瀕死になったとき、動物を安楽死させた。図４４を参照されたい。
参考文献
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５．Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５００，４１５－４２１（２０１３）。
６．Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｒ．Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ，ｌｏｎｇ ｏｒ ｓｈｏｒｔ，ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ？Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １７，３４３－３５０（２０１１）。
７．Ｂｅａｔｔｙ，Ｇ．Ｌ．＆Ｇｌａｄｎｅｙ，Ｗ．Ｌ．Ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｓ ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１，６８７－６９２（２０１５）。
８．Ｏｔｔ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５４７，２１７－２２１（２０１７）。
９．Ｋｅｎｔｅｒ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＰＶ－１６ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｖｕｌｖａｒ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６１，１８３８－１８４７（２００９）。
１０．Ｍｅｌｉｅｆ，Ｃ．Ｊ．＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ，Ｓ．Ｈ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ（ｐｒｅ）ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８，３５１－３６０（２００８）。
１１．Ｍｅｌｉｅｆ，Ｃ．Ｊ．ｉｎ Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．（ｅｄｓ．Ｌ．Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ＆Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ）２４９－２６１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１８）。
１２．Ｓｈｉｒａｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｌｐｅｒ－ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＣＴＬ）ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉ－ＨＩＶ ＣＤ８＋ ＣＴＬ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２，５４９－５５６（１９９４）。
１３．Ｌｙｎｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＬＲ－７／８ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｏｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８，３２０－３３２（２０２０）。
１４．Ｋｕａｉ，Ｒ．，Ｏｃｈｙｌ，Ｌ．Ｊ．，Ｂａｈｊａｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ａ．＆Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｎａｎｏｄｉｓｃｓ ｆｏｒ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ １６，４８９－４９６（２０１７）。
１５．Ｓｃｏｔｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｄｊｕｖａｎｔ－ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ－ ｌｏａｄｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３，６２１１－６２１９（２０１２）。
１６．Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１６，１０４７３－１０４８１（２０１９）。
１７．Ｏｓｔｒｏｕｍｏｖ，Ｄ．，Ｆｅｋｅｔｅ－Ｄｒｉｍｕｓｚ，Ｎ．，Ｓａｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｋｕｈｎｅｌ，Ｆ．＆Ｗｏｌｌｅｒ，Ｎ．ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ７５，６８９－７１３（２０１８）。
１８．Ｓｈａｎｋａｒａｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．ＩＦＮｇａｍｍａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１０７－１１１１（２００１）。
１９．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｓ．Ｅ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｓ．Ｍ．，Ａｎｔｏｎｙ，Ｐ．Ａ．，Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．＆Ｆｏｘ，Ｂ．Ａ．Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｉｎｔａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６９－７９（２０１４）。
２０．Ｍａｒｚｏ，Ａ．Ｌ．，Ｌａｋｅ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｗ．＆Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８ ａｎｄ ＣＤ４ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９，１０７１－１０７９（１９９９）。
２１．Ｏｋａｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７，３５－４８（１９９７）。
２２．Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ，Ｖ．，Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｊ．，Ｇｕｃｋｅｌ，Ｂ．＆ｖｏｎ Ｈｏｅｇｅｎ，Ｐ．Ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７１（Ｐｔ ４），３１１－３２６（１９９３）。
２３．Ｂｏｓ，Ｒ．＆Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．Ａ．ＣＤ４＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｌｉｅｕ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０，８３６８－８３７７（２０１０）。
２４．Ｂａｎｇａ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．，Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｔ．＆Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３６，９８６６－９８６９（２０１４）。
２５．Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｈａｏ，Ｌ．，Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．，Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．＆Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，７６２５－７６３０（２０１３）。
２６．Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２，１０２７－１０３０（２００６）．
２７．Ｒａｄｏｖｉｃ－Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２，３８９２－３８９７（２０１５）。
２８．Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．，Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．＆Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３４，１３７６－１３９１（２０１２）。
２９．Ｓｉｎｅｇｒａ，Ａ．Ｊ．，Ｅｖａｎｇｅｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｚ．＆Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ（２０２１）。
３０．Ｙａｍａｎｋｕｒｔ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｄｅｓｉｇｎ ｓｐａｃｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３，３１８－３２７（２０１９）。
３１．Ｈｏｙｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＣｓ ｗｉｔｈ ＣＤ４（＋）ａｎｄ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＣＴＬ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：Ｉｔ ｔａｋｅｓ ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｔａｎｇｏ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，３５４３－３５５９（２０１４）。
３２．Ｍａｉｌｌｉａｒｄ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ ａｎｄ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｈｅｌｐｅｒ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ １ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９５，４７３－４８３（２００２）。
３３．Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｄａｒｒａｈ，Ｐ．Ａ．＆Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，２４７－２５８（２００８）。
３４．Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｗ．，Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｆ．Ｒ．＆Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ５４，７７７－７８５（１９８８）。
３５．Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，Ｗ．Ｗ．＆Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．Ｂ１６ ａｓ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２０，Ｕｎｉｔ ２０ ２１（２００１）。
３６．Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｎｔ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｄｒｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５）。
３７．ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ ｅｘｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３１，ｅ４３９－４４２（２０１３）。
３８．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６，２４４３－２４５４（２０１２）。
３９．Ｓｋａｋｕｊ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １４０，１２２７－１２３０（２０１８）．
４０．Ｑｉｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，１３３３（２０２０）。
４１．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｃｕｔａｄａｐｔ ｒｅｍｏｖｅｓ ａｄａｐｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ．２０１１ １７，３（２０１１）。
４２．Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９，１５－２１（２０１３）。
４３．Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．，Ｐｙｌ，Ｐ．Ｔ．＆Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ＨＴＳｅｑ－－ａ Ｐｙｔｈｏｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｏ ｗｏｒｋ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１，１６６－１６９（２０１５）。
４４．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．＆Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５，５５０（２０１４）。
４５．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２，１５５４５－１５５５０（２００５）。
４６．Ｒｅｉｍａｎｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｗａｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｍｉｃｓ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒ，ＧＳＥＡ，Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ａｎｄ ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １４，４８２－５１７（２０１９）。

Claims (93)

  1. 球状核酸（ＳＮＡ）であって、
    （ａ）ナノ粒子コアと、
    （ｂ）前記ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、
    （ｃ）主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第１の抗原及び主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第２の抗原と、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）。
  2. 前記第１の抗原が、前記ナノ粒子コアに封入されている、請求項１に記載のＳＮＡ。
  3. 前記第２の抗原が、リンカーを通して前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１又は２に記載のＳＮＡ。
  4. 前記第２の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項３に記載のＳＮＡ。
  5. 前記第２の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項３に記載のＳＮＡ。
  6. 前記第２の抗原が、リンカーを通して前記ナノ粒子コアの前記外部表面に結合している、請求項１又は２に記載のＳＮＡ。
  7. 前記第２の抗原が、前記ナノ粒子コアに封入されている、請求項１又は２に記載のＳＮＡ。
  8. 前記第１の抗原が、リンカーを通して前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１又は３～７のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  9. 前記第１の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項８に記載のＳＮＡ。
  10. 前記第１の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項８に記載のＳＮＡ。
  11. 前記第１の抗原が、リンカーを通して前記ナノ粒子コアの前記外部表面に結合している、請求項１又は３～７のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  12. 主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ－Ｉ）抗原である第３の抗原を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  13. 主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ）抗原である第４の抗原を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  14. 前記第３の抗原が、前記ナノ粒子コアに封入されている、請求項１２又は１３に記載のＳＮＡ。
  15. 前記第４の抗原が、リンカーを通して前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１３又は１４に記載のＳＮＡ。
  16. 前記第４の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項１５に記載のＳＮＡ。
  17. 前記第４の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項１５に記載のＳＮＡ。
  18. 前記第４の抗原が、リンカーを通して前記ナノ粒子コアの前記外部表面に結合している、請求項１３又は１４に記載のＳＮＡ。
  19. 前記第３の抗原が、リンカーを通して前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１２、１３、又は１５～１８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  20. 前記第３の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項１９に記載のＳＮＡ。
  21. 前記第３の抗原が、前記ナノ粒子コアに結合している前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに、前記リンカーを通して結合している、請求項１９に記載のＳＮＡ。
  22. 前記第３の抗原が、リンカーを通して前記ナノ粒子コアの前記外部表面に結合している、請求項１２、１３、又は１５～１８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  23. 前記第４の抗原が、前記ナノ粒子コアに封入されている、請求項１３、１４、又は１９～２２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  24. 前記第１の抗原及び前記第３の抗原が、同じである、請求項１２～２３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  25. 前記第１の抗原及び前記第３の抗原が、異なる、請求項１２～２３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  26. 前記第２の抗原及び前記第４の抗原が、同じである、請求項１３～２５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  27. 前記第２の抗原及び前記第４の抗原が、異なる、請求項１３～２５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  28. 前記ＭＨＣ－Ｉ抗原が、ＯＶＡ２５７－２６４（ＯＶＡ１）（配列番号７）、ＧＰ１００（２５－３３）（配列番号１１）、ＴＣ－１ Ｅ６（４９－５８）（配列番号１２）、ＴＣ－１ Ｅ７（４９－５７）（配列番号１３）、ＰＳＭＡ（６３４－６４２）（配列番号１４）、ＳＰＡＳ－１（ＳＮＣ９－Ｈ８）（配列番号１５）、ＳＩＭＳ２（２３７－２４５）（配列番号１６）、ＰＡＰ（１１５－１２３）（配列番号１７）、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ２７）（配列番号９）、ＴＲＰ－１（２５２－２６０）（配列番号１８）、ＴＲＰ－１（２５２Ｖ２６０Ｍ）（配列番号１９）、ＴＲＰ－１（４５５－４６３）（配列番号２０）、ＴＲＰ－１（４５５Ａ４６３Ｍ）（配列番号２１）、ＴＲＰ－２（１８０－１８８）（配列番号２２）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－（１２７－１３５）、チロキナーゼ（１－９）、チロキナーゼ（３６９－３７７Ｄ）、ＭＣ３８ Ａｄｐｇｋ（配列番号２３）、Ｉｒｇｑ－最小（配列番号２４）、Ｉｒｇｑ－長鎖ペプチド（配列番号２５）、又はこれらの組み合わせである、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  29. 前記ＭＨＣ－ＩＩ抗原が、ＯＶＡ３２３－３３９（ＯＶＡ２）（配列番号８）、ＧＰ１００：（４６－５８）（配列番号２６）、ＴＣ－１ Ｅ６（４３－５７）（配列番号２７）、ＳＩＭＳ２（２４０－２５４）（配列番号２８）、ＰＡＰ（１１４－１２８）（配列番号２９）、Ｂ１６ ＭＡＲＴ－１（Ｍ３０）（配列番号３０）、ＴＲＰ－１（１１３－１２７）（配列番号３１）、ＴＲＰ－１（１０６－１３０）（配列番号３２）、Ｌｉ－Ｋｅｙ（７７－９２）（配列番号３３）、チロシナーゼ（５６－７０）、ＧＰ１００（４４－５９）、ＧＰ１００（１６７－１８９）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（１０２－１１１）（配列番号３４）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（２７－４０）（配列番号３５）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７０）（配列番号３６）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（５１－７３）（配列番号３７）、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１（４３－５７）（配列番号３８）、又はそれらの組み合わせである、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  30. 前記１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  31. 前記１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの各々が、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  32. 前記ＴＬＲが、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる、請求項３０又は３１に記載のＳＮＡ。
  33. 前記ＴＬＲが、ＴＬＲ９である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  34. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧヌクレオチド配列を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  35. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’（配列番号３９）の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  36. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’（配列番号４０）の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  37. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））２コレステロール－３’（配列番号４１）の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  38. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））２コレステロール－３’（配列番号６）の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  39. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  40. 前記リンカーが、カルバメートアルキレンジスルフィドリンカー、チオールリンカー、ジスルフィドリンカー、アミドアルキレンジスルフィドリンカー、アミドアルキレンチオ－スクシンイミジルリンカー、又はそれらの組み合わせである、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  41. 前記ナノ粒子コアが、ミセル、リポソーム、ポリマー、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はそれらの組み合わせである、請求項１～４０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  42. 前記ポリマーが、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、シリカ、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、又はキトサンである、請求項４１に記載のＳＮＡ。
  43. 前記ポリマーが、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である、請求項４２に記載のＳＮＡ。
  44. 前記ナノ粒子コアが、リポソームである、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  45. 前記リポソームが、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びコレステロールからなる群から選択される脂質を含む、請求項４４に記載のＳＮＡ。
  46. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、脂質アンカー基を通して前記ナノ粒子コアの前記外部表面に結合している、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  47. 前記脂質アンカー基が、前記１個以上のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している、請求項４６に記載のＳＮＡ。
  48. 前記脂質アンカー基が、トコフェロール又はコレステロールである、請求項４６又は４７に記載のＳＮＡ。
  49. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、その５’終端及び／又は３’終端でジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）で修飾される、請求項１～４８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  50. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、その５’終端及び／又は３’終端でチオールで修飾される、請求項１～４９のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  51. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  52. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  53. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  54. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドである、請求項１～５３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  55. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約２～約２００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  56. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約２～約１００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  57. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約１５０個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  58. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約２００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  59. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約１０～約８０個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５又は５６に記載のＳＮＡ。
  60. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約７５個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、又は５９に記載のＳＮＡ。
  61. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約５～約１０００ヌクレオチド長である、請求項１～６０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  62. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約１０～約５０ヌクレオチド長である、請求項６１に記載のＳＮＡ。
  63. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約２０～約３０ヌクレオチド長である、請求項６１又は６２に記載のＳＮＡ。
  64. 前記ＳＮＡの直径が、約１ナノメートル（ｎｍ）～約５００ｎｍである、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  65. 前記ＳＮＡの直径が、約８０ナノメートル以下である、請求項１～６４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  66. 前記ＳＮＡの直径が、約５０ナノメートル以下である、請求項１～６５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  67. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、標的化オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、非標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  68. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項６７に記載のＳＮＡ。
  69. 請求項１～６８のいずれか一項に記載の複数のＳＮＡを含む、組成物。
  70. 前記複数の中の少なくとも２つのＳＮＡが、異なるナノ粒子コアを含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. 請求項１～６８のいずれか一項に記載の複数のＳＮＡ又は請求項６９若しくは７０に記載の組成物と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、薬学的製剤。
  72. 請求項１～６８のいずれか一項に記載のＳＮＡ、請求項６９若しくは７０に記載の組成物、又は請求項７１に記載の薬学的製剤を含む、ワクチン。
  73. アジュバントを含む、請求項７２に記載のワクチン。
  74. 薬学的に許容される担体、希釈剤、安定剤、若しくは保存剤中の請求項１～６８のいずれか一項に記載のＳＮＡ、又は請求項７１に記載の薬学的製剤を含む抗原性組成物であって、対象において、抗体生成、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、ヘルパーＴ細胞の活性化、又は防御免疫応答を含む免疫応答を生成することができる、抗原性組成物。
  75. 前記免疫応答が、抗体応答を含む、請求項７４に記載の抗原性組成物。
  76. 前記抗体応答が、中和抗体応答又は防御抗体応答である、請求項７５に記載の抗原性組成物。
  77. 遺伝子産物の発現を阻害する方法であって、前記遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、請求項６７又は６８に記載の阻害性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含み、前記ポリヌクレオチドと前記阻害性オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズが、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性を有する前記ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる、方法。
  78. 前記遺伝子産物の発現が、インビボ又はインビトロで阻害される、請求項７７に記載の方法。
  79. 対象において免疫応答を産生する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～６８のいずれか一項に記載のＳＮＡ、請求項６９若しくは７０に記載の組成物、請求項７１に記載の薬学的製剤、請求項７２若しくは７３に記載のワクチン、又は請求項７４～７６のいずれか一項に記載の抗原性組成物を投与し、それによって、前記対象において免疫応答を産生することを含む、方法。
  80. 前記免疫応答が、抗体応答を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記抗体応答が、全抗原特異的抗体応答である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記抗体応答が、中和抗体応答又は防御抗体応答である、請求項８０に記載の方法。
  83. 対象を１つ以上の抗原に対して免疫化する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～６８のいずれか一項に記載のＳＮＡ、請求項６９若しくは７０に記載の組成物、請求項７１に記載の薬学的製剤、請求項７２若しくは７３に記載のワクチン、又は請求項７４～７６のいずれか一項に記載の抗原性組成物を投与し、それによって、前記対象を前記１つ以上の抗原に対して免疫化することを含む、方法。
  84. 前記組成物又は前記ワクチンが、がんワクチンである、請求項８３に記載の方法。
  85. がんを治療する方法であって、対象に、有効量の、請求項１～６８のいずれか一項に記載のＳＮＡ、請求項６９若しくは７０に記載の組成物、請求項７１に記載の薬学的製剤、請求項７２若しくは７３に記載のワクチン、又は請求項７４～７６のいずれか一項に記載の抗原性組成物を投与し、それによって、前記対象における前記がんを治療することを含む、方法。
  86. 前記がんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、膠芽細胞腫、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、黒色腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、オステオカルシノマ（ｏｓｔｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、及びヒトパピローマウイルス誘発がん、又はそれらの組み合わせである、請求項８４又は８５に記載の方法。
  87. 前記がんが、黒色腫である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記がんが、結腸がんである、請求項８６又は８７に記載の方法。
  89. 前記がんが、リンパ腫である、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 追加の薬剤を投与することを更に含む、請求項７９～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記追加の薬剤が、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体、抗プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）抗体、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）抗体、又はそれらの組み合わせである、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ＳＮＡが、請求項５に記載のＳＮＡである、請求項７７～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＳＮＡが、請求項１０に記載のＳＮＡである、請求項７７～９１のいずれか一項に記載の方法。
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