JP6615148B2 - 免疫療法を用いたｉｌ−１２の誘導 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［分野］
本発明は、免疫細胞を用いた治療法に関する。より具体的には、本発明は、患者におけるＩＬ−１２の産生を促進する免疫細胞療法に関する。
［背景］
既知の最も的確、かつ強力で安全な疾病の予防および治療のメカニズムは、先天性免疫および適応免疫の双方の要素を組み合わせて、医学的な介入を行わずに多種多様な外来病原体を除去する、自然「滅菌」免疫応答である。免疫系は、再感染時に迅速に免疫応答を開始するために、除去された外来抗原を「記憶する」ように構築されている。免疫系は、癌患者の免疫系でさえも、ウイルスやバクテリアでみられるような外来抗原を認識することができ、また、該外来抗原を完全に破壊して身体から除去するのに十分な、外来抗原に対する応答を開始することができる。この滅菌免疫応答の強烈性および特異性を確認することができるのは、不全に陥り低下した免疫系によって、自己組織は影響されないながらも、例えば腎臓、肝臓、または心臓などのような大きな移植臓器が完全に破壊され得ることにおいて、確認することができる。外来抗原に対するこのような免疫の破壊効果は、患者の免疫応答が低下しているが故に逃避した腫瘍および／または他の抗原に転換し得ると、有益となるだろう。

免疫療法は、癌を含む様々な感染性および非感染性の疾病に対する免疫応答を、利用し、誘導し、および制御する方法を開発するために専ら向けられたものである。治療用ワクチンは、免疫系を教育するために構築された免疫療法の一種である。癌が存在する患者において、該ワクチンは、その患者の免疫系が腫瘍細胞を外来のものとして認識するように設計されている。免疫系が腫瘍を外来病原体として認識すると、理論的には免疫応答が誘発され、それによって、免疫細胞に大きな腫瘍を破壊させ、転移性腫瘍細胞が体内のどこに存在しようともその転移性腫瘍細胞を探し出して破壊させることができる。免疫治療が成功した後は、除去された外来細胞を「記憶する」免疫系の能力によって、免疫系が日和見性感染症の罹患を防ぐのと同じように、免疫系は、追加的な治療を施すことなくいかなる再発性癌細胞をも除去することができるだろう。

疾病または病原生物に対する個人の免疫系反応は、Ｔｈ１応答にもＴｈ２応答にもなり得る。Ｔｈ１応答では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞へと分化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）するが、それに対して、Ｔｈ２応答では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２細胞へと分化する。この一層広く使用されている分類方法は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスと呼ばれる。Ｔｈ１細胞が細胞媒介性免疫を促進する一方、Ｔｈ２細胞は液性免疫を誘発する。細胞性免疫（Ｔｈ１）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｔ細胞、およびマクロファージに対して、感染部位にて異常細胞および微生物を攻撃するように誘導する。液性免疫（Ｔｈ２）は、侵入した異物を中和するために用いられる抗体の産生をもたらす。一般的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２への分化が、多くのヒトおよび動物の癌研究において癌の進行との関連が示されてきている一方で、Ｔｈ１への分化は、腫瘍縮小および抗腫瘍免疫と相関がある。

個人の免疫応答、すなわちＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、当該個人におけるサイトカインのバランスによって評価され得る。サイトカインは、小さな細胞内シグナル伝達タンパク質分子である。サイトカインという用語は、通常、ナノモルからピコモルまでの濃度で調節因子として働く様々な可溶性タンパク質群および様々なペプチド群の総称として使用される。サイトカインは、健常な状態または病的な状態のいずれにおいても、個々の細胞および組織の機能活性を調節する。また、これらのタンパク質は、細胞間の相互作用を直接調節し、細胞外環境で行われる作用を調節する。インターロイキンは、免疫調節に関与す
る一群のサイトカインであって、免疫系の様々な細胞によって合成されることが可能である。インターロイキンは、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２などの複数のインターロイキンがあり、これらインターロイキンの各々は、免疫系内で特異的な役割を有する。

Ｔｈ１細胞は、炎症反応に関与する１型サイトカインを産生する。１型サイトカインには、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣ−Ｃケモカインが含まれる。Ｔｈ２細胞は、体液性免疫応答に関与する２型サイトカインを産生する。２型サイトカインには、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦ−ベータが含まれる。Ｔｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答は、１型応答が増加することで２型応答がダウンレギュレートされ、２型応答が増加することで１型応答がダウンレギュレートされるように、互いに対抗調節し合う。

ＩＬ−１２は、ｐ３５およびｐ４０のサブユニットで構成されるヘテロ二量体である。ＩＬ−１２は、一次的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって産生される。また、ＩＬ−１２は、単球およびマクロファージ、樹状細胞、ならびにＢ細胞によって産生され得る。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞に対して免疫調整作用をもたらす。内因性ＩＬ−１２は、最適なＴｈ１応答を生ずることに関与することが知られており、細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫において重要な役割を果たすことができる。

ＩＬ−１２は、免疫系の重要な要素を調節すること、また、研究室での研究や動物実験において劇的な抗腫瘍効果を有することが実証されてきたことから、熱心な研究対象とされてきた。ＩＬ−１２は、例えば、ヒト肺線癌および急性骨髄性白血病の成長の阻害に関与してきた。しかしながら、人体に高い毒性をもたらすがゆえに、治療計画において外因性ＩＬ−１２を用いることが制限されてきた。

１年より長きにわたる患者の血漿中のＩＬ−１２レベルを図示するグラフである。同種異系活性化Ｔｈ１細胞は、様々な投与手段を用いて様々な時間で患者に投与された。

［例示的な実施形態の詳細な説明］
本発明は、患者の血漿中のＩＬ−１２を検出可能なレベルに導く組成物および方法に関する。本発明は、患者に投与された場合に、重篤な毒性を生じることなく、患者の血漿中の内因性ＩＬ−１２を検出可能なレベルで産生し得るように導く組成物を含む。内因性ＩＬ−１２は、驚くことに、癌患者において検出され得る。該組成物は、好ましくは、同種異系活性化Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、ＩＬ−１２を産生することができないため、患者に投与されたＴ細胞組成物は、患者自身のＡＰＣによるＩＬ−１２の産生を引き起こす。

また、本発明は、患者自身の免疫系によって、該患者の内因性ＩＬ−１２の産生を誘発する方法を含む。該方法は、同種異系物質の、好ましくは同種異系活性化Ｔ細胞の、組成物を投与することを含む。該組成物は、単回投与または複数回投与にて投与され得る。好ましくは、同種異系活性化Ｔ細胞は、低用量で頻繁に投与される。同種異系細胞は、皮内ルート、静脈内ルート、または病巣内ルートによって投与され得る。その頻度は、３日置きよりも多いことが好ましい。これらの組成物が投与されると、がん患者でさえも、その患者自身の免疫系によって、血漿中の内因性ＩＬ−１２が検出可能なレベルで産生されるように誘導されることができる。一般的には、腫瘍によってＩＬ−１２の発現が抑制されるがゆえに、癌患者においてＩＬ−１２がみつけられることはない。驚くことには、本明
細書に記載の方法は、この抑制を克服することが可能であり、長期間にわたって、例えば数か月間または１年間までも、血漿中におけるＩＬ−１２の発現を誘発するのに十分な環境を創出することが可能である。さらに、血漿中に内因性ＩＬ−１２が存在することで、薬剤として外因性ＩＬ−１２を投与するほどの重篤な毒性を患者にもたらすことはない。

内因性ＩＬ−１２とは、そのＩＬ−１２が患者自身の免疫系によって患者内で合成されることを意味する。具体的には、該ＩＬ−１２は、患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって合成されることが可能である。ＡＰＣは、単球およびマクロファージ、樹状細胞、ならびにＢ細胞を含み得る。外因性ＩＬ−１２とは、そのＩＬ−１２が患者自身の免疫系によって合成されないことを意味する。外因性ＩＬ−１２は、別の個人から分離されたＩＬ−１２および／または純化されたＩＬ−１２、あるいは、ＩＬ−１２遺伝子を含むＤＮＡ構築体（ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）によって発現されるＩＬ−１２、を含む。

有利なことは、患者において内因性ＩＬ−１２が全身で産生されることによって、患者にもたらされるのは最小限の毒性か、あるいは、いかなる毒性ももたらされないことである。患者は、例えば一過性インフルエンザ様症状などのような、一過性の症状を経験する可能性がある。一般的には、外因性ＩＬ−１２が患者に投与されてきた場合、中毒作用によって治療の場での使用が限定されてきた。本明細書に記載の方法は、毒性を生じることなく血漿中のＩＬ−１２を全身に関して検出可能なレベルとし得るようなＩＬ−１２の生体内産生を促進するための方法であって、当該方法の能力は驚くものがある。この結果、患者自身の免疫系を利用することで、腫瘍および癌細胞の縮小および／または除去を目的としてＩＬ−１２が存在することから生ずる利益を活用することが可能となる。

これらの方法の使用は、Ｔｈ１環境に対して、具体的にはＩＬ−１２に対して、好適な反応をする他の疾患の縮小および／または除去に適用することができる。このような疾患には、癌、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ＨＰＶ、ヒト型結核菌、歯周病などの、慢性ウイルス性および細胞内細菌性またはマイコバクテリア性の疾病を含む感染症、および、アトピー性喘息のようなアレルギー性疾患が含まれる。さらに、ＩＬ−１２の生体内産生を促進する方法には、細胞性免疫を維持することによって抗老化効果が含まれ得る。健常者におけるＴｈ１細胞のＴｈ２細胞に対するバランスは、老化プロセスの一部として減少し、高齢者を感染症および癌にかかりやすくさせてしまう。内因性ＩＬ−１２の産生を促進することでＴｈ１／Ｔｈ２比を上昇させることが可能であり、それによって、疾病に対する脆弱性から守られる。

本発明の組成物は、一般的には、外来抗原、好ましくは同種抗原、を含む。該組成物は、少なくとも１つのＴｈ１サイトカイン、および／または、ＤＣの成熟を誘発してＩＬ−１２を産生することが可能な、少なくとも１つのＤＣエフェクター分子とを含む。治療用組成物は、一般的には、該少なくとも１つのＴｈ１サイトカイン、および／または、同種抗原と相互に結合された該少なくとも１つのＤＣエフェクター分子とを含む。該組成物は、好ましくは、該組成物の各成分を単一の細胞型にて提供することが可能な、生きている同種異系活性化Ｔ細胞を含む。好適な実施形態では、例えば、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子−アルファ、およびインターロイキン−２などのような、Ｔｈ１サイトカインを産生するために活性化され、かつ、細胞表面にＤＣ成熟エフェクター分子であるＣＤ４０Ｌを発現する、生きている同種異系Ｔｈ１細胞が用いられる。あるいは、該組成物の上記３つの成分は、２つ以上の細胞型から供給され得る。例えば、Ｔｈ１サイトカインが、１つの組成物中のある１つの細胞型から供給され、同種抗原が別の細胞型から供給され、また、ＤＣエフェクター分子が第３の細胞型から供給されてもよい。あるいは、ある１つの細胞型が上記成分のうちの任意の２つの成分を含み、第２の細胞型が第３の成分を含んでもよい。細胞型は、組成物の必要成分の供給源を提供しさえすれば、生きている必要はない。

あるいは、組成物の成分は、天然のタンパク質または生物工学処理されたタンパク質から供給可能である。例えば、組み換えられたもしくは精製されたＴｈ１サイトカイン、ＤＣ成熟分子、または同種抗原が、併用されてもよいし、あるいは、生きている細胞成分と組み合わせて用いられてもよい。組成物の成分は、「チップ」または生分解性プラットフォーム上で組み合わされ得る。これらの成分は、患者に対して同時に投与する必要はないが、任意の順で投与され得る。

治療用組成物にある同種抗原は、抗原が貪食され得るように、あるいは、抗原が処理されてＴ細胞に提供されるために免疫系に供与され得るように、提供されなければならない。抗原は、生きている細胞の天然部分でもよいし、あるいは、分子生物工学の技術を用いて変形もしくは生体工学処理されたものでもよい。抗原は、可溶性であるか、または、表面、生体もしくは生きている細胞の無傷部分、または、弱毒化された生体の一部に対して固定化され得る。好適な実施形態では、同種抗原は、同種異系Ｔ細胞であり、より好適な実施形態では、同種異系活性化Ｔ細胞である。

例示的な一実施形態では、治療用組成物は、Ｔ細胞で発現される同種抗原を含む。Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞であり、より好ましくはＴｈ１細胞である。Ｔｈ１細胞は、健常な献血者から得られたナイーブＣＤ４＋先駆体細胞から、生体外で分化され、拡張され、活性化され得る。好ましくは、該細胞は、投与のときに活性化された状態である。好ましくは、該細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８表面分子に対してモノクローナル抗体を架橋結合させることによって活性化される。架橋結合は、好ましくは、表面にＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体を固定化させることによって引き起こされる。好ましくは、該表面は、マイクロビーズ粒子またはナノビーズ粒子である。これらのビーズは、分解性ビーズであってもよい。これらの細胞は、炎症性Ｔｈ１サイトカインを多量に産生することが可能であり、細胞表面に、例えばＣＤ４０Ｌなどのような、エフェクター分子を発現させることが可能である。該エフェクター分子は、内因性ＩＬ−１２の産生を引き起こすことによってＴｈ１免疫の発達を促進する働きをする。

好適な実施形態では、治療用組成物は、活性化同種異系Ｔｈ１細胞を含む。これらの活性化Ｔｈ１細胞は、強力な炎症性物質となり得る。これらの活性化同種異系Ｔｈ１細胞およびこれらの製造方法は、例えば、米国特許第７，４３５，５９２号、第７，６７８，５７２号、第７，４０２，４３１号、および第７，５９２，４３１号に記載されており、参照によって本明細書に援用される。活性化同種異系Ｔｈ１細胞は、患者に対して意図的に不適合である。

様々なＴｈ１炎症性サイトカインが治療用組成物に含まれ得る。炎症性Ｔｈ１サイトカインの例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣ−Ｃケモカインが含まれ、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、またはＩＬ−１０は含まれない。サイトカインの成分は、天然のもしくは組み換えサイトカインであってもよいし、あるいは、サイトカインの受容体と相互作用するように構築された、生体工学で処理された分子であってもよい。サイトカインは、治療用組成物に直接含まれてもよい。あるいは、治療用組成物は、サイトカインを産出し、分泌する、生きている細胞または他の成分を含んでもよい。好ましくは、サイトカインは、活性化された細胞源を通して自然に提供される。その理由は、外因性サイトカインは患者にとって非常に有毒となる傾向がある一方で、内因性サイトカインはそうではないからである。いくつかの例示的な実施形態において、治療用組成物は、Ｔ細胞を活性状態にて含み、該Ｔ細胞は、炎症性Ｔｈ１サイトカインを産出し、分泌するため、治療用組成物中でこれらのサイトカインの発生源としての役割を果たすことが可能である。

治療用組成物は、未熟ＤＣの成熟を引き起こす１つまたは複数の因子を含み得る。具体的には、ＤＣ１細胞の成熟およびＩＬ−１２の産生を促進する成熟因子は、インターフェロン−ガンマの産生およびＴｈ１適応免疫をもたらす。ＤＣは、未熟な抗原捕捉細胞から、成熟した抗原提示Ｔ細胞−プライミング細胞へと進化することが可能であり、該細胞は、抗原を免疫原に変換し、免疫応答を開始するのに必要なサイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子を発現する。誘発された、Ｔ細胞に媒介される免疫応答の種類（Ｔｈ１対Ｔｈ２）は、周囲の微小環境から受ける活性シグナルに応じて変化する。例えば抗腫瘍免疫や抗感染症免疫などのような、免疫を調整するＤＣの能力は、Ｔｈ１免疫を促進するためのＤＣの成熟度に依存する。ヒトＤＣは、均一な集団ではない。抗腫瘍免疫を誘発することに加えて、ＤＣは、アネルギーまたは耐性をも誘発することができる。ＤＣは、ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。骨髄樹状細胞（ＤＣ１）および形質細胞様ＤＣ（ＤＣ２）は、ヒトＤＣの２つの主要な亜集団であり、それらの特徴は、表現型、移動、および機能において大きく変わる。ＤＣ１細胞は、効果的なＴ細胞刺激因子であって、腫瘍特異的免疫応答を誘発する。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ１細胞が、主としてＴｈ１の分化を誘発する一方で、ＩＬ−３（ＣＤ１２３）の受容体を発現するＤＣ２細胞が、主としてＴｈ２応答を促進する。これら両ＤＣ集団は、健康なドナーに比べて、癌患者では著しく低い。ＤＣ１細胞は、成熟するとＩＬ−１２を産生し、また、ＤＣ２細胞は、ＩＬ−１０を産生する。

例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１２などのようなサイトカインがＤＣの成熟過程の間に産生されることは、Ｔｈ１あるいはＴｈ２免疫応答へとＤＣが誘導されることに影響を及ぼす。抗原提示分子および共刺激分子を高いレベルで発現することに加え、成熟したＤＣは、Ｔｈ１免疫応答を刺激するために、多量のＩＬ−１２を放出しなければならない。ＩＬ−１０の放出によって、共刺激分子のアップレギュレーションとＩＬ−１２の産出とが妨害されることでＤＣの成熟過程が阻止され、その後、Ｔｈ１応答を開始するためのＤＣの能力が制限される。

以下に記載の因子を含む様々な因子によって、抗原取り込みおよび抗原処理に続く、ＤＣ１、ＩＬ−１２産生細胞となるＤＣの成熟が誘発され得る：全バクテリアまたはバクテリア由来の抗原（例えば、リポ多糖、ＬＰＳ）、例えばＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦなどの炎症性サイトカイン、選択的細胞表面受容体（例えば、ＣＤ４０）のライゲーション、およびウイルス産物（例えば、２本鎖ＲＮＡ）。未熟ＤＣでのＦａｓ結合は、例えば、ＩＬ−１ベータおよびＩＦＮ−ガンマの成熟および放出の双方を誘発する。ＣＤ４０のライゲーションは、Ｂ７−１／ＣＤ８０およびＢ７−２／ＣＤ８６共刺激分子のアップレギュレーション、ＩＬ−１２の分泌、および、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ）の放出を促進する。

いくつかの好適な実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ＤＣが成熟するための因子として含まれる。ＤＣの成熟を引き起こすその他の因子を含むことも、本発明の範囲内である。いくつかの例示的な実施形態においては、治療用組成物は、当該表面上に高密度のＣＤ４０Ｌを発現する、活性化された状態のＴ細胞を含む。ＣＤ４０Ｌは、ＩＬ−１２を産生するための、ＤＣを成熟させるための強力なエフェクター分子である。

ある１つの例示的な実施形態では、治療用組成物は、活性化同種異系Ｔ細胞と、少なくとも１つのＩ型サイトカインと、ＤＣの成熟を引き起こす少なくとも１つの因子とを含む。これらの成分を含む組成物は、例えば、２０１０年１２月１４日に出願され、参照によって本明細書に援用される、係属中の米国特許出願番号第１２／９６７，９１０号に記載されている。

微小環境内へ腫瘍関連抗原を放出するために、腫瘍細胞の一部を切除した後に治療用組成物を腫瘍内投与することによって、ＤＣがＤＣ１表現型へと成熟するための強力なアジュバント効果を提供することができる。ＤＣ１表現型は、ＩＬ−１２を産生し、１型抗腫瘍免疫の発達と、腫瘍の免疫回避メカニズムのダウンレギュレーションとを促進する。治療用組成物の投与は、例えば、静脈内投与、皮内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、病巣内投与、胸腔内投与などを含む、他の方法によっても達成され得る。皮膚にはランゲルハンス細胞と呼ばれる未熟ＤＣが豊富にあることから、好ましくは、組成物は、まず経皮投与される。例えば、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子−アルファ、ＩＬ−２、およびＧＭ−ＣＳＦなどの炎症性Ｔｈ１サイトカイン、および、例えばＣＤ４０ＬなどのＤＣ成熟因子の存在下で、ランゲルハンスの細胞は、同種抗原を摂取して、ＤＣ１、ＩＬ−１２産生細胞に成熟する。これらの成熟した細胞は、リンパ節へ移動して、Ｔｈ１免疫の発達を促進する。

組成物を皮内注射することで、患者を「プライミング（ｐｒｉｍｅ）」して、組成物中の同種抗原に対して免疫を有するようにすることができる。皮内注射が複数回行われることで、患者の循環系において、同種抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞の数を増加することができ、それによって、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを変化させることとなる。１×１０^６個から１×１０^７個の同種異系活性化Ｔｈ１細胞を注入することは、好適な皮内投与量であり、液体１ｍｌに対して１×１０^７個であることが最も好適である。皮内投与は、Ｔｈ１記憶細胞の循環数を増加させるために、複数回繰り返されることが好ましい。皮内投与の頻度は、好ましくは７日置きに、より好ましくは３〜４日置きに、約３〜４回注射することである。

好適な実施形態では、皮内投与の後には、ｉｎ−ｓｉｔｕワクチンを作り出すために、組成物の腫瘍内投与が行われる。腫瘍内投与は、好ましくは、標的病変にあるいくつかの腫瘍細胞を生体内原位置（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で切除することに続いて行われる。切除は、好ましくは、超低温（冷凍アブレーション）または熱（放射線療法）を用いて行われるが、アルコールアブレーション、化学療法、および／またはモノクローナル抗体薬を含む様々な方法を用いて行うことも可能である。好適な腫瘍内投与量は、約１×１０^７個から１×１０^８個の間であり、最も好ましくは約３ｘ１０^７個である。１回目の腫瘍内投与はアブレーションに続いて速やかに注入され、２回目の腫瘍内投与は、１回目の注入後約７日以内に、好ましくは約３〜４日以内に注入されることが好ましい。組成物の腫瘍内注射が後に続くこのアブレーションのプロセスは、必要に応じて繰り返され得る。

前述の方法は、また、好ましくは、宿主の（先天性および適応性の両方の）免疫細胞の活性化、および、腫瘍の場所を含む炎症部位へのそれらの溢出を引き起こすために、組成物を静脈内へ投与することを含む。同種異系活性化Ｔｈ１細胞の組成物の静脈内投与には、好ましくは、約１×１０^７個から１×１０^９個、より好ましくは約５×１０^７個から１ｘ１０^８個が含まれる。この静脈内注射は、数回、好ましくは月１回、繰り返され得る。

組成物の同種異系Ｔｈ１細胞は、大量の１型サイトカイン、すなわち、ＩＬ２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、およびＧＭ−ＣＳＦ、を産出することが好ましい。未熟ＤＣが抗原を貪食し処理している微小環境に炎症性Ｔｈ１サイトカインが存在することで、ＤＣ１、ＩＬ−１２産生細胞への成熟の促進が助けられ得る。ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γのレベルを刺激することが可能であり、このＩＦＮ−γのレベルによって、次は、Ｔｈ１免疫の促進がもたらされ得る。ＩＦＮ−γは、１型抗腫瘍免疫を促進するために必要な、重要な１型サイトカインである。ＩＦＮ−γは、腫瘍細胞の成長を直接妨げ、Ｔ細胞が媒介する抗腫瘍反応を誘発することで、抗腫瘍効果を仲介することができる。ＩＦＮ−γの分泌は、独立して、ＮＫ細胞の応答に寄与し、そして、ＩＬ−１２によって活性化されたＮＫ細胞の応答を促進することができる。

活性化同種異系Ｔｈ１細胞を含む好適な薬剤は、健常な選別された献血者から得た、純化された先駆体から得ることができる。該細胞は、皮内注射もしくは腫瘍内注射、または、静脈内注入、のいずれかのために処方された、無菌性の低エンドトキシン投与にて供給されるべきである。また、該細胞は、腹腔内注入、胸膜腔内注入、または硬膜外注入用に処方されてもよい。提供者は、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＲＰＲ（梅毒）に対して陰性であることをテストされることが好ましく、該細胞は、マイコプラズマ、ＥＢＶ、およびＣＭＶに対して陰性であることがテストされることが好ましい。好適な実施形態では、活性化同種異系細胞は、患者に対してＨＬＡ不適合である。

本発明の方法は、一般的には、患者の血漿中において内因性ＩＬ−１２を検出可能なレベルで産生することに関する。本方法は、患者の血漿中において内因性ＩＬ−１２を検出可能なレベルで産生するために、患者の免疫系を操作するようにして本発明の組成物を投与することを含む。本明細書に記載された方法によって、癌患者のＴｈ１免疫細胞の循環数を増加させ、Ｔｈ２環境からＴｈ１環境へとバランスを移すことができる。さらに、本方法は、抗腫瘍特異性Ｔｈ１免疫を引き出すステップ、および／または、腫瘍の免疫回避をダウンレギュレートするために、先天性および適応性免疫応答の成分を活性化して持続的なＴｈ１サイトカイン環境を発生させるステップを含んでもよい。

本発明の方法は、外来抗原に対する患者のＴｈ１免疫を促進するために、外来抗原を含む組成物を投与することを含み得る。本方法は、また、少なくとも一部の腫瘍の壊死を生じる腫瘍の全てまたは一部を切除することを含んでもよい。患者の腫瘍を壊死させるために、様々な方法が用いられ得る。また、本方法は、腫瘍壊死部位、すなわち腫瘍病巣部位に近接して炎症性微小環境を形成することを含んでもよい。さらに、本方法は、長期に渡ってＴｈ１環境を維持するために、患者の適応免疫細胞および先天性免疫細胞を活性化することも含み得る。好適な実施形態では、本方法の重要な要素として、上述のように、活性化同種異系Ｔ細胞を含む薬剤または組成物を使用することが含まれる。

ヒト癌患者のほとんどが、一般的には、偏った（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）Ｔｈ２免疫を示すので、この治療方法の目的は、一般的には、癌患者における循環性Ｔｈ１細胞の数を増加させることである。循環性Ｔｈ１細胞の数は、上述された、外来抗原を含む治療用組成物のうちの１つを、癌患者に投与することにより該患者内で高められ得る。

例示的な実施形態では、患者は、皮内注射される活性化同種異系Ｔｈ１細胞を投与される。好適な実施形態では、皮内注射は、週１回で約３週間〜４週間の週間スケジュールに基づいている。別の好適な実施形態では、皮内注射は、約３日〜４日置きに複数回投与されてもよい。皮内注射は、２日置きに、または一年間まで間隔を空けて、投与されてもよい。注射スケジュールは、循環しているＴｈ１記憶細胞のフットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）を向上するように策定されるべきである。外来細胞に発現された同種抗原は、強力な免疫拒絶反応を刺激し得る。さらに、組成物中におけるＴｈ１サイトカインの存在によって、あるいは同種異系細胞によるＴｈ１サイトカインの発現によって、Ｔｈ１記憶免疫に向けて、同種抗原に対する免疫応答を誘導するために必要な、炎症性のアジュバント環境を提供することが可能である。これによって、同種異系Ｔｈ１細胞内に含まれる同種抗原に特異的な、患者内で循環しているＴｈ１記憶細胞のプールを増加することが可能となる。複数回の投与は、追加接種（ｂｏｏｓｔｅｒ ｓｈｏｔ）の役割を果たし得るので、同種抗原に特異的な循環性記憶Ｔｈ１細胞の数を増加させる。

いくつかの実施形態では、同種異系活性化Ｔ細胞の投与に続いて、患者の応答を向上させるために追加のステップが行われてもよい。これらのステップには、例えば、追加の同
種異系活性化Ｔ細胞の腫瘍内投与をするとともに、腫瘍壊死を引き起こす腫瘍を切除することが含まれ得る。同種異系活性化細胞を静脈内に追加で投与してもよい。これらの方法は、参照によって本明細書に組み込まれるＨａｒ−Ｎｏｙの米国特許第７，９７２，５９４号に記載されている。

本明細書に記載された方法を用いて治療用組成物または薬剤を投与することで、患者自身の免疫系によって、患者における内因性ＩＬ−１２の全身での産生が促進され得る。患者における内因性ＩＬ−１２の濃度は、患者の血漿中においてＩＬ−１２が検出できれば、十分である。ＩＬ−１２の検出可能なレベルは内因性のものであり、治療用組成物に存在し得るＩＬ−１２から生じるものではない。その理由は、一般的には、同種異系材の投与によって誘発された拒絶反応において、その組成物の成分は、患者の免疫系によって排除されるからである。好適な実施形態では、組成物は、ＩＬ−１２を産生することができないＴ細胞を含む。したがって、患者の血漿中にて検出されたいかなるＩＬ−１２も、患者自身の免疫系によって産生されたＩＬ−１２の結果である。

好ましくは、ＩＬ−１２は、患者の免疫細胞、例えば、患者自身の単球、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞によって産生される。これらの細胞は、本明細書に記載された組成物の投与によって生成された炎症性またはＩ型サイトカインの影響下で、成熟することとなる。

患者の血漿中のＩＬ−１２の濃度は変動し得るが、一般的には、少なくとも約８０００ｐｇ／ｍｌである。患者の血漿中のＩＬ−１２の濃度は、好ましくは、約８０００ｐｇ／ｍｌから２００，０００ｐｇ／ｍｌの間である。本明細書に記載されているように、患者の血漿中において検出されたＩＬ−１２の濃度は、毒性に関する問題を生じない。しかしながら、外因性ＩＬ−１２の投与は、患者に有害であることが知られてきた。血漿中でＩＬ−１２の発現に血清転換する患者は、血清中にＩＬ−１２を発現しない患者と比べて、生存率が高い。ＩＬ−１２のレベルは、生存率との相関はないかもしれないが、ＩＬ−１２の存在だけは極めて重要である。

一般的には、組成物の投与後で一定期間が経過すると、ＩＬ−１２の増加が検出される。好ましくは、治療用組成物を約３〜４週間投与した後、血漿中においてＩＬ−１２が検出可能となる。最後の組成物を投与した後、ＩＬ−１２の血清転換において約９０日〜１２０日間の遅延が生じ得る。

血漿中のＩＬ−１２は、様々な方法を用いて検出することができる。ＩＬ−１２は、ｐ４０鎖およびｐ３５鎖と呼ばれる２つのサブユニットを有し、ｐ４０に特異的な抗体が検出には好適である。ＩＬ−１２の存在を検出するには、いくつかの方法が利用可能である。例えば、ＩＬ−１２の検出には、ＥＬＩＳＡ法やサイトカインビーズアレイが含まれ得る。

本明細書に記載された方法は、ヒトを含む様々な患者に好適となり得る。また、他の哺乳類に対しても本方法を用いてもよい。
本発明は、患者の疾病を治療する方法も含む。その疾病には、病原体によって引き起こされた疾病だけでなく、上述のような癌性腫瘍や血液悪性疾患が含まれ得る。患者におけるＴｈ１応答の影響を受けやすい他の疾病もまた、本明細書に記載された方法を用いて治療することが可能である。患者は、本明細書に記載された方法に従って、同種異系組成物を投与される。そして、患者の血漿は、ＩＬ−１２が存在するかについて監視される。内因性ＩＬ−１２の検出は、その疾病に対する患者の免疫応答を示唆するものとなり得る。ＩＬ−１２のレベルを維持するために治療用組成物を追加で投与し、それによって、当該疾病抗原に対する患者の免疫応答を維持してもよい。
［例］
本研究は、同種異系活性化Ｔｈ１細胞で治療された患者の血漿中におけるＩＬ−１２のレベルを監視するために行われた。活性化同種異系Ｔｈ１細胞およびその調製方法は、米国特許第７，４３５，５９２号に記載されている。活性化同種異系Ｔｈ１細胞は、意図的に患者に不適合であった。皮内注射−活性化同種異系Ｔｈ１細胞が皮内注射によって投与された。該細胞は、１ｍｌに１×１０^７個／ｍｌの密度で懸濁された。

腫瘍内注射−腫瘍内注射は、切除の１時間以内に、切除された腫瘍の壊死中心部に投与された。
冷凍アブレーションは、ＣｒｙｏＣａｒｅ−２８経皮的プローブシステム（米国カリフォルニア州のエンドケア）を使用して行われた。このシステムは、ジュール−トムソン効果を使用して、閉鎖系中で冷凍器の先端部を冷却した。ガス係数とノズルの寸法とに応じて、異なる気体要素は、当該ノズルに近接する領域にて異なる熱交換現象を生じる。アルゴンガスが冷却（−１８７℃）に用いられ、ヘリウムが加熱（６７℃）に用いられた。

計画された標的腫瘍病変は、ＣＴによる画像誘導下で特定され、位置が確認された。滅菌野が生成され、局所麻酔が計画されたプローブ挿入部位に施された。ガイドプローブは、経皮的に挿入され、ＣＴによって当該標的腫瘍病変内にあることが確認された。凍結融解サイクルが１、２回行われた。標的腫瘍の大きさに応じて、２ｍｍまたは５ｍｍの１つのプローブが使用された。凍結時間は、ＣＴ上で視認可能な「凍結領域（ｉｃｅ−ｂａｌｌ）」の形成に応じて、約５分から２０分とした。解凍は、２回目の凍結プロセスが開始される前に、ヘリウムを凍結時間と同等な時間の間注入することによって達成された。この処置には、腫瘍病変のサンプルを切除することが必要であるが、腫瘍がない周辺を含め腫瘍を完全に切除することは必要ない。

同種異系活性化Ｔｈ１細胞の注射前に、２回目の凍結サイクルに続き、当該病変を冷却することができた。
表１、２、および３は、記載された日数における、具体的な治療のタイミングと患者の血漿中のＩＬ−１２のレベルとを示す。図１は、本研究中の患者の免疫系によるＩＬ−１２の発現を図示するグラフである。

本発明は、好適な実施形態を参照して説明されてきたが、当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく形式及び詳細についての変形が可能であることを認識するであろう。

Claims (11)

1. 患者の血漿中で内因性のＩＬ−１２を誘発するための薬剤の製造における使用のための組成物であって、
   該組成物は、
   約１ｘ１０ ^６ 個〜約１ｘ１０ ^７ 個の活性化同種異系Ｔｈ１細胞を含む第一の組成物、および
   約１ｘ１０ ^７ 個〜約１ｘ１０ ^９ 個の活性化同種異系Ｔｈ１細胞を含む第二の組成物、を含み、
   前記第一の組成物は、少なくとも２回皮内投与され、
   前記第二の組成物は、少なくとも２回静脈内投与され、
   
   前記組成物は患者の血漿中で少なくとも８０００ｐｇ／ｍｌ〜２００，０００ｐｇ／ｍｌの内因性ＩＬ−１２を誘発するために使用され、
   前記内因性ＩＬ−１２の血漿中レベルが前記患者内で測定されて、少なくとも８０００ｐｇ／ｍｌ〜２００，０００ｐｇ／ｍｌの内因性レベルが誘発されるまで前記組成物が再投与され、
   前記活性化同種異系Ｔｈ１細胞はＣＤ３、およびＣＤ２８が架橋されることによって活性化される、組成物。
2. 請求項１に記載の使用のための組成物であって、
   前記組成物は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、およびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つ以上をさらに含む、使用のための組成物。
3. 請求項１に記載の使用のための組成物であって、
   前記活性化されたＴｈ１細胞はその表面上にてエフェクター分子であるＣＤ４０Ｌおよび／またはＦａｓＬを発現する、使用のための組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物であって、
   前記組成物の成分は表面に固定される、使用のための組成物。
5. 請求項４に記載の使用のための組成物であって、
   前記表面は生分解性を有する、使用のための組成物。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物であって、
   前記Ｔｈ１細胞は注入器または可撓性容器に詰められる、使用のための組成物。
7. 請求項１に記載の使用のための組成物であって、
   前記細胞は非栄養培地に懸濁される、使用のための組成物。
8. 請求項１に記載の使用のための組成物であって、
   前記患者の血漿中における前記内因性ＩＬ−１２のレベルは前記患者に対して毒性がない、使用のための組成物。
9. 請求項１に記載の使用のための組成物であって、
   前記架橋結合は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体などのモノクローナル抗体によって架橋が行われる、使用のための組成物。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための組成物であって、
    前記組成物は３日おきよりも多く投与される、使用のための組成物。
11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための組成物であって、
    前記組成物はさらに腫瘍内投与によって投与される、使用のための組成物。