CN115141241A - 具有微生物疫苗佐剂、肿瘤疫苗佐剂和肿瘤治疗作用的单链脱氧寡核苷酸 - Google Patents
具有微生物疫苗佐剂、肿瘤疫苗佐剂和肿瘤治疗作用的单链脱氧寡核苷酸 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种单链脱氧寡核苷酸，它具有抗原增效作用和肿瘤治疗作用。它可以和抗原或疫苗联合应用来提高抗原或疫苗的免疫效力，表现抗感染和抗肿瘤作用。它可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用治疗肿瘤。
Description
技术领域：
本发明涉及具有微生物疫苗佐剂和肿瘤疫苗佐剂作用的单链脱氧寡核苷酸，也涉及对肿瘤有治疗作用的治疗作用的单链脱氧寡核苷酸。
背景技术
具有特定碱基序列的单链脱氧寡核苷酸(single-strandeddeoxyoligodeoxynucleotides)可能激活个体对微生物和肿瘤细胞的固有免疫应答(innate immune responses)，可能增强个体对致病微生物和致病微生物抗原的体液免疫应答(humoral immune response)和细胞免疫应答(cellular immune response)，也可能增强个体对肿瘤细胞和肿瘤抗原细胞免疫应答，因而可能具有抗致病微生物和抗肿瘤的作用[Akira S，et al. Nature 2000，408：740-745；Klinman DM Nat Rev Immunol 2004，4249-259；Krieg AM，et al.J Clin Invest 2007，117 1184-94；Scheiermann J，etal.Vaccine 2014 Nov 12，32(48)6377-89]。由于具有上述活性，具有特定碱基序列的单链脱氧寡核苷酸可能被用作病原微生物疫苗的佐剂来增强病原微生物疫苗的效力、可能被用作肿瘤疫苗的佐剂来增强肿瘤疫苗的效力、也可能单独应用或与其它抗肿瘤制剂或药物联合应用来治疗肿瘤[Shi S，et al Vaccine 2019 May 27；37(24)3167-3178；Karbach J，etal Int J Cancer 2010，126 909-18；Speiser DE，et al J Clin Invest 2005，115 739-46；Valmori D，et al Proc Natl Acad Sci U S A.2007，104 8947-52；Carpentier A，etal Neuro Oncol 2010，12.401-8；Hirsh V，et al J Clin Oncol 2011，292667-2674；Smith DA，et al Cancer Immunol Immunother 2014，63.787-796；Chan E，et al CancerChemother Pharmacol.2015，75 701-9；Friedberg JW，et al.Br J Haematol 2009，146282-91；Brody JD，et al Blood 2009，113·85-94；Lim SH，et al J Immunol Ref2014，193 1519-24； Marabelle A，et al.2014，20 1747-56；Zent CS，et al.LeukLymphoma 2012，53 211-7；Link BK，et al J Immunother 2006，29 558-68；Reilley MJ，et al，J Immunother Cancer 2019 Nov 26，7(1)323，Mangsbo SM，et al J Immunother2010，33 225-35，Proc Natl Acad Sci U S A 2016，113 E7240-9；Buchbinder EI，etal.Am J Clin Oncol 2016，39 98-106；Ghtotto M，et al Int Immunol 2010，22 651-60]。
发明内容：
1、本发明提供了一种单链脱氧寡核苷酸(简称寡核苷酸)，其序列如序列表<400>1所示。它可以激活固有免疫应答，增强个体对致病微生物和肿瘤细胞的适应性免疫应答。
2、这种寡核苷酸可以经过各种化学修饰或被改构。
3、这种寡核苷酸可被用作致病微生物疫苗的佐剂增强其诱导保护性免疫应答的效力。
4、这种寡核苷酸可被用作肿瘤疫苗的佐剂增强其抗肿瘤的效力。
5、这种寡核苷酸可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂、抗肿瘤药物和抗肿瘤细胞联合应用来治疗肿瘤。
发明中的术语：
除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本发明中的解释、界定或说明。
“寡核苷酸”：寡核苷酸是由多个核苷酸组成的分子，其核苷酸的数量可以是几个或几十个。核苷酸 (nucleotide)是核酸、也是寡核苷酸的基本组成单位。核苷酸由核苷(nucleoside)和磷酸组成。核苷由戊糖(pentose)和碱基(base)组成。戊糖包括核糖和脱氧核糖。戊糖分子和碱基连接形成核苷 (nucleoside)。核苷由磷酸基团连接形成核苷酸。核苷酸通过磷酸二酯键连接形成寡核苷酸。组成核苷的碱基包括嘧啶和嘌呤。嘧啶包括胸腺嘧啶(thymine，缩写为T或t)和胞嘧啶(cytosine，缩写为C或 c)。嘌呤包括腺嘌呤(adenine，缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。寡核苷酸中的碱基可以是稀有碱基。稀有碱基包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和5-羟甲基胞嘧啶。寡核苷酸可以是单链、双链、环形或具有环形结构的分子。在本发明中，寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)可以用它的英文缩写ODN来代替。寡核苷酸中的核苷酸排列序顺序构成其一级结构，这种顺序也称核苷酸序列。核苷酸序列可用碱基顺序代表，因此，核苷酸的序列也称为碱基序列。脱氧寡核苷酸的序列可用碱基的英文缩写表示，T或t代表胸腺嘧啶，C或c代表胞嘧啶，A或a代表腺嘌呤，G或g代表鸟嘌呤。
“本发明提供的寡核苷酸”：是指如实施例1所述的寡核苷酸，被命名为W1。W1具有如序列表<400> 1所示的序列。本发明提供的寡核苷酸(W1)是单链脱氧寡核苷酸。在本发明中，单链脱氧寡核苷酸和寡核苷酸(ODN)可以互换使用，具有同样的含义。
“化学修饰”：本发明提供的寡核苷酸可被化学修饰(chemical modification)。寡核苷酸的化学修饰是通过引入或除去任何化学基因而使其共价结构发生改变的现象或方法。寡核苷酸的化学修饰部位可发生在磷酸二酯键、核糖和碱基。寡核苷酸的化学修饰可发生在5’端或3’端，可在合成时或合成后进行。本发明涉及的化学修饰包括但不限于对寡核苷酸骨架的修饰，如硫代修饰(核苷酸间磷酸二酯键中磷酸的氧原子被硫原子取代)和取代修饰(包括烷基、芳香基或其它任何化学基团的取代)。寡核苷酸的化学修饰包括碱基替代和碱基修饰，替代的碱基可以是稀有碱基或各种碱基的衍生物。寡核苷酸的化学修饰还包括在其 5’端和/或3’端连接一或多个核苷酸和/或其它任何化学基团。寡核苷酸的化学修饰还包括将其和蛋白、多肽的偶联(连接)。
“个体”：在本发明中涉及的个体(subject或individual)指人和非人类的脊椎动物。
“抗原”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可增强个体对抗原的免疫应答。抗原包括微生物抗原和肿瘤抗原。微生物抗原是微生物上可被B细胞受体或T细胞受体识别而激发个体适应性免疫应答(adaptive immune response)的物质或分子。采用微生物抗原制备成的疫苗在给个体应用后能使其获得对该微生物的免疫力，使其在再次接触到同样或相似病原体时受到保护。微生物抗原可以从微生物提取、也可以采用重组DNA技术生产或其它方法合成。肿瘤抗原是能在个体激发肿瘤特异性适应性免疫应答，这种免疫应答有肿瘤治疗作用。
“免疫应答”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可通过增强对致病微生物抗原和肿瘤抗原的免疫应答。在本专利中，免疫应答(immune response)和免疫反应可以互换使用，具有同样的含义。免疫应答是个体的免疫细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、树突细胞、巨噬细胞和粒细胞等对抗原或其它刺激物[如病原体相关的模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和损伤相关的模式分子(damageassociated molecular pattern，DAMP)]做出的反应。免疫应答的结果是抑制或清除入侵的致病微生物。对肿瘤细胞的免疫应答可限制肿瘤细胞的生长、杀伤肿瘤细胞。免疫应答包括固有免疫应答和适应性免疫应答。适应性免疫应答括细胞免疫应答和体液免疫应答。采用致病微生物抗原制成的疫苗所激发的免疫应答可以使被免疫的个体获得抵抗致病微生物感染的能力。采用肿瘤抗原制成的疫苗所激发的免疫应答可在被免疫的个体发生肿瘤治疗作用。促进个体对致病微生物的免疫应答可发生抗感染作用。促进个体对肿瘤细胞的免疫应答可发生抗肿瘤作用。本发明提供的寡核苷酸(W1)可通过增强对微生物抗原和肿瘤抗原的免疫应答而被用做微生物疫苗和肿瘤疫苗的佐剂，也可单独应用或和其它的抗肿瘤制剂、药物、细胞被用于肿瘤的治疗。
“抗原提呈细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可激活包括树突细胞(dendriticcell，DC)和B淋巴细(B细胞)在内的抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)。CD11c是DC的表面标志。CD19是 B细胞的表面标志。DC是表达CD11c的细胞(CD11c+细胞)。B细胞是表达CD19的细胞(CD19+细胞)。 APC在激活后上调CD80、CD40和MHC-II类分子的表达。检测APC表面的CD80、CD40和MHC-II分子可反映其激活。CD80、CD40和MHC-II分子表达上调的APC能更有效地向T细胞提呈抗原。
“树突细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可激活树突细胞(dendritic cell，DC)。激活的DC能有效地向未致敏CD4+和CD8+T细胞提呈微生物抗原或肿瘤抗原并将其激活[Steinman RM Annu Rev Immunol 2012，30 1-22；[Fu C，et al.Vaccines(Basel).2020Nov 26；8(4)：706]，进而增强个体对致病微生物抗原或肿瘤抗原的免疫应答。
“CD19+淋巴细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)能刺激CD19+淋巴细胞的增生。CD19+淋巴细胞是表面表达CD19分子的淋巴细胞，也被称为是CD19+B淋巴细胞或CD19+细胞。CD19+细胞是B淋巴细胞。能刺激CD19+淋巴细胞增生的制剂可增强个体对致病微生物的体液免疫应答而被用做致病微生物疫苗的佐剂。在致病微生物感染或接种微生物疫苗后数天，个体出现可产生特异性IgM的母细胞化B细胞 (PBs)。这些PB刺激T细胞分化成特化的滤泡辅助T细胞(T follicular helper，Tfh)。Tfh转而辅助B细胞产生特异性高亲和力的IgG和/或IgA[Quast I，et al Immunity 2021 Feb 9，54(2)205-210]。随着免疫应答的展开，淋巴结或其它淋巴器官的生发中心(germinal centor，GC)会进行性出现“长寿命抗体记忆”(long-lived“Ab memory)，表现为出现分泌高亲和力抗体的浆细胞和的循环记忆性B细胞(circulating memory B cells，MBCs)。此外，也出现长寿命记忆性Tfh(long-livedmemory Tfh，mTfh)[Quast I，et al Immunity 2021 Feb 9，54(2)205-210]。在GC生成的这些浆细胞最终定居在脾或骨髓的特化小区(specialized niches)，其寿命可长达数年或数十年。这种长寿命浆细胞可在无致病微生物存在的情况下持续分泌致病微生物特异性抗体进入血循环提供抗致病微生物保护。和定居的浆细胞相比，MBC在体内处于再循环状态，并可在发生致病微生物感染时迅速激活产生致病微生物特异性抗体并参与形成次级生发中心(secondary GC)[Quast I，et al Immunity 2021 Feb 9，54(2)205-210]。本发明提供的寡核苷酸(W1)可激活B淋巴细胞(B细胞)，表现为其表面CD80、CD40和MHC-II类分子显著升高。 CD80、CD40和MHC-II分子表达上调的B细胞能更有效地向T细胞提呈抗原，进而增强个体对致病微生物抗原的免疫应答。
“CD80”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可上调B细胞(B lymphocyte)表达CD80。CD80是B7- 超家族成员[Yi T，et al J.Immunol.(2011)186 2739-49]，为一种表达在APC上的共刺激分子(costimulatory molecules)[Teh YM，et al.Biomed Res Int.2021 Jan 6；2021：6671552]。在免疫应答过程中，CD80同T细胞上的CD28分子相互作用提供激活 T淋巴细胞的第二信号。T淋巴细胞激活是激发个体对致病微生物和肿瘤细胞免疫应答的关键条件。T淋巴细胞激活需要获得两个激活信号。第一激活信号来自T淋巴细胞通过T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)识别APC或靶细胞表面的抗原肽-MHC复合物。第二激活信号来自T淋巴细胞通过CD28 分子识别、结合APC或靶细胞表面的包括CD80在内的共刺激分子。第二激活信号也称为共刺激信号 (costimulatory signals)。仅获得第一激活信号的T淋巴细胞不能充分激活，甚至会进入免疫耐受状态。只有同时获得第一和第二激活信号后，T淋巴细胞才能被充分激活而行使功能[Sharma P et al Science 2015 Apr 3，348(6230)56-61；Greenwald RJ，et al.Annu Rev Immunol 2005；23 515-48；Croft M，et alCrit Rev Immunol 2017，37(2-6)261-290]。
“CD40”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可上调B细胞(B lymphocyte)表达CD40。CD40是一个43-50 kDa跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族(tumour necrosis factorreceptor superfamily)，也是一种共刺激分子[Foks AC，et al Br J Pharmacol 2017Nov；174(22).3940-3955]。CD40可表达在B细胞、树突细胞、单核巨噬细胞和一些非免疫细胞的表面。CD40L(CD154)是CD40的配体，为39-kDa的跨膜蛋白。激活的T细胞表达CD40L。CD40-CD40L的相互作用调节T细胞的激活、免疫球蛋白的类别转换和细胞因子的产生[Bosmans LA，et al J Cardiovasc Transl Res 2021 Feb，14(1).13-22]。
“淋巴细胞”：淋巴细胞(lymphocyte)指在血液、淋巴液和淋巴组织中存在的没有吞噬能力的单个核白细胞，包括B淋巴细胞(也称B细胞)、T淋巴细胞(也称T细胞)和固有免疫淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILC)[Ivanova DL，et al Front Immunol 2019 Feb28；10 196]。天然杀伤细胞(NK细胞)是一种ILC。T细胞可被分为表面表达CD4分子的T细胞(CD4+T细胞)和为表面表达CD8分子的T细胞(CD8+T细胞)。
“CD4+T细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可激活CD4+T细胞。CD4+T细胞是表面表达CD4分子的T细胞，为辅助性T淋巴细胞(Th)。Th辅助B细胞产生抗体，也辅助CD8+T细胞去杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。能激活CD4+T细胞的制剂可增强个体对致病微生物和肿瘤细胞的免疫应答。CD4+滤泡辅助T细胞(Tfh)是CD4+T细胞的一个亚群。淋巴结生发中(germinal centers，GCs)是抗体亲和力成熟的场所。 CD4+Tfh促进GC的形成和高亲和力抗体产生B细胞选择，是发生保护性抗体反应不可或缺的辅助细胞[Dan JM，et al Science2021 Feb 5，371(6529)eabf4063]。新抗原(neoantigen)特异性CD4+T细胞具有抗肿瘤作用[Brightmen SE，et al J Leukoc Biol. 2020 Apr，107(4)：626-633]。本发明提供的寡核苷酸(W1)可通过激活CD4+T细胞增强个体致病微生物抗原和肿瘤抗原的免疫应答，因而可被用作致病微生物疫苗和肿瘤疫苗的佐剂的佐剂，也可被用于肿瘤的治疗。
“CD8+T细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可激活CD8+T细胞。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是CD8+T细胞。CTL可杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞[HanJ，et al Semin Immunol.2020 Jun.49 101435]。本发明提供的寡核苷酸(W1)可通过激活CD8+T细胞增强个体对肿瘤抗原的免疫应答，因而可被用作肿瘤疫苗的佐剂或被用于肿瘤的治疗。
“CD69”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可刺激B细胞、树突细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达CD69。CD69是一种可诱导的跨膜II型C-凝集素蛋白，为T细胞的早期激活标志(earlyactivation marker)。在激活后3h就可检出。CD69上调(表达增多)是免疫细胞激活的一个标志[Gorabi AM，et al.J Autoimmun. 2020 Jul；111：102453]。
“I型干扰素”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可诱导I型干扰素(Type Iinterferons，IFN-I)。IFN-I 因能在体外培养细胞干扰病毒复制而得名。检测体外培养细胞是否能在病毒感染情况下受到保护也成为了检测IFN-I生物活性的经典方法。多种细胞产生IFN-I。IFN-I是一组蛋白质，包含IFN-α，IFN-β，IFN-o， IFN-δ，IFN-κ，IFN-ε，IFN-T和IFN-ω。IFN-α包括13序列部分同源的蛋白质。它们都有抗病毒的活性。病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可通过模式识别受体(patternrecognition receptors，PRRs)刺激个体的细胞产生IFN-I。IFN-I促进CD4+T细胞产生IFN-Y，增强天然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞的活性。IFN-I介导快速的抗病毒固有免疫应答，促进抗病毒的适应性免疫应答，也促进对肿瘤抗原的适应性免疫应答[Acosta PL，etal J Immunol Res.2020 May 8，2020 1372494]。本发明提供的寡核苷酸(W1)可诱导I型干扰素，因而可被用作致病微生物疫苗的佐剂和肿瘤疫苗的佐剂，也可被用于肿瘤的治疗。
“疫苗”：疫苗(vaccine)是采用微生物抗原制成的用于人工主动免疫的生物制品。抗原和佐剂是疫苗的两种主要成分。接种疫苗的目的是使个体获得对病原体的免疫力进而使其再接触到相应的病原体时受到保护。本发明提供的寡核苷酸(W1)可以和人用疫苗联合应用增强其免疫效力，这些疫苗包括但不限于下述人用致病性微生物疫苗：乙型肝炎病毒疫苗[Szmuness W，et al N Engl J Med.1980；303833-841，Inoue T，et al Vaccines(Basel)2020 Aug 16，8(3)456]、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)疫苗[Ciavattini A，et al.Vaccines(Basel).2020 Jul 2；8(3)：354]、人戊肝病毒(HepatitisE virus，HEV)疫苗[Mazalovska M，et al.Viruses.2020 Jul 30；12(8)：826]、人流感病毒疫苗[Lewnard JA，et al Vaccines 2018，6 28，Wei CJ，et al Nat Rev Drug Discov2020 Apr，19(4).239-252]、人手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)疫苗[LiML，et al Vaccines Vaccines(Basel)2021 Feb 27，9(3)199]、带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)疫苗[Baxter R，et al Pediatrics 2013，131 e1389-e1396，AndreiG，et al. Molecules.2021 Feb 20；26(4)：1132]和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)疫苗[Krammer F Nature 2020 Oct，586(7830)516-527；The Lancet RespiratoryMedicine Lancet Respir Med 2021 Feb，9(2)117]。
“抗感染”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可发挥抗感染作用。抗感染指对致病微生物引起的疾病的治疗和预防。
“致病微生物”：致病微生物包括致病性病毒和致病性细菌。在本发明中，致病微生物和微生物、致病性病毒和病毒、致病性细菌和细菌可以互换使用，具有同样的含义。
“致病性病毒”：本发明提供的寡核苷酸(W1)作为疫苗佐剂应用发挥抗致病性病毒(pathogenic viruses)感染的作用。这些致病性病毒包括但不限于乙型肝炎病毒[Szmuness W，et al N Engl J.Med 1980，303 833-841，Inoue T， et al Vaccines(Basel)2020 Aug 16，8(3)456]、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)[CiavattiniA，et al.Vaccines(Basel).2020 Jul 2；8(3)：354]、人戊肝病毒(Hepatitis E virus，HEV)[Mazalovska M，et al.Viruses.2020 Jul 30；12(8)：826]、人流感病毒[Lewnard JA，et al Vaccines 2018，6 28，Wei CJ，et al Nat Rev Drug Discov 2020 Apr，19(4)：239-252]、人手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)病毒[Li ML，et al VaccinesVaccines(Basel)2021 Feb 27，9(3)199]、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)[Baxter R，et al Pediatrics.2013，131 e1389-e1396，Andrei G，etal.Molecules.2021 Feb 20；26(4)：1132]和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)[Krammer F.Nature 2020 Oct，586(7830)516-527，The Lancet Respiraiory MedicineLaneet Respir Med 2021 Feb，9(2)117]。
“佐剂”本发明提供的寡核苷酸(W1)作为佐剂用于微生物疫苗或肿瘤疫苗，也可以和一种或多种其它的佐剂联合使用来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效力。佐剂(adjuvant)是在疫苗中和抗原一起应用的物质，具有下述活性(1)减少疫苗的接种次数；(2)延长疫苗的免疫持续期；(3)通过激动固有免疫应答促进体液免疫应答和细胞免疫应答；(4)扩展抗原诱导的交叉保护免疫应答；(5)增强弱免疫应答个体如老龄个体或免疫缺陷个体对抗原的免疫应答；(6)减少抗原的用量。可以和本发明提供的寡核苷酸(W1)联合应用的佐剂包括但不限于：(1)铝盐佐剂(aluminium salts，alum)[McKee AS，et al.CurrOpin Immunol. 2017 Aug；47：44-51]；(2)MF59佐剂(an oil-in-water emulsionadjuvant)[Ko EJ，et al Hum Vaccin Immunother 2018，14(12)3041-3045]；(3)AS04佐剂[xu H，et al Mol Pharm 2020 Sep 8，17(9)3259-3269]、(4)AS03佐剂[Madan A，etal.Vaccine 2017 Aug 16，35(35 Pt B)4621-4628]、(5)AS02佐剂[Nathalie GO，et alExpert Rev Vaccines(2011)10 471，Schleiss MR，et al Vaccine.(2014)32 2756-62](6)AS01佐剂[Didierlaurent AM，et al Expert Rev Vaccines 2017 Jan，16(1)55-63]、(7)AF03佐剂[Klucker MF，et al.J Pharm Sci 2012 Dec，101(12)4490-500]；(8)包括聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly IC)和poly-ICLC(polyinosinic-polycytidylic acid withpolylysine and carboxymethylcellulose) 在内的TLR3激动剂[Maisonneuve C，et alProc Natl Acad Sci U S A.2014 Aug 26 111(34)12294-9]；(9)包括monophosphoryllipid A(MPL)在内的， TLR4激动剂[Maisonneuve C，et al Proc Natl Acad Sci USA.2014 Aug 26，111(34)12294-9]；(10)包括imiquimod在内的TLR7激动剂[MaisonneuveC，et al Proc Natl Acad Sci u S A.2014 Aug 26，111(34)12294-9]；包括resiquimod在内的TLR7和TLR8激动剂[Maisonneuve C，et al Proc Natl Acad Sci U S A 2014 Aug26，111(34)12294-9]；(11)包括CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide)在内的TLR9激动剂[Maisonneuve C，et al Proc Natl Acad Sci U S A 2014 Aug 26，111(34)12294-9Campbell JD Methods Mol Biol 2017；1494 15-27]；(12)病原体相关模式分子及其类似物(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)[Luchner M，etal.Pharmaceutics.2021 Jan 22；13(2)：142]；(13)损伤相关模式分子及其类似物(damage-associated molecular patterns，DAMPs)[Zindel J，et al.Annu RevPathol.2020 Jan 24；15：493-518]；(14)包括 c-di-GMP(cyclic di-guanosinemonophosphate)在内的环二核苷酸及其类似物[Ablasser A，Chen ZJ.Science.2019 Mar8；363(6431)eaat8657；Chandra D et al STING ligand c-di-GMP improves cancervaccination against metastatic breast cancer Cancer Immunol Res 2，901-910(2014)]；(15)卡介苗(BCG)； (16)病毒小体佐剂(virosomes)[Alving CR，et al ExpertOpin Drug Deliv 2016 Jun，13(6)807-16]；(17)热不稳定内毒素(heat labileenterotoxin，LT)[Ma Y.Expert Rev Vaccines.2016 Nov，15(11)：1361-1371]；(18)包括GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)在内的细胞因子[Jaffee EM etal.J.Clin.Oncol 19，145-156(2001)] (18)；包括Montanide ISA-720和Montanide ISA-51在内的油包水乳化剂(water-in-oil emulsions) [Aucouturier J，etal.Expert Rev.Vaccines 1，111-118(2002)]；(19)脂质体(Liposomes)[Alving CR.JImmunol Methods 140，1-13(1991)，Neelapu SS et al Clin Cancer Res 10， 8309-8317(2004)，Moser C，et al Expert Rev Vaccines 12，779-791(2013)，Wiedermann U et alBreast Cancer Res Treat 119，673-683(2010)]；(20)纳米磷脂盘(Nanodiscs)和纳米颗粒[Kuai R，et al Nat Mater 16，489-496(2017)]；(21)病毒体(Virosomes)[Moser C，etal Expert Rev Vaccines 12，779-791(2013)，Wiedermann U et al Breast Cancer ResTreat 119，673-683 (2010)；(22)高分子聚合物(polymer)[Lynn GM et al NatBiotechnol 33.1201-1210(2015)]。
“肿瘤”：本发明中的“肿瘤”即现代医学定义的肿瘤，可以分为良性肿瘤和恶性肿瘤。肿瘤(tumor) 和癌症(cancer)可以互换使用，具有相同的含义。本发明提供的寡核苷酸(W1)单独应用或和其它抗肿瘤制剂、药物、细胞联合应用治疗肿瘤。这些肿瘤包括但不限于结肠癌、结直肠癌、肺癌、胃癌和胶质瘤。
“治疗”：对肿瘤的治疗指在个体控制肿瘤的进展、延长肿瘤患者的生存期、改善生活质量、减轻症状、使肿瘤缩小甚至消除或使肿瘤转移受到遏制。在本发明中“肿瘤治疗”和“抗肿瘤作用”或“治疗肿瘤”有相同的含义。抗肿瘤作用也包括对肿瘤发生、复发和转移的预防。本发明提供的寡核苷酸(W1)可被用于肿瘤的治疗。
“肿瘤抗原”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可以用作肿瘤抗原的佐剂。在肿瘤疫苗中，肿瘤抗原[Finn OJ.Cancer Immunol Res.2017 May；5(5)：347-354]可在个体强激发肿瘤特异性免疫应答，产生肿瘤治疗作用。肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原(tumour associatedantigens，TAAs)和肿瘤特异性抗原(tumour specific antigens)[Hu z，et al Nat RevImmunol.2018 Mar；18(3)：168-182]。致癌病毒抗原(Oncogenic viral antigens)可被列为肿瘤特异抗原[Hu Z，et al Nat Rev Immunol. 2018 Mar；18(3)：168-182]。肿瘤新抗原(Tumour neoantigens)是个体个性化的肿瘤特异性抗原，可被用于个性化的肿瘤疫苗(personalized tumor vaccines)[Hu z，et al.Nat Rev Immunol.2018 Mar；18(3)：168-182 Sahin U，et al.Science.2018 Mar 23；359(6382)：1355-1360：Ott PA，etal.Nature.2017 Jul 13；547(7662)：217-221]。
“肿瘤疫苗”：是采用肿瘤抗原加佐剂制成的疫苗[DeMaria PJ，et al.HematolOncol Clin North Am.2019 Apr；33(2)：199-214]。肿瘤疫苗对个体的肿瘤有治疗作用。本发明提供的寡核苷酸(W1)可被用作肿瘤疫苗的佐剂，增强其治疗肿瘤的效力。
“抗肿瘤制剂”：抗肿瘤制剂(anti-tumor agent)是应用于个体后可治疗肿瘤的制剂。在本专利申请中，制剂和药物可互换使用，抗肿瘤制剂和抗肿瘤药物可以互换使用，并表达同样的含义。抗肿瘤制剂包括但不限于下述：(1)肿瘤疫苗[DeMana PJ，et al HematolOncol Clin North Am 2019 Apr，33(2)199-214]；(2)包括CTLA-4抗体、PD-1/PD-L1 抗体免疫卡点抑制物(immune checkpoint inhibitors，ICIs)[de Miguel M，et al CancerCell 2020 Sep 14，38(3)326-333.Melero Iet al Nat Rev Cancer 2015Aug，15(8)457-72；Patdoll DM Nat Rev Cancer 2012 Mar 22，12(4)252-64]；(3)包括IL-2和干扰素在内的细胞因子[Rosenberg SA，et al N Engl J Med.1988 Dec 22，319(25)：1676-80；Rosenberg SA.Nat Clin Pract Oncol.2007 Sep；4(9)497：Di Trolio R，et al.CytokineGrowth Factor Rev.2015 Apr；26(2)203-12]；(4)溶瘤病毒(Oncolytic viruses)[Kaufman HL，et al.Nat Rev Drug Discov.2015 Sep；14(9)：642-62：June CH，et al.NEngl J Med.2018 Jul 5；379(1)：64-73]； (5)包括bevacizumab
(靶向血管内皮细胞生长因子的单克隆抗体)[Garcia J，et al.Cancer Treat Rev.2020 Jun，86.102017]在内的肿瘤血管抑制剂；(6)肿瘤治疗用靶向抗体；(7)包括Imatinib在内的抑制单个激酶的选择性小分子抑制物(Selective small molecule inhibitors)和包括Sorafenib和sunitinib在内的、靶向人激酶组(kinome.)的多种激酶多激酶小分子抑制物(Multikinasesmall molecule inhibitors)[Bedard PL，et al.Lancet.2020 Mar 28，395(10229)：1078-1088]。这些分子也被称为小分子激酶抑制剂[Jin Y，et al.Front Pharmacol.2020Jun 12；11：891]；
“肿瘤治疗用细胞”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可以和肿瘤治疗用细胞联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用细胞是应用于个体后能治疗肿瘤的免疫细胞，包括但不限于这些细胞包括但不限于(1)树突细胞[Nestle， F.et al.(1998)Nature Medicine 4：328-332；Palucka K.et al.Nat Rev Cancer.2012 Mar 22；12(4)：265-77 Kugler，A.et al，(2000)Nature Medicine 6：332-336：Stevens D，et al.Front Immunol.2021 Feb 12；11：620374；Gardner A，et al.Front Immunol.2020 May 21；11：924]；(2)基因工程改造的表达嵌合抗原受体 (chimeric antigen receptors，CARs)的T细胞(CAR-T)[Kershaw MH etal.Nat Rev Cancer.2013 Aug；13(8)：525-41：Hong M，et al. Cancer Cell.2020 Oct12；38(4)473-488]；(3)肿瘤浸润的淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes)[Rosenberg SA，et al.N Engl J Med.1988 Dec 22；319(25)：1676-80]；(4)天然杀伤细胞[Childs Rw et al.Nat Rev Drug Discov.2015 Jul；14(7)：487-98]。
“肿瘤治疗用抗体”本发明提供的寡核苷酸(W1)可和肿瘤治疗用抗体(tumortherapeutic antibodies)联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用抗体是对个体发生的肿瘤有治疗作用的抗体[Scott AM et al.Nat Rev Cancer.2012 Mar 22；12(4)：278-87]，这些抗体包括但不限于：(1)靶向CD20的Tositumomab(Bexxar)、Rituximab (Rituxan)和Ofatumumab(Arzerra；Genmab)；(2)靶向ErbB2的Trastuzumab(Herceptin)；(3)靶向表皮细胞生长因子受体的Panitumumab(Vectibix)和Cetuximab(Erbitux)；(4)靶向血管内皮细胞生长因子受体的Bevacizumab(Avastin)；(5)靶向CD30的Brentuximab(vedotin)；(6)靶向CD52 的Alemtuzumab(Campath)和靶向CD33的Gemtuzumab ozogamicin；(7)靶向免疫卡点分子抗体[Lipson EJ，et al Clin Cancer Res 2011 Nov 15，17(22)6958-62，Sharma P et alScience 2015 Apr 3，348(6230)56 61：Ribas A，et al Oncologist 2007 Jul，12(7)8/3-83.Sangro B，et al J Hepatol 2013 Jul，59(1)81 8，Ralph C et al Clin Cancer Res2010 Mar 1，16(5)1662 72，Topalian SL et al Curr Opin Immunol 2012Apr；24(2)20712，Ito A et al Biomed Res Int 2015.20156054/8.Ito A，et al Biomed Res Int2015，2015 6054/8 Ito A，et al Biomed Res Int 2015，2015 605478 de Miguel M，etal Cancer Cell 2020 Sep 14，38(3)326-333]。
“药用辅料”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可与一种或多种药用辅料(pharmaceutical excipients) 制成包括但不限于溶液、乳化液、脂质体和冻干粉等剂型(pharmaceutical dosage forms)[Kramer l，et al Pharm Res 2020 Aug 2，37(8)159，Zhang Y，et al World J Clin Oncol 2020 May 24，11(5)275-282]。在这些剂型中，该W1的使用剂量为有效剂量(Effective Dosages)。药用辅料是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，包括但不限于(1)包括Tween 80(polysorbate 80)和Triton X-100(TX-100)在内的表面活性剂(Surfactants)[Patel R，et al Int J Mol Sci 2020 Nov3，21(21)8224]；(2)包括聚乙二醇(PEG)在内的多聚物(Polymers)[Patel R，et al Int JMol Sci 2020 Nov 3，21(21)8224]；(3)包括棕榈酸在内的脂肪酸[Patel R，et al Int JMol Sci 2020 Nov 3，21(21)8224]；(4)包括山梨醇(sorbitol)在内的糖(Sugars)和多元醇(polyols)[Zhang Y，et al World J Clin Oncol 2020 May 24，11(5)275-282]；(5)包括组氨酸、精氨酸和甘氨酸在内的氨基酸[Zhang Y，et al World J Clin Oncol 2020 May24.11(5)275-282]；(6)缓冲液制剂(Buffer agents)[Zhang Y，et al World J ClinOncol 2020 May 24.11(5)275-282]；(7)tonicifying agents[Zhang Y，et al World JClin Oncol 2020 May 24，11(5)275-282]；(8)防腐剂(Preservatives)[Zhang Y，et alWorld J Clin Oncol 2020 May 24，11(5)275-282]；(9) 抗氧化剂(antioxidants)[ZhangY，et al World J Clin Oncol 2020 May 24，11(5)275-282]；(10)包括EDTA在内的螯合剂(chelators)[Zhang Y，et al World J Clin Oncol 2020 May 24，11(5)275 282]；(11)助溶剂(Co-Solvents)[Pedro SN，et al Int J Mol Sci 2020 Nov 5，21(21)8298]；(12)溶剂(Solvents) [Pedro SN，et al Int J Mol Sci 2020 Nov 5，21(21)8298]。
“有效剂量”：本发明提供的寡核苷酸(W1)的有效剂量(Effect ive Dosages)包括对微生物疫苗和肿瘤疫苗的免疫效力有增强作用的剂量，也指单独应用或和其它抗肿瘤制剂(药物)或抗细胞联合应用时对个体的肿瘤有治疗作用的剂量。剂量的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准和其它因素。这些因素包括但不限于个体的大小和健康情况和疾病的严重程度。本发明提供的寡核苷酸(W1)可单次或多次应用于个体，每次的剂量范围可在1微克到1000毫克的范围。
“给药途径”：本发明提供的寡核苷酸(W1)可采用肠外、外用或吸入的给药途径。肠外给药途径包括经静脉、腹膜、鞘内、肌肉、皮下、皮内、局部、瘤旁淋巴结、肿瘤组织直接注射和淋巴结内注射。外用给药途径包括经皮肤、口、眼、耳和鼻。吸入可经鼻粘膜和肺。
附图说明：
图1 W1的诱生I型干扰素的作用
采用L929细胞做水泡性口炎病毒(VSV)保护试验(VSV Protection assay)检测W1诱导的小鼠脾细胞培养中的I型干扰素活性。设Med孔(Med)、VSV孔(VSV)、IFN-α+VSV孔(IFN-α)、W1+VSV孔(W1) 和c-W1+VSV孔(c-W1)。在Med孔，用1ml 2％FBS的RPMI培养基培养L929细胞；在VSV孔，用1ml 含VSV病毒的2％FBS的RPMI培养基培养L929细胞；在IFN-α+VSV孔，用1ml含IFN-α(终含量104U/ml) 的2％FBS的RPMI培养基培养L929细胞；在W1+VSV孔，用1ml含W1诱导上清的2％FBS的RPMI 培养基培养L929细胞；在c-W1+VSV孔，用1ml含c-W1诱导上清的2％FBS的RPMI培养基培养L929 细胞。在IFN-α+VSV孔、W1+VSV孔和c-W1+VSV孔也加VSV。培养48h。采用结晶紫染色法显示结果。OD值(A570nm)代表I型干扰素的活性水平。n＝3。数据用平均值±SEM(standard error ofthe mean) 表示。
图2 W1的刺激B细胞增殖的作用
用完全RPMI培养基(Med)、含c-W1完全RPMI培养基(c-W1)、含CpG 1826完全RPMI培养基(1826) 或W1完全RPMI培养基(W1)和未致敏小鼠脾细胞共同培养48h，各孔均加EdU。CpG-1826(1826)是含CpG脱氧寡核苷酸，其序列是5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′[JordanM，et al Cancer Lett 2016 Apr 1，373(1)88 96]。用anti-CD19荧光抗体染色，然后加100μl iClick反应液(含
的EdU反应缓冲液)，参照
标记的EdU法细胞增殖流式检测试剂盒说明书进行。使用BD Accuri C6流式细胞仪进行检测。分析掺入EdU的细胞(EdU+cells)和掺入EdU的CD19+细胞(EdU+CD19+cell)。EdU+CD19+cell是发生增殖反应的B细胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。数据用平均值±SEM(standard errorof the mean)表示。n＝3-5)。
图3 W1的上调B细胞表达MHC II、CD80、CD86和CD40的作用
用W1刺激小鼠脾细胞，然后检测其中B细胞表面的CD80、CD86、CD40和MHC II的水平。(A)方法(Procedure)。分离小鼠脾(spleen)细胞(splenocyte)，将其加至24孔板中。设Med孔(Med)、W1 孔(W1)和c-W1孔(c-W1)。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在W1孔，加1ml含W1(终浓度3 μg/ml)完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)。培养 48h。用荧光标记的抗小鼠CD19、CD80、CD86、CD40和MHC II抗体做表面染色(surface staining)。做流式分析(flow cytometry)。(B)结果圈出活细胞门(Gate1)和CD19+细胞门(Gate2)，检测脾细胞中 CD19+细胞的CD80、CD86、CD40和MHC II的平均荧光强度(MFI)。*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。
图4 W1的树突细胞活化作用
分离小鼠脾(spleen)细胞(splenocyte)，将其加至24孔板中。设Med孔(Med)、c-W1孔(c-W1)， 1826孔和W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI 培养基(终浓度3μg/ml)；1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1 孔，加1ml含W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。CpG-1826是含CpG脱氧寡核苷酸，其序列是 5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′[Jordan M，et al Cancer Lett 2016 Apr 1，373(1)8896]。培养48h。用荧光标记的抗小鼠CD11c和CD69抗体表面染色。做流式分析(flowcytometry)，检测脾细胞中CD11c和CD69双阳性的细胞(CD11c+CD69+cells) 和CD11c+细胞CD69(CD69 on CD11c+cells)的平均荧光强度(MFI)。*代表p＜0.05。
图5.W1的CD4+T细胞活化作用
将分离的小鼠脾细胞加至24孔板中(3×106个/孔)。设Med孔(Med)、c-W1孔(c-W1)，1826孔和 W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-WI孔，加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1孔，加1ml含 W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。CpG-1826是含CpG脱氧寡核苷酸，其序列是 5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′[Jordan M，et al Cancer Lett 2016 Apr 1，373(1)88 96]。培养48h。收集脾细胞，用荧光标记的抗小鼠CD4 和CD69抗体表面染色。做流式分析(flow cytometry)。检测脾细胞中检测脾细胞中CD4CD69双阳性细胞(CD4+CD69+cells)和CD4阳性的细胞CD69(CD69 on CD4+cells)的平均荧光强度(MFI)。
图6 W1对小鼠脾细胞中CD8+T细胞的激活作用
将分离的小鼠脾细胞加至24孔板中(3×106个/孔)。设Med孔(Med)、c-W1孔(c-W1)，1826孔和W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1孔，加1ml含 W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。CpG-1826是含CpG脱氧寡核苷酸，其序列是 5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′[Jordan M，et al Cancer Lett 2016 Apr 1，373(1)88-96]。培养48h。收集脾细胞。用荧光标记的抗小鼠CD8 和CD69抗体做表面染色。用做流式分析(flow cytometry)检测脾细胞中CD8CD69双阳性细胞(CD8+ CD69+cells)和CD8阳性细胞CD69(CD69 on CD8+cells)的平均荧光强度(MFI)。
图7 W1对乙型肝炎疫苗的增效作用
在第0天和第28天(days)给小鼠接种(vaccination)乙肝疫苗(HBV)、含W1的乙肝疫苗(W1+HBV) 或含c-W1的乙肝疫苗(c-W1+HBV)。在第0、35、42、49、56和84天(Days post-vaccination)经尾静脉采血(bleeding)并分离血清。用ELISA(用乙肝病毒表面抗原包被)检测血清中的乙肝病毒特异抗体(anti-HBsAg antibody)，其水平用每毫升(mIU/ml)表示。○□▲分别代表一只小鼠。*代表p＜0.05， **代表p＜0.01。vs c-W1+HBV：W1+HBV与c-W1+HBV比较。
图8 W1对圆环病毒疫苗的增效作用
在第0天和第14天(days)给小鼠接种(vaccination)圆环病毒疫苗(PV)、含W1的PV(W1+PV) 和含B-CpG的PV(B-CpG+PV)。在第21天和第28天(Days post-vaccination)经尾静脉采血(bleeding)，并分离血清。用ELISA(灭活圆环病毒包被)检测血清中的圆环病毒特异性抗体(Anti-PV antibody)。抗体水平的高低用吸光值(A492 OD valuc)表示。○□▲分别代表一只小鼠。每个圆形符号、正方形符号或正三角符号分别代表一只小鼠。
图9、W1对肺癌的治疗作用
(A)操作流程(Experiment procedure)。于第0天，在小鼠左侧背部皮下注射(s.c.)接种LLC细胞 (inoculation of lung cancer LLC cells)。于第1，3，5，7天，分别经小鼠腹腔注射(i.p.)PBS，W1(10μg/ 只)，TIO3(10μg/只)或W1+TIO3。如此治疗4天为一治疗(treatment)疗程(cycle)。共4个疗程，疗程间隔6天(6-day interval)。TIO3是对转化生长因子-2(TGF-β2)mRNA具有干扰作用的寡核苷酸(TGFβ2 mRNA interferingoligonucleotides)(5′-TTACCACTAGAGCACCACA-3′)，可干扰、抑制TGFβ2的表达[Tu L，etal.J Leukoc Biol.2020 Nov；108(5)：1673-1692]。(B)肿瘤体积的测量。在接种后(dayspost LLC-inoculation)，观察肿瘤的生长情况。在肿瘤出现后，每2天使用游标卡尺分别测量肿瘤的长和宽。依此，计算得出肿瘤的体积(tumor volume)。每只小鼠的肿瘤体积的变化用黑线表示，每组小鼠肿瘤体积变化的平均值用红线表示。(C)荷瘤小鼠生存期：在接种肿瘤细胞后(days post-tumor inoculation)，观察并记录小鼠的生存状态，计算各组小鼠的生存率(survival)。
图10、W1对胃癌的治疗作用
于第0天，在小鼠背部皮下注射(s.c.)5×105个胃癌MFC细胞(gastric cancerMFC cells)。在第1，3，5，7 天给小鼠腹腔注射(i.p.)注射PBS，W1(ODN)(10μg/只)，TIO3(ODN)(10μg/只)或W1+TIO3。TIO3 是对转化生长因子-2(TGF-β2)mRNA具有干扰作用的寡核苷酸(TGFβ2 mRNA interfering oligonucleotides)(5′-TTACCACTAGAGCACCACA-3′)，可干扰、抑制TGFβ2的表达[Tu L，et al.J Leukoc Biol.2020 Nov，108(5).1673-1692]。观察、记录小鼠的生存状态(survival recording)。根据记录，计算各组小鼠的生存率(survival)。
实施例1寡核苷酸的合成及检测
W1是具有如序列表<400>1所示序列(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’)的单链脱氧寡核苷酸。c-W1是W1的对照单链脱氧寡核苷酸(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)。CpG-1826是含CpG脱氧寡核苷酸(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′)[Jordan M，et al CancerLett 2016 Apr 1，373(1)88-96]。TIO3是对转化生长因子-2(TGF-β2) mRNA具有干扰作用的寡核苷酸(TGFβ2 mRNA interfering oligonucleotides)(5′ -TTACCACTAGAGCACCACA-3′)，可干扰、抑制TGFβ2的表达[TuL，et al.J Leukoc Biol 2020 Nov；108(5)1673-1692]。W1，c-W1，CpG-1826和TIO3均由上海生工生物工程公司合成，骨架为全硫代修饰。
采用无菌PBS(8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠及0.24g/L磷酸二氢钠，PH＝7.4) 溶解W1，c-W1，CpG-1826和TIO3。经鲎变形细胞溶解法检测，W1，c-W1，CpG-1826和TIO3的内毒素含量＜5EU/mg。采用分光光度计在260nm波长定量W1，c-W1，CpG-1826和TIO3c。采用琼脂糖凝胶(3％)电泳鉴定W1或c-W1的完整性并核定其含量(根据已知含量单链脱氧寡核苷酸标准品判断)。分装，置于-20℃保存。
实施例2寡核苷酸(W1)的I型干扰素诱生作用
2.1.材料和设备
2.1.1 ICR小鼠
6-8周龄，体重18-20g，雌性，购自辽宁长生生物公司。小鼠饲料及垫料购自吉林省长春亿斯实验动物技术有限公司。按照国家卫生研究所实验动物护理和使用指南饲养小鼠。涉及的实验操作均在科学技术科学调查委员会的批准下进行。
2.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)和c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)均由上海生工生物工程公司合成。
2.1.3.水泡性口炎病毒
水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)，来自吉林大学基础医学院分子生物学教研室。
2.1.4 IFN-α
2.1.5.L929细胞
来自吉林大学基础医学院分子生物学教研室。
2.1.6.胎牛血清
胎牛血清(FBS)，购自Gibco USA。
2.1.7.细胞培养基
完全RPMI培养基(Gibco，USA)，含10％(v/v)胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml。无血清RPMI培养基，不含胎牛血清，含100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml。2％FBS的RPMI培养基，含2％(v/v)FBS，100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml。
2.1.8.结晶紫和柠檬酸钠
购自北京化工厂。
2.1.9.主要实验器材和设备
96孔培养板(NEST)、CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)和微量多功能酶标仪(美国Biotek仪器有限公司)。
2.2方法
2.2.1小鼠脾细胞的分离
用安乐死方法牺牲小鼠。置其于75％酒精中浸泡2min(分钟)。使用眼科剪、镊子取出小鼠脾脏。将其放入有6ml预冷的完全RPMI培养基的平皿(置冰上)中。用两片毛玻璃片将脾脏磨碎。用完全RPMI 培养基将磨碎的脾细胞悬起。悬液经300目滤网过滤至10ml离心管中。水平离心(1020rpm，5min)，弃上清。加入3ml预冷ACK溶液(0.155mol/L氯化铵，0.01mol/L碳酸氢钾，0.1mol/L EDTA，PH＝7.4)，充分混匀，2min后加入完全RPMI培养基至10ml。水平离心(1020rpm，5min)，弃上清。用1ml完全 RPMI培养基重悬细胞。混匀。计数。将细胞恳液置冰上备用。
2.2.2 W1诱导的小鼠脾细胞培养上清的获取
将分离的脾细胞加至24孔板中(3×106个/孔)。加入W1或c-W1(终浓度3μg/ml)。培养48h， 37℃，5％CO2。收集脾细胞至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm，5min)。收集上清，将其分装保存于-80℃超低温冷冻冰箱中备用或直接使用。
2.2.3 W1诱导的小鼠脾细胞培养上清中I型干扰素活性的检测
将采用完全RPMI培养基培养的L929细胞加至24孔板中(1×105个/孔)。过夜培养(37℃，5％CO2)，至形成80％的细胞单层。弃培养基。加无血清RPMI培养基(1ml/孔)，轻晃，弃培养基。
设Med孔、VSV孔、IFN-α+VSV孔、W1+VSV孔和c-W1+VSV孔。在Med孔和VSV孔，分别加1ml完全 RPMI培养基。在IFN-α+VSV孔，加1ml含IFN-α完全RPMI培养基，IFN-α的终含量是(104U/ml)。在W1+VSV孔，加1ml用完全RPMI培养基稀释(1∶1)W1诱导的小鼠脾细胞培养上清。在c-W1+VSV孔，加1ml用完全RPMI培养基稀释(1∶1)c-W1诱导的小鼠脾细胞培养上清。培养18h.37℃，5％CO2。
弃掉培养液。用1ml无血清RPMI培养基洗涤一次。在Med孔，加1ml 2％FBS的RPMI培养基。在 VSV孔、IFN-α+VSV孔、W1+VSV孔和c-W1+VSV孔，加1ml含VSV病毒的2％FBS的RPMI培养基。培养 48h，37℃，5％CO2。弃培养液。加0.25％结晶紫染色(200μl/孔)，室温，10分钟。弃染液。用RO 水(2ml/孔)洗涤，重复两次。吸净RO水。加柠檬酸钠缓冲液(200μl/孔)，置摇床中，100rpm，室温，1 h。使用多功能酶标仪在A570nm测OD值。
2.3结果
W1诱导的小鼠脾细胞培养上清可使L929细胞获得抵抗VSV感染破坏的能力，这证明，W1可刺激小鼠脾细胞产生具有抗病毒(VSV)活性的I型干扰素(图-1)。在个体对病毒或肿瘤细胞的免疫应答过程中产生的I型干扰素促进个体清除病毒或肿瘤细胞。因此，W1能通过诱生I型干扰素而展现病毒疫苗或肿瘤疫苗佐剂的效力，也能展现抗肿瘤的效力。
实施例3寡核苷酸(W1)的促进B细胞增殖的作用
3.1.材料和设备
3.1.1 ICR小鼠
同实施例2 2.1.1。
3.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)，c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)和CpG-1826或称1826(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′，见实施例1) 均由上海生工生物工程公司合成。
3.1.3胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6
3.1.6细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
3.1.7.荧光素标记抗体
抗鼠CD19抗体(553785)(BD公司)。
3.1.8.
标记的EdU法细胞增殖流式检测试剂盒
购自广州易锦生物技术有限公司。
3.1.9.主要实验器材和设备
24孔培养板(NEST)、CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)、流式细胞仪为Accuri C6 flow cytometer(BD Bioscience)、流式细胞仪检测结果分析软件为NovoExpress software(ACEA Biosciences)。
3.2方法
3.2.1小鼠脾细胞的分离
同实施例2 2.2.1
3.2.2 B细胞增殖检测
采用Edu掺入法检测了W1刺激小鼠脾细胞中CD19+细胞(B细胞)的增殖状态。将分离的小鼠脾细胞加至24孔板中(3×106个/孔)，分别加入W1(3μg/ml)，c-W1(3μg/ml)或1826(3μg/ml)。每孔加入EdU(10μM)。37℃，5％CO2培养48h。之后，将每孔的脾细胞悬液收集至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm)5min，弃上清。用1ml含2％FBS的PBS重悬细胞沉淀，置于冰上备用。每管加50μl稀释的anti-CD19抗体(用含2％FBS的PBS按1∶50稀释)。避光冰上孵育30min，加入1ml含2％FBS 的PBS，混匀，离心(1020rpm，5min)，弃上清。然后加100μliClick反应液(含
的 EdU反应缓冲液)重悬细胞(按
标记的EdU法细胞增殖流式检测试剂盒说明书进行)。室温避光孵育30min，洗涤细胞两次，弃掉上清，用200μl 2％FBS的PBS重悬细胞。用300目滤网过滤细胞悬液。使用BD Accuri C6流式细胞仪检测。在活细胞门内，检定EdU+CD19+细胞(增殖的B细胞)。
结果(图-2)显示，W1显著刺激脾细胞中的B细胞增殖。在个体对致病微生物体液免疫应答的过程中，抗原特异性B增殖，进一步演变为产生特异性抗体的浆细胞。因此，W1能通过刺激B细胞增促进个体对致病微生物疫苗的体液免疫应答，成为致病性微生物疫苗的佐剂。
实施例4寡核苷酸(W1)对小鼠B细胞表达MHC II、CD80、CD86和CD40的上调作用
4.1.材料
4.1.1 ICR小鼠
同实施例2 2.1.1。
4.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)和c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)均由上海生工生物工程公司合成。
4.1.3胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6
4.1.4细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
4.1.5荧光素标记抗体
荧光标记抗小鼠anti-CD19(557399，BD)、anti-CD40(102905，BD)、anti-CD80(553769，BD)、 anti-CD86(558703，BD)和anti-MHC II(562363，BD)。
4.1.6.主要实验器材和设备
同实施例3 3.1.9。
4.2方法
将分离的小鼠脾细胞(方法同实施例2 2.2.1)加至24孔板中(3×106个/孔)。加入W1或c-W1(终浓度3μg/ml)。在37℃，5％CO2条件下培养48h。收集脾细胞至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm， 5min)。收集细胞。用5ml 4℃预冷的PBS或FACS缓冲液离心(277g，5分钟，4℃)洗涤细胞。用4℃预冷的FACS缓冲液(200-1,000μl)悬起细胞。记细胞数，调细胞浓度。用台酚蓝排除试验检测细胞的活力。将1-10X106小鼠脾细胞转入5ml圆底聚苯乙烯管中。用FACS缓冲液离心(277g，5分钟，4℃)洗涤细胞。弃上清，将细胞悬在50-100μl含荧光素标记的抗小鼠CD19、CD80、CD86、CD40、MHC II抗体的FACS缓冲液中。每种荧光抗体的含量为0.5-1μg，冰上作用30-45min。样品避光。用FACS缓冲液离心(277g，5分钟，4℃)洗涤细胞。将细胞悬在50-100μl FACS缓冲液中，做流式分析。
4，3结果
W1能够显著促进B细胞表面CD80、CD40和MHC II的表达(图-3)。这一结果说明，应用W1可使抗原提呈细胞如B细胞表面的共刺激分子显著增多，因而使其能向T细胞提供更多的第二激活信号，进而促进对致病微生物抗原疫苗的适应性免疫应答。
实施例5寡核苷酸(W1)对树突状细胞的激活作用
5.1.材料
5.1.1 ICR小鼠
同实施例2 2.1.1。
5.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)，c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)和CpG-1826或称1826(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′，见实施例1) 均由上海生工生物工程公司合成。
5.1.3胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6
5.1.4细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
5.1.5荧光素标记抗体
荧光素标记的抗小鼠anti-CD11c(553801)(BD)和anti-CD69(553236)(BD)。
5.1.6.主要实验器材和设备
同实施例3 3.1.9。
5.2方法
将分离的小鼠脾细胞(方法同实施例2 2.2.1)加至24孔板中(3×106个/孔)。设Med孔(Med)、 c-W1孔(c-W1)，1826孔和W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1孔，加1ml含W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。培养48h。收集脾细胞至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm，5min)。收集细胞。用5ml 4℃预冷的PBS或FACS缓冲液离心(277g，5分钟， 4℃)洗涤细胞。用4℃预冷的PBS或FACS缓冲液(200-1,000μl)悬起细胞。记细胞数，调细胞浓度。用台酚蓝排除试验检测细胞的活力。用含荧光标记的抗小鼠CD11c和CD69抗体表面染色，做流式分析(flow cytometry)。检测脾细胞中CD11c和CD69双阳性的细胞(CD11c CD69 cells)和CD11c细胞CD69(CD69 on CD11c cells)的平均荧光强度(MFI)。
5.3结果
结果(图4)显示，W1能够明显提高活化DC的比例以及其活化水平。这一结果说明，应用W1可使DC 更高效激活T细胞，因而促进个体对微生物抗原和肿瘤抗原的适应性免疫应答。
实施例6寡核苷酸(W1)对CD4+T细胞激活作用
6.1.材料
6.1.1 ICR小鼠
同实施例2 2.1.1。
6.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)，c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)和CpG-1826或称1826(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′，见实施例1) 均由上海生工生物工程公司合成。
6.1.3胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6。
6.1.4细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
6.1.5荧光标记抗体
荧光素标记的抗小鼠anti-CD4(553049)(BD)和anti-CD69(553236)(BD)。
6.1.6.主要实验器材和设备
同实施例3 3.1.9。
6.2方法
将分离的小鼠脾细胞(方法同实施例2 2.2.1)加至24孔板中(3×106个/孔)。设Med孔(Med)、 c-W1孔(c-W1)，1826孔和W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1孔，加1ml含W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。培养48h。收集脾细胞至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm，5min)。收集细胞。用5ml 4℃预冷的PBS或FACS缓冲液离心(277g，5分钟， 4℃)洗涤细胞。用4℃预冷的PBS或FACS缓冲液(200-1,000μl)悬起细胞。记细胞数，调细胞浓度。用台酚蓝排除试验检测细胞的活力。用含荧光素标记的抗小鼠CD4和CD69抗体表面染色，做流式分析(flow cytometry)。检测脾细胞中CD4 CD69双阳性细胞(CD4+CD69+)和CD4阳性的细胞CD69的平均荧光强度 (MFI)。
6.3结果
结果(图-5)表明，W1能够显著上调CD4+T细胞CD69的表达。这说明，W1可激活个体的CD4+细胞；W1 可通过激活辅助性T细胞，因而促进微生物抗原和肿瘤抗原的适应性免疫应答。
实施例7 寡核苷酸(W1)对CD8+T细胞激活作用
7.1.材料
7.1.1 ICR小鼠
同实施例2 2.1.1。
7.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)，c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’)和CpG-1826或称1826(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′，见实施例1) 均由上海生工生物工程公司合成。
7.1.3胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6。
7.1.4细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
7.1.5荧光标记抗体
荧光素标记的抗小鼠anti-CD8(553033)(BD)和anti-CD69(553236)(BD)。
7.1.6.主要实验器材和设备
同实施例3 3.1.9。
7.2方法
将分离的小鼠脾细胞(方法同实施例2 2.2.1)加至24孔板中(3×106个/孔)。设Med孔(Med)、 c-W1孔(c-W1)，1826孔和W1孔。在Med孔，加1ml完全RPMI培养基；在c-W1孔，加加1ml含c-W1的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；1826孔，加1ml含CpG 1826的完全RPMI培养基(终浓度3μg/ml)；在W1孔，加1ml含W1(终浓度3μg/ml)完全RPMI培养基。培养48h。收集脾细胞至1.5ml离心管中。水平离心(1020rpm，5min)。收集细胞。用5ml 4℃预冷的PBS或FACS缓冲液离心(277g，5分钟， 4℃)洗涤细胞。用4℃预冷的PBS或FACS缓冲液(200-1,000μl)悬起细胞。记细胞数，调细胞浓度。用台酚蓝排除试验检测细胞的活力。用含荧光标记的抗小鼠CD8和CD69抗体表面染色，做流式分析(flow cytometry)。检测脾细胞中CD8 CD69双阳性细胞(CD8+CD69+)和CD8阳性的细胞CD69的平均荧光强度 (MFI)。
7.3结果
W1能激活小鼠脾细胞中的CD8+T细胞的(图-6)。CD8+T细胞可强效杀伤肿瘤细胞。这一结果说明， W1能通过激活个体的CD8+T细胞而对个体发生的肿瘤有治疗作用。
实施例8 寡核苷酸(W1)对重组蛋白疫苗的佐剂作用(1)
8.1材料
8.1.1 ICR小鼠
ICR雌性小鼠，6-8周龄、体重18-20g，购买自北京维通利华动物技术有限公司，由吉林大学基础医学院实验动物中心饲养。
8.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcga W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)和c-W1(5’-tgcagcaagcttgggtcactgcag-3’) 均由上海生工生物工程公司合成。
8.1.3重组乙型肝炎病毒疫苗
重组乙型肝炎病毒疫苗(简称乙肝疫苗或HBV)，国药准字S20040016，艾美汉信疫苗(大连)有限公司。
8.1.4乙型肝炎病毒表面抗原
重组乙型肝炎表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)，汉逊酵母表达，来自北京生物制品检定所。
8.2主要实验器材和设备
Corning 96-孔板(ThermoFisher)、SW-CJ-IF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、离心机 (德国Biofuge Fresco)和微量多功能酶标仪(美国Biotek仪器有限公司)。
8.3乙肝疫苗的配制
加含20μg HBsAg的乙肝疫苗(HBV)，50μg W1或50μg c-W1于青霉素瓶，用无菌PBS补齐至 2ml，此为含W1乙肝疫苗(W1+HBV)或含c-W1乙肝疫苗(c-W1+HBV)。充分混匀，置4℃备用。
8.4免疫、采集血清
在第0天，在小鼠两后肢分别肌肉注射100μl HBV、W1+HBV、c-W1+HBV。在第28天，强化免疫一次。于初次免疫第35、42、49、56和84天采血。将小鼠置于固定器中，用75％乙醇消毒尾静脉处。待干后，用无菌手术刀轻划尾静脉，用移液器收集血液(约100μl)至1.5ml离心管中。37℃恒温孵箱中静置 20分钟。之后，4℃静置30分钟。离心(11000rpm，15分钟)。收集血清，分装，-80℃保存。
8.5血清中特异性抗体检测(ELISA法)
使用无菌PBS溶解HBsAg(20μg/mL/孔)后，按照100μl/孔加入Corning 96-孔板(ThermoFisher) 酶标板中，4℃过夜孵育(包被)。用2％脱脂奶粉的TBS封闭，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1.5 小时。用稀释液(含2％脱脂奶粉，20％绵羊血清的TBS)稀释灭活补体的小鼠血清(1∶100、1∶50和1∶ 8000稀释)。加样，室温2小时。用含0.05％Tween20的TBS缓冲液洗5次。加羊抗小鼠IgG-HRP(1∶3000 稀释)。稀释液是含2％脱脂奶粉的TBS。室温1小时。用含0.05％Tween 20的TBS洗三次。加入100μl显色液(1％3，3′，5，5′-tetranethylbenzidine，0.01％H2O2，100mM醋酸钠，100mM柠檬酸)显色。用0.8 μM H2SO4终止显色反应。在使用酶标仪检测A492nm的OD值。
8.6结果
W1可增强重组蛋白疫苗(乙型肝炎病毒疫苗)的免疫效力(图7)。这说明，W1可被用于个体来增强其对致病微生物抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型微生物抗原或微生物疫苗的佐剂；W1可被用于个体来增强其对重组蛋白疫苗的体液免疫应答。
实施例9 寡核苷酸(W1)对重组蛋白疫苗的佐剂作用(2)
9.1材料
9.1.1 ICR小鼠
ICR雌性小鼠，6-8周龄、体重18-20g，购买自北京维通利华动物技术有限公司，由吉林大学基础医学院实验动物中心饲养。
9.1.2.寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)由上海生工生物工程公司合成。
9.1.3抗原
重组圆环病毒2b衣壳蛋白(ΔCP)为抗原[Vaccine.2016 Dec 7；34(50)：6358-6366]。
9.1.4佐剂
ISA 35乳化剂(Seppic)
9.2主要实验器材和设备
Corning 96-孔板(ThermoFisher)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、离心机 (德国Biofuge Fresco)和微量多功能酶标仪(美国Biotek仪器有限公司)。
9.3疫苗的配制
用PBS溶解重组圆环病毒2b衣壳蛋白(ΔCP)，将其和ISA35乳化剂按1∶1(体积∶体积)比例混合制成疫苗，此疫苗被命名为PV。配制含W1的PV(W1+PV)。配制含B-CpG的PV(B-CpG+PV)。每100μl W1+PV 或B-CpG+PV中含10μg ΔCP。B-CpG是含CpG脱氧寡核苷酸(5′-tccatgaCGttcctgaCGtt-3′)[Jordan M，et al Cancer Lett 2016 Apr 1，373(1)88-96]。每100μl W1+PV中含10μg W1。每100μl B-CpG+PV中含10μg B-CpG。
9.4免疫、采集血清
在免疫第0天和第14天，在小鼠右后肢肌肉注射W1+PV(100μl/针)、PV或B-CpG+PV。于第21天和第28天采集小鼠血清。尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。
9.5.小鼠血清特异性抗体检测
采用ELISA方法检测小鼠血清中的圆环病毒(PCV2b)特异性抗体。
9.5.1材料
9.5.1.1灭活圆环病毒(PCV2b)(天津瑞普生物技术股份有限公司，TCID50/ml＝7.0)。
9.5.1.3试剂
碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)， Na2HPO4·12H2O(国药集团化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)
9.5.1.4液体
包被液(25％戊二醛PBS)，PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4·12H2O和17.6mmol/L KH2PO4水溶液)，洗涤液(0.05％吐温20的PBS)，封闭液(5％脱脂奶粉的洗涤液)，0.1Mol/L柠檬酸水溶液，0.2Mol/L Na2HPO4.12H2O水溶液，10×甲乙液[0.1Mol/L柠檬酸水溶液(体积)：0.2Mol/L Na2HPO4.12H2O水溶液(体积)＝94.5∶100]，底物缓冲液[含OPD(1μg/ml)和0.045％H2O2的甲乙液]和终止液(20％浓硫酸)。
9.5.2 ELISA
用灭活PCV2b在包被液中包被96孔板，100μl/孔，4℃过夜。甩干液体，用封闭液于37℃封闭2小时，200μl/孔。加待测血清(1∶100稀释)，37℃，1小时。甩干液体，加洗涤液(300μl/孔)，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加HRP标记二抗(羊抗小鼠)IgG(用洗涤液做1∶5000稀释)。100μl/孔， 37℃1小时。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入底物液， 100μl/孔，室温避光(包锡纸)显色15min。加终止液(稀硫酸2mmol/L，50μl/孔。用酶标仪(波长492nm) 测。
9.5.3结果
W1可增强重组蛋白疫苗(圆环病毒疫苗)的免疫效力(图-8)。该结果说明，W1可被用于个体来增强其对包括圆环病毒在内的致病微生物抗原(疫苗)的免疫应答而被用作致病微生物疫苗的佐剂；W1可被用于个体来增强其对重组蛋白疫苗的体液免疫应答。
实施例10 W1的抗肺癌作用
10.1材料
10.1.1小鼠
C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6周龄。
10.1.2细胞
Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)细胞(ATCC)，起源于C57BL/6小鼠。使用完全RPMI1640 培养基(如11.1.4所述)，在37℃，5％CO2的条件下培养该细胞。
10.1.3寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)和TIO3(5′ -TTACCACTAGAGCACCACA-3′，见实施例1)均由上海生工生物工程公司合成。
10.1.4胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6
10.1.5细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
10.2.主要实验器材和设备
细胞培养瓶(无锡NEST公司)、CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)。
10.3.方法
10.3.1.Lewis肺癌细胞(LLC)的体内扩增
将体外传代培养的LLC细胞(1×106/0.1ml)接种于C57BL/6J小鼠背部皮下。长成实体肿瘤。牺牲小鼠，置于75％乙醇浸泡2-3min消毒。取出肿瘤。按无菌操作取出GL261细胞实体瘤。用手术剪将其在平皿中剪成小块，用生理盐水反复冲洗去除肿瘤组织和残留的血液。用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化30 min。滤过，制成单细胞悬液。在PBS中调细胞浓度为每1×106/100μl。
10.3.2接种Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)细胞
于第0天，小鼠左侧背部皮下注射经体内扩增的LLC细胞悬液100μl。按图-9注射PBS，W1，TIO3，W1+ TIO3。观察、记录肿瘤的大小、记录小鼠的生存期。
10.4结果
结果(图-9)表明，W1单独应用、和TIO-3联合应用可使肿瘤缩小，延长荷瘤小鼠的生存期。
实施例11 W1对胃癌的治疗作用：
11.1材料
11.1.1小鼠
Balb/c雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，18-22g。
11.1.2胃癌细胞
MFC细胞(mouse gastric cancer cell)是Balb/c小鼠来源的胃癌细胞(源自美国ATCC)。用完全RPMI1640培养基，在37℃，5％CO2的条件下培养。
11.1.3寡核苷酸
W1(5’-tcgacgaacgttcggtcgccgcgg-3’，见序列表<400>1)和TIO3(5′ -TTACCACTAGAGCACCACA-3′，见实施例1)均由上海生工生物工程公司合成。
11.1.4胎牛血清(FBS)
同实施例2 2.1.6
11.1.5细胞培养基
同实施例2 2.1.7。
11.2.主要实验器材和设备
细胞培养瓶(无锡NEST公司)、CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)。
11.3实验
将体外培养的MFC细胞于第0天接种于小鼠左后肢背侧皮下，注射体积为200μl，其中含1X106MFC 细胞。于接种MFC细胞后，按图10所示腹腔注射W1(溶于PBS)共注射4次。注射体积为100μl。每 100μl含10μg W1、10μg TIO3或W1 TIO3各10μg。对照组小鼠按同样的程序注射PBS。观察并记录小鼠的生存时间。
11.4结果
单独应用W1荷瘤小鼠生存期明显延长(图-10)和TIO3联合应用效力更强。这说明，W1可增强个体的抗胃癌细胞免疫应答，可被用来治疗包括胃癌在内的肿瘤。
Claims (18)
1.单链脱氧寡核苷酸，具有如序列表<400>1所示的序列。
2.按照权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以被化学修饰。
3.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可通过激活Toll样受体9表现免疫增强作用。
4.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可促进对微生物抗原或微生物疫苗的免疫应答，因而被用作微生物疫苗的佐剂，增强微生物抗原和微生物疫苗的抗感染效力。
5.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和重组乙型肝炎病毒表面抗原或乙型肝炎病毒疫苗联合应用于个体增强其免疫效力，产生抗乙型肝炎病毒感染的作用。
6.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和重组人乳头瘤病毒抗原或人乳头瘤病毒疫苗联合应用于个体增强其免疫效力，产生抗人乳头瘤病毒感染的作用。
7.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和重组人单纯疱疹病毒抗原或单纯疱疹疫苗联合应用于个体增强其免疫效力，产生抗人单纯疱疹病毒感染的作用。
8.按照权利要求1，2所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和包括重组流感病毒抗原或流感病毒疫苗在内的病毒抗原或疫苗联合应用于个体增强其免疫效力，产生抗流感病毒感染的。
9.按照权利要求1，2，3，4所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和其它的微生物疫苗佐剂联合应用于个体增强微生物疫苗的免疫效力。
10.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以单独应用于个体治疗肿瘤。
11.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和其它抗肿瘤制剂联合应用于个体治疗肿瘤。
12.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用于个体治疗肺癌。
13.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用于个体治疗胃癌。
14.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用于个体治疗结肠癌。
15.按照权利要求1，2，3所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以和肿瘤治疗用细胞联合应用于个体治疗肿瘤。
16.按照权利要求1，2，3，4，10，11所述的单链脱氧寡核苷酸，它能与药物学可接受的载体组成药物组合物应用并采用有效剂量。
17.按照权利要求1，2，3，4，10，11所述的单链脱氧寡核苷酸，它通过给药途径应用于个体。
18.按照权利要求1，2，3，4，10，11所述的单链脱氧寡核苷酸，它可以通过治疗装置或递送载体应用于个体。
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