KR20140014077A - 교모세포종의 치료를 위한 치료 조성물 - Google Patents

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tumor
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존 알. 올페스트
마이클 레이몬드 올린
월터 로우
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리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
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Abstract

본 발명은 다형 교모세포종 (GBM) 진단을 받은 동물을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

교모세포종의 치료를 위한 치료 조성물{THERAPEUTIC COMPOSITION FOR TREATMENT OF GLIOBLASTOMA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2010년 10월 25일 출원된 미국 출원 일련 번호 61/406,429를 우선권 주장하며, 상기 출원은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 배경
다형 교모세포종 (GBM)은 인간에서의 원발성 뇌 종양 중 흔한 유형이며, 이는 매우 침습성이고, 대단히 파괴적인 암이며, 중앙 생존 기간은 대략 1년이다 (문헌 [Eramo et al., Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241]). 교모세포종이 임의의 중추 신경계 악성 종양 중 최악의 예후를 가지고 있다. 뇌에서 그의 생물학상의 위치로 인해 GBM에 대한 요법은 어렵다. 현 치료법으로는 화학요법, 방사선, 방사선수술, 코르티코스테로이드, 혈관신생 억제성 요법, 및 수술을 포함할 수 있다. 새로운 수술 기법 및 방사선 기법의 개발 및 다중 항종양성 약물의 사용에도 불구하고, 악성 신경교종에 대한 치유법은 없다 (문헌 [Eramo et al., Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241]). 교모세포종 세포는 세포독성제에 대해 내성을 띠며, 교모세포종 환자에서 매우 짧은 단기간 이내에 재발될 발병률이 높다는 것은 종양형성성 세포가 치료법을 추월할 수 있다는 것을 제안하는 것이다.
본 발명의 개요
본 발명은 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항종양 면역 반응을 발생시키는데 유용한 무혈청 배지 중의 부착성 세포주이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ATCC® 특허 기탁 지정번호 PTA-11498로 지정된, 교모세포종 줄기 세포주 (GBM6-AD)를 제공한다. 특정 실시양태에서, GBM6-AD 세포는 용해된 것이다. 특정 실시양태에서, GBM6-AD 세포는 방사선 조사된 것이다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 추가로 생리학상 허용되는 비독성 비히클을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 추가로 아주반트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 이미퀴모드이다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 톨-유사 수용체 (TLR) 리간드, 예컨대, CpG ODN, 아넥신(Annexin) A2, 폴리 ICLC, 또는 면역 반응을 자극하는 비-TLR 리간드이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 캐리어, 예컨대, 수지상 세포 또는 대식세포에 접합된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 비-세포 캐리어, 예컨대, 리포솜 중에 함유된다.
본 발명은 면역 반응 유도를 필요로 하는 동물에게 상기 기술된 항종양 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 동물은 포유동물, 예컨대, 인간 또는 비-인간 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 동물에게 이미퀴모드를 투여하는 단계를 추가로 포함하다. 특정 실시양태에서, 이미퀴모드는 항종양 조성물 투여 이전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 비경구로, 예컨대, 근육내로, 피하로, 피내로 또는 정맥내로 투여된다. 그러나, 투여 모드, 예컨대, 경구 또는 비내 또는 전달 또한 허용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 1회 초과의 시점에, 예컨대, 2회의 시점에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 각 투여 시점에 1 ㎍-100 mg의 GBM6-AD 세포의 용량 범위로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항종양 조성물은 각 투여 시점에 2 x 106개의 GBM6-AD 세포의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 이미퀴모드는 국소적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 이미퀴모드는 2개의 견갑골상 주사 부위에 국소적으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 동물에게 방사선 조사 요법을 실시하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방사선 조사 요법은 항종양 조성물 투여 이전, 투여 동안, 또는 투여 이후에 실시된다. 특정 실시양태에서, 방사선 조사 요법은 6,000 cGY 미만의 선량으로 실시된다. 특정 실시양태에서, 방사선 조사 요법은 다회 시점에 걸쳐 실시된다. 특정 실시양태에서, 방사선 조사 요법은 3회 시점에 걸쳐 실시된다. 특정 실시양태에서, 방사선 조사 요법은 5,220 cGY의 선량으로 실시된 후, 각각 360 cGY의 2회 추가 선량으로 실시된다. 특정 실시양태에서, 360 cGY의 1차 추가 선량은 5,220 cGY의 선량 후 10주 경과하였을 때 실시되고, 360 cGY의 2차 추가 선량은 5,220 cGY의 선량 후 14주 경과하였을 때 실시된다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 동물에게 방사선 감작제인 테모졸로미드를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방사선 감작제는 "parp 억제제" (parp는 DNA 수복에 관여하는 단백질이다)이다. 특정 실시양태에서, 방사선 감작제는 테모졸로미드이다. 특정 실시양태에서, 테모졸로미드는 초기 방사선 요법 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 테모졸로미드 조성물은 5-200 mg/㎡/일의 용량 범위로 투여된다. 특정 실시양태에서, 테모졸로미드 조성물은 75 mg/㎡/일의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 방사선 요법은 180 cGy씩의 분할량으로 5,220 cGy 선량으로 실시된다. 특정 실시양태에서, 방사선 요법은 6 내지 7주 간에 걸쳐 실시된다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 초기 방사선 요법 후 4 및 8주째에 이틀 연속으로 180 cGy씩의 분할량으로 추가의 360 cGy의 분할량을 실시하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 동물은 포유동물, 예컨대, 인간이다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 동물에게 덱사메타손 요법을 실시하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 덱사메타손 요법은 진단시에 실시된다. 특정 실시양태에서, 초기 방사선 요법 6주차까지 동물에서 덱사메타손을 중단한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 조절성 T 세포 또는 골수 유래 억제 세포를 제거하는 화학요법제 또는 약물을 투여하는 단계를 포함한다. 그 예로 수니티닙, 온탁, 시클로포스파미드, 겜시타빈, 레티노산을 포함한다.
본 발명은 상기 기술된 항종양 조성물로 수지상 세포를 감작시키는 단계를 포함하는, 수지상 세포 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 기술된 조성물을 동물 내로 도입시키는 단계를 포함하는, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 기술된 조성물을 동물 내로 도입시키는 단계, 및 GBM6-AD에 특이적인 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, GBM6-AD에 특이적인 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포에 특이적으로 결합하는 정제된 항체로서, 여기서, 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포는 ATCC® 특허 기탁 지정번호 PTA-11498인 것인, 정제된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 Fv 또는 scFv 단편이다.
본 발명은 원발성 뇌 종양 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 기술된 바와 같은 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포에 특이적으로 결합하는 항종양 조성물 또는 정제된 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 원발성 뇌 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 원발성 뇌 종양은 성상세포종, 다형 교모세포종, 수모세포종 또는 상의세포종이다.
도 1은 종양 항원의 공급원으로서 사용하고자 하는 GBM6-AD 세포에 관한 유세포 분석법 데이터이다. 히스토그램은 배경 결합인 대조군에 관한 이소형 염색 (완전 회색) 및 시험 항체 염색 (백색)을 보여주는 것이다.
도 2는 이미퀴모드/종양 용해물 백신이 뮤린 GBM에서 생존 기간을 연장시켰다는 것으로 보여주는 것이다. C57BL/6 마우스의 우측 선조체에 GL261 신경교종 세포를 이식하였다. 종양 접종 후 3, 10, 17, 24, 및 31일째 피내 주사에 의해 GL261 용해물로 백신화하는 것을 실시하였다. 매회 이미퀴모드 크림을 피부에 적용시켜 백신화 부위를 도포하였다. 염수로 처리된 마우스를 대조군으로서 사용하였다 (N=5마리/군). 백신화된 군에서의 생존 기간은 유의적으로 연장되었다 (로그-순위; p=0.06).
도 3은 치료 계획안을 나타낸 것이다. 처음 4주간의 방사선 요법 (XRT) 동안 환자 중 절반에는 테모졸로미드를 제공하고 (tem+), 절반에는 제공하지 않았다 (tem-). 방사선을 180 cGy씩의 분할량으로 조사하였다. 10주째부터 14주째까지는 매 2주마다, 이어서, 16주째부터 52주째까지 매 4주마다 이미퀴모드/BTIC 백신을 투여하였다.
도 4는 2개의 산소 분압에서 성장시킨 인간 교모세포종으로부터 단리된 원발성 세포를 나타낸 것이다. DMEM/F12, 20 ng/ml EGF 및 FGF, 및 1X B27 및 N2 보충제로 구성된 완전 줄기 세포 배지 중에 동일한 개수의 신경교종 세포를 시딩하였다. 5일 경과 후 대표 영상을 포착하였다.
도 5. 본 도면은 조직 배양 검정법에서의 GBM6 용해물로 감작된 DC 프라이밍된 종양 살상 T 세포의 결과를 제공한다. 본 데이터는 GBM6이 종양 살상 면역 반응을 발생시킬 수 있다는 것을 직접 제시한다.
도 6A-6C는 5% 산소에서 배양된 원발성 GBM 세포주가 고수준으로 신경교종-관련 및 종양-개시 단백질을 발현한다는 것을 나타낸 것이다. A에서, 실시간 PCR에 의해, 5% 또는 20% O2에서 배양된 3개의 신경교종으로부터 유래된 세포를 mRNA 수준에 대하여 분석하였고 (n=4마리/군), B에서는 유세포 분석법에 의해 단백질 수준을 분석하였다 (n=3-4마리/군). C에서, 웨스턴 분석법에 의해 단백질 수준을 확인하였다. * P < 0.05; ** P < 0.01.
도 7A-7D는 5% 산소로부터의 뇌 TL이 우수한 종양 살상 활성을 보인다는 것을 나타내는 것이다. 5% 또는 20% O2로부터의 TL로 감작된 DC로 PBMC를 자극시키고, A & B의 HLA-A2 매칭된 표적 교모세포종 또는 C의 상의세포종과 함께 인큐베이션시켰다. D에서, 증가된 종양 살상 반응이 MHC-I-의존성인지 여부를 측정하기 위해, PBMC에 앞서 항-ABC 차단 항체를 표적 세포에 첨가하였다. 데이터는 별개의 두 실험값을 나타낸다. 오차 막대, ±SEM. * P < 0.05; ** P < 0.01.
도 8A-8C는 5% 산소로부터의 종양 용해물이 CD8 T 세포 프라이밍을 증가시켰다는 것으로 보여주는 것이다. 수지상 세포를 5% 또는 20% O2 중에서 유래된, CFSE로 표지된 TL로 감작시키고, α-HLA-DR로 염색하고, A에서와 같이, 유세포 분석법으로 분석하였다 (3회 반복 실시된 값의 대표값). CMV+ PBMC를 5% 또는 20% O2 TL±pp65 펩티드로 감작된 DC와 함께 공배양하였는데, B에서와 같이 48h 동안 공배양하고 분비된 IFNγ 생산에 대하여 분석하고, C에서와 같이 72h 동안 공배양하고, 각 세포별로 CD8+pp65 오량체+ IFNγ 생산을 측정하였다. 오차 막대, ±SEM. * P < 0.05; ** P < 0.01.
도 9는 자가 말초 혈액-유래된 dc 프로세싱을 보여주는 것이다.
도 10은 치료 전후의 종양을 나타낸 것이다. 첫번째 패널은 시점 = 0일 때의 것이고, 두번째 패널은 2개월 경과 후의 병변을 보여주는 것이고, 세번째 패널은 3개월 경과 후의 병변을 보여주는 것이다. 2차 병변은 3개월 경과 후 사라졌다.
본 발명의 상세한 설명
항종양 조성물
종래 연구를 통해 GBM이 미만성 내인성 뇌교 신경교종 (DIPG)의 가장 흔한 조직학적 성질이라는 것이 밝혀졌다. 따라서, DIPG는 IL-13Rα2, Epha2, Her-2, 및 EGFRvIII을 비롯한, 현재 백신 임상 시험에서 표적화되는 GBM-관련 면역원성 단백질을 발현하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Wheeler CJ, et al. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cancer Research. 2008;68:5955-5964]; [Okada H, et al. Expression of glioma-associated antigens in pediatric brain stem and non-brain stem gliomas. J Neurooncol. 2008;88:245-250]; [Sampson JH, Archer, G.E., Mitchell, D.A., Heimberger, A.B. & Bigner, D.D. Tumor-specific immunotherapy targeting the EGFRvIII mutation in patients with malignant glioma. Semin Immunol. 2008;20:267-275]). 그러나, DIPG는 수술에 의해 접근이 가능한 종양이 아니기 때문에, 세포 용해물 백신을 생성하는 것은 어려웠다. 본 발명자들은 용해물 백신을 사용하여 DIPG를 치료하는 데 사용될 수 있는, 무혈청 줄기 세포 배지 중에서 성장시킨 BTIC 세포주인 GBM6을 확립하였다.
본 발명자들은 또한 무혈청 줄기 세포 배지 중에서 성장되었을 때에 부착성을 띠는, GBM6-AD라 명명되는 모체 GBM6 세포주의 변종을 확립하였다. 본원에서 사용되는 바, "부착성 세포주"라는 용어는 완전하게 무혈청인 조건에서 세포주가 부착성 단층으로서 성장한다는 것 (즉, 세포가 배양물 중에서, 배양 배지 중에서 자유롭게 부유한다기 보다는 (현탁 배양물이라기 보다는) 인공 기판 상에 단층으로서 (부착성 배양물) 성장한다는 것)을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "부착성 세포주"라는 용어는 심지어는, 부착성을 띠도록 만들어 주는 물질로 처리되지 않은 표준 조직 배양 플라스크 (예컨대, 팔콘(Falcon) 75 c㎡ 플라스크, 10 c㎡ 디쉬 등) 상에서도 조차 무혈청 줄기 세포 배지 중 부착성을 띠는 세포를 의미한다. 따라서, 본 세포는 심지어 전처리된 고체 기판의 부재하에서도 고체 기판에 부착된다. 이는 상기 세포주의 매우 드문 독특한 특성이다. 이러한 특징을 통해 무혈청 조건하에서 비-부착성인 세포주에 비하여 훨씬 더 빠르게 훨씬 더 저렴한 비용으로 임상 조건하에서 세포를 대규모로 제조할 수 있다.
GBM6-AD가 GBM6보다 더 광범위하게 계대접종되었고, 액체 질소로부터의 해동 후 그의 성장 역학은 시간 경과에 따라 증가하였다. 환자가 빠른 속도로 죽음에 다가가고 있을 경우에 중요한 고려 사항이 되는 것으로서, GBM6-AD는 더 많은 양의 백신을 더 빠르게 만들 수 있기 때문에 GBM6에 비하여 상당한 도움이 되는 것이다. 또한 GBM6을 장기간 동안 5% O2에서 성장시킴으로써 GBM6-AD를 생성하였는데, 이를 통해 세포가 부착성을 띠게 되었고, 중요하게는 더 큰 면역원성을 가지게 된 것으로 보였다.
GBM6-AD는 유니버시티스 몰레큘러 앤드 셀룰러 테라퓨틱스 (MCT) 퍼실러티 (University's Molecular and Cellular Therapeutics (MCT) Facility)의 클래스 10,000 생산 슈트의 유니버시티스 메디컬 센터 클리니컬 셀 테라피 래버러토리(University's Medical Center Clinical Cell Therapy Laboratory) (FACT-승인, CAP #18060-01, CLIA #24D0688128)에서 우수의약품 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Practice) (GMP) 조건하에 확립되었다. 유세포 분석법 데이터를 통해 GBM6이 IL-13Rα2, Epha2, 및 Her-2를 비롯한 많은 중요한 DIPG 항원을 발현한다는 것이 입증되었다 (도 1). 추가로, GBM6-AD는 또한 CD133, 네스틴, 및 Sox-2를 비롯한 중요한 BTIC 항원을 발현한다 (도 1). 상기 데이터에 기초하여, GBM6-AD 용해물의 백신화는 뇌의 다른 부분에서는 발생되지 않은 대부분의 DIPG 및 GBM을 표적화한다.
교모세포종 줄기 세포주 GBM6-AD는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 기탁 기관(American Type Culture Collection Depository) (ATCC® 기탁 기관(ATCC® Depository: 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801))에 기탁되었고, ATCC® 특허 기탁 지정번호 PTA-11498을 지정받았다. 세포주 기탁은 2010년 11월 18일에 이루어졌다. 상기 기탁물에의 접근은 출원이 미국 특허 및 상표청(Commissioner of Patents and Trademarks)에 계속 중인 동안 이용가능할 것이며, 분양신청시 미국 특허 및 상표청에 의해 접근할 자격이 있는 것으로 결정된 당사자가 이용가능할 것이다. 기탁물은 공공 기탁 기관인 ATCC® 기탁 기관에 30년 또는 가장 최근의 분양신청일로부터 5년, 또는 특허 강제 실시 기간 중 늦게 도래하는 기간까지 보관될 것이며, 그 기간 동안 생존 불가능하게 된 경우에는 대체될 것이다.
특정 실시양태에서, GBM6-AD 세포는 조작, 예컨대, 용해되거나, 방사선 조사된다. 용해는 다회의 냉동 해동 순환을 비롯한 방법에 의해, 또는 세포에 구멍을 "천공하기" 위해 고압 기포 (분무)를 이용함으로써 달성될 수 있다. 보관하기 위해서 용해물을 급속 냉동시키거나, 또는 속도 조절형 냉동기 (예컨대, 1℃/분씩)를 이용하여 -80℃로 냉동시킬 수 있다. 용해물 생성 이전에 세포에 방사선 조사할 수 있거나, 또는 용해물 그 자체에 방사선 조사하여 세포가 확실하게 사멸될 수 있도록 할 수 있다. 방사선 조사는 세슘 또는 코발트 방사선 조사 장치를 비롯한 다중 장치로부터 전달될 수 있다.
아주반트
백신은 보통 2가지 성분: 항원 및 아주반트를 함유한다. 항원은 그에 대해서 면역 반응이 유도되도록 하는 것인 병원체 또는 종양에 의해 코딩되는 분자 구조물이다. 항원-특이 면역 반응을 활성화시키기 위해, 항원을 적절한 면역자극성 미세환경에 제시할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 면역-활성화 분자, 예컨대, 염증유발 시토카인의 생산을 자극함으로써 상기 미세환경을 확립한다. 백신의 효능은 항원 및 아주반트의 유형, 그의 투여 방법에 따라 달라진다. 상기 성분들 간의 균형을 적절히 맞추는 것이 방어 면역을 유도하는 데 중요하다.
1. 톨-유사 수용체
대부분의 포유동물은 10 내지 15가지 유형의 톨-유사 수용체 (TLR)를 가지는 것으로 추정된다. 11가지의 TLR (간단하게 TLR1 내지 TLR11로 명명됨)이 인간에서 확인되었고, 상기의 등가 형태 다수가 다른 포유동물 종에서 발견되었다. TLR은 이량체로서 작용한다. 비록 대부분의 TLR은 동종이량체로서 작용하는 것으로 보이지만, TLR2는 TLR1 또는 TLR6과 함께 이종이량체를 형성하는데, 상기 이량체는 각각 상이한 리간드 특이성을 가진다. 모든 유기체에서 TLR의 기능은 단일의 작용 모드를 사용하기에 충분할 정도로 유사하게 보인다. 각 톨-유사 수용체는 미생물 상에 존재하는 하나의 특이 또는 한 세트의 특이 분자 결정기를 인식하였을 때 동종이량체 또는 이종이량체를 형성한다.
TLR은 병원체 관련 분자 패턴을 인식하고, 염증을 유발시킴으로써 감염을 감지한다. 그러므로, TLR 리간드는 백신 아주반트로서 개발되었다. 특정 실시양태에서, TLR1 내지 TLR11에 대한 리간드는 아주반트로서 사용될 수 있다. 항원의 흡수 및 아주반트에 의한 TLR 신호전달 활성화는 역동적이고, 극도로 약한 과정이다. 항원을 포식(engulf)하는 항원-제시 세포(APC) 또한 TLR 리간드를 흡수하여 공동자극성 분자를 상향 조절하고, 염증성 시토카인을 분비시키고, T 세포에 항원을 제시시키는 것이 이상적일 것이다. 이는 APC가, TLR 리간드 (예컨대, dsRNA) 및 바이러스 단백질, 둘 모두를 함유하는 바이러스 입자를 프로세싱할 경우에 확실히 그러하다. 그러나, 암 백신의 경우에는 항원 및 TLR 리간드가 혼합물 형태로 투여되어 왔다. 이러한 접근법을 통해 주사 부위에서는, APC가 항원만을 단독으로 포식하거나, TLR 리간드만을 단독으로 포식하거나, 또는 항원과 함께 TLR 리간드를 포식 (원하는 결과)하는 결과와 같은 수개의 이론상의 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 공동 투여하면 생성된 면역 반응에서 신호 대 잡음의 문제가 발생될 수 있다. 심지어 항원 및 TLR 리간드가 같은 APC에 의해 포식된 경우에도, 타이밍이 중요하다. 이는 항원에 앞서 TLR9 리간드를 흡수하게 되면 CTL에 대한 항원의 교차 제시는 동시에 흡수할 때보다 유의적으로 감소하였다는 것을 밝혀낸 니에르겐스(Nierkens) 등에 의해 가장 잘 입증되었다 (문헌 [Nierkens S, et al., Cancer Res. 2008;68:5390-5396). 이에, 인게일(Ingale) 등은 공유 결합에 의해 TLR2 리간드를 항원에 직접 접합시키는 것이 각 성분의 혼합물로 백신화시키는 것에 비하여 종양-반응성 IgG의 역가를 100,000배 넘게 증가시켰다 것을 입증하였다 (문헌 [Ingale S, et al., Nat Chem Biol. 2007;3:663-667]). 유사하게, 항원을 TLR9 리간드와 커플링시키면 항원-특이 T 세포의 개수는, 상기 두 성분을 따로따로 공동 투여하였을 때에 비하여 5 내지 100배 증가하게 된다 (문헌 [Krishnamachari Y, Salem AK. Adv Drug Deliv Rev . 2009;61:205-217]).
이미다조퀴놀린은 백신 아주반트로서 이용되어 온 더블 시클릭 유기 분자이다. 이미퀴모드는 피부 종양 치료를 위해 피부 상에 크림제로서 투여되는, FDA 승인을 받은 면역 반응 조절제이다. 이미퀴모드는 인간 형질세포양 수지상 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 TLR7을 통해 그의 면역자극성 효과를 발휘한다. 이미퀴모드로 치료하면, 모두가 동물에서 항종양 및 항바이러스 활성과 관련된 강건한 Th1 면역 반응을 프라이밍하는 데 중요한 것인 인터페론α, 인터페론γ, 및 IL-12를 비롯한 염증유발 시토카인이 방출된다. 국소용 이미퀴모드는 백신 아주반트로서 사용되어 왔으며, 확립된 종양 및 바이러스 감염을 표적화하는 많은 연구에서 어느 정도의 성공을 거두었다. 그러나, TLR7이 가장 풍부하게 존재하는 전문적인 APC 중 하나인 CD8α+TLR7- 골수 수지상 세포에서는 발현되지 않고, 이에 효능이 제한되기 때문에 이미퀴모드의 효능은 오직 TLR7 신호전달에 의존함에 의해 제지된다 (문헌 [Edwards AD, et al., Eur J Immunol. 2003;33:827-833]). 이러한 이유에서, 이미퀴모드를 변형시킴으로써 다른 화합물이 개발되었다.
레시퀴모드는 강력한 이중 TLR7 및 TLR8 리간드이다 (문헌 [Wu JJ, et al., Antiviral Res . 2004;64:79-83]). TL 8은 CD8α+ 골수 수지상 세포에서 발현되는 바, 이는 이미퀴모드가 가진 한계 중 하나를 극복하였다 (문헌 [Coffman RL, et al., Immunity ; 33: 492-503]). 그럼에도 불구하고, 많은 인자가 레시퀴모드 및 이미퀴모드의 효능을 제한하여 왔다. 최근에 확인된 치료 실패 기전 중 하나는 비록 상기 약물이 염증유발 시토카인을 유도하기는 하지만, 이는 고수준의 항염증성 시토카인, 예컨대, IL-10을 동시에 유도한다는 점이다 (문헌 [Gibson SJ, et al., Cell Immunol . 2002;218:74-86]; 및 [Lu H, et al., J Immunol;184:5360-5367]). 임상적으로 관련하여, 이미퀴모드 크림제를 적용하면 처리된 종양에 대해서는 작용을 하지만, 원위부에 있는 종양에는 작용을 하지 못하는데, 이는 전신 면역 장애를 제안한다 (문헌 [Lu H, et al., J Immunol;184:5360-5367]; 및 [Gill VL, et al., Vet Comp Oncol. 2008;6:55-64]). 실제로, 이미퀴모드 처리 후 IL-10을 차단한 결과, 처리된 종양 및 원위부 (비처리된) 종양은 제어된 것으로 나타났는데, 이는 현재 사용되는 이미다조퀴놀린에 의해 유도된 자가-조절 시토카인 반응의 임상적 중요성을 입증한다. 따라서, 염증유발 시토카인 대 항염증성 시토카인을 보다 더 바람직한 비율로 유발하는 신규한 이미퀴다졸퀴놀린계 화합물 개발이 요구되고 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, TLR-7 및/또는 TLR-8 (또는 조합물 TLR-7/8) 분자가 투여된다.
폴리 ICLC는 카르복시메틸셀룰로스, 폴리이노신산-폴리시티딜산, 및 폴리-L-리신 더블-스트랜드 RNA로 구성된 면역자극제이다. 이는 톨 유사 수용체-3 (TLR3)에 대한 리간드이다.
2. 아넥신 A2
아넥신 A2는 ANXA2 유전제에 의해 코딩되는 단백질이다. 아넥신 2는 다양한 세포 과정, 예컨대, 세포 운동성 (특히, 상피 세포의 운동성), 막-결합 단백질 복합체의 액틴 세포골격에의 연결, 엔도시토시스, 피브린용해, 이온 채널 형성, 및 세포 기질 상호작용에 관여한다. 이는 칼슘-의존성 인지질-결합 단백질로서, 세포내 단백질의 세포외 도메인으로의 엑소시토시스를 조직화하는 데 도움을 주는 기능을 한다. 아넥신 2A는 다면발현성 단백질인데, 이는 그의 기능이 체내에서 장소 및 시간에 따라 달라진다는 것을 의미한다.
3. 올리고뉴클레오티드
"핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 길이가 5개 이상의 염기인 중합체 형태의 뉴클레오티드를 의미한다. "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 싱글 및 더블 스트랜드 형태의 핵산, 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 중 어느 것의 변형된 형태일 수 있다. 비록 싱글 스트랜드 분자가 합성 골격을 포함한 경우에는 증가된 활성을 가지기는 하지만, 일반적으로는 생체내에서 더블 스트랜드 분자의 안정성이 더 크다.
본원에서 사용되는 바, "올리고데옥시리보뉴클레오티드" (ODN)는 길이가 약 3-1,000개 (또는 그 사이의 임의의 정수) 염기인 데옥시리보핵산 서열이다. 특정 실시양태에서, ODN은 길이가 약 3 내지 약 50개의 염기이다. 림프구 ODN 흡수는 세포 활성화에 의해 조절된다. 예를 들어, CpG ODN을 흡수하는 B 세포는 면역글로불린을 증가된 양으로 증식하고 분비한다. 본 발명은 1 이상의 비메틸화된 시토신-구아닌 (CpG) 디뉴클레오티드를 함유하는 특정 올리고뉴클레오티드가 면역 반응을 활성화시킨다는 결과에 기초한다.
"CpG" 또는 "CpG 모티프"는 포스페이트 결합에 의해 시토신 다음에 구아닌이 연결되어 있는 핵산을 의미한다. "메틸화된 CpG"라는 용어는 피리미딘 고리 상의, 보통은 피리미딘 고리의 5번 위치에서 일어나는 시토신의 메틸화를 의미한다. "비메틸화된 CpG"라는 용어는 피리미딘 고리 상에 메틸화가 존재하지 않음을 의미한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 비메틸화된 CpG 모티프의 메틸화, 부분 제거, 또는 제거가 그의 효과를 감소시키는 것으로 여겨진다. 올리고뉴클레오티드에서 모든 비메틸화된 CpG 모티프의 메틸화 또는 제거가 그의 효과를 실질적으로 감소시킨다. CpG 모티프의 메틸화 또는 제거의 효과가 CpG 모티프를 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드의 것과 유사하다면, 그 효과는 "실질적인" 것이다.
특정 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드의 크기는 그 범위가 약 8 내지 1,000개 염기, 또는 약 8 내지 30개 염기이다. 본 발명에서의 사용을 위해, 핵산은 당업계에 주지된 많은 방법들 중 어느 방법을 이용함으로써 새로 합성될 수 있다. 예를 들어, 시아노에틸 포스포라미다이트 방법 (문헌 [Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859,1981]); 뉴클레오시드 H-포스포네이트 방법 (문헌 [Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054,1986]; [Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986]; [Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986]; [Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988])이 있다. 이러한 화학법은 시판 중에 있는 이용가능한 다양한 자동 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해 수행될 수 있다.
별법으로, CpG 디뉴클레오티드는 플라스미드로 대규모로 제조될 수 있으며 (문헌 [Sambrook, T., et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989] 참조), 이는 대상체에게로 투여된 후, 올리고뉴클레오티드로 분해된다. 올리고뉴클레오티드는 공지된 기법, 예컨대, 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하는 기법을 사용한 기존 핵산 서열 (예컨대, 게놈 또는 cDNA)로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 분자이다. "면역자극성 핵산 분자"는 비메틸화된 시토신, 구아닌 디뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산 분자 (즉, "CpG DNA" 또는 시토신에 이어 구아노신을 함유하고, 포스페이트 결합에 의해 연결되어 있는 DNA)로서, 수지상 세포를 자극하는 (예컨대, 수지상 세포에 대해 유사분열촉진 영향을 미치거나, 수지상 세포에 의한 시토카인 발현을 유도 또한 증가시키는) 핵산 분자를 의미한다. 면역자극성 핵산 분자는 더블 스트랜드 또는 싱글 스트랜드일 수 있다. 싱글 스트랜드 분자가 증가된 면역 활성을 가지기는 하지만, 일반적으로는 생체내에서 더블 스트랜드 분자의 안정성이 더 크다.
"핵산" 또는 "DNA"는 포스페이트 기, 및 치환된 피리미딘 (예컨대, 시토신 (C), 티미딘 (T) 또는 우라실 (U)) 또는 치환된 퓨린 (예컨대, 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G))인 교환가능한 유기 염기에 연결된 다중 뉴클레오티드 (즉, 당, 예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스를 포함하는 분자)를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라, 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오시드 (즉, 포스페이트가 없는 폴리뉴클레오티드) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 포함하여야 한다. 핵산 분자는 기존 핵산 공급원 (예컨대, 게놈 또는 cDNA)으로부터 수득될 수 있지만, (예컨대, 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조된) 합성 핵산 분자인 것이 바람직하다.
CpG ODN
CpG ODN에는 구조상 및 표현형상 차이가 있는 3가지 주요 부류가 존재하는 것으로 기술된 바 있다. 각 부류에 특이적인 면역 효과 및 구조적 특징과 함께 그 부류의 예가 문헌 [Krieg (Krieg, 2006, Nature Reviews Drug Discovery, 5, 471-484)]에 제시되어 있다. A 부류 CpG ODN (이는 또한 D형으로도 지칭됨)은 (형질세포양 수지상 세포로부터의) 인터페론α (IFNα) 분비를 유도하는 강력한 유도제일 뿐만 아니라, B 세포도 약하게 자극한다. A 부류 ODN의 구조는, G-테트래드로 알려진 고도로 안정하지만 복잡한 고차 구조를 형성할 수 있는 5' 및/또는 3' 말단의 폴리-G 모티프 (3개 이상의 연속되는 구아닌), 및 자기 상보성 팔린드롬 중 하나 이상의 CpG 모티프를 함유하는 중앙의 포스포디에스테르 영역을 포함한다. 상기 모티프로 인해 A 부류 ODN은 나노입자로 자기 조립하게 된다. B 부류 ODN (이는 또한 K형으로도 지칭됨)은 포스포로티오에이트 골격을 가지지만, 전형적으로는 고차 구조를 형성하지는 않고, 강력한 B 세포 자극제이지만, IFNα 분비에 있어서는 그보다는 약한 유도제이다. 그러나, B 부류 CpG ODN을 덴드리머에서 또는 양이온성 지질 형질감염을 이용하여 비드 또는 미세입자 상에서 고차 구조를 형성하도록 인공적으로 가압한다면, 이는 A 부류 CpG ODN과 동일한 면역 프로파일을 발휘하는 바, 고차 구조 형성과 생물학적 활성이 연관이 있다고 볼 수 있다. C 부류 CpG ODN은 B 세포 활성화 및 IFNα 분비, 둘 모두를 유도하면서, A와 B 부류 중간 정도의 면역 특성을 가진다. 엔도솜 환경 내에서 이중체가 형성될 수 있도록 하는 것으로 여겨지는, 하나 이상의 5' CpG 모티프, 및 3' 팔린드롬을 포함하는 것인, 상기 ODN의 독특한 구조로부터 상기와 같은 특성이 초래될 수 있다고 보여진다 (문헌 [Krieg, 2006. Nature Reviews Drug Discovery, 5, 471-484]; [Takeshita F. et al., 2004. Semin Immunol. 16(1):17-22]; [Verthelyi D, Zeuner RA., 2003. Trends Immunol. 24:519-522]).
CpG ODN은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드 특히, 서열 콘택스트 (CpG 모티프)를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 포유동물 DNA와 비교하여 박테리아 DNA에서 20배 더 큰 빈도로 존재한다. 이는 주로 상기 분자의 인식에 관여하는 면역 세포의 활성화에 기초하여 공동 작용할 수 있는 한 세트의 면역 반응을 유도한다. CpG 모티프의 중요한 센서인 형질세포양 수지상 세포 (PDC) 상에서의 그의 상이한 활성에 기초하여 2가지 유형의 CpG ODN이 확인되었다 (문헌 [Krug A. et al., 2001. Eur J Immunol, 31(7): 2154-63]). CpG-A는 형질세포양 수지상 세포 (PDC)에서 IFNα를 유도하는 강력한 유도제인 반면, CpG-B는 IFNα의 약한 유도제이지만, B 세포의 강력한 활성제이다. 비록 CpG 모티프가 마우스 및 인간 사이에 상이하기는 하지만, 상기 두 종 모두에서 CpG ODN의 인식은 주로 TLR9에 의해 매개된다 (문헌 [Bauer S. et al., 2001. Proc Natl Acad Sci U S A, 98(16):9237-42]).
최근, PDC를 고도로 유도하고, B 세포를 고도로 활성화시키는, 이 둘 모두를 수행하는, CpG-C로 명명되는 새로운 유형의 CpG ODN이 확인되었다 (문헌 [Hartmann G. et al., 2003. Eur J Immunol. 33(6): 1633-41]). CpG-C의 서열은 CpG-A 및 CpG-B, 둘 모두의 요소를 조합한 것이다. 가장 강력한 서열은 M362로 명명되는데, 이는 CpG-A의 특징적인 특성인, CG 디뉴클레오티드를 포함하는 중앙 팔린드롬 서열, 및 CpG-B에 존재하는 5' 말단의 "TCGTCG 모티프"를 함유한다.
제제
특정 실시양태에서, 항종양 조성물 제제는 비히클 중 유효량의 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포 ("활성 성분")를 함유하는데, 여기서, 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정되는 양이다. 활성 성분의 범위는 전형적으로는 조성물의 약 1% 내지 약 95% (w/w)일 수 있거나, 적절할 경우, 그보다 훨씬 더 많거나 적을 수 있다. 투여량은 인자, 예컨대, 백신화가 고려시 되는 동물 또는 인간 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태에 따라 달라진다. 상기 양은 또한 항체를 합성할 수 있는 동물 면역계의 능력, 원하는 방어 정도에 따라 달라진다. 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 통상의 시험을 통해 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 확립될 수 있다. 생물막 펩티드 또는 그의 단편을 1회 이상의 용량으로 투여함으로써 대상체를 면역화시킨다. 요구에 따라 다중 용량을 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 비내용 제제는 코 점막에 자극을 유발하지도 않고, 섬모 기능을 유의적으로 방해하지 않는 비히클을 포함한다. 희석제, 예컨대, 물, 수성 염수 또는 다른 공지된 물질이 대상 발명과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비강용 제제는 또한 보존제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 클로로부탄올 및 벤즈알코늄 클로라이드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제가 존재함으로써 코 점막에 의한 대상 단백질의 흡수는 증진된다.
특정 실시양태에서, 경구용 액체 제제는 예를 들어, 수성 또는 오일성 현탁제, 액제, 에멀젼, 시럽제 또는 엘릭시르 형태이거나, 또는 정제 형태 또는 사용 전 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성되는 제품으로 건식으로 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기와 같은 액체 제제는 통상의 첨가제, 예컨대, 현탁화제, 유화제, 비-수성 비히클 (식용가능한 오일을 포함할 수 있다), 또는 보존제를 함유한다.
특정 실시양태에서, 항종양 조성물을 제조하기 위해, 상기 기술된 바와 같이, 정제된 GBM6-AD를 단리시키고, 동결건조시키고/거나, 안전화시키고, 용해시킨다. 이어서, GBM6-AD 세포의 양을 적절한 농도로 조정하고, 임의로 적합한 아주반트와 조합하고, 사용하기 위한 용도로 패킹한다. 적합한 아주반트로는 이미퀴모드; 계면활성제, 예컨대, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N-비스(2-히드록시에틸-프로판 디아민), 메톡시헥사데실-글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 폴리음이온, 예컨대, 피란, 덱스트란 술페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산, 카르보폴; 펩티드, 예컨대, 무라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 터프트신, 오일 에멀젼, 알룸, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 가능성을 지닌 다른 아주반트로는 E. 콜라이(E. coli) 이열성 독소 또는 콜레라 독소의 B 펩티드 서브유닛을 포함한다 (문헌 [McGhee, J.R., et al., "On vaccine development," Sem. Hematol, 30:3-15 (1993)]). 최종적으로, 면역원성 생성물을 제제로 사용하기 위해 리포솜 내로 혼입시킬 수 있거나, 또는 단백질, 예컨대, 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 다른 중합체에 접합시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 추가로 공지된 TLR 리간드 중 하나 이상을 함유한다. 구체적으로, 특정 실시양태에서, 조성물은 우수한 아주반트인 신규한 TLR2 리간드로서 아넥신 A2 (단백질) 또는 아넥신 A2의 단편을 함유한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 공유 결합에 의해 GBM-AD 중의 단백질에 접합된다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 말레이미드 화학적 링커를 수단으로 GBM6-AD 단백질에 접합된다.
투여 모드
본 발명의 항종양 조성물, GBM6-AD 유래 백신, GBM6-AD 반응성 T 세포 및 항-GBM6-AD 항체는 제약 조성물로서 제제화될 수 있고, 선택된 투여 경로, 즉, 경구로, 비내로, 피내로 또는 비경구로, 비내, 근육내, 국소 또는 피하 경로에 의한 투여 경로에 적합화된 다양한 형태로 포유동물 숙주, 예컨대, 인간 환자에게 투여될 수 있다.
따라서, 본 화합물은 제약상 허용되는 비히클, 예컨대, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 조합되어 전신으로, 예컨대, 경구로 투여될 수 있다. 이는 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 정제로 압착될 수 있거나, 또는 환자의 식이 식품과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 활성 화합물은 하나 이상의 부형제와 함께 조합될 수 있고, 섭취가능한 정제, 협측용 정제, 트로키, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 제제는 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유하여야 한다. 물론 조성물 및 제제의 비율은 달라질 수 있으며, 알맞게는 주어진 단위 투여 형태의 약 2 내지 약 60중량%일 수 있다. 상기 치료학상 유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 유효 투여량 수준을 수득할 수 있도록 하는 양이 될 것이다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐제 등은 또한 하기를 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대, 스테아린산 마그네슘; 및 감미제, 예컨대, 수크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파탐 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐제일 때, 이는 상기 유형의 물질 이외에도, 액체 담체, 예컨대, 식물성 오일, 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 각종의 다른 물질이 코팅제로서, 또는 다르게는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 또는 캡슐제는 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대, 체리 또는 오렌지 풍미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양으로서 이는 제약상 허용되고 실질적으로 비독성이어야 한다. 추가로, 활성 화합물은 서방형 제제 및 장치 내로 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 그의 염의 액제는 물 중에서 제조될 수 있고, 임의로 비독성 계면활성제와 혼합될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 그의 혼합물 중, 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 일반 보관 및 사용 조건하에서 상기 제제는 미생물 성장을 막기 위해 보존제를 함유한다.
주사 또는 주입에 적합한 제약 투여 형태는 멸균 주사용 또는 주입용 액제 또는 분산제를 즉석에서 제조하는 데 적합화되고, 임의로 리포솜 내로 캡슐화된, 활성 성분을 포함하는 멸균 수성 액제 또는 분산제, 또는 멸균 분제를 포함할 수 있다. 모든 경우에, 최종 투여 형태는 제조 ? 보관 조건하에서 멸균성이고, 유동성이고, 안정성을 띠어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 비독성 글리세릴 에스테르, 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 용매, 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 리포솜 형성에 의해, 분산액인 경우, 원하는 입자 크기 유지에 의해 또는 계면활성제 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 미생물의 작용을 막을 수 있다. 다수의 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 완충제, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 사용함으로써 주사용 조성물 흡수를 장기화시킬 수 있다.
멸균 주사용 액제는 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 각종의 다른 성분들과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 필터 멸균화시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 액제 제조를 위한 멸균 분제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 기법이며, 앞서 멸균 여과된 액제 중에 존재하는 임의의 추가의 원하는 성분과 함께 활성 성분으로 이루어진 분제를 수득할 수 있다.
국소 투여를 위해, 본 화합물은 순수한 형태로, 즉, 액체인 경우로 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로는 상기 화합물을 고체 또는 액체일 수 있는 피부학상 허용되는 담체와 함께 조합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
유용한 고체 담체로는 미분된 고체, 예컨대, 활석, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미늄 등을 포함한다. 유용한 액체 담체로는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드를 포함하며, 본 화합물은 유효 수준으로 상기 담체 중에 임의로는 비독성 계면활성제의 도움을 통해서 용해되거나 분산될 수 있다. 주어진 용도를 위한 특성을 최적화시키기 위해 아주반트, 예컨대, 방향제 및 추가의 항미생물제가 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키는 데 사용되는 흡수 패드로부터 적용될 수 있거나, 또는 펌프형 또는 에어로졸 분무기를 사용하여 환부 상에 분무될 수 있다.
액체 담체와 함께 증점제, 예컨대, 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로스 또는 개질된 광물질 또한 사용함으로써 사용자의 피부에 직접 적용시키기 위한 도포가능한 페이스트, 겔, 연고, 피부 등을 형성할 수 있다.
본 발명의 화합물을 피부에 전달하는 데 사용될 수 있는 피부학상 조성물의 예가 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 자케(Jacquet) 등의 미국 특허 번호 4,608,392, 게리아(Geria)의 미국 특허 번호 4,992,478, 스미스 등(Smith)의 미국 특허 번호 4,559,157 및 워츠만(Wortzman)의 미국 특허 번호 4,820,508을 참조할 수 있다.
본 발명의 화합물의 유용한 투여량은 그의 시험관내 활성, 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스, 및 다른 동물에서의 유효 투여량을 인간에게로 외삽하는 방법은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 4,938,949를 참조할 수 있다.
일반적으로, 액체 조성물, 예컨대, 로션 중 본 발명의 화합물(들)의 농도는 약 0.1-25 중량%, 바람직하게, 약 0.5-10 중량%일 것이다. 반고체 또는 고체 조성물, 예컨대, 겔 또는 분제 중 농도는 약 0.1-5 중량%, 바람직하게, 약 0.5-2.5 중량%일 것이다.
치료 용도로 사용하는 데 필요한 화합물, 그의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 특정 염 뿐만 아니라, 투여 경로, 치료되는 병증의 성질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 것이며, 궁극적으로는 간병의 또는 임상의의 재량에 따라 달라질 것이다.
그러나, 일반적으로 적합한 용량은 1일 체중 1 kg당 약 0.1 내지 약 100 mg 범위, 예컨대, 약 10 내지 약 75 mg 범위, 예컨대, 1일 수령자의 체중 1 kg당 3 내지 약 50 mg 범위, 바람직하게는, 6 내지 90 mg/kg/일 범위, 가장 바람직하게는 15 내지 60 mg/kg/일 범위가 될 것이다.
화합물은 예를 들어, 단위 투여 형태당 5 내지 1,000 mg, 알맞게 10 내지 750 mg, 가장 알맞게는, 50 내지 500 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투여 형태로 알맞게 투여된다.
이상적으로는, 활성 성분은 활성 화합물의 최고 혈장 농도가 약 0.5 내지 약 75 μM, 바람직하게는, 약 1 내지 50 μM, 가장 바람직하게는, 약 2 내지 약 30 μM이 달성될 수 있도록 투여되어야 한다. 이는 예를 들어, 임의로 염수 중 0.05 내지 5%의 활성 성분 액제를 정맥내로 주사하거나, 또는 약 1-100 mg의 활성 성분을 함유하는 볼루스로서 경구로 투여함으로써 달성될 수 있다. 약 0.01-5.0 mg/kg/hr를 제공하기 위해 연속 주입하거나, 약 0.4-15 mg/kg의 활성 성분(들)을 함유하는 것을 간헐적으로 주입함으로써 바람직한 혈중 수준을 유지시킬 수 있다.
바람직한 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격을 두고 투여되는 분할된 용량으로, 예를 들어, 1일당 2, 3, 4회 이상의 서브-용량으로 편리하게 제공될 수 있다. 서브-용량은 예컨대, 취입기로부터의 다중 흡입, 또는 여러 번에 걸친 눈으로의 점안 적용에 의해 다회에 걸쳐 분리식으로 느슨하게 이격되어 투여하기 위한 것으로 추가로 분할될 수 있다.
치료 방법
환자는 하기를 비롯한, 다양한 방법으로 치료될 수 있다:
백신 #1: 적절한 아주반트와 함께 대상체 내로 전달함으로써 (세포가 살아있기는 하지만, 사멸되어 가고 있고, 모두 사멸될 운명에 처하도록, 방사선 조사 및 열쇼크에 의해 유도된) 아폽토시스성 GBM6-AD 세포 투여.
백신 #2: 적절한 아주반트와 함께 대상체 내로 전달함으로써 (냉동 해동 또는 분무에 의해 유도된) GBM6-AD 세포 용해물 투여.
백신 #3: 적절한 아주반트와 함께 대상체 내로 전달함으로써 (세포가 살아있기는 하지만, 사멸되어 가고 있고, 모두 사멸될 운명에 처하도록, 방사선 조사 및 열쇼크에 의해 유도된) 아폽토시스성 GBM6-AD 세포로 감작된 수지상 세포 투여.
백신 #4: 적절한 아주반트와 함께 대상체 내로 전달함으로써 (냉동 해동 또는 분무에 의해 유도된) GBM6-AD 세포 용해물로 감작된 수지상 세포 투여.
백신 #5: 적절한 아주반트와 함께, GBM6-AD에 융합된 수지상 세포 투여 (세포 융합물 백신).
백신 #6: 적절한 아주반트와 함께, GBM6-AD에 융합된 B 세포 투여 (세포 융합물 백신).
백신 #7: 적절한 아주반트와 함께, GBM6-AD의 표면으로부터 유래된 산 용리된 펩티드의 투여.
백신 #8: 상기 중 하나 이상의 임의의 조합.
특정 실시양태에서, 백신을 다회 사이클을 위해 상기 기술된 바와 같은 용량 및 아주반트를 이용하여 피내로 또는 피하로 또는 림프절내로 주사한다.
특정 실시양태에서, 환자를 입양 세포 요법을 수단으로 치료한다. 특정 실시양태에서, 환자에게 GBM6-AD 용해물로 감작된 수지상 세포에 의해 프라이밍된 T 세포를 투여한다.
특정 실시양태에서, 환자를 GBM6-AD 항원에 특이적인 항체를 투여함으로써 치료한다.
GBM6 - AD 항체 및 GBM6 - AD 반응성 T 세포, 및 항- GBM6 - AD 항체 및 GBM6 - AD 반응성 T 세포 제조 방법
특정 실시양태에서, 자가 GBM6-AD로 감작된 수지상 세포로 프라이밍하여 배양물 중에서 GBM6-AD 반응성 T 세포를 생성하고, 표준 조직 배양 방법을 사용하여 확장시키고, 환자에게 투여한다. 요약하자면, 특정 실시양태에서, GBM6-AD를 직접 백신으로서 사용하거나, 또는 항체 또는 T 세포를 생성하는 데 간접적으로 사용하고, 이어서, 상기 항체 또는 T 세포를 직접 요법으로서 사용한다.
특정 실시양태에서, GBM6-AD에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 클로닝한다. 본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질인 항체로 이루어진 군, 즉, 군을 구성하는 항체가 소량으로 존재하는 천연적으로 발생된 돌연변이체를 제외하면 균질인 것인 항체군으로부터 수득된 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대하여 고도로 특이성이고, 그와 상호작용한다. 추가로, 각 모노클로날 항체는, 전형적으로는 다양한 항원 결정기에 대한 다양한 항체를 포함하는 일반 폴리클로날 항체 제제와 비교하여, 항원 상의 단일 항원 결정기 (에피토프)를 표적화한다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린으로 오염되지 않은 하이브리도마 배양물로부터 제조된다는 점에서 이롭다.
"모노클로날"이라는 형용사는 실질적으로 균질인 항체 군으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내는 것이며, 특정 방법에 의해 제조된 항체를 명시하는 것이 아니다. 예를 들어, 본 발명에 의해 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]) 또는 재조합 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다 (문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991]). 본 발명의 모노클로날 항체는 특별히, 중쇄 (H) 및/또는 경쇄 (L)의 일부가 특정 종 또는 특정 항체 또는 서브부류로부터 유래된 것이고, 상기 쇄의 나머지 부분은 또 다른 종, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류로부터 유래된 것인, "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다. 추가로, 돌연변이체 항체 및 그의 항체 단편 또한 본 발명에 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984]).
본원에서 사용되는 바, "돌연변이체 항체"라는 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 있는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 항체를 의미한다. 예를 들어, 생물학적 특성, 예컨대, 항원 결합을 개선시키기 위해 항체의 가변 영역을 변형시킬 수 있다. 그러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발법 (문헌 [see Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)]), PCR-기반 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법 등에 의해 달성될 수 있다. 상기 돌연변이체는 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한, 더욱 바람직하게는, 75% 이상, 더욱더 바람직하게는, 80% 이상, 더욱더 바람직하게는, 85% 이상, 더욱더 바람직하게는, 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "서열 동일성"이라는 용어는 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 서열 동일성을 최대화시키기 위해 갭을 적절히 도입한 후, 항체 원래의 아미노산 서열의 것과 동일한 잔기의 비율(%)로서 정의된다.
구체적으로, 알고리즘 BLAST을 사용하여 한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 또 다른 것에 대한 동일성을 측정할 수 있다 (문헌 [Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993)]). 프로그램, 예컨대, BLASTN 및 BLASTX는 상기 알고리즘에 기초하여 개발되었다 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990]). BLAST에 기초하여 BLASTN에 따라 뉴클레오티드 서열을 분석하기 위해, 파라미터, 예를 들어, 스코어=100 및 워드길이=12로 설정한다. 한편, BLAST에 기초하여 BLASTX에 의해 아미노산 서열에 대하여 분석하는 데 사용되는 파라미터는 예를 들어, 스코어=50 및 워드길이=3을 포함한다. BLAST 및 갭이 있는(Gapped) BLAST 프로그램을 사용할 경우, 각 프로그램에 대한 디폴드 파라미터가 사용된다. 상기 분석을 위한 구체적인 기법은 당업계에 공지되어 있다 (국립 생물 기술 정보 센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information), 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool)의 웹 사이트; http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
폴리클로날 및 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체는 하기 기술되는 방법에 의해 제조될 수 있다.
동물 면역화를 위해 사용하고자 하는 GBM6-AD로는 용해되고 방사선 조사된 GBM6-AD 세포를 포함한다. 면역화용 항원으로서의 GBM6-AD 세포는 변형되지 않고 사용될 수 있거나, 또는 캐리어 분자와의 접합 이후에 사용될 수 있다. 캐리어 분자가 사용될 경우, 예를 들어, GBM6-AD 세포를 먼저 캐리어 분자와 커플링시킨 후, 아주반트를 그에 첨가한다. 그러한 아주반트로는 알룸(Alum), 프로인트(Freund's) 완전 및 불완전 아주반트 등을 포함하며, 그중 임의의 것은 함께 조합될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 제조된 항원이 포유동물, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 기그, 말, 원숭이, 염소, 및 양에게 제공된다. 상기 면역화는 전형적으로 사용되는 정맥내 주사, 피하 주사, 및 복강내 주사를 비롯한, 임의의 기존 방법에 의해 수행될 수 있다. 면역화 간격에 있어서는 어떤 제한도 없다. 면역화는 수일 내지 수주 간격, 바람직하게는 4 내지 21일 간격으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 항원 단백질을 10 내지 100 ㎍ (예를 들어, 20 내지 40 ㎍)의 단일 용량으로 하여 마우스를 면역화시킬 수 있지만, 상기 용량을 상기 값으로 제한되지 않는다.
1차 면역화 이전, 및 2차 및 후속 면역화 이후 3 내지 7일째에 동물로부터 혈액을 채취하고, 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 면역 반응을 촉진시키기 위해, 응집제, 예컨대, 알룸을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 선택된 포유동물 항체는 충분히 높은 항원 결합 친화도를 가진다. 항체 친화도는 포화 결합 검정법, 효소 결합된 면역흡착 검정법 (ELISA), 또는 경쟁적 검정법 (예를 들어, 방사면역검정법)을 사용하여 측정될 수 있다.
폴리클로날 항체는 종래 가교 결합 분석법, 예컨대, 문헌 ["Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Harlow and David Lane edit. (1988))"]에 기술되어 있는 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 대체 방법으로는 예를 들어, 에피토프 지도화 문헌 [(Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995))]가 있다. 폴리펩티드 또는 항체 역가를 측정하는 바람직한 방법으로는 항체-결합 친화도를 정량화하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체-결합 친화도를 측정하는 방법 이외에도, 또는 그 대신 항체의 하나 이상의 생물학적 특성을 평가하는 방법 또한 사용된다. 상기 분석 방법은 항체의 치료학적 유효성을 입증하기 때문에 특히 유용하다. 상기 분석법에서 항체가 개선된 특성을 보일 경우, 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로 그의 결합 친화도는 증진된 것이다.
모노클로날 항체를 제조하는 데 사용되는 하이브리도마는 예를 들어, 문헌 [Milstein et al. (Kohler, G., and Milstein, C, Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46)]의 방법에 의해 수득할 수 있다. 항체-생산 세포와 융합시키고자 하는 골수종 세포는, 일반적으로 당업자에게 이용가능한 각종 동물 중 임의의 것, 예컨대, 마우스, 래트, 및 인간으로부터 유래된 세포주일 수 있다. 사용하고자 하는 세포주는 약물-내성이고, 비융합 상태에서는 선택 배지 (예컨대, HAT 배지) 중에서 생존할 수 없지만, 융합 상태에서는 생존할 수 있다. 8-아자구아닌-내성 세포주가 일반적으로 사용되는데, 이는 히포크산틴-구아닌-포스포리보실 트랜스퍼라제가 부족하고, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지 중에서는 성장할 수 없다. 골수종 세포로는 공지의 다양한 세포주, 예를 들어, P3x63Ag8.653 (문헌 [J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550]), P3x63Ag8U.1 (문헌 [Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7]), NS-1 (문헌 [Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519]), MPC-11 (문헌 [Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8: 405-415]), SP2/0 (문헌 [Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270]), F0 (문헌 [de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21]), S194 (문헌 [Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323]), R210 (문헌 [Galfre, G. et al, Nature (1979) 277: 131-133]), 및 P3U1 (문헌 [J. Exp. Med. 1979, 150:580]; [Curr Top Microbiol. Immunol. 1978, 81:1])을 포함한다. 인간 모노클로날 항체를 제조하는 데 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주 또한 사용될 수 있다 (문헌 [Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]). 예를 들어, 최종 면역화 후 2 내지 3일 경과하였을 때 희생된 동물로부터 항체-생산 세포를 수집하였다. 항체-생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 및 말초 혈액 세포를 포함한다. 비장 세포가 일반적으로 사용된다. 구체적으로, 조직, 예컨대, 비장 또는 림프절을 상기 기술된 각종 동물로부터 절개해 내거나, 수집한다. 이어서, 조직을 파쇄시키고, 생성된 물질을 배지 또는 완충제, 예컨대, PBS, DMEM, 또는 RPMI1640 중에 현탁시킨 후, 스테인레스 메쉬 등을 이용하여 여과한다. 이어서, 이를 원심분리하여 관심의 대상이 되는 항체-생산 세포를 수득한다.
이어서, 상기 기술된 골수종 세포와 항체-생산 세포를 융합시킨다. 세포 융합은 융합 촉진제의 존재하에 30 내지 37℃에서 1 내지 15분 동안 동물 세포 배양용 배지, 예컨대, MEM, DMEM, 및 RPMI-1640 중에서 골수종 세포를 항체-생산 세포와 1:1 내지 1:20의 비율로 접촉시킴으로써 달성된다. 세포 융합을 촉진시키기 위해, 상업적으로 이용가능한 세포 융합 장치를 이용하고, 융합 촉진제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (평균 분자량 1,000 내지 6,000 (Da)) 또는 폴리비닐 알콜, 또는 융합용 바이러스, 예컨대, 센다이(Sendai) 바이러스를 이용함으로써 항체-생산 세포와 골수종 세포를 융합시킬 수 있다.
관심의 대상이 되는 하이브리도마는 세포 융합 후 세포로부터 선택된다. 선택 방법은 선택 배지 중에서의 세포의 선택적 증식을 이용하는 방법을 포함한다. 구체적으로, 세포 현탁액을 적절한 배지로 희석시킨 후, 세포를 마이크로타이터 플레이트 상에 플레이팅한다. 분취량의 선택 배지 (예를 들어, HAT 배지)를 각 웰에 첨가한 후, 선택 배지를 적절히 교체해 주면서 세포를 배양한다. 그 결과, 성장한 세포를 하이브리도마로서 구체할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al. (Nature 348:552-554 (1990))]에 보고된 기법을 사용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 문헌 [Clackson et al. (Nature 352:624-628 (1991))] 및 [Marks et al. (J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))]에는 파지 라이브러리로부터 마우스 및 인간 항체를 각각 단리시키는 것이 보고되어 있다. 쇄 셔플링에 기초하여 고 친화도 (nM 범위의) 인간 항체를 제조하는 것 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]), 및 대규모 파지 라이브러리를 구축하는 방법인, 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 21 :2265-2266 (1993)])을 기술한 보고 또한 존재한다. 이러한 기술은 또한 모노클로날 항체 제조를 위한 종래의 하이브리도마 기술을 사용하는 것 대신 모노클로날 항체를 단리시키는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 교모세포종 요법을 제공하는 항체이다.
수득된 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 표준 세포 배양 방법, 및 복수 생산을 포함하는 방법을 포함한다. 세포 배양 방법에서, 하이브리도마를 동물 세포용 배양 배지, 예컨대, 10 내지 20% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 또는 MEM, 또는 무혈청 배지 중 표준 배양 조건하에서 (예를 들어, 5% CO2 대기하에 37℃에서) 2 내지 14일 동안 배양한 후, 배양물 상청액으로부터 항체를 제조한다. 복수 생산을 포함하는 방법에서, 골수종 세포의 유래되는 것과 동일한 종의 포유동물 개체의 복막강에 하이브리도마를 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 이어서, 1 내지 4주 후 복수 또는 혈청을 수집한다. 복수 생산을 증진시키기 위해, 예를 들어, 프리스탄 (2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸)을 복막강에 사전 투여할 수 있다.
공지된 방법, 예컨대, 단백질 A-세파로스 방법, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 술페이트를 이용하는 염석 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 및 친화도 크로마토그래피로부터 적절히 선택된 방법에 의해, 또는 상기 방법의 조합된 사용에 의해 본 발명에서 사용하고자 하는 항체를 정제할 수 있다.
본 발명은 유전자 조작에 의해 제조된 재조합 항체를 사용할 수 있다. 상기 기술된 방법에 의해 수득된 항체를 코딩하는 유전자를 하이브리도마로부터 단리시킨다. 유전자를 적절한 벡터 내로 삽입한 후, 숙주 내로 도입한다 (예컨대, 문헌 [Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, Published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd, 1990] 참조). 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 구체적으로, 역전사 효소를 사용하여, 항체의 가변 영역 (V 영역)을 코딩하는 cDNA를 하이브리도마의 mRNA로부터 합성한다. 관심의 대상이 되는 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 수득한 후, 이를 항체의 원하는 불변 영역 (C 영역)을 코딩하는 DNA와 결찰시키고, 생성된 DNA 구축물을 발현 벡터 내로 삽입한다. 별법으로, 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 이는 유전자가 발현 조절 영역, 예를 들어, 인핸서 및 프로모터의 조절하에 발현될 수 있도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 이어서, 숙주 세포를, 항체를 발현하는 발현 벡터로 형질전환시킨다. 본 발명은 본 발명의 항체를 발현하는 세포를 제공한다. 본 발명의 항체를 발현하는 세포는 상기 항체의 유전자로 형질전환된 세포 및 하이브리도마를 포함한다.
본 발명에서, 인간에 대한 이종 항원성을 감소시키기 위해 인공적으로 변형시킨 재조합 항체가 사용될 수 있다. 그 예로 키메라 항체 및 인간화된 항체를 포함한다. 이렇게 변형된 항체는 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 키메라 항체는 서로 상이한 종의 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체, 비인간 포유동물, 예컨대, 마우스의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 인간의 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 상기 항체는 (1) 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체의 불변 영역을 코딩하는 DNA에 결찰시키고; (2) 이를 발현 벡터 내로 혼입하고; (3) 상기 벡터를 항체 제조를 위한 숙주 내로 도입함으로써 수득할 수 있다.
재성형된 인간 항체로도 불리는 인간화된 항체는 비인간 포유동물, 예컨대, 마우스의 항체의 H 또는 L쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 항체의 CDR로 치환함으로써 수득된다. 상기 항체의 제조를 위한 종래의 유전자 재조합 기법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988]); [Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)] 참조). 구체적으로, 마우스 항체의 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역 (FR)과 결찰시키기 위해 디자인된 DNA 서열은, 올리고뉴클레오티드의 말단에 중복부를 포함하도록 구축된 수개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 합성된다. 인간화된 항체는 (1) 생성된 DNA를, 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 DNA에 결찰시키고; (2) 이를 발현 벡터 내로 혼입하고; (3) 벡터를 숙주 내로 형질감염시켜 항체를 제조함으로써 수득될 수 있다 (유럽 특허 출원 번호 EP 239,400, 및 국제 특허 출원 번호 WO 96/02576 참조). 바람직한 항원-결합 부위를 형성하는 것인 CDR을 통해 결찰된 인간 항체 FR이 선택된다. 인간화된 항체는 수용체 항체 내로 CDR 중에 포함되지 않고, 프레임워크 서열 중에도 포함되지 않은 추가의 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다. 그러한 아미노산 잔기는 보통 항원을 인식하고, 그에 결합할 수 있는 항체의 능력을 더욱 정확하게 최적화시키기 위해 도입된다. 예를 들어, 필요에 따라, 재성형된 인간 항체의 CDR이 적절한 항원-결합 부위를 형성할 수 있도록 항체 가변 영역의 프레임워크 영역 중의 아미노산을 치화시킬 수 있다 (문헌 [Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856]).
인간 항체를 수득하는 방법 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 항원-결합 활성을 가진 원하는 인간 항체는 (1) 시험관내에서 인간 림프구를 관심의 대상이 되는 항원 또는 관심의 대상이 되는 항원을 발현하는 세포로 감작시키고; (2) 감작된 림프구를 인간 골수종 세포, 예컨대, U266과 융합시킴으로써 수득할 수 있다 (일본 심사된 공개 특허 출원 번호 (JP-B) Hei 1-59878 참조). 별법으로, 필요에 따라서 인간 항체는 또한 항원을 사용하여 인간 항체 유전자의 부분적인 또는 전체 레퍼토리를 포함하는 트랜스제닉 (Tg) 동물을 면역화시킴으로써 수득할 수 있다 (문헌 [Nature Genetics 7:13-21 (1994)]; [Nature Genetics 15:146-156 (1997)]; [Nature 368:856-859 (1994)]; 국제 특허 출원 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, 및 WO 96/33735 참조). 구체적으로, 상기 Tg 동물은 하기와 같이 생성한다: 넉아웃 동물 또는 Tg 동물을 생성하거나, 또는 상기 동물을 교배시킴으로써 내인성 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 유전자좌는 파괴되고, 대신 인간 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터 등을 통해 도입되어 있는 비인간 포유동물을 수득할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 예를 들어, J 영역 또는 C 영역 (예컨대, Cμ 영역) 중의 특정 부위에 결함을 도입함으로써 기능적으로 불활성화될 수 있다. 면역글로불린 경쇄 (예컨대, κ 쇄)는 예를 들어, J 영역 또는 C 영역, 또는 J 및 C 영역을 포함하는 영역 중의 특정 부위에 결함을 도입함으로써 기능적으로 불활성화될 수 있다.
상기 인간화된 항체는 또한 유전자 조작 기술을 사용하여 항체의 중쇄 및 경쇄, 각각을 코딩하는 cDNA, 또는 바람직하게는 상기 cDNA를 포함하는 벡터로 진핵 세포를 형질전환시킨 후, 재조합 인간 모노클로날 항체를 제조하는 형질전환된 세포를 배양함으로써 배양물 상청액으로부터 수득될 수 있다. 숙주는 예를 들어, 원하는 진핵 세포, 바람직하게, 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, 림프구, 및 골수종이다.
추가로, 인간 항체 라이브러리를 이용하여 패닝함으로써 인간 항체를 수득하는 기법이 공지되어 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 방법을 사용하여 파지 표면 상에 단일 쇄 항체 (scFv)로서 인간 항체의 가변 영역을 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선별할 수 있다. 선별된 파지의 유전자를 분석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 밝혀낼 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 확인되었다면, 상기 서열을 포함하는 적절한 발현 벡터를 구축할 수 있고, 이어서, 적절한 숙주 내로 도입하고, 발현시켜 인간 항체를 수득할 수 있다. 상기 방법은 이미 주지되어 있다 (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, 및 WO 95/15388 참조).
항체 유전자를 단리시키고, 적절한 숙주 내로 도입하였을 때, 숙주 및 발현 벡터를 적절히 조합하여 항체를 제조할 수 있다. 진핸 세포로서 숙주 세포, 동물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포가 사용될 수 있다. 동물 세포로는 (1) 포유동물 세포, 예컨대, CHO, COS, 골수종, 새끼 햄스터 신장 (BHK), HeLa, 및 Vero 세포; (2) 양서류 세포, 예컨대, 제노푸스(Xenopus) 난모세포; 또는 (3) 곤충 세포, 예컨대, sf9, sf21, 및 Tn5, 또는 누에를 포함한다. 공지된 식물 세포로는 니코티아나(Nicotiana) 속, 예컨대, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)으로부터 유래된 세포를 포함하며, 이는 캘러스 배양될 수 있다. 공지된 진균 세포로는 효모, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아애(Saccharomyces cerevisiae), 및 사상 진균, 예컨대, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 예를 들어, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 포함한다. 원핵 세포는 또한 박테리아 세포를 이용하는 생산 시스템에서 사용될 수 있다. 공지된 박테리아 세포로는 E. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다. 항체는 형질전환을 이용하여 관심의 대상이 되는 항체 유전자를 상기 세포로 전이시킨 후, 형질전환된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 항체의 이소형은 제한되지 않는다. 이소형으로는 예를 들어, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), IgM, IgA (IgA1 및 IgA2), IgD, 및 IgE를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 항원 결합을 담당하는 일부를 포함하는 항체 단편, 또는 그의 변형된 단편일 수 있다. "항체 단편"이라는 용어는 전장의 항체의 일부를 의미하며, 일반적으로는 항원-결합 도메인 또는 가변 영역을 포함하는 단편을 의미한다. 상기와 같은 항체 단편으로는 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 적절한 링커로 함께 커플링된 중쇄 Fv 및 경쇄 Fv를 포함하는 단일 쇄 Fv (scFv), 디아바디 (디아바디들), 선형 항체, 및 항체 단편으로부터 제조된 다중특이성 항체를 포함한다. 이전에는 천연 항체를 프로테아제로 분해시킴으로써 항체 단편을 제조하였으며; 현재는 유전자 조작 기법을 사용하여 항체 단편을 재조합 항체로서 발현시키는 방법 또한 공지되어 있다 (문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]; [Co, M. S. et al., J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976]; [Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.]; [Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.]; [Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669]; [Bird, R. E. et al., TIBTECH, 1991, 9, 132-137] 참조).
"Fv" 단편이 가장 작은 항체 단편이며, 이는 완전한 항원 인식 부위 및 결합 부위를 포함한다. 상기 영역은 중쇄 및 경쇄, 각각의 가변 영역이 비공유 결합에 의해 강력하게 연결되어 있는 이량체 (VH-VL 이량체)이다. 각 가변 영역의 3개의 CDR이 서로 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 형성한다. 다시 말해, 중쇄 및 경쇄로부터의 총 6개의 CDR이 함께 항체의 항원-결합 부위로서의 기능을 한다. 그러나, 비록 가변 영역 단독의 친화도는 전체 결합 부위의 친화도보다는 낮기는 하지만, 가변 영역 (또는 오직 3개의 항원-특이 CDR만을 함유하는 Fv 절반부)만이 단독으로 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체 단편은 Fv 단편이지만, 그로 한정되는 것은 아니다. 상기와 같은 항체 단편은 보존되는 중쇄 또는 경쇄 CDR의 항체 단편을 포함하고, 그의 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다.
Fab 단편 (이는 또한 F(ab)로도 지칭됨)은 또한 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역 (CH1)을 포함한다. 예를 들어, 항체의 파파인 분해를 통해 하기 2종의 단편이 생성된다: 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 함유하며, 단일 항원-결합 도메인으로서의 역할을 하는, Fab 단편으로 불리는 항원-결합 단편; 및 쉽게 결정화되기 때문에 "Fc"로 불리는 남은 일부. Fab' 단편은 또한 항체의 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 중쇄 CH1 영역의 카르복실 말단으로부터 유래된 수개의 잔기를 또한 가지고 있다는 점에서 Fab 단편과는 상이하다. 그러나, Fab'와 Fab, 둘 모두가 단일 항원-결합 도메인으로서의 역할을 하는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단편이라는 점에서 Fab' 단편은 Fab와 구조상으로는 등가한 것이다. 여기서, 단일 항원-결합 도메인으로서의 역할을 하는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하고, 파파인 분해에 의해 수득된 것과 등가인 것인 항원-결합 단편은, 심지어 프로테아제 분해에 의해 제조된 항체 단편과 동일하지 않을 때에도 "Fab-유사 항체"로서 지칭된다. Fab'-SH는 그의 불변 영역 중 유리 티올기를 가지는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 Fab'이다. F(ab') 단편은 F(ab')2의 힌지 영역 중 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 절단함으로써 제조된다. 화학적으로 가교 결합된 다른 항체 단편 또한 당업자에게 공지되어 있다. 항체를 펩신으로 분해하면 하기와 같은 2개의 단편이 제조된다; 하나는 2개의 항원-결합 도메인을 포함하며, 항원과 교차 반응하는 것인 F(ab')2 단편이고, 나머지 다른 하나는 나머지 단편 (이는 pFc'로도 지칭됨)이다. 여기서, 펩신 분해에 의해 수득되는 것과 등가의 것인 항체 단편은, 그가 2개의 항원-결합 도메인을 포함하고, 항원과 교차 반응할 수 있을 경우에는 "F(ab')2-유사 항체"로서 지칭된다. 상기 항체 단편은 또한 예를 들어, 유전자 조작에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체 단편은 또한 예를 들어, 상기 기술된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, F(ab')2-SH 단편은 숙주, 예컨대, E. 콜라이로부터 직접 회수된 후, 화학적 가교 결합에 의해 F(ab')2 단편으로 형성될 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]). 대안적 방법에서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주의 배양물로부터 직접 단리될 수 있다.
"디아바디 (Db)"라는 용어는 유전자 융합에 의해 구축된 2가 항체 단편을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)], EP 404,097, WO 93/11161). 일반적으로, 디아바디는 두 폴리펩티드 쇄의 이량체이다. 각 폴리펩티드 쇄에서, 동일 쇄에서 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)은 짧은 링커, 예를 들어, 약 5개의 잔기로 이루어진 링커를 통해 연결되어 있으며, 이로써 상기 두 영역은 함께 결합할 수 없다. 둘 간의 링커가 너무 짧기 때문에, 동일 폴리펩티드 쇄 중의 VL 및 VH는 단일 쇄 V 영역 단편을 형성할 수는 없지만, 대신 이량체는 형성할 수 있다. 따라서, 디아바디는 2개의 항원-결합 도메인을 가진다. 2가지 유형의 항원 (a 및 b)에 대한 VL 및 VH 영역이 조합되어 약 5개의 잔기로 이루어진 링커를 통해 VLa-VHb 및 VLb-VHa를 형성한 후, 공발현되었을 때, 이는 이중특이성 Db로서 발현된다. 본 발명의 항체는 상기 Db일 수 있다.
단일 쇄 항체 (이는 또한 "scFv"로도 지칭됨)는 항체의 중쇄 V 영역 및 경쇄 V 영역을 연결시킴으로써 제조될 수 있다 (scFv에 대한 리뷰를 위해, 문헌 [Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds. Rosenburg and Moore, Springer Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)] 참조). 단일 쇄 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778; 5,260,203; 5,091,513; 및 5,455,030 참조). 상기와 같은 scFv에서, 중쇄 V 영역 및 경쇄 V 영역은 링커, 바람직하게, 폴리펩티드 링커를 통해 함께 연결된다 (문헌 [Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883]). scFv에서 중쇄 V 영역 및 경쇄 V 영역은 동일 항체로부터, 또는 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. V 영역을 결찰시키는 데 사용되는 펩티드 링커는 12 내지 19개의 잔기로 이루어진 임의의 단일 쇄 펩티드일 수 있다. scFv를 코딩하는 DNA는 주형으로서 전체 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 중쇄의 V 영역을 코딩하는 DNA, 및 상기 항체의 경쇄 또는 경쇄의 V 영역을 코딩하는 DNA로부터 선택되는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 부분적인 DNA를 사용하고; 두 말단을 정의하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 이어서, 추가의 증폭은 펩티드 링커 부위를 코딩하는 DNA의 조합, 및 각각 중쇄 및 경쇄에 결찰시키고자 하는, DNA의 양 말단을 정의하는 프라이머 쌍을 사용하여 수행될 수 있다. scFv를 코딩하는 DNA를 구축한 후, 종래 방법을 사용하여 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 수득할 수 있다. 추가로, 생성된 숙주를 사용하여 종래 방법에 따라 scFv를 수득할 수 있다. 상기 항체 단편은 상기 개요된 바와 같이 항체 단편을 코딩하는 유전자를 수득하고, 이를 발현시킴으로써 숙주에서 제조할 수 있다. 다양한 유형의 분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 결합된 항체가 변형된 항체로서 사용될 수 있다. 항체를 변형시키는 방법은 이미 당업계에 확립되어 있다. 본 발명에서 "항체"라는 용어 또한 상기 기술된 항체를 포함한다.
수득된 항체는 균질성을 띨 때까지 정제될 수 있다. 항체는 단백질을 단리시키고 정제하는 데 통상적으로 사용되는 방법에 의해 단리되고 정제될 수 있다. 항체는 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석법, 투석, 분취용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 등전 포커싱으로부터 적절히 선택되는 하나 이상의 방법을 조합하여 사용함으로써 단리되고 정제될 수 있다 (문헌 [Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)]; [Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow-and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]). 상기 방법은 상기 열거된 것으로 한정되지 않는다. 크로마토그래피 방법으로는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다. 상기 크로마토그래피 방법은 액상 크로마토그래피, 예컨대, HPLC 및 FPLC를 사용하여 수행될 수 있다. 친화도 크로마토그래피에서 사용하고자 하는 칼럼으로는 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼을 포함한다. 예를 들어, 단백질 A 칼럼으로는 히퍼 D, 포로스(Hyper D, POROS), 및 세파로스 F. F.(Sepharose F. F.) (파마시아(Pharmacia))를 포함한다. 항체는 또한, 항원이 그 위에 고정화되어 있는 것인 캐리어를 사용함으로써 항원 결합을 이용하여 정제될 수 있다.
본 발명의 항체는 표준 방법에 따라 제제화될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 제약상 허용되는 담체 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체, 및 제약상 허용되는 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 조성물 (시약 및 제약 포함)에 관한 것이다. 예시적인 담체로는 계면활성제 (예를 들어, PEG 및 트윈(Tween)), 부형제, 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산), 착색제, 향미제, 보존제, 안정제, 완충화제 (예를 들어, 인산, 시트르산, 및 다른 유기산), 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA), 현탁화제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 유동 촉진제, 및 교정제를 포함한다. 그러나, 본 발명에서 사용될 수 있는 담체는 상기 목록으로 한정되는 것은 아니다. 사실상, 보편적으로 사용되는 다른 담체: 경질 무수 규산, 락토스, 결정질 셀룰로스, 만니톨, 전분, 카르멜로스 칼슘, 카르멜로스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 폴리비닐아세트알디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중간 쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 60, 수크로스, 카르복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 무기 염 등이 적절하게 사용될 수 있다. 조성물은 또한 다른 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 및 면역글로불린, 및 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스프라긴, 아르기닌, 및 리신을 포함할 수 있다. 조성물이 주사용 수성 액제로서 제조되는 경우, 이는 예를 들어, 생리식염수, 덱스트로스, 및 예를 들어, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화나트륨을 비롯한, 다른 아주반트를 포함하는 등장성 용액을 포함할 수 있으며, 이는 또한 적절한 가용화제, 예를 들어, 알콜 (예를 들어, 에탄올), 폴리알콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜 및 PEG), 및 비-이온성 계면활성제 (폴리소르베이트 80 및 HCO-50)를 함유할 수 있다.
필요할 경우, 본 발명의 항체는 마이크로캡슐 (히드록시셀룰로스, 젤라틴, 폴리메틸메타크릴레이트 등으로 제조된 마이크로캡슐)로 캡슐화되고, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자, 및 나노캡슐)의 성분으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)] 참조). 추가로, 서방형 약물을 제조하는 방법은 공지되어 있고, 이는 본 발명의 항체에 적용될 수 있다 (문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)]; [Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)]; 미국 특허 번호 3,773,919; EP 특허 출원 번호 58,481; [Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)]; EP: 133,988).
상기 기술된 본 발명의 항체는 교모세포종을 앓는 개체 치료에 사용될 수 있다.
하기 실시예는 예시적인 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 발명자들은 주로 소아기 및 청소년기 동안에 발생하는 치명적인 뇌 종양인 미만성 내인성 뇌교 신경교종 (DIPG)의 치료를 위해 이미퀴모드 및 뇌 종양 개시 세포 (BTIC) 백신을 이용하는 면역요법을 사용하는 신규한 요법을 개발하였다. DIPG 대부분의 조직학적 성질은 다형 교모세포종 (GBM), WHO IV 등급 이다 (문헌 [Tsuchida T, Shimbo Y, Fukuda M, et al. Computed tomographic and histopathological studies of pontine glioma. Child's Nerv Syst. 1985; 1:223- 229]). 이전 경험을 통해 DIPG는 방사선 요법에 반응은 하지만, 이는 일시적인 것으로 밝혀졌다. 상기 종양을 앓는 아동들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 아주반트 화학요법 및/또는 동시 방사선 감작제 사용을 통해 결과를 유의적으로 개선시키고자 한 시도가 현재까지는 실패로 이어졌다 (문헌 [Frazier JL, Lee J, Ulrich WT, et al. Treatment of diffuse brainstem gliomas: failed approaches and future strategies. J Neurosurg Pediatrics. 2009;3:259-269]). 미국 중앙 뇌종양 등록 기관(CBTRUS: The Central Brain Tumor Registry of the United States)의 통계에 따르면, 0 내지 19세 연령군에서 뇌간 종양의 연간 발병률은 새해에는 450건이 넘을 것으로 예상된다. 이중, 360건 초과의 사례가 악성 DIPG를 앓는 아동 및 청소년에서의 것으로 예상된다 (Central Brain Tumor registry of the United States. Retrieved 2009 Jul 16, from Reports and Tables web site: http://cbtrus.org/reports/2009-NPCR-04-05/CBTRUS-NPCR2004-2005-Report-.pdf. 2009). 상기 청소년 중 생존할 것으로 예상되는 사람은 거의 없다. 본 요법을 통해 상기 질환을 앓는 청소년 간의 생존은 증가하였다.
수지상 세포 (DC)가 항원을 제시하고, 적응 면역 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 발견을 통해 그를 조작함으로써 GBM을 치료할 수 있다는 가능성이 열리게 되었다. 2000년 리아우(Liau) 등은 신경교종 환자를 위해 종양 펩티드로 감작된 DC 백신화를 최초로 사용한 것을 공개하였고; 상기 연구에서는 질환 진행에도 불구하고 종양-반응성 T 세포가 문서로 입증되었다 (문헌 [Liau LM, et al. Treatment of a patient by vaccination with autologous dendritic cells pulsed with allogeneic major histocompatibility complex class I-matched tumor peptides. Case Report. Neurosurg Focus. 2000;9:e8]). 이후, 종양 용해물로 감작된 자가 DC로 GBM 환자를 백신화함으로써 항원-특이 CD8+ T 세포를 유도할 수 있고, 표준 요법을 받은 역사상의 대조군 환자의 경우는 30주인 것과 비교하였을 때, 중앙 생존 기간은 133주로 연장될 수 있었다 (문헌 [Yu JS, et al. Vaccination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Research. 2004;64:4973-4979]). 야마나카(Yamanaka) 등은 I/II상 임상 시험에서 종양 용해물로 감작된 DC를 진피하 주사한 후, 또는 종양내 및 진피하 백신화를 동시에 수행한 후 유사한 결과를 얻었다고 보고하였다. 4명의 환자는 임상 반응을 보였고, 10명은 종양 안정화를 보였으며, 10명은 종양 진행을 보였다 (문헌 [Yamanaka R, et al. Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma: results of a clinical phase I/II trial. Clin Cancer Res. 2005;11:4160-4167]). 최근 II상 연구에서, DC 백신화에 대한 반응으로 IFN-γ를 생성하는 CTL의 능력은 임상 반응 및 전체 생존 기간과 유의적인 상관관계가 있었다 (문헌 [Wheeler CJ, et al. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cancer Research. 2008;68:5955-5964]). 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 대부분의 환자들은 결국에는 그의 질환으로 쓰러진다. 면역요법이 구체적으로 방사선에 내성인 뇌 종양 개시 세포를 표적화하도록 디자인된다면 이는 더 큰 성공을 거둘 것이다.
뇌 종양 개시 세포: 마커 및 면역요법에 대한 영향
지난 15년 동안에 걸쳐 수행된 연구를 통해 이종성 세포 집단이 한 종양을 포함하는데, 그중 오직 한 서브세트만이 자가 재생, 종양 개시, 및 부분적인 분화를 할 수 있다는 것이 제안되었다 (문헌 [Beachy PA, Karhadkar SS, Berman DM. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature. 2004;432:324-331]에서 리뷰). 종양 개시 세포의 존재는 1990년대 급성 골수성 백혈병 (문헌 [Lapidot T, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994:367:645-648]; [Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 1997;3:730-737])에서, 그리고 아주 최근에는 원발성 뇌 종양, 예컨대, 교모세포종 및 수모세포종에서 확고하게 확립되었다 (문헌 [Ignatova TN, et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 2002;39:193-206]; [Singh SK, et al., Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401]; [Singh SK, et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 2003;63:5821-5828]; [Galli R, et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Research. 2004;64:7011-7021]; [Li MC, et al. Isolation and characterization of brain tumor stem cells in human medulloblastoma. Ai Zheng. 2006;25:241-246). 이는 뇌 종양 개시 세포 (BTIC)에 대한 마커로서 사용되어 온, 조혈 및 신경 줄기 세포에서 발현되는 120 kDa의 막횡단 당단백질이다. 싱(Singh) 등은 겨우 100개 정도의 적은 개수의 CD133+ 신경교종 세포가 면역결핍 마우스에서 종양을 형성할 수 있는 반면, 같은 벌크한 종양 종괴로부터 단리된 100,000개의 CD133- 종양 세포는 생착은 되었지만, 종양을 형성하지는 못하였다는 것을 입증하였다 (문헌 [Singh SK, et al., Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401]). 추가로, 종양 종괴 중 CD133+ 세포의 비율은 재발 환자에서는 증가하였고, CD133 발현은 이제 저등급 신경교종에서의 질환 진행을 예측하는 데 사용되고 있다 (문헌 [Zeppernick F, et al. Stem Cell Marker CD133 Affects Clinical Outcome in Glioma Patients. Clin Cancer Res. 2008;14:123-129]). 그러나, 신경교종의 서브세트로부터의 CD133- 세포가 종양 개시성을 띠기 때문에 CD133이 BTIC에 대한 유일의 마커는 아니다 (문헌 [Beier D, et al. CD133+ and CD133- Glioblastoma-Derived Cancer Stem Cells Show Differential Growth Characteristics and Molecular Profiles. Cancer Research. 2007;67:4010-4015]). 리(Lee) 등은 BTIC에 대한 중요한 기준 (적은 세포 개수에서의 종양 개시)을 충족시키는, 인간 GBM으로부터 단리된 네스틴+Sox-2+ 세포를 확인하였다 (문헌 [[Lee J, et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 2006;9:391-403]). 상기 CD15+ BTIC는 마우스 뇌 내로 이식되었을 때 침습성이 매우 큰 종양을 형성하였고, 그의 유전자 발현 시그니처는 원발성 종양의 것과 매우 유사하였다 (문헌 [Lee J, et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell . 2006;9:391-403]). 비록 CD133 및 Sox-2가 유용한 마커이기는 하지만, 그 자체에 의해 항상 종양 개시를 예측할 수 있는 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, CD133을 발현하는 세포는 특히 방사선 및 화학요법으로부터 우선적으로 생존하는 것으로 보여지며, 이에, 면역요법에 의해 상기 세포를 표적화하는 것이 매우 중요시된다. 상기 연구로부터 출현한 중요한 개념은 뇌 종양이 제한된 종양형성의 가능성을 가진 벌크한 종양 세포 및 BTIC로 이루어져 있다는 것이다. BTIC는 전체 종양 세포 중 한 부분을 차지할 수 있지만, 끝없는 종양-재생 및 질환 진행의 근원일 수 있는 가능성을 지니고 있다.
백신 감작제로서 방사선을 사용하는 것에 대한 근거. 바오(Bao) 등은 CD133+ 세포가 우선 활성화 체크포인트 키나제 Chk1, Chk2에 의해 그의 CD133- 딸세포에 비하여 전리 방사선에 대하여 증진된 내성을 보인다는 것을 밝혀냈다 (문헌 [Bao S, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760]). 비록 CD133+ 및 CD133- 세포에서 DNA 손상이 유사한 정도로 나타나기는 하였지만, CD133+ 세포는 CD133- 세포에 비하여 보다 빠르게 상기 손상을 수복하였고, 각 선량의 방사선 후 강화되었다 (문헌 [Bao S, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760]). 정밀한 연구에서 개서(Gasser) 등은 DNA 손상 경로가 NKG2D 수용체의 선천성 면역계 리간드를 조절한다는 것을 입증하였다 (문헌 [Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature . 2005;436:1186-1190]). 이들은 방사선에 의해 유도된 NKG2D 리간드 발현에 대한 분자적 기반은 Chk1/2 활성화 유도였다는 것을 밝혀냈다. 추가로, Chk1의 약리학적 억제가 NKG2D 리간드 상향조절을 억제시켰고, 이를 통해 방사선이 체크포인트 키나제 경로를 통해 세포 면역원성을 증가시킨다는 것이 뚜렷이 밝혀졌다. 그러나, 상기 연구는 정상적인 세포와 육종 세포를 사용하여 수행된 것이었다 (문헌 [Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436:1186-1190]). 그럼에도 불구하고, 상기 결과를 신경교종 세포에 적용시킨다면, 이때 CD133+ 세포가 방사선 요법을 견뎌내기 위해 사용하는 동일한 경로 (Chk1을 통한 신호전달)는 NKG2D 리간드의 상향조절에 의해 이를 자연살 세포 또는 T 세포 세포 매개 용해에 대해 우선적으로 감작화시킬 것으로 예측된다. 만약 상기 내용이 사실이라면, "전반적으로는 강함에도 불구하고 치명적으로 약하기 때문에, 이로 인해 실제로 또는 잠재적으로 몰락에 이르게 하는 것"으로서 정의되는 CD133+ 세포에 대한 "아킬레스 건(Achilles heel)"을 나타낼 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 DIPG 치료를 위해 BTIC 표적화된 면역요법과 함께 방사선을 병용하여 사용한다.
BTIC 항원 표적화: 신경교종 세포의 배양 조건이 면역요법에 중요하게 영향을 미친다. 수십 년간, 신경교종의 생물학적 성질을 이해하고, 잠재적인 요법을 조사하기 위해 수행된 연구는 혈청에서 배양된 신경교종 세포주를 사용하는 것에 의존하여 왔다. 따라서, 종양 세포 용해물 또는 펩티드로 감작된 DC로 GBM 환자를 백신화시킨 최근 임상 시험에서, 종양 세포를 배양하고, 혈청 중에서 확장시켰다 (문헌 [Yu JS, et al. Vaccination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Research. 2004;64:4973-4979]; [Yamanaka R, et al. Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma:results of a clinical phase I/II trial. Clin Cancer Res. 2005; 11:4160-4167]; [Yamanaka R, et al. Vaccination of recurrent glioma patients with tumour lysate-pulsed dendritic cells elicits immune responses:results of a clinical phase I/II trial. Br J Cancer. 2003;89:1172-1179]). 최근 잘 제어된 2개의 연구를 통해 혈청 중에서 BTIC를 배양하는 것이 분화를 일으키며, 이것이 게놈의 불안정화를 증진시키고, 유전자 돌연변이를 가속화시키며, 전반적인 유전자 발현 패턴 및 표현형이 원발성 종양과 현저한 차이를 보이도록 만든다는 것이 밝혀졌다 (문헌 [Lee J, et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell . 2006;9:391-403]; [Gunther HS, et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 2007]). 대조적으로, EGF 및 FGF로 보충된 신경 줄기 세포 배지 중에서 원발성 종양 세포를 배양한 경우에는 분화가 일어나지 못한다. 이러한 신경구 배양물은 마우스 뇌 내로 이종이식되었을 때, 원발성 종양의 유전자형, 유전자 발현 패턴, 및 표현형을 반복한다 (문헌 [Lee J, et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell . 2006;9:391-403]; [Gunther HS, et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 2007]). 보다 효과적인 면역요법을 개발하기 위한 시도가 이루어지고 있는 바, 상기와 같은 최근의 발견 사실에 주시하여야 한다. DC를 종양 용해물로 감작시키고, 백신으로서 투여하였을 때, 용해물 중의 단백질 항원은 DC 내에서 프로세싱되고, MHC I 및 MHC II 상에 제시되어 상기 항원에 대해 반응하는 순수한(
Figure pct00001
) T 세포를 프라이밍한다. 그러므로, 현재까지는 용해물로 감작된 DC 백신이 원발성 종양 상에서 발현된 항원 서브세트만을 편형적으로 표적화하여 왔을 수 있으며, 가능하게는 항원 공급원이 혈청 중에서 배양되었기 때문에 상기 중에는 BTIC-특이 항원이 (있다 해도) 거의 없었다. 이에 한 연구를 통해 이러한 가설을 지지하는 증거가 제시되었다. 펠레가타(Pellegata) 등은 혈청 배양된 신경교종 세포 용해물로 감작된 DC로 백신화된 마우스와 비교하였을 때, 신경구 배양 용해물로 감작된 DC로 백신화된 마우스가 우수한 치료학적 반응을 보였다고 밝혔다 (문헌 [Pellegatta S, et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Research. 2006;66:10247-10252]). 다시 말해, DC 백신 시험을 수행하는 방식을 통해 신호 대 잡음에 관한 문제가 발생할 수 있다. 현 프로젝트에서, 신경교종 세포 배양물은 원발성 종양으로부터 유래되었고, 이를 신경 줄기 세포 배지 중에서 배양하여 임상적으로 관련된 표형형을 강화시키고, 중요한 BTIC 항원을 발현시켰다.
이미퀴모드 + 종양 세포 용해물이 강력한 항-신경교종 백신이다.
이미퀴모드는 피부 종양 치료용으로 피부 상에 크림제로서 투여되는 FDA 승인을 받은 면역 반응 조절제이다. 이미퀴모드는 인간에서 DC 및 B 세포 상에서 발현되는 톨-유사-수용체 7 (TLR7)을 통해 그의 면역자극성 효과를 발휘한다. 이미퀴모드로 치료하면, 모두가 동물에서 항종양 활성과 관련된 강력한 Th1 면역 반응을 프라이밍하는 데 중요한 것인 인터페론α, 인터페론γ, IL-12를 비롯한, 염증유발 시토카인이 방출된다. 국소용 이미퀴모드는 백신 아주반트로서 사용되어 왔으며, 이는 확립된 종양 및 바이러스 감염을 표적화하는 다수의 연구에서 성공을 거두었다 (문헌 [Adams S, et al. Immunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ESO-1 protein using TLR7 agonist Imiquimod as vaccine adjuvant. J Immunol. 2008;181:776-784]; [Johnston D, Bystryn JC. Topical Imiquimod is a potent adjuvant to a weakly-immunogenic protein prototype vaccine. Vaccine . 2006;24:1958-1965]; [Craft N, et al. The TLR7 agonist Imiquimod enhances the anti-melanoma effects of a recombinant Listeria monocytogenes vaccine. J Immunol. 2005;175:1983-1990]; [Harrison CJ, Miller RL, Bernstein DI. Reduction of recurrent HSV disease using Imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine. Vaccine. 2001;19:1820-1826]; [Bernstein DI, Miller RL, Harrison CJ. Adjuvant effects of Imiquimod on a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine in guinea pigs. J Infect Dis. 1993;167:731-735]). 이러한 이전 연구 결과에 기초하여, 뮤린 모델에서의 종양 세포 용해물 백신의 효능을 시험하였다. 주사 직전에 백신화 부위에 이미퀴모드를 적용하는, GL261 세포 용해물을 이요한 피내 백신화에 의해 동계 GL261 신경교종을 보유하는 근교배 C57BL/6 마우스를 처리하였다. 염수를 대조군으로서 투여하였다. 이미퀴모드/종양 용해물 백신화로 처리된 마우스의 생존 기간은 20% 더 장기화된 생존 기간을 비롯하여, 대조군보다 현저히 더 길었다 (도 2; p<0.01).
치료 계획안. 본 치료 계획안 (도 3)은 상기 데이터에 기초하는 것이며, 이는 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 방사선법에 대해 알려져 있는 것이다. BTIC 세포주 (GBM-6)를 백신 공급원으로서 사용하였다. 최소 잔류 질환을 달성하기 위한 시도로 유도하기 위해 6 내지 7주 간에 걸쳐 180 cGy씩의 분할량으로 5,220 cGy 선량으로 입체 조형 방사선 요법을 실시하였다. NKG2D 리간드 상향조절을 유도하기 위한 신규한 노력으로 (이를 통해서 부착된 림프구에 대해 잔류 종양을 "감작화"시키기 위해서) 초기 방사선 요법 종료 후 4 및 8주째에 이틀 연속으로 180 cGy씩의 분할량으로 추가의 360 cGy의 분할량을 전달하였다. 그러므로, 각 환자에 대한 총 방사선 선량은 5,940 cGy였다. 환자를 2개의 군으로 지정하였다; 아주반트 항종양 효과를 위해 처음 4주 동안 방사선 요법 동안 1군에는 테모졸로미드 75mg/㎡/일을 제공하고, 방사선 감작화시켰다. 테모졸로미드가 림프구감소증을 유발시킬 것으로 예상되었다. 면역 회복을 DIPG에서 발현되는 종양 항원, 예컨대, IL-13Rα2, Epha2, Her-2에 대해 특이적인 T 세포 쪽으로 편중시키기 위해 상기 군의 환자에서의 후속 림프구 회복 동안 백신을 전달하였다. T 조절성 세포는 테모졸로미드 회복 동안 지연되는 우세한 림프구 서브세트일 수 있다는 것이 최근 데이터를 통해 밝혀졌으며, 따라서, 2군은 어떤 아주반트 테모졸로미드로도 처리하지 않았다. 본 발명자들은 초기 방사선 요법 완료 후, 다른 기관으로부터의 위탁시에 상기 환자를 소개받을 수 있었다. 다른 환자들 모두를 테모졸로미드 아암 또는 비-테모졸로미드 암으로 무작위로 지정하였다. 백신 요법 개시 이전 및 이후에 수집된 말초 혈액 단핵 세포에 대한 유세포 분석법을 통해 양 군간의 T reg 개수 및 면역 반응을 비교하였다. 방사선 요법 완료 후 4주째에 백신 투여를 개시하고, 4 용량으로 매 2주마다 백신을 투여하였다. 이어서, 매 4주마다 부스터를 투여하고, 역사상의 데이터에 기초하면 중앙 생존 기간은 이미 넘긴 시점이 되는 방사선 요법 개시로부터 최장 1년까지 계속하여 투여하였다.
상기 투여 가이드라인에 대해 상당한 주의를 기울이면서, 유니버시티 오브 미네소타 칠드런스 하스피탈(University of Minnesota Children's Hospita)의 치료 기준에 따라 방사선 요법은 실시하였다. 모든 환자를 세기 변조 방사선 치료 (IMRT: Intensity Modulated Radiation Therapy)로 또는 등가의 입체 조형 기법으로 치료하였다. 임상 표준 부피는 육안적 종양 부피 (MRI 상에서 눈으로 볼 수 있는 전체 종양 범위) + 1 cm 차이로서 정의되었다.
모두가 그러한 것은 아니었지만, 대부분의 환자에서 진단시에 덱사메타손 요법을 실시하는 것으로 하였다. 백신 투여 이전에 면역이 다시 재구성될 수 있도록 하기 위해 초기 초기 방사선 요법 6주차인 시점까지 모든 환자에서 덱사메타손을 중단하고자 하는 노력을 기울였다.
먼저 이미퀴모드를 2개의 견갑골상 주사 부위에 국소적으로 투여함으로써 백신 투여를 달성하였다. 이어서, 각 투여 시점에 대략 1 용량당 2 x 106개의 용해된, 감마 방사선 조사된 GBM6-AD 세포가 되도록 하는 2개의 분할된 용량으로 백신을 피내로 투여하였다.
실시예 2
수지상 세포 (DC) 백신화는 최근 규제 기관의 승인을 받은, 암 면역요법을 위한 매우 효과적인 접근법이며, 종양 용해물로 감작된 DC 백신은 임상 시험에서 테스트 중에 있다. 종양 세포 용해물 (TL)은 대개 종양 계내 중의 O2 분압보다 더 높은 대기 중의 산소 (~20% O2)에서 배양된 세포로부터 생성된다. 5% O2에서 뮤린 종양 세포를 배양한 결과 TL 백신의 효능은 크게 증진되었다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명자들은 5% O2에서 원발성 인간 신경교종 세포를 배양하는 것이 DC 효능 및 종양 항원 발현을 증진시키는지 여부를 밝혀내고자 하였다. 20% O2에서 배양된 원발성 교모세포종 세포와 달리, 5% O2에서 배양된 배양물은 모체(parental) 종양 계내에서의 유전자 발현 패턴쪽으로 부분적으로 복귀하는 것으로 나타났다. 추가로, 5% O2 TL은 DC에 의해 더 효과적으로 흡수되었는데, 항원을 CD8 T 세포로 제시할 수 있는 우수한 능력을 보여주는 것이었다. 5% O2 용해물로 감작된 DC로 프라이밍된 CD8 T 세포는 20% O2 TL에 의해 프라이밍된 것에 비하여 유의적으로 개선된 종양 살상 기능을 가졌다. 종합해 보면, 본 발명자들의 결과는 O2에서의 조직 배양이 i) 표적 항원을 편향적으로 발현시켜 종양 계내에서의 것을 잘 반영할 수 있고, ii) 항원을 제시하는 DC의 효능을 증가시킬 수 있고, iii) CD8 T 세포의 이펙터 기능을 증진시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 TL로 감작된 DC 백신의 효능을 개선시키는 데 광범위하게 영향을 미친다. 상기 데이터에 기초하여, 무혈청 조건하에 5% O2에서 확장된 신경교종 세포로 감작된 DC를 이용하여 임상 시험을 개시하였다.
종양 관련 항원으로 감작된 수지상 세포 (DC)를 사용하는 치료학적 백신화는 암 면역요법을 위해 유망한 접근법이다 (문헌 [Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. Cancer Invest 2003;21:873-86]). 미 식품의약국(United States Food and Drug Administration)은 최근 펩티드로 감작된 DC 백신을 거세 저항성 전립샘암 치료용으로 승인하였다 (문헌 [DeFrancesco L. Landmark approval for Dendreon's cancer vaccine. Nat Biotechnol;28: 531-2]; [Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med; 363: 411-22]). DC 백신을 위한 항원 공급원으로서 종양 세포가 빈번하게 사용된다. 종양 세포 및 종양 세포 용해물 (TL)을 사용하는 백신은 다중의, 환자-특이 종양 항원을 표적화하는 것을 비롯한, 수개의 장점을 가지고 있다. TL로 감작된 DC로 백신화는 것은 다수의 악성 종양에 대한 조기 단계의 임상 시험에서 유망한 결과를 입증하였지만, 분명 추가 개선이 요구되고 있다 (문헌 [Le DT, Pardoll DM, Jaffee EM. Cellular vaccine approaches. Cancer J; 16: 304-10]).
조직 배양이 종양 세포 백신에 의해 유발된 항종양 면역 반응에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 관해서는 여전히 불명확한 상태로 남아있다. 혈청 함유 배지에서 배양된 원발성 교모세포종 세포는 원발성 종양과 유전적으로 및 표현형상 매우 상이한 반면, 무혈청 조건하에서 배양된 동일 세포의 배양물은 원발성 종양에 보다 가깝게 반영하였고, 암 줄기 세포 표현형이 강화되어 있었다 (문헌 [Lee J, Kotliarova S, Kotliarov Y, et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell 2006; 9: 391-403]). 무혈청 조건하에서 생성된 신경교종 세포 용해물은 뮤린 모델에서 TL로 감작된 DC 백신용으로 사용되었을 때, 혈청 함유 배지로부터 유래된 것보다 더 큰 효과를 나타내었다 (문헌 [Pellegatta S, Poliani PL, Corno D, et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res 2006; 66: 10247-52]). 전통적으로, 종양 세포 백신은, 교모세포종 계내에서 측정되는 6% O2 미만의 평균 산소 분압과는 거리가 먼 대기 중의 산소 (~20.95%; 이하, 20% O2)에서 보관되는 배양물로부터 유래된다 (문헌 [Evans SM, Judy KD, Dunphy I, et al. Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors. Clin Cancer Res 2004; 10: 8177-84]). 산소가 유전자 발현, 세포 대사, 증식, 생존에 영향을 주고 (문헌 [van den Brenk HA, Moore V, Sharpington C, Orton C. Production of metastases by a primary tumour irradiated under aerobic and anaerobic conditions in vivo. Br J Cancer 1972; 26: 402-12]; [Sciandra JJ, Subjeck JR, Hughes CS. Induction of glucose-regulated proteins during anaerobic exposure and of heat-shock proteins after reoxygenation. Proc Natl Acad Sci U.S.A 1984;81:4843-7]; [Pouyssegur J, Dayan F, Mazure NM. Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression. Nature 2006;441:437-43]; [Gordan JD, Simon MC. Hypoxia-inducible factors:central regulators of the tumor phenotype. Curr Opin Genet Dev 2007;17:71-7]), 저산소증이 종양 줄기 세포 마커인 CD133, 네스틴, 및 SOX2의 발현을 증가시킨다는 것이 확립되어 있다 (문헌 [Platet N, Liu SY, Atifi ME, et al. Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cancer Lett 2007;258:286-90]; [McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol Cancer Res 2009;7:489-97]; [Li Z, Bao S, Wu Q, et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 2009;15:501-13]). 그러나, 산소가 종양 세포 면역원성에 미치는 효과에 관해서는 충분히 이해되지 못한 상태이다.
본 결과는, 20% O2에서 원발성 신경교종 세포를 배양하자 그의 유전자 발현이 원발성 종양에서 벗어난 전반적인 변화를 일으켰고, 이는 5% O2에서의 세포 배양에 의해 부분적으로는 복귀되었다는 것을 나타내었다. 특히, T 세포 반응을 유도하는 것으로 알려져 있는 수개의 신경교종 항원의 발현이 5% O2에서 증가되었다. 5% O2에서 성장시킨 원발성 인간 신경교종 세포는 우수한 DC 흡수, 항원 제시, 및 종양 살상 CD8 T 세포의 프라이밍에 의해 평가되는 바와 같이, 내인성 아주반트 특성을 보였다. 따라서, 5% O2의 무혈청 배지에서 성장시킨 원발성 인간 신경교종 세포가 종양 세포 백신 진화 과정에서 가장 최근의 개선안으로서 출현하게 되었다.
물질 및 방법
종양 세포 배양: 수술을 통해 절제된 신경교종 (하기 표 1)을 효소를 이용하여 해리시키고, 신경 줄기 세포 배지 중에서 배양하였다 (문헌 [Wu A, Oh S, Wiesner SM, et al. Persistence of CD133+ cells in human and mouse glioma cell lines: detailed characterization of GL261 glioma cells with cancer stem cell-like properties. Stem Cells Dev 2008; 17: 173-8]).
<표 1>
종양 식별, 환자 정보, 및 종양이 사용된 실험, 및 세포의 계대접종 횟수를 나타낸 표.
Figure pct00002
*표시는 종양이 메이요 클리닉(Mayo Clinic: 미국 미네소타주 로체스터)에서 절제된 것을 나타내고, 나머지 것들은 유니버시티 오브 미네소타 메디컬 센터(University of Minnesota Medical Center: 미국 페어뷰)에서 절제된 것이었다.
GBM = 다형 교모세포종, Epd = 상의세포종, FC = 유세포 분석법, CTL = 세포독성 검정법.
달리 명확하게 언급되지 않는 한, 모든 조직 배양물은 20% O2에서 보관하였다. "5% O2"로 표시된 배양물은 기술된 바와 같이 사용하기 전 적어도 30일 동안 5% O2에서 보관함으로써 20% O2로부터 전환시켰다 (문헌 [Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM, et al. Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cancer Res; 16: 4800-8]).
마이크로어레이: 절제시 급속 냉동된 조직으로부터, 또는 5% 또는 20% O2로부터 배양된 세포로부터 총 RNA를 단리시켰다. 홀-게놈 진 익스프레션 DASL 어세이(Whole-Genome Gene Expression DASL Assay) (일루미나(Illumina: 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 사용하여 18,401개의 유전자의 발현 수준을 분석하였다.
제조사의 설명서에 따라 RN이지® 플러스 미니 키트(RNEasy® Plus Mini Kit) (퀴아젠®(Qiagen®: 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 사용하여 절제시 급속 냉동된 조직으로부터, 또는 5% 또는 20% O2에서 성장시킨 세포로부터 총 RNA를 단리시켰다. 애질런트 2100 바이오애널라이저(Agilent 2100 Bioanalyzer: 미국 캘리포니아주 산타클라라)를 사용하여 품질 관리를 수행하였다. 홀-게놈 진 익스프레션 DASL 어세이 (일루미나: 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 18,401개의 유전자의 발현 수준을 분석하였다. 간략하면, 혼합된 폴리-T 및 무작위 구량체 프라이머를 사용하여 각 샘플로부터 유래된 100 ng의 총 RNA로부터 비오티닐화된 cDNA를 합성하였다. 비오티닐화된 cDNA를 검정용 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화시킨 후, 스트렙트아비딘에 접합된 상자성 입자에 결합시켰다. 올리고를 신장시키고, 결찰시켜 무작위 형광 프라이머로 증폭된 주형을 생성하였다. 일루미나 휴먼 Ref-8_V1 익스프레션 비드칩(Illumina HumanRef-8_V1 Expression BeadChip)의 각 마이크로어레이 상에 함유되어 있는 24,631개의 올리고뉴클레오티드 프로브에 형광 표지된 생성물을 결합시키고, 레이저 공초점 현미경으로 분석하였다. 환자 2에 대해, 및 환자 1로부터 유래된 조직에 대한 3개의 기법상의 부본을 각 조건에 관하여 분석하였다. 환자 1로부터 유래된 세포주에 대해서는 2개의 기법상의 부본을 분석하였다.
앞서 기술된 바와 같이 품질 관리에 관하여 어레이 데이터를 분석하고 (문헌 [Sarver AL. Toward understanding the informatics and statistical aspects of micro-RNA profiling. J Cardiovasc Transl Res;3:204-11]), 분위수를 정규화하고, 각 유전자에 대한 다중 프로브의 평균값을 구하였다. 각 실험 세트 (종양, 20% 및 5% 산소)에 대한 각 실험값을 20% O2 배양물의 평균값으로 나누어 상이한 종양 간의 차이와는 상관없이 상태 간의 차이를 확인하였다. 두 군간의 t-검정 뿐만 아니라, 평균 변화 배수를 사용하여 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였다.
정량적 RT - PCR: SYBR 그린 1단계 PCR 마스터 믹스(SYBR Green one step PCR master mix)(퀴아젠®)를 이용하여 실시간 PCR에 의해 추출된 RNA를 분석하였다. ABI PRISM 7500 써모사이클러에서 PCR을 위해 하기 조건을 사용하였다: 95℃에서 15 min 동안; 94℃에서 30s 동안, 55℃에서 30s 동안, 68℃에서 30s 동안 총 40사이클; 72℃에서 10 min 동안; 및 10℃에서 수집할 때까지. 유전자 발현의 상대적인 정량화 값을 계산하고, 2-ΔΔ Ct 방법을 이용하여 GAPDH 발현 수준으로 정규화하였다 (문헌 [Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001;25:402-8]). 프라이머는 하기 표 2에 열거되어 있다.
<표 2>
전사 수준을 측정하는 데 사용된 프라이머 목록.
Figure pct00003

유세포 분석법: 5 x 105개의 세포를 항-CD133/2 (밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotec)), EphA2, SOX2, 네스틴, HER-2/neu (R&D 시스템즈(R&D Systems)), 및 IL13Rα2 (산타그크루즈 바이오테크놀로지(SantaCruz Biotechnology))로 염색하였다. 3회에 걸쳐 세척한 후, CD133/2를 2차 항-마우스-647로 염색하고; IL13Rα2 및 EphA2를 그의 각각의 이소형과 함께 2차 항-마우스-PE로 염색하고, FACS 칸토 II(FACS Canto II)를 사용하여 분석하였다. DC 표현형 분석을 위해서는 5 x 105개의 DC를 CD80-FITC, CD86-PE, CD83-PE, HLA-DR-APC, CCR7-FITC (e바이오사이언스(eBioscience)) 및 HLA-ABC-FITC (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 염색하고, 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 고정시킨 후, FACS 캘리버(FACS Caliber) 상에서 분석하였다. 제조사의 프로토콜 (BD 바이오사이언시스)에 따라 세포내 염색을 수행하였다.
수지상 세포: CD14 자기 비드 (밀텐이 바이오텍)를 사용하여 건강한 HLA-A2+ 기증자의 말초 혈액으로부터 단핵구를 정제하고, 24-웰 플레이트 중에 5 X 105개의 농도로 플레이팅하고, 앞서 기술된 바와 같이 성숙화시켰다 (문헌 [Mailliard RB, Wankowicz-Kalinska A, Cai Q, et al. alpha-type-1 polarized dendritic cells:a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res 2004; 64:5934-7]); 6일째, 5% 또는 20% O2 중에서 유도된 100 μg의 TL로 DC를 감작시키고, 본 실험에 앞서 성숙화시켰다.
CTL 검정법: 정상적인 기증자로부터 유래된 1 X 106개의 HLA-A2+ PBMC를 50 U IL-2와 함께 성숙화된 (8일째의) 용해물로 감작된 DC에 첨가하고, 7일 동안 인큐베이션시켰다. 다시 자극시키기 위해, 감작된 DC의 제2 세트를 4일 동안 공-배양물에 첨가하였다. 11일째, 프라이밍된 PBMC를 2 X 104개의 CFSE로 표지된 HLA-A2+ 신경교종 세포와 함께 6h 동안 공-배양한 후, 기술된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 분석하여 세포독성을 측정하였다 (문헌 [Olin MR, Hwa Choi K, Lee J, Molitor TW. Gammadelta T-lymphocyte cytotoxic activity against Mycobacterium bovis analyzed by flow cytometry. J Immunol Methods 2005; 297:1-11]). 차단 검정을 위해, 항-HLA-ABC를 25 min 동안 표적 세포에 첨가하고, 세척하고, 이펙터 세포에 첨가하였다.
CMV 검정법: 5 X 105개의 HLA-A2+ iDC를 5% 또는 20% O2 중에서 유래된 100 ㎍의 종양 용해물 ± 10 ㎍의 pp65 HLA-A2-구속성 CMV 항원 (NLVPMVATV)으로 감작시키고, 방법 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 성숙화시켰다. 성숙화시킨 후, DC를 3회에 걸쳐 세척하고, CMV 혈청-양성 기증자로부터 유래된 5 X 105개의 PBMC를 DC에 첨가하였다. CMV 혈청-음성 PBMC를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 48h 동안 인큐베이션시키고, 세포분석용 비드 어레이 (BD 바이오사이언시스)에 의해 IFNγ에 대하여 상청액을 분석하였다. 세포를 추가의 24h 동안 배양하고, 항-CD8, pp65 오량체 (프로이뮨(ProImmune))로 염색하고, IFNγ 생산에 대하여 세포내 염색을 실시하였다.
종양 살상 활성 증가는 공동자극성 분자 증가에 기인하는 것이 아니다. 5% O2 배양물 중에서 유래된 용해물이 공동자극성 분자 발현을 변경시켰는지 여부를 조사하기 위해, DC를 5% 또는 20% O2 조건에서 유래된 종양 용해물로 감작시키고, 성숙화시키고, CD83, CD80/86, HLA-DR, HLA-ABC, 및 CCR7 발현에 대하여 분석하였다. 3개의 별개의 실험에서, 두 산소 조건 간에 공동자극 마커에서의 유의적인 차이는 없는 것으로 관찰되었다.
통계학적 분석: ANOVA에 의해 통계학적으로 분석한 후, 양측 t-검정을 사용하여 사후 비교를 수행하였다. 모든 검정은 프리즘 4 소프트웨어(Prism 4 software) (그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드(Graph Pad Software, Inc.))를 이용하여 수행하였다. P 값 <0.05를 유의적으로 것으로 간주하였다.
결과 및 논의
조직 배양물과 계내 원발성 종양을 비교하기 위해, 두 교모세포종으로부터 mRNA 발현 수준을 프로파일링하고, 5% 및 20% O2 중에서 성장시킨 같은 종양으로부터 유래된 세포를 배양하였다. 추세에 따라 유전자 발현 시그니처는 20% O2와 비교하여 세포를 5% O2에서 배양하였을 때 계내에서 관찰되는 수준 쪽으로 이동하였다. 두 환자 모두에서 20% O2 배양물과 계내 종양 사이의 3,333개의 유전자의 발현에 있어서 유의적인 차이가 있었다. 이들 중, 77개의 유전자는 5% 및 20% O2 배양물 사이에서 차별적으로 발현되었다.
선택된 암 줄기 세포 마커 (CD133, 네스틴, Sox2) 및 T 세포 반응을 유도하는 것으로 알려져 있는 TAA (EphA2, IL-13Rα2, HER-2/neu)를 PCR 및 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 20% O2와 비교하여, 5% O2에서 배양된 세포는 CD133, EphA2, IL-13Rα2 및 HER-2/neu를 코딩하는 mRNA를 유의적으로 더 많이 발현하였다 (도 6A). SOX2 및 네스틴은 같은 추세를 보였지만, 통계학적 유의성에 도달하지는 못하였다. HER-2/neu를 제외하면, 단백질 발현은 같은 추세를 보였는데, CD133, EphA2, 및 IL13Rα2는 유의적으로 증가하였다 (도 6B). 추가로, CD133 및 IL13Rα2에 대한 웨스턴 블롯을 통해 발현은 유사하게 변경된 것으로 나타났다 (도 6C). 종합해 보면, 5% O2 중에서 배양된 세포가 종양 계내에서의 항원 발현을 보다 잘 반영하고, "줄기세포성"의 마커 및 면역원성 TAA가 강화된다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다.
이어서, 산소 분압이 배양물 중 종양 살상 T 세포를 프라이밍시킬 수 있는 TL의 능력을 변경시키는지 여부에 관해 의문을 가지게 되었다. 3명의 상이한 신경교종 환자로부터 유래된 TL로 감작된 자가 DC에 의해 정상적인 기증자로부터 유래된 HLA-A2+ PBMC를 프라이밍시켰다. 프라이밍된 PBMC를, 프라이밍에 사용된 같은 HLA-A2+ 신경교종 세포를 용해시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 5% O2 TL에 의해 프라이밍된 PBMC가 표적 세포에 대해 우수한 종양 살상 활성을 보였다는 것이 3/3 환자로부터 입증되었다 (도 7A-C). 종양 세포 용해가 CD8 T 세포를 프라이밍하는 데 필요한지 여부를 밝혀내기 위해, 이펙터 세포에 앞서 항-HLA-ABC 차단 항체를 종양 세포에 첨가하였다. MHC I-TCR 상호작용 차단이 종양 살상 반응을 방해하였는데, 이는 세포독성 T 림프구 (CTL)가 상기 검정에 있어서 주된 이펙터임을 시사하는 것이다 (도 7D).
CTL 프라이밍 증진에 관한 타당한 설명을 통해 5% O2 TL에 의한 DC 성숙화는 개선될 것이다. 20% 또는 5% O2로부터의 TL로 감작시킨 후, 성숙한 DC 상의 공동자극성 분자, MHC 분자, 및 CCR7의 발현을 측정하였다. CD83, CD80, CD86, 또는 HLA-ABC, HLA-DR, 또는 CCR7의 발현에 있어 어떤 유의적인 차이도 없었다. 그러므로, 5% O2 TL의 아주반트 활성이 DC 성숙화 증진에 기인한다고 볼 여지는 없었고, 이는 다른 기전을 제안한다. 5% O2 TL로 달성된 우수한 CTL 프라이밍이 용해물 흡수 변화에 기인할 수 있는지 여부를 측정하는 실험을 수행하였다. 5% 또는 20% O2 중에서 성장시킨 CFSE로 표지된 신경교종 세포로부터 유래된 TL로 미성숙 DC를 감작시켰다. (용해물이 적재된 DC를 마킹하는) CFSE+HLA-DR+ 세포에 관한 유세포 분석-기반 검출을 통해 5% O2 TL이 20% O2 중에서 유래된 TL과 비교하여 DC 개수를 2배만큼 더 많이 흡수하였다는 것이 밝혀졌다 (도 8A). 따라서, 5% O2 TL 중에서 미확인 인자(들)는 조직 배양물 중 종양-관련 단백질을 포식하는 DC 분획을 증가시켰다.
본 발명자들은 TL이 TL 중에 존재하지 않는 정의된 항원으로부터의 DC-매개 CD8 T 세포 프라이밍을 변경시키는지 여부를 밝혀내기 위해 검정을 확립하였다. 이를 달성하기 위해, TL을, 잘 정의된 CD8 T 세포 반응을 보이는 특이 마커 항원인 pp65 펩티드와 혼합하였다. 시토메갈로바이러스 (CMV)-유래의 pp65는, CMV 혈청-양성 환자가 전형적으로는 그에 대해 CD8 T 세포 기억 반응을 보이는 것인 HLA-A2-구속성 면역우성 에피토프이다 (문헌 [Moss P, Khan N. CD8(+) T-cell immunity to cytomegalovirus. Hum Immunol 2004; 65:456-64]에서 리뷰됨). 혈청-양성 기증자로부터 유래된 PBMC를 pp65의 존재하에 또는 부재하에서 TL로 감작된 DC와 함께 공배양하였다. 혈청-음성 기증자로부터 유래된 PBMC를 pp65와는 상관없이 CD8 T 세포 활성화에 대한 대조군으로서 사용하였다. CD8 T 세포 활성화의 척도로서 조직 배양물 상청액 중 가용성 IFNγ을 정량화하였다. pp65와는 상관없이, 가능하게는 T 세포 또는 자연살 (NK) 세포의 활성화에 기인하여, TL을 pp65 부재하에서 감작시켰을 때에 상청액 중에서 50-200 pg/ml의 IFNγ 배경이 검출되었다 (도 8B). 용해물 중 CMV 항원에 대한 반응성을 배제시키면, 혈청-양성 기증자로부터 유래된, 감작되지 않는 PBMC와 용해물로 감작된 PBMC 사이의 IFNγ 생성에 있어 어떤 유의적인 차이도 없었으며, 이를 통해 TL에서 CMV 항원의 발현은 무시할 수 있을 정도의 것임이 입증되었다 (문헌 [Cobbs CS, Harkins L, Samanta M, et al. Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer Res 2002; 62:3347-50]). 예측대로, 혈청-양성 기증자로부터 유래된, pp65으로만 단독으로 (TL 없음) 프라이밍된 PBMC는 배경보다 2-4배 더 큰 수준으로 IFNγ를 생성한 반면, 혈청-음성 기증자 PBMC는 pp65에 대해 반응하지 않았다. 따라서, 혈청-양성 기증자 PBMC는 CMV에 대한 면역학적 기억과 일치하는 표현형을 보였으며, 이를 통해 본 발명자들은 TL이 정의된 CD8 T 세포 에피토프에 대한 반응을 어떻게 변화시킬 수 있는지를 측정할 수 있었다.
5% O2 TL과 혼합된 pp65로 프라이밍된 PBMC는 pp65으로만 단독으로 프라이밍된 것과 비교하여 IFNγ의 양을 2배 더 많이 생성하였다. 20% O2 TL은 pp65-의존성 IFNγ 분비를 유의적으로 억제시키는 뚜렷한 대조를 보였다 (도 8B). pp65-특이 CD8 T 세포가 IFNγ의 주요 공급원인지 확인하기 위해, 유세포 분석법을 수행하여 구체적으로 CD8+pp65-오량체+ 세포에서의 IFNγ 발현을 평가하였다 (도 8C). 측정된 가용성 IFNγ와 일관되게, 5% O2 TL + pp65로 프라이밍된 CD8+pp65-오량체+ 세포는 모든 다른 군에 비하여 각 세포별로 더 많은 IFNγ를 생산하였다. 모두 종합해 보면, 상기 데이터는 TAA의 발현량과는 상관없이 5% O2 TL이 내인성 아주반트 활성을 가진다는 것을 입증한다. 이러한 발견은, 보다 정확한 마우스 면역학 시약 및 확립된 신경교종 세포주를 사용하여 본 발명자들이 최근에 보고한 것; 즉, 5% O2 TL은 MHC I 상에 외인성 오브알부민의 제시를 증가시키고, 항원-특이 CD8 T 세포 활성화를 증진시킨 반면, 20% O2 TL은 CD8 T 세포 프라이밍에 대해 억제성이고, 다르게는, 항체 반응을 촉진시켰다는 것과 유사하였다는 점은 주목할 만하다 (문헌 [Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM, et al. Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cancer Res; 16:4800-8]).
요약컨대, 본 데이터는 조직 배양 산소가 TAA의 발현과, CD8 T 세포의 DC-매개 프라이밍을 조정하는 인자의 발현을 동시에 조절함으로써 마스터 "면역 스위치"로서 작용한다는 것을 입증한다. 종양 계내에서 더 풍부하게 존재하는 TAA의 발현을 선택함으로써 본 발명자들은 종양 계내에 풍분하게 존재하는 표적에 대하여 더 큰 특이성으로 CD8 T 세포를 프라이밍하는 데 산소가 이용될 수 있다는 것을 제시하였다. 별도로 발견된 것으로서 똑같이 중요한 사실은 생리학적 산소 중에서 성장시킨 종양 세포는, 공동 자극과는 상관은 없지만, CD8 T 세포 프라이밍 증진을 포함하는 것인 기전을 통해서 CD8 T 세포에 대하여 선천적으로 더 큰 면역원성을 띤다는 것이다. 세번째 고려 사항은 수개의 이전 연구에서 1-7% O2 중에서 원발성 신경교종 세포를 성장시킨 결과, 암 줄기 세포 마커가 증가하였다는 점인데 (문헌 [Platet N, Liu SY, Atifi ME, et al. Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cancer Lett 2007; 258:286-90]; [McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol Cancer Res 2009; 7:489-97]; [Li Z, Bao S, Wu Q, et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 2009; 15:501-13]), 이는 프라이밍된 T 세포가 계내에서 암 줄기 세포를 근절시키는 데 더 적합하다는 것을 보여준다. 생리학적 산소 중에서 원발성 종양 세포를 확장시킴으로써 제조된 백신이 임상적으로 유용한 항종양 면역 반응을 유도하는 데 있어 강력한 시스템으로서의 역할을 한다.
실시예 3
GBM6-AD 세포를 성장시켜 자가 수지상 세포를 감작시키는 아폽토시스성 소체를 생성함으로써 백신을 제조할 수 있다.
수지상 세포 제조. 확립된 표준 수집 방법을 사용하여 FDA-허가를 받은 혈액 성분 채집기로 말초 혈액 단핵 세포 (MNC)를 수집하였다. 수집의 오염을 막기 위해 멸균 기법을 따라 수행하였다. 세포를 조직 배양 플라스크 또는 세포 팩토리에 1.0E+05-1.5E_05의 생존가능 시딩 밀도로 시딩하고, 5% CO2하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. +3일째, IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 20% 총 부피의 배양 배지 보충제 (1,000 IU/mL)를 세포에 첨가하였다. +6일째, GM-CSF (1,000 IU/mL), IL1베타 (25 ng/mL) TNF-알파 (50 ng/mL), IFN-알파 (10,000 IU/mL), IFN-감마 (1,000 IU/mL), 및 폴리-IC (20 ㎍/mL)를 첨가하여 세포를 성숙화시키고, +8일째까지 인큐베이션시켰다 (37℃, 5% CO2). 또한, 6일째 뇌 종양 아폽토시스성 소체 (iDC 1개당 1개의 아폽토시스성 세포)도 첨가하였다. +8일째, TrypLE 셀렉트(TrypLE Select)를 이용하여 배양물로부터 성숙한, 감작된 알파-1형의 분극화된 DC를 수거하고, 플라즈마라이트-A(Plasmalyte-A), 5% 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 DMSO (10% 최종 농도) 중에서 동결보존시켰다.
뇌 종양 줄기 세포 프로세싱. MCT 시설로부터의 승인에 앞서 다형 교모세포종을 앓는 성인 환자로부터 유래된 단일 세포주를 시험하였다. 검사 내용은 마이코플라스마 (PTC) 및 멸균성을 포함하였다: 결과는 만족스러웠다. 이어서, 5% CO2, 및 5% O2하에 37℃에서 EGF (20 ng/mL 최종 농도) 및 bFGF (2 ng/mL 최종 농도)를 포함하는 무혈청 신경 줄기 세포 배지 (DMEM/F12, B-27 보충제, N-2 보충제) 중에서 세포를 확장시켰다. 대략 3-5일째에 TrypLE 셀렉트 및 기계에 의한 해리를 이용하여 배양물을 구상 형성 세포로 나누었다. 세포를 EGF (20 ng/mL 최종 농도)/bFGF (2 ng/mL 최종 농도)를 포함하는 무혈청 신경 줄기 세포 배지 중에 재현탁시키고, MCB를 위해 충분량의 세포가 확장될 때까지 계속 배양하였다. 이어서, DPBS 중에서 세포를 세척하고, 동결보존 배지 (플라즈마라이트-A, 5% 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 DMSO (10% 최종 농도)) 중에서 동결보존시켰다.
MCB 샘플을 MCB와 같은 방식으로 확장시켜 실험 세포괴를 확립하고, 속도 조절형 냉동기를 사용하여 냉동시켰다. 이어서, 세포괴 중 일부를 해동시키고, 분무시키고, 생성된 벌크한 전체 세포 용해물에 방사선 조사하고 (200 Gy), 대략 2 mg/mL로 조정하였다. 이어서, 600 ㎕ 중 대략 1.2 mg을 바이알 내로 멸균적으로 옮겨 놓았다. 속도 조절형 냉동기를 사용하여 용해물을 함유하는 바이알을 냉동시킨 후, 투여를 위해 배급할 때까지 ≤ -150℃에서 보관하였다.
실시예 4
치료 계획. 백신 제조는 백혈구 성분 채집 시점으로부터 대략 4주 소요되었다.
백혈구 성분 채집 - 자가 수지상 세포 공급원. 백혈구 성분 채집에 의해 각 환자로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 자가 DC를 수집하였다. 표준 수집 기법을 사용하여 수집을 수행하였다. 과립구 분리 챔버 및 소량 수집 챔버 (SVCC)가 장착된 펜월 CS-3000® 플러스(Fenwal CS-3000® Plus) 혈액 세포 분리기 (#4R4538) (펜월 디비젼, 백스터 헬쓰케어(Fenwal Division, Baxter Healthcare: 미국 일리노이주 디어필드))를 사용하여 PBMC를 수집하였다.
프로세싱하기 위해 PBMC를 유니버시티 오브 미네소타(University of Minnesota) 몰레큘러 앤드 셀룰러 테라피 (MCT) 퍼실리티(Molecular and Cellular Therapy (MCT) Facility)로 즉시 수송하였다. 계획된 치료 종료점에 도달하기 전에 백신 공급이 고갈된 환자에서는 추가의 백신 생산을 위하여 세포를 수득하기 위해 2차 백혈구 성분 채집을 수행할 수 있었다. 상기 수집에 필요한 요구 사항 및 소요 시간은 개인 환자별로 결정되었다.
백신 제조. 도 9에 요약되어 있는 바와 같이 자가 PBMC를 프로세싱하는 것으로 하였다. 다형 교모세포종으로부터 유래된 뇌 종양 줄기 세포주를 몰레큘러 앤드 셀룰러 테라퓨틱스 퍼실리티(Molecular and Cellular Therapeutics (MCT) Facility)에 보관하고, 동종 종양 항원의 공급원으로서 프로세싱하였다. 107 내지 108개의 세포를 함유하는 DC 배양물을 4 x 106개의 BTSC로부터의 종양 용해물에 노출시켰다. 감작된 DC를 사용시까지 개별 분취량으로 냉동시켰다.
수지상 세포-뇌 종양 줄기 세포 백신화 / 이미퀴모드. 처음 8주 동안은 매 2주마다, 이어서, 10회의 추가 백신화를 위해서는 매 4주마다 외래 환자별로 백신화를 수행하였다. 백신화 직전에, 및 그후 24시간 경과하였을 때 다시 상기 부위에 이미퀴모드를 국소적으로 적용시켰다. 백신화 후 30분 동안 전신의 또는 주사 부위에서의 국소적인 즉각적 부작용에 대해서 환자를 관찰하였다.
이미퀴모드 적용. 이미퀴모드는 250 mg 패킷 중 5% 알드라(Aldara) 크림으로서 시판되며, 이는 패킷 1개당 12.5 mg의 총 용량을 제공하는데, 이는 20 ㎠를 도포하는데 충분한 양이다. 패킷의 내용물 중 ½ 정도를 얇은 막으로 적용시켜 계획된 백신화 부위의 피부 대략 10 ㎠를 도포하였다. 이미퀴모드를 잘 문질렀다. 남은 이미퀴모드는 처분하고, 각 적용을 위해서는 새 패킷을 사용하였다.
24시간 (±2시간) 경과 후, 백신화 부위에 동일한 방식으로 이미퀴모드를 다시 적용하였다.
백신 투여 계획. DC의 경부 림프절로의 수송을 촉진시키기 위해 목 뒷부분 부근의 어깨에 피내 주사를 통해 0.5 ml PBS 중 백신을 지정된 용량으로 투여하였다. 계획된 백신화 당일날 환자의 열이 101°F (38.3℃)를 초과하였거나, 스테로이드를 받은 경우에는, 백신화를 1주 연기시켰다. 1주 초과로 지연되는 경우에는 환자에서 추가 백신화를 중단하는 것으로 하였다. 각 주사 후 30분 동안 전신의 또는 주사 부위에서의 국소적인 즉각적 부작용에 대해서 환자를 관찰하였다. 각 백신 후 48시간째 (±4시간) 부작용에 대해서 환자를 추적 조사하였다.
도 10은 방사선 조사된 GBM6-AD 아폽토시스성 소체로 감작된 자가 수지상 세포로의 백신화 후 종양 퇴행을 보여주는 MRI 스캔이다. 이를 통해 동종 신경교종 세포에 대해서는 신규하다는, 인간 대상체에서의 치료학적 개념 입증이 증명되었다.
모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 본원에서 참고로 포함된다. 상기 명세서에서 본 발명은 그의 특정 실시양태와 관련하여 기술되었고, 설명하기 위한 목적으로 많은 상세한 설명이 기술되었지만, 본 발명은 추가의 실시양태가 가능하고, 본원에 기술된 상세한 설명 중 일부는 본 발명의 기본 원리로부터 벗어남 없이 상당 수준 변형될 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.
본 발명을 기술하는 것과 관련하여 "하나("a" 및 "an") 및 "그"라는 용어 및 유사 지시 대상을 사용하는 것은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수, 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는(comprising)," "가지는," "포함하는(including)," 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한, 넓은 해석을 인정하는(open-ended) 용어 (즉, "~을 포함하나, 그에 한정되는 것은 아니다"를 의미한다)로서 해석되어야 한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 값의 범위를 나열하는 것은 단지 상기 범위 내에 포함된 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 것에 대한 속기 방법으로서의 역할을 하고자 하는 것이며, 각각의 개별 값이 마치 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 일례, 또는 예시와 관련된 표현 (예컨대, "예컨대")를 사용하는 것은 단지 본 발명을 보다 잘 명확하게 하고자 하는 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떤 표현도 임의의 비청구 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 해석되서는 안된다.
본원에는 본 발명자에게 공지된, 본 발명을 수행하기 위한 최상의 모드를 비롯한 본 발명의 실시양태가 기술되어 있다. 상기 설명 판독시 상기 실시양태의 변형은 당업계의 숙련가에게 자명할 수 있을 것이다. 본 발명자들은 당업자들이 상기와 같은 변형을 적절히 사용할 수 있을 것으로 예상하고 있으며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시되는 것도 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바와 같이, 본원에 첨부된 특허청구범위에서 언급된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 추가로, 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 그의 가능한 모든 변형에서 상기 기술된 요소들의 임의이 조합이 본 발명에 포함된다.
ATCC PTA-11498 20101118

Claims (64)

  1. 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포를 포함하는 항종양 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 정제된 GBM6-AD 줄기 세포가 부착성 세포인 항종양 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포가 ATCC® 특허 기탁 지정번호 PTA-11498인 항종양 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, GBM6-AD 세포가 용해된 것인 항종양 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, GBM6-AD 세포가 방사선 조사된 것인 항종양 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생리학상 허용되는 비독성 비히클을 추가로 포함하는 항종양 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 항종양 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 아주반트가 CpG ODN, 폴리 ICLC, 아넥신 A2, 또는 TLR 리간드인 항종양 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 아주반트가 TLR7, TLR8 또는 TLR7/8 리간드인 항종양 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 아주반트가 이미퀴모드인 항종양 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 아주반트가 면역 반응을 자극하는 비-TLR 리간드인 항종양 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포 용해물이 캐리어에 접합된 것인 항종양 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 캐리어가 수지상 세포 또는 대식세포인 항종양 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 비-세포 캐리어에 함유되어 있는 항종양 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜에 함유되어 있는 항종양 조성물.
  16. 면역 반응 유도를 필요로 하는 동물에게 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항종양 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 동물에게 이미퀴모드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 이미퀴모드를 항종양 조성물 투여 이전에 투여하는 것인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항종양 조성물을 비경구로 투여하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 조성물을 근육내로, 피하로, 피내로 또는 정맥내로 투여하는 것인 방법.
  21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 경구로 또는 비내로 투여하는 것인 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항종양 조성물을 1회 초과의 시점에 투여하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항종양 조성물을 2회의 시점에 투여하는 것인 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항종양 조성물을 각 투여 시점에 100,000 - 100 x 106개의 GBM6-AD 세포의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 항종양 조성물을 각 투여 시점에 2 x 106개의 GBM6-AD 세포의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  26. 제17항에 있어서, 이미퀴모드를 국소적으로, 피내로, 피하로, 및/또는 림프절내 주사를 통해 투여하는 것인 방법.
  27. 제17항에 있어서, 이미퀴모드를 2개의 견갑골상 주사 부위에 국소적으로 투여하는 것인 방법.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 방사선 조사 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 방사선 조사 요법을 항종양 조성물의 투여 이전, 투여 동안, 또는 투여 이후에 실시하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 방사선 조사 요법을 6,000 cGY 미만의 선량으로 실시하는 것인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 조사 요법을 다회 시점에 걸쳐 실시하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 방사선 조사 요법을 3회 시점에 걸쳐 실시하는 것인 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 조사 요법을 5,220 cGY의 선량으로 실시한 후, 각각 360 cGY의 2회 추가 선량으로 실시하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 360 cGY의 1차 추가 선량을 5,220 cGY의 선량 후 10주 경과하였을 때 실시하고, 360 cGY의 2차 추가 선량을 5,220 cGY의 선량 후 14주 경과하였을 때 실시하는 것인 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 방사선 감작제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 방사선 감작제가 parp 억제제인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 방사선 감작제가 테모졸로미드인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 테모졸로미드를 초기 방사선 요법 동안 투여하는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 테모졸로미드를 5-200 mg/㎡/일의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 테모졸로미드를 75 mg/㎡/일의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 요법을 180 cGy씩의 분할량으로 5,220 cGy의 선량으로 실시하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 방사선 요법을 6 내지 7주 간에 걸쳐 실시하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 초기 방사선 요법 후 4 및 8주째에 이틀 연속으로 180 cGy씩의 분할량으로 추가의 360 cGy의 분할량을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 포유동물인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  46. 제16항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 덱사메타손 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 덱사메타손 요법을 진단시에 실시하는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 초기 방사선 요법 6주차까지 동물에서 덱사메타손을 중단하는 것인 방법.
  49. 제16항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조절성 T 세포 또는 골수 유래 억제 세포를 제거하는 화학요법제 또는 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 화학요법제가 수니티닙, 온탁, 시클로포스파미드, 겜시타빈, 및/또는 레티노산인 방법.
  51. 동물 내로 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 도입시키는 단계를 포함하는, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  52. 동물 내로 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 도입시키는 단계, 및 GBM6-AD에 특이적인 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, GBM6-AD에 특이적인 항체를 생성하는 방법.
  53. 수지상 세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항종양 조성물로 감작시키는 단계를 포함하는, 수지상 세포 백신을 제조하는 방법.
  54. 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포에 특이적으로 결합하는 정제된 항체.
  55. 제54항에 있어서, 정제된 부착성 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포가 ATCC® 특허 기탁 지정번호 PTA-11498인 항체.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 인간 항체 또는 인간화된 항체인 항체.
  57. 제56항에 있어서, 인간화된 항체인 항체.
  58. 제56항에 있어서, 완전 인간화된 항체인 항체.
  59. 제56항에 있어서, 단일 쇄 Fv 또는 scFv 단편인 항체.
  60. 원발성 뇌 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항종양 조성물, 또는 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 정제된 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 원발성 뇌 종양을 치료하는 방법.
  61. 암 치료를 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항종양 조성물, 또는 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 정제된 항체의 용도.
  62. 암의 예방적 또는 요법적 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항종양 조성물, 또는 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 정제된 항체의 용도.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 원발성 뇌 종양이 성상세포종, 다형 교모세포종, 수모세포종 또는 상의세포종인 방법 또는 용도.
  64. 제63항에 있어서, 원발성 뇌 종양이 다형 교모세포종인 방법.
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