CN115246870A - 活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用。具体地，本发明涉及一种经胎盘来源的热休克蛋白gp96‑抗原复合物，经所述复合物活化的树突细胞，以及含有所述复合物或树突细胞的药物组合物、疫苗佐剂、免疫调节剂和疫苗制剂及其在抗肿瘤中的用途。

Description

活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
细胞免疫疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输至人体以杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞或突变的细胞的技术。
以活化的树突状细胞(Dendritic Cells，DC)为工具进行的细胞治疗是目前癌症防治有前景的手段之一。然而现有免疫细胞营养液-培养基试剂技术虽然可以维持细胞在体外生长繁殖，提升其成活率、杀伤活性和扩增倍数，但获得的细胞功效仍不理想，缺乏特异性，尤其是活化的DC不能有效刺激产生特异性识别和杀伤肿瘤的T细胞，大大制约其应用发展，本领域迫切需要新型免疫细胞培养技术，用以提升相关免疫细胞体外培养的功能和疗效。
发明内容
为了克服上述问题，经过大量的科学研究及论证，发明人研发了针对脑胶质瘤，胆管癌等癌症的DC细胞免疫疗法。其中，所述DC细胞经胎盘来源的热休克蛋白gp96-抗原复合物活化获得。应用多肽芯片富集技术联合质谱鉴定，该复合物中至少含50种以上的潜在肿瘤抗原，证明其具有广谱抗肿瘤能力。皮下免疫后，结合的抗原能被有效地递呈给DC细胞，同时作为天然佐剂活化DC细胞，促进DC细胞的成熟及相关细胞因子的分泌，从而有效激发肿瘤特异性的CTL，并增强机体的非特异性免疫反应。特异性CTL应答和非特异性增强的免疫应答反应二者协同介导针对肿瘤的免疫应答。
热休克蛋白gp96-抗原复合物
在一个方面，本发明提供一种热休克蛋白gp96-抗原复合物，其可通过以下方法制备得到：
将离体动物组织的匀浆液依次经ConA-Sepharose凝胶柱层析、HiTrap Q离子交换层析以及CHT离子交换层析分离得到所述复合物。
在一些实施方案中，所述离体动物组织为人或非人哺乳动物的胎盘组织或肿瘤组织。
在一些实施方案中，所述离体动物组织的匀浆液经下述方法制备得到：将离体动物组织按质量(g)-体积(ml)比1：4～1：8的比例加入10～50mM、pH值为6～8的NaHCO3溶液中研磨，得所述组织匀浆液。
在一些实施方案中，所述NaHCO3溶液浓度例如为10～20mM，10～30mM，10～40mM，20～30mM，20～40mM，20～50mM，30～40mM，30～50mM，或40～50mM，优选为30mM。在一些实施方案中，所述NaHCO3溶液的pH例如6.2～8，6.4～8，6.6～8，6.8～8，7.0～8，7.2～8，7.4～8，7.6～8，7.8～8，6.2～7.8，6.4～7.8，6.6～7.8，6.8～7.8，7.0～7.8，7.2～7.8，7.4～7.8，7.6～7.8，6.2～7.6，6.4～7.6，6.6～7.6，6.8～7.6，7.0～7.6，7.2～7.6，7.4～7.6，6.2～7.4，6.4～7.4，6.6～7.4，6.8～7.4，7.0～7.4，7.2～7.4，6.2～7.2，6.4～7.2，6.6～7.2，6.8～7.2，7.0～7.2，6.2～7.0，6.4～7.0，6.6～7.0，6.8～7.0，6.2～6.8，6.4～6.8，6.6～6.8，6.2～6.6，6.4～6.6，或6.2～6.4。
在一些实施方案中，在进行上述的分离前，还包括将所述组织匀浆液按下述步骤初步提纯的操作：
步骤1-1：将所述组织匀浆液低温(例如，2～6℃)离心，取上清；
步骤1-2：采用硫酸铵分级沉淀法，将步骤1-1所得上清在低温条件下(例如，2～6℃)加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为50％～70％时所得沉淀，得初提物。在一些实施方案中，在步骤1-1中，将所述组织匀浆液在2～6℃，1000rpm～10000rpm离心0.5h～1h，收集上清，任选地，将收集到的上清在2～6℃，1000rpm～10000rpm再次离心0.5h～1h，取上清。
在一些实施方案中，在步骤1-2中，收集硫酸铵浓度大于50％，例如52％～70％、54％～70％、56％～70％、58％～70％、60％～70％、62％～70％、64％～70％、66％～70％、或68％～70％时所得沉淀。
在一些实施方案中，在步骤1-2中，按质量(g)-体积(ml)比1：(2～20)的比例用含50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液溶解所得沉淀。
在一些实施方案中，在步骤1-2中，按质量(g)-体积(ml)比为1：(4～20)、1：(6～20)、1：(8～20)、1：(10～20)、1：(12～20)、1：(14～20)、1：(16～20)、1：(18～20)、1：(2～18)、1：(4～18)、1：(6～18)、1：(8～18)、1：(10～18)、1：(12～18)、1：(14～18)、1：(16～18)、1：(2～16)、1：(4～16)、1：(6～16)、1：(8～16)、1：(10～16)、1：(12～16)、1：(14～16)、1：(2～14)、1：(4～14)、1：(6～14)、1：(8～14)、1：(10～14)、1：(12～14)、1：(2～12)、1：(4～12)、1：(6～12)、1：(8～12)、1：(10～12)、1：(2～10)、1：(4～10)、1：(6～10)、1：(8～10)、1：(2～8)、1：(4～8)、1：(6～8)、1：(2～6)、1：(4～6)、或1：(2～4)，优选为1：9的比例用5～50mM的Tris-HCl溶液溶解所述沉淀。在一些实施方案中，所述Tris-HCl的浓度例如为5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM。在进一步优选的实施方案中，所述Tris-HCl溶液中NaCl浓度例如为50～100mM、50～150mM、50～200mM、100～150mM、100～200mM、或150～200mM，优选为200mM。
在一些实施方案中，所述ConA-Sepharose凝胶柱层析包括以下步骤：
步骤2-1：将所述初提物上样至ConA-Sepharose凝胶柱；
步骤2-2：用含50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液洗脱至检测波长为280nm时洗脱产物紫外吸收低于0.01；
步骤2-3：用含8％α-吡喃糖苷、50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液继续洗脱，收集洗脱液(优选地，收集第0～3个(例如，0.5～2个)柱体积的流穿液)，得ConA-Sepharose分离物。
在一些实施方案中，在步骤2-2中，所述Tris-HCl的浓度例如为5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM。在进一步优选的实施方案中，所述Tris-HCl溶液中NaCl浓度例如为50～100mM、50～150mM、50～200mM、100～150mM、100～200mM、或150～200mM，优选为200mM。
在一些实施方案中，所述HiTrap Q离子交换层析包括以下步骤：
步骤3-1：将所述ConA-Sepharose分离物上样至HiTrap Q离子交换柱；
步骤3-2：用5～50mM Tris-HCl清洗HiTrap Q离子交换柱；
步骤3-3：用含NaCl(300mM～1000mM)的5～50mM Tris-HCl洗脱，收集洗脱液至检测波长为280nm时洗脱产物吸光度值低于100mA；任选地，将收集到的洗脱液浓缩(例如，超滤浓缩)并用pH 6～8的20～100mM磷酸盐缓冲液稀释，得HiTrap Q分离物。
在一些实施方案中，在步骤3-2中，用5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM的Tris-HCl清洗HiTrap Q离子交换柱。
在一些实施方案中，在步骤3-3中，所述Tris-HCl浓度例如为5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM。在进一步优选的实施方案中，所述Tris-HCl中NaCl浓度例如为300～350mM、300～400mM、300～450mM、300～500mM、300～550mM、300～600mM、300～650mM、300～700mM、300～750mM、300～800mM、300～850mM、300～900mM、300～950mM、300～1000mM、350～400mM、350～450mM、350～500mM、350～550mM、350～600mM、350～650mM、350～700mM、350～750mM、350～800mM、350～850mM、350～900mM、350～950mM、350～1000mM、400～450mM、400～500mM、400～550mM、400～600mM、400～650mM、400～700mM、400～750mM、400～800mM、400～850mM、400～900mM、400～950mM、400～1000mM、450～500mM、450～550mM、450～600mM、450～650mM、450～700mM、450～750mM、450～800mM、450～850mM、450～900mM、450～950mM、450～1000mM、500～550mM、500～600mM、500～650mM、500～700mM、500～750mM、500～800mM、500～850mM、500～900mM、500～950mM、500～1000mM、550～600mM、550～650mM、550～700mM、550～750mM、550～800mM、550～850mM、550～900mM、550～950mM、550～1000mM、600～650mM、600～700mM、600～750mM、600～800mM、600～850mM、600～900mM、600～950mM、600～1000mM、650～700mM、650～750mM、650～800mM、650～850mM、650～900mM、650～950mM、650～1000mM、700～750mM、700～800mM、700～850mM、700～900mM、700～950mM、700～1000mM、750～800mM、750～850mM、750～900mM、750～950mM、750～1000mM、800～850mM、800～900mM、800～950mM、800～1000mM、850～900mM、850～950mM、850～1000mM、900～950mM、900～1000mM、或950～1000mM。
在一些优选的实施方案中，在步骤3-3中，所述磷酸盐缓冲液的pH例如为6.2～8，6.4～8，6.6～8，6.8～8，7.0～8，7.2～8，7.4～8，7.6～8，7.8～8，6.2～7.8，6.4～7.8，6.6～7.8，6.8～7.8，7.0～7.8，7.2～7.8，7.4～7.8，7.6～7.8，6.2～7.6，6.4～7.6，6.6～7.6，6.8～7.6，7.0～7.6，7.2～7.6，7.4～7.6，6.2～7.4，6.4～7.4，6.6～7.4，6.8～7.4，7.0～7.4，7.2～7.4，6.2～7.2，6.4～7.2，6.6～7.2，6.8～7.2，7.0～7.2，6.2～7.0，6.4～7.0，6.6～7.0，6.8～7.0，6.2～6.8，6.4～6.8，6.6～6.8，6.2～6.6，6.4～6.6，或6.2～6.4，优选pH 6.8。
在一些优选的实施方案中，在步骤3-3中，所述磷酸盐缓冲液的浓度例如为20～30mM、20～40mM、20～50mM、20～60mM、20～70mM、20～80mM、20～90mM、30～40mM、30～50mM、30～60mM、30～70mM、30～80mM、30～90mM、30～100mM、40～50mM、40～60mM、40～70mM、40～80mM、40～90mM、40～100mM、50～60mM、50～70mM、50～80mM、50～90mM、50～100mM、60～70mM、60～80mM、60～90mM、60～100mM、70～80mM、70～90mM、70～100mM、80～90mM、80～100mM、或80～100mM，优选50mM。
在一些实施方案中，所述CHT离子交换层析包括以下步骤：
步骤4-1：将所述HiTrap分离物上样至CHT离子交换柱；
步骤4-2：用5～50mM Tris-HCl清洗CHT离子交换柱；
步骤4-3：用含300mM～1000mM NaCl的20mM Tris-HCl洗脱，收集洗脱液至吸光度值低于100mA；任选地，将收集到的洗脱液浓缩(例如，超滤浓缩)并用pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液稀释，得所述复合物。
在一些实施方案中，在步骤4-2中，所述Tris-HCl浓度例如为5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM。
在一些实施方案中，在步骤4-3中，用浓度例如为300～350mM、300～400mM、300～450mM、300～500mM、300～550mM、300～600mM、300～650mM、300～700mM、300～750mM、300～800mM、300～850mM、300～900mM、300～950mM、300～1000mM、350～400mM、350～450mM、350～500mM、350～550mM、350～600mM、350～650mM、350～700mM、350～750mM、350～800mM、350～850mM、350～900mM、350～950mM、350～1000mM、400～450mM、400～500mM、400～550mM、400～600mM、400～650mM、400～700mM、400～750mM、400～800mM、400～850mM、400～900mM、400～950mM、400～1000mM、450～500mM、450～550mM、450～600mM、450～650mM、450～700mM、450～750mM、450～800mM、450～850mM、450～900mM、450～950mM、450～1000mM、500～550mM、500～600mM、500～650mM、500～700mM、500～750mM、500～800mM、500～850mM、500～900mM、500～950mM、500～1000mM、550～600mM、550～650mM、550～700mM、550～750mM、550～800mM、550～850mM、550～900mM、550～950mM、550～1000mM、600～650mM、600～700mM、600～750mM、600～800mM、600～850mM、600～900mM、600～950mM、600～1000mM、650～700mM、650～750mM、650～800mM、650～850mM、650～900mM、650～950mM、650～1000mM、700～750mM、700～800mM、700～850mM、700～900mM、700～950mM、700～1000mM、750～800mM、750～850mM、750～900mM、750～950mM、750～1000mM、800～850mM、800～900mM、800～950mM、800～1000mM、850～900mM、850～950mM、850～1000mM、900～950mM、900～1000mM、或950～1000mM，优选500mM的PB洗脱。
在一些实施方案中，在步骤4-3中，用浓度为5～10mM、5～15mM、5～20mM、5～25mM、5～30mM、5～35mM、5～40mM、5～45mM、5～50mM、10～15mM、10～20mM、10～25mM、10～30mM、10～35mM、10～40mM、10～45mM、10～50mM、15～20mM、15～25mM、15～30mM、15～35mM、15～40mM、15～45mM、15～50mM、20～25mM、20～30mM、20～35mM、20～40mM、20～45mM、20～50mM、25～30mM、25～35mM、25～40mM、25～45mM、25～50mM、30～35mM、30～40mM、30～45mM、30～50mM、35～40mM、35～45mM、35～50mM、40～45mM、40～50mM、或45～50mM，优选20mM的磷酸盐缓冲液稀释。在进一步优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的pH例如为6.2～8，6.4～8，6.6～8，6.8～8，7.0～8，7.2～8，7.4～8，7.6～8，7.8～8，6.2～7.8，6.4～7.8，6.6～7.8，6.8～7.8，7.0～7.8，7.2～7.8，7.4～7.8，7.6～7.8，6.2～7.6，6.4～7.6，6.6～7.6，6.8～7.6，7.0～7.6，7.2～7.6，7.4～7.6，6.2～7.4，6.4～7.4，6.6～7.4，6.8～7.4，7.0～7.4，7.2～7.4，6.2～7.2，6.4～7.2，6.6～7.2，6.8～7.2，7.0～7.2，6.2～7.0，6.4～7.0，6.6～7.0，6.8～7.0，6.2～6.8，6.4～6.8，6.6～6.8，6.2～6.6，6.4～6.6，或6.2～6.4，优选pH6.8。
所述热休克蛋白gp96是细胞中表达丰度很高的一种分子伴侣蛋白，在多种新生蛋白折叠与受损蛋白降解、病毒与肿瘤抗原呈递和T细胞活化、损伤相关的分子模式(DAMPs)介导的天然免疫、引发抗肿瘤与抗病毒T细胞免疫，以及作为宿主因子调节病毒复制、驱动炎癌转化和肿瘤发生发展等方面均发挥重要功能。在一些实施方案中，所述gp96具有如SeqID No.1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述热休克蛋白gp96-抗原复合物中所述抗原选自如Seq ID No.2～72所示的多肽中的一种或多种(例如，1种以上、5种以上、10种以上、15种以上、20种以上、25种以上、30种以上、35种以上、40种以上、45种以上、50种以上、55种以上、60种以上、65种以上或70种以上)，所述多肽为肿瘤相关抗原或肿瘤组织中高表达蛋白。
在一些实施方案中，经多肽芯片富集技术联合质谱鉴定，所述复合物中gp96与SeqID No.2～72所示的71条肿瘤相关抗原结合。在一些实施方案中，热休克蛋白gp96的多肽结合位点位于gp96高度保守的第624-630位氨基酸，可以非共价结合抗原多肽。
经本发明方法获得的复合物杂质含量更少，如核酸残留、杂蛋白残留等，大大提高了热休克蛋白gp96-抗原复合物的纯度，能够更好地活化免疫细胞。经SDS-PAGE胶分析显示，本发明所述复合物纯度为80％以上，例如85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上或99％以上。
活化的树突细胞
Gp96为迄今发现的唯一来源于哺乳动物的天然佐剂，其可作用于APC(抗原呈递细胞，主要是DC细胞)激活其它免疫细胞，产生免疫因子，从而增强机体免疫反应。所述复合物中gp96可将结合的多种肿瘤相关抗原有效地递呈给DC细胞，同时作为天然佐剂活化DC细胞，促进DC细胞的成熟及相关细胞因子的分泌，从而有效激发肿瘤特异性的CTL，并增强机体的非特异性免疫反应。因此，本发明还涉及经所述复合物活化的DC细胞。
在另一个方面，本发明提供一种DC细胞群体，
(1)提供单核细胞；
(2)于含0.1～5μM糖皮质激素类化合物的DC细胞培养基中培养所述单核细胞3～10天(例如，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天或10天，优选6天)，获得成熟的DC细胞；
(3)按20～100μg/1×107个DC细胞的比例，加入前文所述的复合物，继续培养6～48h，收集得到所述DC细胞群体。
“单核细胞”是指具有分化成树突细胞能力的CD14+单核白细胞。单核细胞可以来自任何哺乳动物，但优选是人单核细胞。用于提供单核细胞的样品包括但不限于血液、血液级分(例如，白细胞(WBC)、血沉棕黄层、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞白细胞去除术产物。在一些实施方案中，步骤(1)中所述单核细胞来源于外周血或脐带血，优选为外周血。在一些实施方案中，单核细胞与其他外周血单个核细胞(PBMC)一起提供，例如作为单核细胞单采血液成分分离术(apheresis)产物。从包括血液和骨髓在内的各种来源分离富集树突细胞前体如单核细胞和常规树突细胞的细胞群体的方法是本领域已知的。例如，单核细胞和常规树突细胞可以通过收集肝素化的血液、通过单采血液成分分离术或白细胞去除术、通过制备血沉棕黄层、玫瑰花环(rosetting)、离心、密度梯度离心、细胞的差异裂解、过滤、淘析、荧光激活细胞分选或免疫磁性分离来分离。在一些优选的实施方案中，单核细胞从单核细胞白细胞去除术中分离。白细胞去除术的方法是本领域已知的。白细胞去除术是从受试者的血液中去除白细胞，然后将其剩余部分输回受试者的程序。白细胞去除术产物通常是富含PBMC的血液级分，具有低水平的污染性红细胞、粒细胞和血小板。用于进行白细胞去除术的方法和设备是本领域众所周知的。单核细胞性树突细胞前体和/或分化的常规树突细胞可以从健康受试者或从需要免疫刺激的受试者分离，所述受试者例如是癌症患者或其他的细胞免疫刺激对其可以是有益的或期望的受试者(例如具有细菌或病毒感染的受试者等)。树突细胞前体和/或未成熟树突细胞也可以从与HLA匹配的健康个体中获得，以施用于需要免疫刺激的与HLA匹配的受试者。
在一些实施方案中，富集单核细胞的操作可以对单核细胞或PBMC等进行，包括例如离心、淘析、切向流过滤、Ficoll密度梯度、稀释的Ficoll密度梯度离心、稀释的Percoll密度梯度离心、抗体淘选、磁性细胞分选、阳性或阴性免疫磁性选择等。另外，一旦从受试者分离，单核细胞(例如，纯化的单核细胞，富集的单核细胞，包含单核细胞的PBMC等)可以任选地被温育，例如在1℃～34℃的温度下保持一段时间，例如从其自受试者分离的时间之后的大约1到96小时。成活的单核细胞是高度纯化的，例如纯度超过90％，95％甚至99％，如使用单核细胞标志物CD14和成活力染色通过流式细胞仪所确定。
在分离，纯化和/或富集单核细胞后，诱导其分化为树突细胞。因此，在进一步的实施方案中，本发明的方法包括培养和/或分化步骤以获得未成熟的DC。
在一些实施方案中，在步骤(2)中，按1×105～1×108个/ml(例如，1×105个/ml，1×106个/ml，1×107个/ml，或1×108个/ml，优选2～4×106个/ml)的密度将所述单核细胞接种至所述DC细胞培养基。
在一些实施方案中，在步骤(2)所述培养过程中(例如在培养的第0天，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天或10天)加入PHA、IL-2、IL-4、GM-CSF和TNF-α中的一种或多种。在一些实施方案中，在至少粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)(称为分化培养基)存在下培养单核细胞，并且这持续约1至4天，例如1至3天或2至3天，甚至更特别地长达80、75、74、73、72、71、70小时或更短的小时，更特别地长达至少48小时和长达72小时。+/-4小时或+/-2小时的限度是可接受的。在一些实施方案中，在培养的第0天加入GM-CSF和IL-4，例如分别加入终浓度为50～100ng/ml的GM-CSF和IL-4。在一些实施方案中，使单核细胞与GM-CSF和IL-4接触约1至4天，例如1至3天或2至3天(以1天24小时计)，在此期间DC前体分化为未成熟的树突细胞。GM-CSF和IL-4的浓度为50～100ng/ml，例如50ng/ml，60ng/ml，70ng/ml，80ng/ml，90ng/ml，或100ng/ml。
前体和/或未成熟树突细胞用(至少)以上因子的组合来培育。这可以通过将所述因子添加到培养基中来进行。所述培养基可以是任何合适的种类，即可以补充有或没有任何其他补充剂，例如蛋白质、氨基酸或抗生素。在一些实施方案中，所述培养基为RPMI1640。
在单核细胞分化成未成熟的树突细胞后，未成熟的树突细胞可以成熟为成熟的树突细胞。因此，在一些实施方案中，制备本文所述DC细胞群体的方法包括成熟步骤，例如向(分化的)未成熟的DC中加入TNF-α。DC细胞在TNF-α存在下的成熟时间为1至3天，优选为1至2天，更优选为约1天(24小时)。在一些实施方案中，在培养的第6天加入TNF-α，优选加入终浓度为10～50ng/ml的TNF-α，优选为20ng/ml。培养条件适合于未成熟的DC形成成熟的DC群体。特别地，在收获和/或刺激前的最后24小时±4小时(特别是±2小时)的细胞培养期间，将TNF-α加入到培养基中。在一些实施方案中，所述培养基为RPMI1640。
在一些特别优选的实施方案中，在诱导DC的过程中添加糖皮质激素类化合物可以增强对PBMCs的刺激作用。因此，在诱导DC细胞过程成中加入糖皮质激素类化合物。在一些实施方案中，所述糖皮质激素类化合物为地塞米松。糖皮质激素类化合物的浓度为0.1～5μM，例如0.1～0.5μM、0.1～1μM、0.1～1.5μM、0.1～2μM、0.1～2.5μM、0.1～3μM、0.1～3.5μM、0.1～4μM、0.1～4.5μM、0.1～5μM、0.5～1μM、0.5～1.5μM、0.5～2μM、0.5～2.5μM、0.5～3μM、0.5～3.5μM、0.5～4μM、0.5～4.5μM、0.5～5μM、1～1.5μM、1～2μM、1～2.5μM、1～3μM、1～3.5μM、1～4μM、1～4.5μM、1～5μM、1.5～2μM、1.5～2.5μM、1.5～3μM、1.5～3.5μM、1.5～4μM、1.5～4.5μM、1.5～5μM、2～2.5μM、2～3μM、2～3.5μM、2～4μM、2～4.5μM、2～5μM、2.5～3μM、2.5～3.5μM、2.5～4μM、2.5～4.5μM、2.5～5μM、3～3.5μM、3～4μM、3～4.5μM、3～5μM、3.5～4μM、3.5～4.5μM、3.5～5μM、4～4.5μM、4～5μM、或4.5μM～5μM。
在一些实施方案中，步骤(2)和(3)中所述培养的具体条件均为37℃、5％CO2。
经上述方法制备得到的DC细胞群体中CD83+的DC细胞比例大于70％，例如大于75％，大于80％，大于85％，大于90％，大于91％，大于92％，大于93％，大于94％，大于95％，大于96％，大于97％，大于98％或大于99％。
在一些实施方案中，以所述DC细胞群体刺激PBMCs细胞IFN-γ+ELISPOT斑点数大于500CD83+的DC细胞比例大于70％。
药物组合物、疫苗佐剂、免疫调节剂、疫苗制剂
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前文所述的复合物或DC细胞群体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供一种疫苗佐剂、免疫调节剂或免疫制剂，其含有前文所述的复合物和/或DC细胞群体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述疫苗佐剂、免疫调节剂或免疫制剂为注射剂(例如，注射液或者冻干粉针剂)。
在一些实施方案中，单位剂量DC细胞含量不少于1×104个(例如不少于1×104个，不少于3×104个，不少于5×104个，不少于7×104个，不少于1×105个，不少于3×105个，不少于5×105个，不少于7×105个，不少于1×106个，不少于3×106个，不少于5×106个，不少于7×106个，不少于1×107个，不少于3×107个，不少于5×107个，不少于7×107个，不少于1×108个，不少于3×108个，不少于5×108个，不少于7×108个，不少于1×109个，不少于3×109个，不少于5×109个，不少于7×109个，不少于1×1010个，不少于3×1010个，不少于5×1010个或不少于7×1010个，又例如1×105～1×108个)。
用于配制树突细胞疫苗的方法是本领域技术人员已知的。用于施用的合适的制剂可以包括水性等渗无菌注射溶液，该溶液可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使制剂与预期接受者血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其中所述悬浮液可以包括悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂，防腐剂，免疫刺激剂，细胞因子和佐剂。
树突细胞药物组合物/疫苗可以通过多种方法施用，例如但不限于注射(例如皮下，皮内，静脉内，淋巴管内，关节内，肌肉内，腹膜内)，通过连续输注，从植入物中缓释等。DC疫苗能够以特定的间隔施用。在一个实施方案中，以2至4周的间隔，特别是两周的间隔施用DC。树突细胞疫苗能够与生理上可接受的载体，缓冲液，稀释剂，佐剂，免疫调节剂等一起施用。优选地，树突细胞疫苗对于其所施用的患者是自体的，或者是最大程度的HLA匹配的。
向受试者施用的细胞剂量为有效量，例如在受试者中有效地实现所需的有益治疗反应，或抑制癌细胞的生长，同时保持良好的耐受性特征(最小毒性)。足以完成此效果的量定义为“治疗有效剂量”。该剂量将由所产生的树突细胞的生物学和/或临床活性以及任选地患者的病况决定。该剂量的大小也将由在特定患者中施用特定细胞所伴随的任何不良副作用的存在，性质和程度来确定。在确定治疗或预防疾病诸如癌症(例如，脑胶质瘤，胆管癌等)的细胞有效量时，医师(或研究者)需要评价针对包含在疫苗中的靶标的免疫反应(即免疫监测)，以及使用可测量参数(通过常规或与免疫相关的RECIST标准的放射学肿瘤负荷，肿瘤标志物，循环肿瘤细胞，血浆循环肿瘤DNA，或疾病负荷或疾病活性的其他替代标志物)评价肿瘤临床进展。
通常，施用的剂量取决于从一轮白细胞去除术获得的DC的产量和后续疫苗接种的所需次数。在一些实施方案中，剂量例如为每轮疫苗接种5-100×106DC，重复2至8次，特别是2至6次，更特别是2至4次。DC疫苗接种的毒性通常较低，并且与施用途径有关(与皮内途径相比，静脉内途径的急性副作用更大)。注射可以是例如以1、2或3周的间隔重复2、3、4、5或6次，并且应通过以下方式给予：静脉内或在淋巴结附近通过皮内或皮下注射或直接注射到淋巴结中。可以在暂停例如1到若干个月之后进行加强注射。
任选地，可添加生物反应调节剂，以通过本发明的DC进行治疗。例如，任选地细胞与佐剂或诸如GM-CSF，IL-12，IFN-α或IL-2的细胞因子一起施用。
用途、免疫治疗
在另一个方面，本发明提供本文所述复合物物或DC细胞群体在制备药物中的用途，其中所述药物具有以下至少一种功能：
(1)增强受试者免疫反应(例如，非特异性免疫反应)；
(2)诱导产生肿瘤特异性CTL细胞；
(3)抗肿瘤(例如，减缓或停止已建立的肿瘤病灶的生长)。
在另一个方面，本发明提供一种增强受试者免疫反应(例如，非特异性免疫反应)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述复合物或DC细胞群体的步骤。
在另一个方面，本发明提供一种诱导产生肿瘤特异性CTL细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述复合物或DC细胞群体的步骤。
在另一个方面，本发明提供一种抗肿瘤(例如，减缓或停止已建立的肿瘤病灶的生长)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述复合物或DC细胞群体的步骤。
在一些实施方案中，本文所述肿瘤选自脑胶质瘤和胆管癌。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员所通常理解的含义，本文中所涉及的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA技术均为所属领域常规技术。参见例如Sambrook和Green，MolecularCloning：A Laboratory Mannual，第4版(2012)；系列Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编辑)；系列Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)，PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Harlow和Lane编辑(1988)Antibodies，A Laboratory Mannual；以及Culture of AnimalCells：A Mannual of Basic Technique and Specialized Applications，第6版(R.I.Freshney编辑(2010))。
除非有明确规定，否则本文中所使用的单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数形式的所指代物。
“约”或“大约”是指在如通过本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，其部分取决于测量系统的局限性。例如，在一些实施方案中，“约”意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，特别是关于生物系统或过程，“约”意指在所指代数值的一个数量级内、优选地在所指代数值的5倍内、更优选在所指代数值的2倍内。
“细胞”通常指生物细胞，其可以是活生物体的基本结构、功能和/或生物学单位。其可以来源于具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制实例包括原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞、藻类细胞、真菌细胞、动物细胞(例如，无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞)、等等。在一些实施方案中，所述细胞可以不是来源于天然生物体，例如，其为人造细胞。
“树突细胞”或“DC细胞”是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresenting cells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
“抗原”是指任何能够被选择性结合剂(例如，受体或者抗体)结合的分子或其片段。在一些实施方案中，抗原特指任何能够引起免疫反应的物质，其能够被用于动物中以产生能够于所述抗原结合的抗体的分子或其片段。
“肿瘤相关抗原”是指在肿瘤细胞中异常高表达、而在正常组织细胞中表达量较低的抗原。经多肽芯片富集技术联合质谱鉴定，本文中所述由离体动物组织提取获得的复合物中含多种肿瘤抗原，包括Seq ID No：2～72所示的71条肿瘤组织中高表达蛋白，是肿瘤相关抗原，部分抗原为脑胶质瘤和胆管癌的特异性表面抗原，涉及特异性免疫反应。
“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过一个或多个肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。这一术语并不意味着聚合物的特定长度，也不旨在暗示或区分多肽是使用重组技术、化学或酶促合成产生还是天然存在的。
“受试者”是指健康个体、患有或者疑似患有某种疾病的个体，可以为人或者非人哺乳动物，优选为人。通常包括健康志愿者、患者、检测对象以及治疗对象等。
“治疗(treatment/treating)”通常是指获得所需的药理和/或生理效果，并且涵盖哺乳动物尤其是人中的任何疾病治疗，包括：
(1)防止疾病或症状发生于可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患有该疾病或症状的受试者中；
(2)抑制疾病症状，即阻止其发展；或
(3)减轻疾病症状，即引起疾病或症状的消退。
就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，该效果可以是治疗性的。此外，除了主要疗法或初始疗法外，还可将疫苗用作“辅助疗法”以使其在治疗环境中的有效性最大化，或在初始疗法后用作“维持”或“巩固(consolidative)”法以使疾病控制最大化并延迟疾病复发。
“癌症”是指由恶性肿瘤引起的任何种类的疾病。
“脑胶质瘤”起源于脑部神经外胚层，约占所有颅内肿瘤分型的51％，是最具攻击性的恶性脑肿瘤之一，具有生长率高，复发性高和侵袭性高等特性。在中国，脑肿瘤的发病率位居所有肿瘤发病率第14位，其死亡率位居第10位。脑肿瘤因其病灶部位的特殊性，治疗困难，复杂性高，至今仍是肿瘤治疗中最为棘手且最具挑战性的研究领域之一。目前，手术疗法，放射疗法和化学药物疗法是脑胶质瘤治疗的主要手段。但每种方法都有其自身的局限性。手术疗法可以减少患者的致残率和致死率，但手术对机体创伤大，术后容易感染。放疗虽然提高了脑胶质瘤患者的治愈率，但是该疗法也最正常的脑组织产生了一定的伤害。就化学药物治疗方法而言，虽然化学药物疗法在脑胶质瘤治疗方面取得了一些成果，但是化学治疗药物仍存在水溶性较差，稳定性不足和较为明显的不良反应等缺陷。而且因其缺乏选择性和低的靶向效率，对健康的脑组织或脑细胞也会产生一定的毒性。
“胆管癌”是一种起源于胆道的恶性肿瘤，占所有胃肠道肿瘤的3％，在全球范围内，肝脏及胆道的恶性肿瘤占癌症相关死亡的13％，其中10-20％属于胆管癌。在过去的30年，全球胆管癌的发病率逐步上升。由于胆管癌的解剖位置特殊，临床症状出现较晚，因此面临诊断难，预后差的治疗困境。由于解剖结构的特殊性，胆管癌的根治性治疗手术非常困难，患者的5年生存率不足30％。免疫治疗，特别是细胞免疫治疗，通过调节机体免疫功能，诱导特异性肿瘤免疫，达到治疗胆管癌，减少胆管癌复发和转移的目的，现已成为胆管癌综合治疗的重要组成部分。
附图说明
图1显示SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测gp96-抗原复合物分子量结果。
图2显示流式细胞检测CD83+的DC细胞比例。
图3显示IFN-γ+ELIPOT检测地塞米松活化后DC刺激的PBMCs的斑点数。
图4显示25种糖皮质激素类，小分子化合物以及抗体类药物对DC活化PBMCs的影响。
图5显示HS 683脑胶质瘤小鼠腹部皮下注射gp96-抗原复合物活化的DC对肿瘤体积变化的影响。
图6显示RBE人胆管癌小鼠腹部皮下注射gp96-抗原复合物活化的DC对肿瘤体积变化的影响。
具体实施方式
下面进一步结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,MolecularCloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
雌性裸鼠源自北京维通利华实验动物有限责任公司产品；在实施例中简称小鼠。
HS 683细胞(人脑胶质瘤细胞)及RBE细胞(人胆管癌细胞)购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，细胞株资源编号分别为3111C0001CCC000345、3131C0001000700179。
gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。
HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。
HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。
Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。
ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为Con A-Sepharose 4B。
Hitrap Q阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的规格为0.7×2.5cm。
50kD与3kD超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号分别为UFC905096、UFC500324。
研磨缓冲液：30mM NaHCO3，溶剂为蒸馏水，pH值为7.4。
溶液A：20mM Tris-HCl，溶剂为蒸馏水，pH值为7.4。
溶液B：20mM Tris-HCl、1000mM NaCl，溶剂为蒸馏水，pH值为7.4。
溶液C：20mM Tris-HCl、200mM NaCl，溶剂为蒸馏水，pH值为7.4。
1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。
BSA、PMSF、NaHCO3、MnCl2、CaCl2、NaCl2、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷、地塞米松均为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号分别为V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882、D1756。
序列信息简表
Figure BDA0003041593680000171
Figure BDA0003041593680000181
Figure BDA0003041593680000191
Figure BDA0003041593680000201
Figure BDA0003041593680000211
Figure BDA0003041593680000221
热休克蛋白gp96的氨基酸序列：
MRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQREEEAIQLDGLNASQIRELREKSEKFAFQAEVNRMMKLIINSLYKNKEIFLRELISNASDALDKIRLISLTDENALSGNEELTVKIKCDKEKNLLHVTDTGVGMTREELVKNLGTIAKSGTSEFLNKMTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYSAFLVADKVIVTSKHNNDTQHIWESDSNEFSVIADPRGNTLGRGTTITLVLKEEASDYLELDTIKNLVKKYSQFINFPIYVWSSKTETVEEPMEEEEAAKEEKEESDDEAAVEEEEEEKKPKTKKVEKTVWDWELMNDIKPIWQRPSKEVEEDEYKAFYKSFSKESDDPMAYIHFTAEGEVTFKSILFVPTSAPRGLFDEYGSKKSDYIKLYVRRVFITDDFHDMMPKYLNFVKGVVDSDDLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKYNDTFWKEFGTNIKLGVIEDHSNRTRLAKLLRFQSSHHPTDITSLDQYVERMKEKQDKIYFMAGSSRKEAESSPFVERLLKKGYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKRFQNVAKEGVKFDESEKTKESREAVEKEFEPLLNWMKDKALKDKIEKAVVSQRLTESPCALVASQYGWSGNMERIMKAQAYQTGKDISTNYYASQKKTFEINPRHPLIRDMLRRIKEDEDDKTVLDLAVVLFETATLRSGYLLPDTKAYGDRIERMLRLSLNIDPDAKVEEEPEEEPEETAEDTTEDTEQDEDEEMDVGTDEEEETAKESTAEKDEL
实施例1胎盘组织gp96蛋白的提取
组织中热休克蛋白gp96(以下简称gp96)的提取步骤如下：
(1)收集分娩后人体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入研磨缓冲液，然后用组织匀浆机制备组织匀浆；
(2)完成步骤(1)后，7000rpm离心1h，得到上清液甲。
(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，7000rpm离心50min，得到上清液乙。
(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，硫酸铵除杂后收沉淀，按质量-体积比(g/ml)1:9加入溶液C，混匀后得到上样液。具体操作如下：
a.上清杂蛋白去除
量取匀浆上清总体积，4℃中按29.1g硫酸铵/100ml的比例(即50％饱和硫酸铵比例)缓慢加入硫酸铵粉末，以磁力搅拌器混匀液体，确保硫酸铵迅速溶解，然后将该溶液4℃静置过夜，于4℃，7000rpm离心30min，弃去沉淀。
b.上清目的蛋白收集
量取上清体积，再按12.5g硫酸铵/100ml的比例(即70％饱和硫酸铵比例)补加硫酸铵粉末。同样缓慢加入，利用磁力搅拌器，确保硫酸铵加入后迅速溶解，于4℃静置3小时以上，7000rpm离心30分钟，收集沉淀，按沉淀：溶液C＝1:9(g/ml)的比例加入溶液C溶解沉淀。
(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。
(6)完成步骤(5)后，用C液冲洗所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。
(7)完成步骤(6)后，用含α吡喃糖的溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去前0.5个柱体积流穿液，再收集过柱后溶液2个柱体积，此即为ConA洗脱液。
(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。
(9)完成步骤(8)后，用A、B液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：线性梯度洗脱20个柱体积。洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，收集洗脱峰，获得洗脱液甲。
(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管进行超滤浓缩，然后用PH 6.8的50mMPB缓冲液进行换液为置换液乙，将置换液乙以1ml/min～2ml/min上样CHT离子层析柱。利用A、B液进行梯度洗脱：冲洗洗脱5-10个柱体积，目的梯度洗脱收集洗脱液丙；
(11)完成步骤(10)后，取洗脱液丙进行超滤浓缩并置换至保护缓冲液中得到高纯度的热休克蛋白gp96-抗原复合物溶液，其中gp96浓度为5mg/mL。
将gp96-抗原复合物的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(第一泳道为分子量标记，第二泳道为gp96-抗原复合物考马斯亮蓝染色检测，第三泳道为gp96-抗原复合物Westernblot检测结果，箭头所指为gp96-抗原复合物)。结果表明，gp96-抗原复合物的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。SDS-PAGE胶分析蛋白纯度大于95％。
将gp96-抗原复合物经0.3％三氟乙酸冰浴处理30分钟，促进gp96与胎盘来源抗原肽的解离。再用5kDa超滤管浓缩收集洗脱下来的多肽抗原，滴加至多肽富集芯片表面，质谱鉴定多肽序列。
经多肽芯片富集技术联合质谱鉴定，在胎盘提取的gp96-抗原复合物种鉴定出71条肿瘤抗原，氨基酸序列见Seq ID No.2～72。热休克蛋白gp96氨基酸序列见Seq ID No.1。
实施例2gp96-抗原复合物活化的DC细胞
使用人淋巴细胞分离液(Cellgro，25-072-CI)分离健康志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培养基(Gibco，12633012)调整细胞浓度为2.0X107/ml；
胎盘gp96活化DC的制备方法：
a.采集健康志愿者外周血150-200ml，将采集的血样转入50ml离心管，2000rpm离心5min，吸取血浆分装于50ml离心管中，将血浆放入56℃水浴锅中灭活30min，供培养树突细胞时使用；
b.预先将淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度1.077)，加入50ml无菌离心管，20ml/管(分离单个核细胞)；
c.用生理盐水将吸取血浆后的标本还原至一定体积，混匀，按体积比为1～1.5：1缓慢加在Ficoll-Hypaque上，2000rpm室温离心20min；
d.用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁小心吸取该层细胞转移到另一支50ml离心管中。每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次(第1次，室温1500r/min，7min；第2次，室温1200r/min，10min)，除去血小板和分离介质；
e.将获得的外周血单个核细胞进行培养；
f.取一份外周血单个核细胞，按浓度为2～4x106细胞/毫升铺入培养瓶中，每瓶40毫升，置于37℃、5％CO2培养箱中。可根据细胞数量，适当调整细胞浓度及瓶数；
g.孵育2小时后，轻晃培养瓶，弃去悬浮细胞(或收集悬浮细胞用于培养T细胞)。再用磷酸缓冲液洗瓶1～2次，加入树突细胞培养液40毫升(内含1μM地塞米松)后继续置于37℃、5％CO2培养箱中。
h.第3天补加40毫升/瓶树突培养基(内含1μM地塞米松)；
i.第6天加入终浓度20ng/ml的TNF-α，并取样做细菌/真菌检测；
j.第6天收集1×107树突细胞，加入50μg gp96-抗原复合物或培养液作为对照，置于37℃、5％CO2培养箱中共刺激24h。流式细胞检测CD83+的DC细胞比例大于70％(见图2)。以地塞米松活化的DC刺激PBMCs，通过IFN-γ+ELISPOT检测斑点数大于500/105个PBMCs(见图3)。不同糖皮质激素类，小分子化合物以及抗体类药物对DC活化PBMCs的影响见图4。
流式细胞检测：
(1)取适量需要染色的外周血单个核细胞(不超过106个细胞)，将细胞放入到1.5mL的EP管中，加入含有10％BSA的PBS封闭至少10分钟。
(2)细胞中加入1mL的PBS，1500rmp离心五分钟，弃去上清。再加入1mL的PBS将细胞重悬起来，再1500rmp离心五分钟，弃去上清。
(3)将细胞用100uL含有10％BSA的PBS重悬起来，加入CD83表面染色抗体，每种抗体5μL，4℃孵育30分钟以上。
(4)细胞中加入1mL的PBS，1500rmp离心五分钟，弃去上清。再加入1mL的PBS将细胞重悬起来，再1500rmp离心五分钟，弃去上清。
(5)细胞用500μL的PBS重悬，直接上流式仪检测。
酶联免疫斑点实验(ELISPOT)
(1)预包被：用无菌PBS(pH 7.4)稀释包被抗体至20mg/mL(1:200稀释)，将稀释好的包被抗体加入ELISPOT板中，每孔加入100μL，于4℃孵育过夜。以上操作应在超净台中进行。
(2)封闭：弃去ELISPOT板中的包被液，用无菌PBS洗涤3次，每孔200μL。最后一次洗涤完后拍干，每孔加入200μL含10％血清的RPMI 1640培养基，室温孵育30分钟。
(3)取适量以DC刺激后的PBMCs，用含10％血清的RPMI 1640培养基将其稀释为350万/mL的浓度。同时加入IL-2与anti-mouse CD28抗体，使其终浓度分别为20U/mL与1μg/mL。
(4)将细胞分别加入各孔，每孔200μL，使得最终每孔中含有50万个细胞。以PMA与离子霉素进行刺激作为阳性对照。
(5)置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养24小时。
(6)培养结束后，取出ELISPOT板，弃掉细胞及培养基，拍干。
(7)每孔加入200μL预冷的去离子水，放置3分钟，弃去，再重复一次，拍干。
(8)每孔加入200μL的PBST，放置3分钟，弃去。共洗涤5次，最后一次在吸水纸上拍干。
(9)用PBS配制生物素标记的anti-IFN-γ单抗，1:200稀释。每孔加入100μL，室温孵育2小时。
(10)弃去抗体，每孔加入200μL的PBST，放置3分钟，弃去。共洗涤5次，最后一次在吸水纸上拍干。
(11)用PBS配制亲和素标记的HRP，1:100稀释。每孔加入100μL，室温孵育1小时。
(12)弃去液体，每孔加入200μL的PBST，放置3分钟，弃去。共洗涤5次，再用PBS洗涤两次，最后一次在吸水纸上拍干。
(13)配制AEC底物，加入ELISPOT板中，每孔100μL。
(14)室温放置10分钟显色。
(15)待斑点显色到适合的大小之后，用去离子水洗涤3遍，终止显色反应。再将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，正面放在通风的地方，室温自然晾干。
(16)用图像自动分析仪对ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，进行统计分析。
实施例3gp96-抗原复合物活化的DC对脑胶质瘤的治疗作用
取20只6-8周的雌性裸鼠，每只尾静脉回输107个健康人PBMC细胞(0.5ml)，在小鼠体内重建人体免疫系统；回输后3天，所有小鼠皮下分别接种5×106HS 683脑胶质瘤细胞；肿瘤接种后第2天将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：
第一组：腹部皮下注射gp96-抗原复合物活化的DC，免疫三次(每次0.5ml)，单次免疫剂量为106/只；
第二组：尾静脉回输未经gp96-抗原复合物刺激的人单核细胞来源的DC细胞，免疫三次(每次0.5ml)，单次免疫剂量为单次免疫剂量为106/只；
以上两组中：接种肿瘤细胞后第2天进行第一次免疫；第9天进行第二次免疫；第16天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab2/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图5。
实施例4gp96-抗原复合物活化的DC对胆管癌的治疗作用
取20只6-8周的雌性裸鼠，每只尾静脉回输107个健康人PBMC细胞；回输后3天，所有小鼠皮下分别接种1×106RBE人胆管癌细胞；肿瘤接种后第2天将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：
第一组：腹部皮下注射gp96-抗原复合物活化的人单核细胞来源DC细胞，免疫三次(每次0.5ml)，单次免疫剂量为106/只；
第二组：腹部皮下注射人单核细胞来源的DC细胞，免疫三次(每次0.5ml)，单次免疫剂量为单次免疫剂量为106/只；
以上两组中：接种肿瘤细胞后第2天进行第一次免疫；第9天进行第二次免疫；第16天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab2/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图6。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山热休生物技术有限公司
<120> 活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用
<130> IDC200471
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 803
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 热休克蛋白gp96的氨基酸序列
<400> 1
Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe
1 5 10 15
Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu
20 25 30
Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val
35 40 45
Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser
50 55 60
Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala
65 70 75 80
Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn
85 90 95
Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu
100 105 110
Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly
115 120 125
Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu
130 135 140
Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val
145 150 155 160
Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn
165 170 175
Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile
180 185 190
Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys
195 200 205
Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu
210 215 220
Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr
225 230 235 240
Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser
245 250 255
Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser
260 265 270
Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr
275 280 285
Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu
290 295 300
Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys
305 310 315 320
Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met
325 330 335
Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu
340 345 350
Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp
355 360 365
Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys
370 375 380
Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu
385 390 395 400
Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val
405 410 415
Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe
420 425 430
Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg
435 440 445
Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu
450 455 460
Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr
465 470 475 480
Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val
485 490 495
Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe
500 505 510
Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val
515 520 525
Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser
530 535 540
Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys
545 550 555 560
Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys
565 570 575
Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala
580 585 590
Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg
595 600 605
Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp
610 615 620
Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu
625 630 635 640
Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly
645 650 655
Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp
660 665 670
Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn
675 680 685
Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp
690 695 700
Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr
705 710 715 720
Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly
725 730 735
Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp
740 745 750
Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu
755 760 765
Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val
770 775 780
Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys
785 790 795 800
Asp Glu Leu
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原1
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Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn
1 5 10 15
Pro Thr Gln Lys
20
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<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原2
<400> 3
Val Lys Lys Pro Pro Arg Gly Arg Lys Pro Ala Glu Lys Pro Leu Pro
1 5 10 15
Lys Pro Arg
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原3
<400> 4
Gly Phe Gly Phe Val Thr Phe Ser Ser Met Ala Glu Val Asp Ala Ala
1 5 10 15
Met Ala Ala Arg Pro His Ser Ile Asp Gly Arg
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<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原4
<400> 5
Leu Gln Ala Gln Gly Val Glu Val Pro Ser Lys Asp Ser Leu Pro Lys
1 5 10 15
Lys Arg Pro Ile Tyr Glu Asp Lys Lys Arg Lys
20 25
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原5
<400> 6
Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ala
1 5 10 15
Val Asp Lys Lys Ala Ala Gly Ala Gly Lys Val Thr Lys Ser Ala Gln
20 25 30
Lys Ala Gln Lys Ala
35
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原6
<400> 7
Gln Leu Arg Lys Leu Gln Leu Gln
1 5
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原7
<400> 8
Thr Gln Asn Thr Tyr Gln His Phe Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Val Val
1 5 10 15
Ala Gly Arg
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原8
<400> 9
Ala Thr Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asn
20
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原9
<400> 10
Lys Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Asp Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala
20 25 30
Gly Ala Ala Ser Gly Glu Gln
35
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原10
<400> 11
Val Ala Phe Gln Asp Val Ala Gln Asn Pro Ala Asn Met Ser Lys Tyr
1 5 10 15
Gln Ser Asn Pro Lys Val Met Asn Leu
20 25
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原11
<400> 12
Thr Ile Lys Pro Asp Val Gln Lys Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Lys Gln
1 5 10 15
Lys
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原12
<400> 13
Phe Val Thr Ala Ala Gln Thr Ser Gly Leu Pro Ser Ser Val Arg
1 5 10 15
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原13
<400> 14
Ala Ser Asp Pro Leu Asp Thr Leu Gly Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Gly Val Ala Ser Leu
20
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原14
<400> 15
Phe Gln Ala Pro Asp Leu Arg Gly Ile Ser Glu Gln Ser Leu Val Val
1 5 10 15
Ser Gly Val Gln His Gln Ser Thr Leu Glu Leu
20 25
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原15
<400> 16
Leu Arg Glu Pro Val Arg Ala Pro Ala Val Ala Val Ala Pro Thr Pro
1 5 10 15
Val Gln Pro Pro Ile Ile Val Ala Pro Val Ala
20 25
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原16
<400> 17
Ile Arg Glu Phe Asp Asn Met Ala Lys Val Gln Asp Glu Lys Arg Lys
1 5 10 15
Ser Lys Gln Lys Leu Gly
20
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原17
<400> 18
Ala Ser Thr Ala Ser Gln Leu His Ser Asn Val Val Asn Tyr Val Gln
1 5 10 15
Gln Ile Val Ala Pro Lys Gly Ser
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原18
<400> 19
Lys Val Ser Met Glu Ala Val Gln Lys Asn Gln Gly Arg Lys Lys Gln
1 5 10 15
Val Val Gln Phe
20
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原19
<400> 20
Tyr Trp Val Asn Gly Gln Val Pro Asp Gly Val Ser Lys Val Leu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原20
<400> 21
Ile Ser Lys Lys Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly
1 5 10 15
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原21
<400> 22
Val Arg Gln Ile Asn Arg Lys Thr Pro Val Pro Gly Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原22
<400> 23
Leu Glu Gly Lys Pro Leu Glu Ala Ser Arg Ala Leu Pro Ala Lys Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原23
<400> 24
Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原24
<400> 25
Glu Pro Ser Pro Gly Thr Leu Pro Arg Lys Ala Gly Val Phe Ser Asp
1 5 10 15
Leu Ser Asn Gln Glu Leu Lys Ala Val His Ser Phe Leu
20 25
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原25
<400> 26
Ser Arg Pro Gly Gly Arg Ala Ser Val Asp Thr Lys Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Gln Val Glu Ala Gly Lys Arg Leu Glu Glu Leu
20 25
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原26
<400> 27
Ser Val Gln Arg Gln Phe Phe Pro Thr Asp Glu Asp Glu Ile Gly Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Leu
20
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原27
<400> 28
Asp Leu Gly Asn Ile Arg Ala Glu Pro Leu Asn Ser Val Ala His
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原28
<400> 29
Lys Ile Gly Ile Val Gly Leu Pro Asn Val Gly Lys Ser Thr Phe
1 5 10 15
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原29
<400> 30
Asp Leu Pro Ala Pro Val Thr Pro Gln Pro Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原30
<400> 31
Val Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala
1 5 10 15
Arg
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原31
<400> 32
Ala Ala Pro Ala Val Gln Thr Lys Thr Lys Lys Thr Leu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Asn Ile Arg Asn
20
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原32
<400> 33
His Gly Glu Gly Ser Ser Ser Gly Lys Ala Thr Gly Asp Glu Thr Gly
1 5 10 15
Ala Lys Val Glu Arg Ala Asp Gly Tyr Glu Pro Pro Val Gln Glu Ser
20 25 30
Val
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原33
<400> 34
Ser Ala Ser Leu Gly Thr Arg Gln Ala Glu Pro Glu Leu Asp Leu Arg
1 5 10 15
Ser Ile Lys
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原34
<400> 35
Pro Ala Ala Asp Asn Ile Glu Met Leu Pro His Tyr Glu Pro Ile Pro
1 5 10 15
Phe Ser Ser Ser Met Asn Glu Ser Ala Pro Thr Gly Ile Thr
20 25 30
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原35
<400> 36
Asn Tyr Asp Ile Pro Asn Leu Ala Lys Lys Leu Glu Glu Ile Lys Lys
1 5 10 15
Asp Leu Asp Ala Lys Lys Lys Pro Pro Ser Ala
20 25
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原36
<400> 37
Ala Val Pro Met Gln His Asn Asn Arg Pro Thr Gln Pro Leu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Thr Val Arg Ala Ser Phe
20
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原37
<400> 38
Ala Ala Ile Pro Lys Asp Lys Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Pro Asp
1 5 10 15
Leu Met
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原38
<400> 39
Ile Arg Glu Val Ala Asn Lys Val Lys Val Pro Leu Gln Asp Leu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原39
<400> 40
Thr Lys Leu Ala Asn Pro His Tyr Gln Pro Glu Leu Gln Ala Gln Ala
1 5 10 15
Thr Leu
<210> 41
<211> 56
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原40
<400> 41
Thr Pro Ala Val Pro Val Glu Ser Lys Pro Asp Lys Pro Ser Gly Lys
1 5 10 15
Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Leu Gly Gly
20 25 30
Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val
35 40 45
Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr
50 55
<210> 42
<211> 38
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原41
<400> 42
Gly Ile Leu Gly Tyr Thr Glu His Gln Val Val Ser Ser Asp Phe Asn
1 5 10 15
Ser Asp Thr His Ser Ser Thr Phe Asp Ala Gly Ala Gly Ile Ala Leu
20 25 30
Asn Asp His Phe Val Lys
35
<210> 43
<211> 38
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原42
<400> 43
Glu Pro Val Arg Thr Ser Arg Glu His Pro Val Pro Leu Leu Pro Ile
1 5 10 15
Arg Gln Thr Leu Pro Glu Asp Asn Glu Glu Pro Pro Ala Leu Pro Pro
20 25 30
Arg Thr Leu Glu Gly Leu
35
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原43
<400> 44
Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原44
<400> 45
Pro Glu Lys Arg Pro Phe Glu Arg Leu Pro Ala Asp Val Ser Pro Ile
1 5 10 15
Asn Tyr Ser Leu
20
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原45
<400> 46
Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ala Glu Lys Leu Ser Pro
1 5 10 15
Lys Ala Ala Thr Leu Ala Glu Arg Ser Ala Gly Leu Ala Phe Ser Leu
20 25 30
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原46
<400> 47
Thr Ser Trp Glu Arg Val Ser Thr Glu Val Arg Asp Tyr Val Tyr Arg
1 5 10 15
Gln Glu Ala Arg Leu Glu
20
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原47
<400> 48
Ser Asp Gly Val Pro Ser Asp Ser Val Glu Ala Ala Lys Asn Ala Ser
1 5 10 15
Asn Thr Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Met Gln Asn Pro Arg Val Leu
20 25 30
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原48
<400> 49
Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val
1 5 10 15
Asn Pro Thr Gln Lys
20
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<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原49
<400> 50
Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala
20 25
<210> 51
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原50
<400> 51
Glu Ala Asp Glu Arg Glu Pro Thr Glu Ser Thr Gln Gln Leu Asn Lys
1 5 10 15
Pro Glu Val Leu Glu Val Thr Leu Asn Arg Pro Phe Leu Phe
20 25 30
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原51
<400> 52
Ala Leu Ala Gly Asn Gln Asp Lys Arg Lys Glu Val Leu Lys Ser Leu
1 5 10 15
Asn Glu Glu Ala Val Lys Lys Asp Asn
20 25
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原52
<400> 53
Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu
20 25
<210> 54
<211> 38
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原53
<400> 54
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
1 5 10 15
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
20 25 30
Gly Leu Leu Pro Val Leu
35
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原54
<400> 55
Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
20 25
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原55
<400> 56
Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ser Tyr Arg
20
<210> 57
<211> 35
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原56
<400> 57
Glu Pro Ser Pro Gly Thr Leu Pro Arg Lys Ala Gly Val Phe Ser Asp
1 5 10 15
Leu Ser Asn Gln Glu Leu Lys Ala Val His Ser Phe Leu Trp Ser Lys
20 25 30
Lys Glu Leu
35
<210> 58
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原57
<400> 58
Leu Glu Tyr Arg Glu Val Val Asp Gly Leu Glu Lys Ala Ile Tyr Lys
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro
20
<210> 59
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原58
<400> 59
Lys Leu Ser Asn Asn Ala Leu Ser Gly Leu Pro Gln Gly Val Phe Gly
1 5 10 15
Lys Leu Gly Ser Leu Gln Glu Leu
20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原59
<400> 60
Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ser Ser Ile Phe
20
<210> 61
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原60
<400> 61
Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp Gly Lys Val Asn
1 5 10 15
Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu
20 25
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原61
<400> 62
Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu
20 25
<210> 63
<211> 29
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原62
<400> 63
Val Gly Asn Lys Ser Asp Leu Arg His Leu Arg Ala Val Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Ala Arg Ala Phe Ala Glu Lys Asn Asn Leu Ser Phe
20 25
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原63
<400> 64
Ile Lys Gln Leu Ala Lys Ser Val Arg Asp Arg Tyr Ala Arg Ser Pro
1 5 10 15
Lys Glu Lys
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原64
<400> 65
Ala Ala Pro Ser Glu Pro Ser Glu Pro Ser Arg Pro Ser Pro Gln Pro
1 5 10 15
Lys Pro Arg Thr Pro
20
<210> 66
<211> 42
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原65
<400> 66
Arg Ser Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Gly Glu Asp Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Gly Gly Gly Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Pro Gly Thr Ser
20 25 30
Pro Glu Ala Gln Gly Lys Ala Ser Val Asn
35 40
<210> 67
<211> 35
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原66
<400> 67
Ser Asn Glu Asn His Gly Ile Ala Gln Arg Ile Tyr Gly Asn Gln Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ser Gln Leu Lys Lys Phe Tyr Asn Gln Val Ser Thr Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Asn
35
<210> 68
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原67
<400> 68
Leu Ser Ser Trp Leu Gln Ser Asp Asp Glu Pro Glu Lys Glu Arg Leu
1 5 10 15
Arg Gln Arg Ala Gln Ala Leu Ala Val Ser Tyr
20 25
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原68
<400> 69
Ile Ala Asn Met Pro Glu Ser Gly Pro Ser Tyr Glu Phe His Leu Thr
1 5 10 15
Arg Gln Glu Ile Val Ser Leu
20
<210> 70
<211> 34
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原69
<400> 70
Phe Ser Glu Thr Gly Ala Gly Lys His Val Pro Arg Ala Val Phe Val
1 5 10 15
Asp Leu Glu Pro Thr Val Ile Asp Glu Val Arg Thr Gly Thr Tyr Arg
20 25 30
Gln Leu
<210> 71
<211> 47
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原70
<400> 71
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
20 25 30
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe
35 40 45
<210> 72
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 抗原71
<400> 72
Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys
1 5 10 15
Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu
20 25 30

Claims (10)

1.一种热休克蛋白gp96-抗原复合物，其通过以下方法制备得到：
将离体动物组织(例如，人或非人哺乳动物的胎盘组织或肿瘤组织)的匀浆液依次经ConA-Sepharose凝胶柱层析、HiTrap Q离子交换层析以及CHT离子交换层析分离得到所述热休克蛋白gp96-抗原复合物。
2.权利要求1所述的热休克蛋白gp96-抗原复合物，其制备方法特征在于下述的一项或多项：
(1)所述离体动物组织的匀浆液经下述方法制备得到：将离体动物组织按质量(g)-体积(ml)比1：4～1：8的比例加入10～50mM、pH值为6～8的NaHCO3溶液中研磨，得所述组织匀浆液；
(2)在分离前，还包括将所述组织匀浆液按下述步骤初步提纯的操作：
步骤1-1：将所述组织匀浆液低温(例如，2～6℃)离心，取上清；
优选地，将所述组织匀浆液在2～6℃，1000rpm～10000rpm离心0.5h～1h，收集上清，任选地，将收集到的上清在2～6℃，1000rpm～10000rpm再次离心0.5h～1h，取上清；
步骤1-2：采用硫酸铵分级沉淀法，将步骤1-1所得上清在低温条件下(例如，2～6℃)加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为50％～70％时所得沉淀，得初提物；优选地，按质量(g)-体积(ml)比1：(2～20)的比例用含50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液溶解所得沉淀；
(3)所述ConA-Sepharose凝胶柱层析包括以下步骤：
步骤2-1：将所述初提物上样至ConA-Sepharose凝胶柱；
步骤2-2：用含50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液洗脱至检测波长为280nm时洗脱产物紫外吸收低于0.01；
步骤2-3：用含8％α-吡喃糖苷、50～200mM NaCl的5～50mM Tris-HCl溶液继续洗脱，收集洗脱液(优选地，收集第0～3个(例如，0.5～2个)柱体积的流穿液)，得ConA-Sepharose分离物；
(4)所述HiTrap Q离子交换层析包括以下步骤：
步骤3-1：将所述ConA-Sepharose分离物上样至HiTrap Q离子交换柱；
步骤3-2：用5～50mM Tris-HCl清洗HiTrap Q离子交换柱；
步骤3-3：用含NaCl(300mM～1000mM)的5～50mM Tris-HCl洗脱，收集洗脱液至检测波长为280nm时洗脱产物吸光度值低于100mA；任选地，将收集到的洗脱液浓缩(例如，超滤浓缩)并用pH 6～8的20～100mM磷酸盐缓冲液稀释，得HiTrap Q分离物；
(5)所述CHT离子交换层析包括以下步骤：
步骤4-1：将所述HiTrap分离物上样至CHT离子交换柱；
步骤4-2：用5～50mM PB清洗CHT离子交换柱；
步骤4-3：用含300mM～1000mMPB洗脱，收集洗脱液至吸光度值低于100mA；任选地，将收集到的洗脱液浓缩(例如，超滤浓缩)并用pH 6～8的5～50mM磷酸盐缓冲液稀释，得所述热休克蛋白gp96-抗原复合物。
3.权利要求1或2的热休克蛋白gp96-抗原复合物，其中所述抗原选自如Seq ID No.2～72所示的多肽中的一种或多种(例如，1种以上、5种以上、10种以上、15种以上、20种以上、25种以上、30种以上、35种以上、40种以上、45种以上、50种以上、55种以上、60种以上、65种以上或70种以上)，所述多肽为肿瘤相关抗原或肿瘤组织中高表达蛋白；
优选地，所述复合物纯度为80％以上，例如85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上或99％以上。
4.一种DC细胞群体，其通过以下方法制备得到：
(1)提供单核细胞；
(2)于含0.1～5μM糖皮质激素类化合物的DC细胞培养基中培养所述单核细胞3～10天(例如，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天或10天，优选6天)，获得成熟的DC细胞；
(3)按20～100μg/1×107个DC细胞的比例，加入权利要求1-3任一项所述的热休克蛋白gp96-抗原复合物，继续培养6～48h，收集得到所述DC细胞群体。
5.权利要求4所述的DC细胞群体，其特征在于下述的一项或多项：
1)步骤(1)中所述单核细胞来源于外周血或脐带血，优选为外周血；
2)步骤(2)中所述糖皮质激素类化合物为地塞米松；
3)在步骤(2)中，按1×105～1×108个/ml(例如，1×105个/ml，1×106个/ml，1×107个/ml，或1×108个/ml，优选2～4×106个/ml)的密度将所述单核细胞接种至所述DC细胞培养基；
4)在步骤(2)所述培养过程中(例如在培养的第0天，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天或10天)加入PHA、IL-2、IL-4、GM-CSF和TNF-α中的一种或多种；例如，在培养的第0天加入GM-CSF(例如，终浓度为50～100ng/ml)和IL-4(例如，终浓度为50～100ng/ml)；再例如，在培养的第6天加入TNF-α(优选终浓度为10～50ng/ml)；
5)步骤(2)中所述DC细胞培养基为RPMI1640；
6)步骤(2)和(3)中所述培养的具体条件均为37℃、5％CO2。
6.权利要求4或5的DC细胞群，其中CD83+的DC细胞比例大于70％，例如大于75％，大于80％，大于85％，大于90％，大于91％，大于92％，大于93％，大于94％，大于95％，大于96％，大于97％，大于98％或大于99％；
优选地，以所述DC细胞群体刺激PBMCs细胞IFN-γ+ELISPOT斑点数大于500CD83+的DC细胞比例大于95％。
7.一种药物组合物，其含有权利要求1-3任一项所述的热休克蛋白gp96-抗原复合物和/或权利要求4-6任一项所述的DC细胞群体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
8.一种疫苗佐剂、免疫调节剂或疫苗制剂，其含有权利要求1-3任一项所述的热休克蛋白gp96-抗原复合物和/或权利要求4-6任一项所述的DC细胞群体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
9.权利要求7所述的药物组合物或者权利要求8所述的疫苗佐剂、免疫调节剂或疫苗制剂，其为注射剂(例如，注射液或者冻干粉针剂)；
优选地，单位剂量DC细胞含量不少于1×104个(例如不少于1×104个，不少于3×104个，不少于5×104个，不少于7×104个，不少于1×105个，不少于3×105个，不少于5×105个，不少于7×105个，不少于1×106个，不少于3×106个，不少于5×106个，不少于7×106个，不少于1×107个，不少于3×107个，不少于5×107个，不少于7×107个，不少于1×108个，不少于3×108个，不少于5×108个，不少于7×108个，不少于1×109个，不少于3×109个，不少于5×109个，不少于7×109个，不少于1×1010个，不少于3×1010个，不少于5×1010个或不少于7×1010个，又例如1×105～1×108个)。
10.权利要求1～3任一项所述的热休克蛋白gp96-抗原复合物或权利要求4-6任一项所述的DC细胞群体在制备药物中的用途，其中所述药物具有以下至少一种功能：
(1)增强受试者免疫反应(例如，非特异性免疫反应)；
(2)诱导产生肿瘤特异性CTL细胞；
(3)抗肿瘤(例如，减缓或停止已建立的肿瘤病灶的生长)；
优选地，所述肿瘤选自脑胶质瘤和胆管癌。
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