JP6782503B1 - 癌治療用細胞組成物を製造する方法、それにより製造される癌治療用細胞組成物、及び癌治療用細胞組成物を用いた癌の治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、癌治療に用いることができる成熟化樹状細胞及び／又は樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法、及びそれにより得られる癌治療用細胞組成物を提供することを目的とする。【解決手段】（１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で培養する工程；（２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で培養する工程；（３）前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；及び（４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で成熟樹状細胞を誘導する工程；及び（５）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群をサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、を含む方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、癌治療用細胞組成物を製造する方法及びそれにより製造される癌治療用細胞組成物に関する。また、本発明は、癌治療用細胞組成物を用いた癌の治療方法に関する。

樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）は、強力な抗原提示細胞である。血液、組織、リンパ器官などに存在し、微生物や癌などの異物を貪食して、ＤＣ上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ分子に抗原ペプチドを発現させ、それぞれがＣＤ４Ｔ細胞、及びＣＤ８Ｔ細胞を活性化させる。これにより、抗原特異的に生体内の免疫応答を誘導して、異物を排除する。

ＤＣを用いた癌免疫療法は、臨床研究（試験）や自由診療下で多くの施設で実施されているが、期待されているような臨床効果が認められていない。これは、ＤＣが抗原提示能を得るための十分な成熟化が得られていない、ＤＣの数が少ない、あるいは一般的な投与ルートである皮内又は皮下接種されたＤＣが、ナイーブT細胞に抗原提示する場であるリンパ節へ遊走されないためである、と考えられている。

そのような状況の下、本発明者らは、癌患者から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から成熟化ＤＣと、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導し、それらを抗癌剤（シクロフォスファミド）とを併用した臨床試験を実施し、ある程度の癌治療効果が得られることを見出した（非特許文献１）。

Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８ Ｊａｎ ２；１３（１）：ｅ０１８７８７８

本発明の課題は、癌治療に用いることができる成熟化樹状細胞及び／又は樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法、それにより得られる癌治療用細胞組成物、及び癌治療用細胞組成物を用いた癌の治療方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、本発明を開発するに至った。すなわち、本発明は以下の特徴を有する。

［１］ 成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
（１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
（２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
（３）前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；及び、
（４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
を含む、方法。
［２］ 前記工程（３）において、プロスタグランジンＥ２をさらに添加する、［１］に記載の方法。

［３］ 樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
（１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
（２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
（３）前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；
（４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程；及び、
（５）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
を含む、方法。
［４］ 前記工程（３）において、プロスタグランジンＥ２をさらに添加する、［３］に記載の方法。
［５］ 前記工程（５）が、
（５−１）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２及びＩＬ−１２を含む培地中で、６〜３６時間培養する工程；及び
（５−２）前記工程（５−１）で得られる前記第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む培地中で、１２〜１６８時間培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
である、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］ （６）前記工程（５）により得られる前記第１細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第２細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、［３］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］ （７）前記工程（６）により得られる前記第２細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第３細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、［６］に記載の方法。
［８］ 培養することが、刺激応答性培養基材を用いて実施される、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。

［９］ ［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
［１０］ 前記工程（４）で得られる成熟樹状細胞と併用される、［３］〜［７］のいずれか１項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
［１１］ 抗癌剤と併用される、［９］又は［１０］に記載の癌治療用細胞組成物。

［１２］ ［９］又は［１０］に記載の癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法であって、
癌の治療又は予防を必要とする対象に、前記癌治療用細胞組成物を投与する工程、
を含む方法。
［１３］ 前記投与する工程が、２回以上実施される、［１２］に記載の方法。
［１４］ 前記投与する工程が、前記癌治療用細胞組成物を、前記対象のリンパ節に直接投与する工程である、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］ 前記対象が、抗癌剤が投与された、放射線療法、及び／又は手術に供された対象である、［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。

本発明により、従来よりも治療効果の高い癌治療用細胞組成物を、効率的に作製することができる。また、本発明の癌治療用細胞組成物を用いることにより、治療効果の高い癌治療を提供することが可能となる。

図１は、末梢血から成熟樹状細胞（成熟ＤＣ）及び樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）への分化方法の概略図を示す。 図２は、成熟樹状細胞の細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲのそれぞれの発現を解析した図である。各パネルは解析の対象とする分子に特異的な抗体による染色を施した蛍光強度を示す。縦軸は樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃの蛍光強度、横軸は各細胞表面分子の蛍光強度を示す。 図３は、１０例の癌患者の末梢血単核球から作製した成熟ＤＣの細胞表面分子の陽性率を示す。 図４は、１０例の癌患者の樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）の細胞表面分子ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの発現率を示す。 図５は、成熟樹状細胞（成熟ＤＣ）及び樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）を用いた臨床試験のスケジュールを示す。 図６は、治療前後の患者末梢血中のＲＮＦ４３ペプチド特異的細胞の変化を示す。（Ａ）患者における治療前後の患者末梢血中のＲＮＦ４３ペプチド特異的ＣＤ１０７ａ／ｂ陽性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の割合の変化を示す。（Ｂ）患者における治療後の患者末梢血中のＲＮＦ４３ペプチド特異的ＩＦＮ−γ陽性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の割合の変化を示す。ＳＤ＝ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ； ＰＤ＝ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ（ＲＥＣＩＳＴ基準に基づく）。実線：ＳＤ症例（有効例）、点線：ＰＤ症例（無効例）。 図７は、実施例１に記載の方法で得られた成熟ＤＣのＤａｙ６及びＤａｙ８における細胞表面分子の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 図８は、実施例１に記載の方法で得られた１２例の癌患者の成熟ＤＣの細胞表面分子の発現率を示す。ＳＤ：ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ； ＰＤ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ（ＲＥＣＩＳＴ基準に基づく） 図９は、ＯＫ４３２又はＯＫ４３２＋プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加後、３時間、６時間、１２時間又は２４時間培養後の成熟ＤＣの細胞表面分子の発現量（平均蛍光強度：ＭＦＩ）を示す。 図１０は、ＯＫ４３２又はＯＫ４３２＋プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加後、３時間、６時間、１２時間又は２４時間培養後の、各種細胞表面マーカーを発現する成熟ＤＣの割合を示す。ＳＳＣとＦＳＣゲーティングしたでＤＣ分画におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞の数を１００％とした時の、各種細胞表面マーカーを発現する細胞の割合を示す。 図１１は、ＯＫ４３２に加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）非添加（−）又は添加（＋）にて、従来の細胞培養基材（Ｓｔａｎｄａｒｄ）又は温度応答性培養基材（ＵｐＣｅｌｌ）上で誘導したＤＣの誘導効率（ＣＤ１１ｃの発現）を示す。「ＤＣ＃１」及び「ＤＣ＃２」はそれぞれ別の被験体由来のＤＣであることを示す。 図１２は、ＯＫ４３２に加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）非添加（−）又は添加（＋）にて、従来の細胞培養基材（Ｓｔａｎｄａｒｄ）又は温度応答性培養基材（ＵｐＣｅｌｌ）上で誘導した成熟ＤＣのＣＤ８０の発現量（平均蛍光強度：ＭＦＩ）を示す。「ＤＣ＃１」及び「ＤＣ＃２」はそれぞれ別の被験体由来のＤＣであることを示す。 図１３は、ＯＫ４３２に加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）非添加（−）又は添加（＋）にて、従来の細胞培養基材（Ｓｔａｎｄａｒｄ）又は温度応答性培養基材（ＵｐＣｅｌｌ）上で誘導した成熟ＤＣのＣＣＲ７の発現量（平均蛍光強度：ＭＦＩ）を示す。「ＤＣ＃１」及び「ＤＣ＃２」はそれぞれ別の被験体由来のＤＣであることを示す。 図１４は、ＯＫ４３２に加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）添加にて、従来の細胞培養基材（Ｓｔａｎｄａｒｄ）又は温度応答性培養基材（ＵｐＣｅｌｌ）上で誘導した成熟ＤＣの顕微鏡写真を示す。「ＤＣ＃１」及び「ＤＣ＃２」はそれぞれ別の被験体由来のＤＣであることを示す。 図１５は、ＯＫ４３２又はＯＫ４３２＋プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加後、３時間、６時間、１２時間又は２４時間培養後の成熟ＤＣによるＩＬ−１２の分泌量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。ＩＬ−１２の量はＥＬＩＳＡにより測定した。 図１６は、末梢血から成熟樹状細胞（成熟ＤＣ）を作成し複数のオンコアンチゲンやネオアンチゲンペプチドを各々２０〜５０ｕｇ／ｍｌ濃度でパルスする方法の概略図を示す。

本発明を以下に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることを意図するものではない。

本明細書において、「第１」「第２」「第３」等の用語は、１つの要素をもう１つの要素と区別するために用いており、例えば、第１の要素を第２の要素と表現し、同様に第２の要素を第１の要素と表現してもよく、これによって本発明の範囲を逸脱するものではない。

特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語（技術的用語および科学的用語）は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。

なお、以下の「成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」、「樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」、「癌治療用細胞組成物」及び「癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法」において説明されている事項は、相互に適用され得る。

＜成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法＞
一実施態様において、本発明は、成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
（１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
（２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
（３）前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；及び、
（４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間、インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
を含む、方法を提供する。

本明細書において、「樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）」とは、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩに提示してＴ細胞を活性化する能力を持つ細胞をいい、表面マーカーとして、例えば、ヒトの樹状細胞では、ＣＤ１１ｃ及びＭＨＣ−ｃｌａｓｓ ＩＩ（特に、ＨＬＡ−ＤＲ）が陽性の細胞であり、マウスの樹状細胞ではＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＣＤ２４及びＣＤ４５が陽性並びにＳｉｇｌｅｃ−Ｆが陰性の細胞として知られる。

本明細書において「樹状細胞前駆細胞」とは、適当な因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＳＣＦ（ｃ−ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ−３リガンド、またはそれらの組み合わせ等）の存在下でＤＣに分化する細胞をいう。樹状細胞前駆細胞は、単球、ＣＤ３４^＋幹細胞、造血始原細胞、骨髄単核球等が挙げられ、これらは、本発明の樹状細胞前駆細胞として用いることができる。

一実施態様において、本発明に用いられる樹状細胞前駆細胞は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を、培養容器に播種し、３０分〜２４０分、好ましくは６０分〜１８０分（例えば、約１２０分）、３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートし、接着した細胞（例えば、単球）を、樹状細胞前駆細胞として用いることができる。培養容器に接着した細胞は、ピペッティング、タッピング又は細胞剥離液（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡなど）で剥離して回収してもよく、刺激応答性培養基材（例えば、温度、ｐＨ、光、電気等の刺激によって分子構造を変化させて、細胞の接着性を変化させる培養基材、好ましくは、温度応答性培養基材（例えば、セルシード（日本）製のＵｐＣｅｌｌ（登録商標）））を用いて、任意の刺激を与えることによって接着した細胞を剥離させて回収してもよい。他の実施態様において、本発明に用いられる樹状細胞前駆細胞は、例えば、セルソーターやエルトリエータを用いて、任意の細胞群より単球、ＣＤ３４^＋幹細胞、造血始原細胞又は骨髄単核球を単離して、本発明の樹状細胞前駆細胞として用いてもよく、ネガティブセレクションによって選択してもよい。

本明細書において、ＰＢＭＣとは、単球やリンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＢ細胞）を含む細胞集団であり、顆粒球、赤血球、及び血小板などがほぼ除去された細胞集団を意味する。ＰＢＭＣは、例えば、患者から採取した試料より比重遠心分離法等の公知の方法によって得ることができる。患者から採取した試料としては、末梢血、骨髄液、臍帯血等があげられる。

本明細書において、「未成熟樹状細胞」とは、成熟状態に比べＴ細胞活性化能力が有意に低い樹状細胞をいう。一方、「成熟樹状細胞」とは、未成熟状態に比べＴ細胞活性化能力が有意に高い樹状細胞をいう。成熟樹状細胞、特にヒト成熟樹状細胞は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＭＨＣ−ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲ）からなる群から選択される表面マーカーの発現が陽性の細胞である。従って、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＭＨＣ−ｃｌａｓｓ Ｉ及びＩＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲ）からなる群から選択される表面マーカーの発現を基に、未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞を見分けることができる。未成熟樹状細胞はこれらのマーカーの発現が弱いか、又は陰性である。

未成熟樹状細胞は、抗原特異的傷害生Ｔ細胞をアナジー（ａｎｅｒｇｙ）に陥らせる働きを有することが知られている。そのため、未成熟樹状細胞の割合が多い細胞組成物は、癌抗原特異的傷害生Ｔ細胞を活性化させる能力が低いだけでなく、癌抗原特異的傷害生Ｔ細胞の活性化を抑制する負の効果をもたらす。その結果、癌治療効果が低いだけでなく、逆に癌を悪化させてしまう可能性がある。

本発明によって、未成熟樹状細胞の割合を低減させ、一方で成熟樹状細胞、特にＣＤ８３陽性成熟樹状細胞を効率的に誘導させた癌治療用細胞組成物を得ることができる。そのため、従来の免疫療法に用いられる樹状細胞、特に未成熟樹状細胞の割合が高い細胞組成物よりも、癌抗原特異的傷害生Ｔ細胞を活性化させる能力が高く、治療効果が高い成熟樹状細胞を含む癌治療用細胞組成物を提供することが可能となる。

一実施態様において、本発明の工程（１）は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間、好ましくは９６〜１３２時間（例えば、約１２０時間）培養する工程である。本工程（１）によって、樹状細胞前駆細胞が、効率的に未熟樹状細胞へと分化させることができる。

一実施態様において、本発明の工程（２）は、工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間、好ましくは１２時間〜３６時間（例えば、約２４時間）培養する工程である。本明細書において、「キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）」とは、免疫調節剤の一種であり、免疫反応を促進する物質として知られている。本工程（２）によって、未熟樹状細胞が、効率的に成熟樹状細胞へと分化させることができる。

一実施態様において、本発明の工程（３）は、前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間、例えば１０時間〜３０時間培養する工程である。本明細書において、「ピシバニール」とは、別名「ＯＫ４３２（ＯＫ−４３２）」と呼ばれ、溶連菌の乾燥菌体を有効成分とする抗悪性腫瘍剤又はリンパ管腫治療剤である。本工程（３）によって、続く工程（４）で添加される腫瘍関連抗原を効率的に成熟樹状細胞にパルスすることができる。また、本工程（３）によって、工程（２）で得られる細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に必要であるＩＬ−１２の産生が促進される。本工程（３）において、後述するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加しない場合、１８時間を超えて培養すると、工程（２）で得られる細胞のＣＣＲ７の発現が低減する。そのため、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加しない場合は、工程（３）における培養時間は、３時間〜１８時間、好ましくは８時間〜１４時間、より好ましくは１０時間〜１４時間（例えば、約１２時間）がよい。

他の態様において、本発明の工程（３）は、前記工程（２）に、ピシバニールに加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加し、３時間〜３６時間培養する工程であってもよい。工程（３）においてピシバニールに加えプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）がさらに添加されることにより、樹状細胞の成熟化マーカーであるＣＤ８０の発現や、ＣＤ８３の発現は低下せず、一方で遊走能のマーカーであるＣＣＲ７の発現が上昇する。本工程（３）において、ピシバニールに加え、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を添加する場合、培養時間は、３時間〜３６時間、好ましくは８時間〜３６時間、より好ましくは１０時間〜３０時間（例えば、約２４時間）がよい。

一実施態様において、本発明の工程（４）は、前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間、好ましくは６０分〜１８０分（例えば、約１２０分間）インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程である。

本明細書において「腫瘍関連抗原」とは、癌細胞に特異的に発現しているタンパク質若しくはそのフラグメント、又は癌細胞において正常細胞より発現が有意に多いタンパク質若しくはそのフラグメントをいい、例えば、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｈｅｒ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ ２）、ｈＴＥＲＴ（Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ １）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １）及びＲＮＦ４３（Ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＶＥＧＦＲ１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、及びＶＥＧＦＲ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）等の腫瘍血管新生に関与するタンパク質も腫瘍関連抗原に含んでもよい。

本発明に用いられる腫瘍関連抗原は、ネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）であってもよい。本明細書において、「ネオ抗原」とは、新生抗原、新規抗原、腫瘍特異的変異抗原などとも呼ばれ、癌細胞独自の遺伝子変異に伴って新たに生まれた変異抗原であり、正常な細胞には発現しておらず、癌細胞のみに特異的に発現する抗原である。

本明細書において、「腫瘍関連抗原由来ペプチド」とは、腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８〜１２のペプチド、及びその類似体をいう。アミノ酸数は、例えば、８個、９個、１０個、１１個又は１２個である。

一実施態様において、本発明に用いられ得る腫瘍関連抗原由来ペプチドの候補及び腫瘍関連抗原由来ペプチドは、市販されているものを用いてもよく、あるいは、ＨＬＡ型や腫瘍関連抗原のアミノ酸配列等に基づき、例えば、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ等のコンピュータープログラムを用いて設計し、合成したものを用いてもよい。

腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８〜１２のペプチドの類似体とは、そのペプチドの機能特性を実質的に変えることなく、ペプチドの一方若しくは両方の末端又は内部に、１又は数個（例えば、２個又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたペプチドのエピトープをいう。腫瘍関連抗原由来ペプチドには、一方又は両方の末端に、そのペプチドの生成、精製、安定化、結合、又は検出等に関連する目的のために追加された１又は２以上のアミノ酸を結合したものであってもよい。

本発明において用いられる培地は、例えば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、α−ＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５等の市販の培地を用いることができる。培地には、必要に応じて、ウシ血清、ウシ胎児血清、及びヒト血清等の血清を添加してもよい。また、培地には、必要に応じて、各種の添加剤を加えてもよい。

＜樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法＞
一実施態様において、本発明は、成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
（１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
（２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
（３）前記工程（２）に、ピシバニールを添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；
（４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程；及び、
（５）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
を含む、方法を提供する。

一実施態様において、本発明の工程（１）〜（４）は、上記の「成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」と共通する。

一実施形態において、本発明の工程（５）は、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程である。

本明細書において、「リンパ球」とは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＢ細胞を含む細胞集団をいう。一実施態様において、本発明において用いられるリンパ球は、例えば、患者より採取されたＰＢＭＣを培養容器に播種し、３０分〜２４０分、好ましくは６０分〜１８０分（例えば、約１２０分）、３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートし、非接着細胞を回収することによって得ることができる。また、他の実施態様において、本発明に用いられるリンパ球は、例えば、セルソーターを用いて、ＰＢＭＣからを単離してもよく、ＰＢＭＣから単球をネガティブセレクションによって除去したものを用いてもよい。

本明細書において、「樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）」とは、前記工程（１）〜（４）の工程によって得られる成熟樹状細胞によって刺激を受けて活性化されたリンパ球をいう。ＤＡＫは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を合わせて９０％以上、好ましくは９５％以上含んでいる。本発明により、従来の免疫療法で用いられるリンパ球よりも、癌治療効果の高いリンパ球が提供される。特に、本発明によって作製されるＤＡＫは、従来のような癌特異的傷害効果の持続時間が少ない疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）Ｔ細胞でなく、分化度が若いメモリー型Ｔ細胞を多く含むものであり、癌特異的傷害効果が長期間持続する。

一実施態様において、前記工程（５）は、
（５−１）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２及びＩＬ−１２を含む培地中で、６〜３６時間、好ましくは１２時間〜３０時間（例えば、約２４時間）培養する工程；及び
（５−２）前記工程（５−１）で得られる前記第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む培地中で、１２〜１６８時間、好ましくは２４時間〜１０８時間（例えば、約９６時間）培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
である。

一実施態様において、本発明は、上記工程（５）で得られるＤＡＫをさらに活性化させるために、
（６）前記工程（５）により得られる前記第１細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第２細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含んでもよい。

一実施態様において、本発明は、上記工程（６）で得られるＤＡＫをさらに活性化させるために、
（７）前記工程（６）により得られる前記第２細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第３細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含んでもよい。

他の実施態様において、上記工程（６）及び（７）は、さらに任意の回数繰り返してもよい。

なお、上記の培養することは、刺激応答性培養基材（例えば温度応答性培養基材）を用いて実施されることが好ましい。これにより、細胞を回収する時に、接着した細胞を、非侵襲的に剥離させることができ、ダメージが少ない細胞を得ることができる。

＜癌治療用細胞組成物＞
上記の成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」及び「樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」によって、癌治療用細胞組成物が得られる。本発明の癌治療用細胞組成物は、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、免疫促進剤、及びアジュバント剤等の医薬上許容される担体又は溶媒などを含むことができる。

＜癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法＞
一実施態様において、本発明は、癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法であって、
癌の治療又は予防を必要とする対象に、前記癌治療用細胞組成物を投与する工程、
を含む方法を提供する。

本明細書において「対象」とは、癌の治療又は予防を必要とするヒトを含む哺乳類である。本明細書において、「癌の治療又は予防」とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及び癌と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせることをいう。

本発明に係る癌治療用細胞組成物が治療又は予防し得る癌としては、例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆管癌、子宮癌、乳癌、すい臓癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、悪性リンパ腫、咽頭癌、喉頭癌、癌性胸膜炎及び腹膜炎、並びに骨転移及び転移性癌が含まれるがこれらに限定されない。

一実施態様において、癌治療用細胞組成物を投与する工程は、２回以上実施されてもよい。

一実施態様において、癌治療用細胞組成物を投与する工程は、当業者に公知の方法で対象へ投与することを含む。例えば、罹患部位への直接投与であってもよく、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射、並びにリンパ節への直接注入であってもよく、適用される対象の状態に応じて、適宜選択することができる。例えば、表在リンパ節が大きく腫れていてエコー下穿刺が可能な対象には、癌治療用細胞組成物をリンパ節内へ直接投与してもよい。例えば、対象において、表在リンパ節が小さく穿刺注入できない対象には、工程（３）においてＰＧＥ２を添加し、遊走能を高めたＤＣを含む癌治療用細胞組成物を皮下注射することによって投与してもよい。癌治療用細胞組成物の投与量は、疾患、患者の体格、年齢、性別、症状、投与目的、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することができる。

一実施態様において、対象は、抗癌剤が投与された、放射線療法及び／又は手術（例えば、外科手術）に供された対象である。本発明の癌治療用細胞組成物と併用される抗癌剤は、対象が罹患している疾患に応じて、公知の抗癌剤を使用することができる。本発明に用いられ得る抗癌剤としては、特に限定されないが、例えば、分子標的薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、プラチナ製剤、ホルモン剤、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管作用抗癌剤、免疫賦活剤、抗癌性抗生物質等が挙げられ、これらを組み合わせて用いても良い。分子標的薬としては、例えば低分子化合物や抗体などであってもよく、例えば免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−１阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＣＤ１３７阻害剤、ＣＣＲ４阻害剤など）や、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）、ＶＥＧＦＲ阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦＲ抗体）、ＧＤ２阻害剤（例えば、ＧＤ２抗体）であってもよい。分子標的薬としては、例えば、イブリツモマブチウキセタン、ニボルマブ、イピリマブ、ペムブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、リルルマブ、ＢＭＳ９８６０１６、ウレルマブ、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブ、ベムラフェニブ、アレクチニブ等が挙げられる。アルキル化剤としては、例えば、イホスファミド、カルボコン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等が挙げられる。プラチナ製剤としては、例えば、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等が挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾール等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害薬としては、例えば、イリノテカン、エトポシド、ノギテカン等が挙げられる。微小管作用抗癌剤としては、例えば、エリブリン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン等が挙げられる。免疫賦活剤としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン、ウベニメクス、レンチナン、乾燥ＢＣＧ等が挙げられる。抗癌性抗生物質としては、例えば、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシン等が挙げられる。

また、本発明の癌治療用細胞組成物と併用される放射線療法は、当業者にとって公知の放射線療法を適用すればよい。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。なお、本実施例における臨床試験プロトコールは、九州大学病院の臨床試験倫理審査委員会によって承認されて実施されたものであり、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントを得て実施された。

［実施例１］
１．細胞の調製

樹状細胞（ＤＣ）、樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）の前駆細胞は、末梢血単核球から採取した。具体的には有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法も採用することができる。フィコール分画、つまりフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）密度勾配または溶出を利用する方法が、一般的に使用される。図１にヒト末梢血単核球からＤＣ、ＤＡＫへの分化誘導培養方法の概略図を示す。なお、以下の「ｘ日目」との記載は、各被験体より採血した日を「１日目」とした場合の日数を示す。

成熟樹状細胞の誘導
［１日目］
（１）各被験体より採取された末梢血単核球を、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、ＭＤ、ＵＳＡ）に懸濁し、Ｔ−１７５フラスコまたはＴ１７５フラスコ型ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（セルシード、日本）に入れた。

（２）３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータで１２０分静置した。
（３）インキュベータよりＴ−１７５フラスコを取り出し、タッピング及びピペッティングにて、非接着細胞（リンパ球）を回収し、１〜５×１０^７個／ｍｌになるようにケーエムバンカーＩＩ（コスモバイオ、日本）に加え懸濁し、クライオンチューブに分注し−８０℃以下に冷凍保存した。

（４）非接着細胞を除いた前記Ｔ−１７５フラスコ数個に、以下：
・１０００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；及び
・１０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−４（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
を含むＤＣ培養用培地（ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。

（５）３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータにて５日間培養した。

［６日目：サイトカイン、ＫＬＨ追加］
（６）以下：
・１０００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
・５０ｎｇ／μｌ ＴＮＦ−α（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；及び
・２５μｇ／ｍｌ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｏｐｏｒｅ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、
を含むＤＣ培養用培地（ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、前記Ｔ−１７５フラスコに加えた。

（７）３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータにて１日間培養した。

［７日目：ＯＫ４３２添加］
（８）各Ｔ−１７５培養フラスコにピシバニール（ＯＫ４３２、中外製薬、日本）を０．１ＫＥ／ｍｌずつ加えた。
（９）３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータにて、６時間〜翌朝まで培養した。

［７〜８日目：成熟化ＤＣの回収］
（１０）前記Ｔ−１７５培養フラスコから接着細胞を回収した。

（１１）回収した細胞懸濁液を含むコニカルチューブ数本を遠心し、ピペットにて上清を吸引した。ＰＢＳあるいはＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣにて各々コニカルチューブのペレットを懸濁し、５０ｍｌコニカルチューブに移し、ＰＢＳあるいはＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣにて４０ｍｌまでメスアップした。
（１２）細胞浮遊液を１００μｍセルストレーナーでろ過し、遠心した（３００ｇ、４℃、５分）。
（１３）２２５ｍｌコニカルチューブにＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣを加えて懸濁した。

（１４）回収された細胞のＨＬＡに応じて、以下のいずれかの腫瘍抗原ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって合成）を添加し３７℃インキュベータに入れて、１２０分間インキュベートした。

・ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性被験体用：
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性ＲＮＦ４３ペプチド（ＲＮＦ４３−Ａ２４−９−７２１、アミノ酸配列：ＮＳＱＰＶＷＬＣＬ）

・ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性被験体用：
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性ＲＮＦ４３ペプチド（ＲＮＦ４３−Ａ０２−１０−１１、アミノ酸配列：ＡＬＷＰＷＬＬＭＡＴ）

（１５）インキュベータから前記２２５ｍｌコニカルチューブを取り出し、遠心して、上清を捨てた。

（１６−１）（１５）により得られた細胞の一部（５×１０^６個〜１．５×１０^７個）をケーエムバンカーＩＩに懸濁し、クライオンチューブに入れ、超低温フリーザに保存した（なお、被験体に投与する際は、２％自己血清／生理食塩水または乳酸リンゲル液０．５〜１ｍｌに懸濁して投与した。）。

樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）の誘導（ＤＣによる刺激１回目）
［７〜８日目］
（１６−２）以下を混合した培地を調製した：
・Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０（Ｌｏｎｚａ、ＭＤ、ＵＳＡ） １９ｍｌ；
・自己血清 １ｍｌ；
・ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２０μｌ；及び
・ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ） １６μｌ
上記の１日目に保存したリンパ球（非接着細胞）を融解して洗浄し、１×１０^８個のリンパ球と、５×１０^６個の腫瘍抗原パルス樹状細胞（上記の（１５）により得られた細胞）を、上記で調製した培地２０ｍＬとともにＴ７５フラスコに加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［９〜１０日目］
（１７）以下：
・Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ １９ｍｌ；
・自己血清 １ｍｌ；
・ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ） ４０μｌ；
・ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ） １６μｌ；
・ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ） ２０μｌ；及び
・ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ） ２０μｌ
を（１９）のＴ７５培養フラスコにさらに加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［１３〜１４日目］
（１８）前記Ｔ７５培養フラスコから、細胞懸濁液４０ｍｌを５０ｍｌコニカルチューブに回収し、遠心（３００×ｇ、４℃、５分）行った。上清を除去し、以下の組成を含む培地：
・Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ １９ｍｌ
・自己血清 １ｍｌ
・ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ） ４０μｌ
・ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ） １６μｌ
・ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ） １０μｌ
・ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ） １０μｌ
を加えて懸濁し、元のＴ７５フラスコに戻しインキュベータにて培養した。

［１４〜１５日目］
（１９）前記Ｔ−７５培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブに回収した。Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ １０ｍｌで先のＴ７５培養フラスコをリンスして先のコニカルチューブに回収した。遠心し（３００×ｇ、４℃、５分）上清を捨てた。

投与用ＤＡＫの調製
（２０−１）生理食塩水３０ｍｌに懸濁し遠心した（３００×ｇ、４℃、５分）。これを２回繰り返した。２ｍＬの自己血清を添加した１００ｍＬの生理食塩水ボトル（２％自己血清／生理食塩水）を作製した。作製した２％自己血清／生理食塩水 ２０ｍＬで上記ペレットを懸濁し、１００μｍセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水１００ｍｌボトルに入れて投与用ＤＡＫを調製した。

樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）の誘導（ＤＣによる刺激２回目の場合）
（２０−２）（１９）のペレットを、Ｘ−ＶＩＶＯ１０ １０ｍｌで懸濁し、新しいＴ７５フラスコに加えた。凍結保存したＤＣ（上記（１８−１））５×１０^６個を３７℃のＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ ９ｍｌまたはＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ９ｍｌ＋自己血清１ｍｌに融解し、遠心した（１２０×ｇ、２０℃、１０分）。上清を捨て、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ２０ｍｌで懸濁し、再度遠心した（１２０×ｇ、２０℃、１０分）。上清を捨て、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０で２〜５×１０^６個／２〜５ｍｌに調整し、先のＴ７５フラスコに加えＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０を全体量２０ｍｌになるように加えた（可能であれば、リンパ球数は０．８〜１．２×１０^８個が望ましい。）。

（２１）さらにＴ−７５フラスコにＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ８．５ｍｌ＋自己血清１．５ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）３０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）２４μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）７．５μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）７．５μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［１６〜１７日目］
（２２）Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ４７．５ｍｌ＋自己血清２．５ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）８０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）３２μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌを作製した。前記Ｔ−７５培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞を新しいＴ−１７５フラスコに移した。先のＴ−７５培養フラスコを先の培地１０ｍｌで洗浄後、前記新しいＴ−１７５フラスコに加えた。この作業をもう一回繰り返した。残り３０ｍｌの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［１９〜２０日目］
（２３）前記のＴ−１７５培養フラスコから細胞混濁液５０ｍｌ（できるだけ上清）を５０ｍｌコニカルチューブに回収し、遠心した（３００×ｇ、４℃、５分）。上清を捨てＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ２８．５ｍｌ＋自己血清１．５ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）６０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）２４μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）１５μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）１５μｌを加えて懸濁し、元のＴ−１７５培養フラスコに戻し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［２１〜２２日目］
（２４）前記Ｔ−１７５培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブに回収した。Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ２０ｍｌで先のＴ１７５培養フラスコをリンスして、先のコニカルチューブに回収し、遠心して（３００×ｇ、４℃、５分）、上清を捨てた。

投与用ＤＡＫ（ＤＣ刺激２回）の調製
（２５−１）生理食塩水３０ｍｌに懸濁し遠心した（３００×ｇ、４℃、５分）。これを２回繰り返した。作製した２％自己血清／生理食塩水 ２０ｍＬで上記ペレットを懸濁し、１００μｍセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水１００ｍｌボトルに入れて投与用ＤＡＫを調製した。

樹状細胞誘導キラーリンパ球（ＤＡＫ）の誘導（ＤＣによる刺激３回目の場合）
（２５−２）（２４）のペレットを、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ １０ｍｌで懸濁し、新しいＴ７５フラスコ２個に分注した（可能であれば、リンパ球数は０．８〜１．２×１０^８個／フラスコが望ましい。）。凍結保存したＤＣ（上記（１８−１））５×１０^６個２本それぞれを、３７℃のＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ ９ｍｌまたはＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ９ｍｌ＋自己血清１ｍｌに融解し、遠心した（１２０×ｇ、２０℃、１０分）。上清を捨て、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ２０ｍｌでそれぞれ懸濁し、再度遠心した（１２０×ｇ、２０℃、１０分）。上清を捨て、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０で２〜５×１０^６個／２〜５ｍｌに調整し、先のＴ７５フラスコに加えＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０を全体量２０ｍｌになるように加えた。

（２６）（２５−２）のＴ−７５フラスコの細胞懸濁液にＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ８．５ｍｌ＋自己血清１．５ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）３０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）２４μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）７．５μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）７．５μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにて培養した。

［２３〜２４日目］
ＤＡＫの継代
（２７）Ｔ−７５フラスコの細胞懸濁液を各々Ｔ−１７５フラスコに移しＸ−ＶＩＶＯ１０ ４７．５ｍｌ＋自己血清２．５ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）８０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）３２μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌを加えた。

［２５〜２６日目］
（２８）前記の２つのＴ−１７５培養フラスコから細胞懸濁液４０ｍｌを５０ｍｌコニカルチューブに回収し、遠心した（３００×ｇ、４℃、５分）。培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ３８ｍｌ＋自己血清２ｍｌ＋ＩＬ−２（１００ＩＵ／μｌ）８０μｌ＋ＩＬ−１２（５００ｐｇ／μｌ）３２μｌ＋ＩＬ−７（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌ＋ＩＬ−１５（５０ｎｇ／μｌ）２０μｌで懸濁し、元のＴ−１７５培養フラスコに戻した。

［２８〜２９日目］
（２９）前記２つのＴ−１７５培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を６つの５０ｍｌコニカルチューブに回収した。Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０ ２０ｍｌで先のＴ１７５培養フラスコをリンスして先のコニカルチューブに回収した。遠心し（３００×ｇ、４℃、５分）、上清を捨て、生理食塩水３０ｍｌでペレットを懸濁し、６本分の細胞を２本にまとめて遠心し（３００×ｇ、４℃、５分）、上清を捨てた。再度生理食塩水３０ｍｌで懸濁し、遠心し（３００×ｇ、４℃、５分）、上清を捨てた。
（３０）２ｍＬの自己血清を添加した１００ｍＬの生理食塩水ボトル（２％自己血清／生理食塩水）を作製した。作製した２％自己血清／生理食塩水 ２０ｍＬで上記ペレットを懸濁し、１００μｍセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水１００ｍｌボトルに入れて投与用ＤＡＫを調製した。

２．細胞表面分子の解析
上記１の（１６−１）で得られた成熟樹状細胞の細胞表面分子の発現について、Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｙ．ら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８ Ｊａｎ ２；１３（１）：ｅ０１８７８７８）に記載のフローサイトメーターを用いた方法によって解析した。

図２は最終細胞加工物である成熟樹状細胞の細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲのそれぞれの発現を解析した図である。各パネルは解析の対象とする分子に特異的な抗体による染色を施した蛍光強度を示す。縦軸は樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃの蛍光強度、横軸は各細胞表面分子の蛍光強度を示す。

図３は１０例のがん患者の末梢血単核球から作成した成熟ＤＣの細胞表面分子の陽性率を棒グラフで示す。成熟マーカーの発現が高いことが示されている。

図４は１０例のがん患者のＤＡＫの細胞表面分子ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの発現率を示す。９０％以上がＴ細胞であり、そのうち疲弊型のエフェクターＴ細胞は少なくメモリー型Ｔ細胞が多く存在する。

３．患者への投与及び評価
上記１の方法によって、１０例の癌患者（直腸結腸癌、肺小細胞癌、食道癌、子宮頸癌）のそれぞれから得た末梢血単核球より作製した成熟ＤＣ及びＤＡＫを、図５のスケジュールに沿って投与した。具体的には、以下のスケジュールで実施した。
（１）Ｄａｙ１：低用量のシクロフォスファミド（３００ｍｇ／ｍ^２）を投与
（２）Ｄａｙ６：ＤＡＫを静脈内投与
（３）Ｄａｙ６、１３、２０：成熟ＤＣ １×１０^７個を皮下投与

その結果、ＳＤ（有効）症例では治療前と比べ、治療後に患者末梢血中のＲＮＦ４３ペプチド特異的ＣＤ１０７ａ／ｂ陽性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の増加が、ＰＤ症例と比べて高い傾向を示した（ｐ＝０．０５７）（図６（Ａ））。また、治療前と比べ、ＳＤ症例ではＰＤ症例より治療後の患者末梢血中のＲＮＦ４３ペプチド特異的ＩＦＮ−γ陽性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の割合が有意に増加していた（ｐ＝０．０４６）（図６（Ｂ））。

［実施例２］
１．細胞の調製
以下に記載の手順以外は、基本的には実施例１と同様の手順を実施した。

［７日目：ＯＫ４３２＋プロスタグランジンＥ２添加］
（８）各Ｔ−１７５培養フラスコにピシバニール（ＯＫ４３２、中外製薬、日本）を２ｍｌ（０．１ＫＥ／ｍｌ）加え、さらにプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２、ナカライテスク、日本）を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加した。
（９）３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータにて、３時間〜２４時間培養した。

２．結果
実施例１の方法で作製された成熟ＤＣは、遊走能を示す表面マーカーＣＣＲ７の発現が低い（図７及び８）。一般的な成熟ＤＣの投与ルートである皮下接種では所属リンパ節に移動できるＤＣが、わずか数％程度しかなく非効率的である。そのためアフェレーシスで大量の成分採血を行ってＤＣ細胞数を極端に増やして（平均１×１０^７個）投与し、所属リンパ節にたどり着けるＤＣ数を補う方法がとられる。

そこで、我々は実施例１の方法を改良することによって、成熟化を阻害せずに遊走能のマーカーであるＣＣＲ７の発現を増強することに成功した。つまりｄａｙ７にＯＫ−４３２とプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）１μｇ／ｍｌを添加後、１２〜２４時間（実施例１の方法はＯＫ−４３２のみ添加後２４時間）後にＤＣを回収する（図９及び図１０）。

特注したＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（温度応答性細胞培養ディッシュ）を使って、末梢血単核球を培養するとＤＣの誘導効率が良い（図１１）。さらにＰＧＥ２を添加すると成熟化マーカーＣＤ８０は低下せず、ＣＣＲ７の発現も上昇する（図１２及び１３）。

２例とも既存の細胞培養ディッシュよりＵｐＣｅｌｌのほうが樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃの誘導効率が高い。またＰＧＥ２添加しても効率は悪くならない。

顕微鏡写真でも樹状を認める細胞（ＤＣ）は細胞培養ディッシュよりもＵｐＣｅｌｌ（登録商標）で培養した場合に多く認められる（図１４）。

ＤＣにＯＫ−４３２を添加するとＩＬ−１２分泌能は２４時間が最も高くなった（図１５）。しかしながら２４時間ではＤＣ遊走能の指標であるＣＣＲ７の発現が低下する（図１０）。ＯＫ−４３２にＰＥＧ２を追加するとＩＬ−１２分泌能はＯＫ４３２単独に比べて低下するものの、分泌能はある程度維持されたままＣＣＲ７発現が増加する（図１０及び図１５）。以上を踏まえると、以下の２つの治療戦略を患者の状態に応じて適用し得る。

１）．表在リンパ節が大きく腫れていてエコー下穿刺が可能な患者には、実施例１に記載のＤＣ製造法による成熟ＤＣ（抗原提示能が高く遊走能が低い）をリンパ節内投与する。
２）．表在リンパ節が小さく穿刺注入できない患者にはＰＧＥ２を添加して遊走能を高め、ＤＣを皮下接種し所属リンパ節に移動できるようにする。

従来、癌ワクチンとしてはいわゆる正常の細胞にも発現しているが、腫瘍細胞に過剰発現している腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｓ：ＴＡＡ）を標的としてきた（ＨＥＲ２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１等）。しかしほとんどの臨床試験結果では、標準療法と比較した場合に永続性のある結果は示されていない。一方で、体細胞ＤＮＡ変異（非同義点突然変異、挿入−欠失（いわゆる「ｉｎｄｅｌ」）、遺伝子融合及び／又はフレームシフト変異）の結果発生する腫瘍特異的抗原であるネオ抗原は、典型的にはＭＨＣへの高予測結合親和性を有しており、正常細胞にない蛋白配列を標的とし、胸腺での中枢性免疫寛容によるクローン消失を回避でき、高い有効性と安全性が期待できる。実際に、免疫チェックポイント阻害剤の有効性が腫瘍細胞における体細胞変異負荷との関連が示されている。

実施例１及び２で得られる成熟ＤＣは、以下の手順で同定されるネオ抗原ペプチドでパルスして、癌治療に用いることもできる。

３．ネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）ペプチドの同定方法
患者腫瘍組織からＤＮＡ、ＲＮＡを抽出し次世代シーケンサによる解析（Ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で変異タンパク質の同定とＨＬＡタイピングを行う。

ネオ抗原―ＭＨＣ結合親和性を予測する。ＮｅｔＭＨＣｐａｎなどを使った方法にて親和性の高い候補ペプチドを上位１０個まで選ぶ。

各ペプチドはＤＣのＨＬＡ親和性の違いからミックスしてパルスすると競合して抗原提示の際に競合してしまう。そのため、Ｄａｙ８に、選んだ各々ペプチドを、分配した成熟ＤＣに各々パルスする（図１６）。

２時間ペプチドパルスした各々のＤＣは一つのフラスコに再度集め、リンパ球と共培養する（ＤＡＫの製造）。

Claims (10)

1. 成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
   （１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
   （２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
   （３）前記工程（２）に、ピシバニール及びプロスタグランジンＥ２を添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；及び、
   （４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
   を含み、
   ここで培養することが、刺激応答性培養基材を用いて実施される、方法。
2. 樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
   （１）樹状細胞前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中で、７２〜１４４時間培養する工程；
   （２）前記工程（１）で得られる細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む培地中で、６時間〜４８時間培養する工程；
   （３）前記工程（２）に、ピシバニール及びプロスタグランジンＥ２を添加し、さらに３時間〜３６時間培養する工程；
   （４）前記工程（３）で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、３０分〜２４０分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程；及び、
   （５）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
   を含み、
   ここで培養することが、刺激応答性培養基材を用いて実施される、方法。
3. 前記工程（５）が、
   （５−１）前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第１細胞群を、ＩＬ−２及びＩＬ−１２を含む培地中で、６〜３６時間培養する工程；及び
   （５−２）前記工程（５−１）で得られる前記第１細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む培地中で、１２〜１６８時間培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
   である、請求項２に記載の方法。
4. （６）前記工程（５）により得られる前記第１細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第２細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
   をさらに含む、請求項２〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. （７）前記工程（６）により得られる前記第２細胞群と、前記工程（４）で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第３細胞群を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
   をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
7. 前記工程（４）で得られる成熟樹状細胞と併用される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
8. 抗癌剤と併用される、請求項６又は７に記載の癌治療用細胞組成物。
9. 対象のリンパ節に直接投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌治療用細胞組成物。
10. 抗癌剤が投与された、放射線療法、及び／又は手術に供された対象に投与される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の癌治療用細胞組成物。